MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS ENTEROPARASITOSIS

IMPORTANCIA

Diagnóstico de enteroparasitosis sintomáticas, asintomáticas.

Diagnóstico diferencial de infecciones entéricas.

Diagnóstico diferencial con otras patologías del aparato digestivo.

Tratamiento específico.

Valoración de respuesta al tratamiento.

Prevención.

DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS

Pre-analítica

Analítica

Post-analítica

ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO

DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS

MÉTODOS DIRECTOS:

Coproparasitario

Coloraciones

Método de Graham - Espátula adhesiva

Sondeo Duodenal

Biopsia duodenal

Coproantígenos

MÉTODOS INDIRECTOS:

En suero: anticuerpos séricos

Amibiasis invasiva, estrongiloidiasis,fasciolosis,esquistosomiasis, etc

ETAPA PRE-ANALÍTICA

ETAPA PRE-ANALÍTICA

Indicaciones del examen parasitario

Pacientes con sintomatología sugestiva; pacientes asintomáticos con antecedentes epidemiológicos relevantes; control o control post-tratamiento

Solicitud del examen parasitario

Datos filiatorios del paciente

Datos clínicos (síntomas y signos, diagnóstico clínico presuntivo)

Antecedentes personales: inmunosupresión, viajes al exterior

Antecedentes familiares

Antecedentes ambientales (agua potable, saneamiento)

Tratamientos previos anti diarreicos, antiparasitarios, antibióticos etc.

ETAPA PRE-ANALÍTICA

Indicación de Régimen alimentario

48 a 72 hs antes de realizarse el estudio (libre de frutas, verduras y grasas dado que estas preparaciones obstaculizan la visualización microscópica lo que puede conducir a resultados Falsos Negativos o Falsos Positivos).

Necesario?

Emisión

Espontanea.

No en periodo menstrual, ni posterior a realización de estudio radiológico con bario.

ETAPA PRE-ANALÍTICA

Muestra de materia fecal

Aproximadamente 50 grs (tamaño de una nuez) si heces formadas o 10 a 15 ml si heces líquidas.

Rotular adecuadamente.

En recipiente de boca ancha, transparente y con tapa de rosca.

Emitidas recientemente o conservadas en heladera hasta 24 horas.

Evitar contaminación con orina para evitar deterioro de los parásitos.

ETAPA ANALÍTICA

COPROPARASITARIO

DEFINICIÓN

Conjunto de técnicas diagnósticas complementarias que permiten la identificación de la mayoría de las enteroparasitosis causadas por protozoarios y helmintos intestinales o de aquellos que si bien tienen una localización tesidual sus huevos se eliminan en las materias fecales.

Se debe tener en cuenta a la hora de su indicación que esta metodología es útil para protozoarios y helmintos cuyas formas evolutivas se eliminan con las materias fecales:

Trofozoítos

Quistes

Ooquistes

Huevos

Larvas

Adultos

EXAMEN COPROPARASITARIO SERIADO

Se considera que muestras únicas solo permiten un diagnóstico positivo en un 40%-60% aprox. de las materias fecales con parásitos (ciclos de los parásitos alternan períodos negativos de eliminación de quistes) *

Existen diferentes esquemas sobre la secuencia de recolección de materia fecal para realizar el examen coproparasitario. Los más usados son:

3 muestras seriadas en días alternos

3 muestras separadas por intervalos de una semana entre si

* Manual de Toma de muestras para estudio Bacteriológico y Micológico.

Departamento de Laboratorio Clínico. Hospital de Clínicas. 2004

EXAMEN MACROSCÓPICO

Consistencia: moldeada, pastosa, semilíquida, inhomogénea

Color: marrón, amarillo, macilla, negruzco, verdoso

Olor: “sui generis”, fétido, butírico

Presencia de elementos anormales: sangre, mucus, pus

Presencia de seudoparásitos

Búsqueda de parásitos macroscópicos

EXAMEN MACROSCÓPICO

EXAMEN MACROSCÓPICO

En el caso de hallar proglótides de Taenia:

Dejar en agua destilada durante 24hs

Colocar el segmento sobre un recuadro de papel

Comprimir entre dos láminas

Observar las ramificaciones del útero

También se pueden teñir con Carmín Clorhídrico

EXAMEN MICROSCÓPICO

Examen directo de una pequeña porción de heces frescas

Examen después de aplicar un método de concentración

Examen de frotis o preparaciones permanentes

EXAMEN DIRECTO

Suero Fisiológico

Lugol

Objetivo 10 x

Objetivo 25-40 x

Habitualmente no se emplea objetivo de inmersión

Importante: No diluir demasiado las muestras

EXAMEN MICROSCÓPICO

DIRECTO EN FRESCO CON SUERO FISIOLÓGICO Y LUGOL

Inconvenientes:

Escaso material, por lo que es necesario la realización de técnicas de Enriquecimiento o Concentración (Ritchie, Faust, Sheater)

Ventajas:

Movilidad de trofozoítos, células intestinales, células inflamatorias, mala absorción.

MÉTODOS DE ENRIQUECIMIENTO O CONCENTRACIÓN

Procedimientos por Sedimentación

Procedimientos por Flotación

Procedimientos Biológicos

Aumentan el número de parásitos a partir de un volumen conocido.

TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO O CONCENTRACIÓN

MÉTODOS FÍSICOS

o Dilución minuciosa de heces en líquido o solución de densidad:

o Inferior a la de los parásitos (Técnicas de sedimentación)o Superior a la de los parásitos (Técnicas de flotación)

o Ventajas:

o Realización muy simple

o Precisan poco material

o Inconvenientes:

o Procesos largos

o Exigen mucha manipulación

o No aplicables a series grandes de muestras

MÉTODOS FÍSICOS

SEDIMENTACIÓN SIMPLE

• Espontanea

SEDIMENTACIÓN -CENTRIFUGACIÓN

• Ritchie (formol-éter)

• Telemann (éter-ácido clorhídrico)

• Carles y Barthélémy (éter-ácido cítrico)

TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO POR SEDIMENTACIÓN

Basados en la utilización de suero fisiológico (SF) y otras soluciones de baja densidad.

Se recuperan huevos, larvas, ooquistes y quistes del fondo de un tubo en el que se depositan por ser más densos.

SEDIMENTACIÓN SIMPLE

Lentos y poco prácticos

Mayor utilidad para huevos de trematodos

SEDIMENTACIÓN /CENTRIFUGACIÓN

Se destaca el método de Ritchie (con formol y éter o acetato de etilo), que es el más usado en los laboratorios de nuestro medio

SEDIMENTACIÓN SIMPLE

o Homogeneizar 2 a 5 gr de heces (10-20 gr) en 10 ml de SF o agua.

o Colocar la dilución en tubo cónico de 50 ml, filtrando a través de gasa.

o Completar el volumen con SF o agua de la canilla.

o Agitar y dejar reposar por 45 minutos.

o Desechar sobrenadante.

o Resuspender con SF o agua de la canilla.

o Dejar sedimentar 45 minutos.

o Desechar sobrenadante.

o Repetir esta operación varias veces, hasta que el sobrenadante quede

transparente.

o Tomar con pipeta el material sedimentado.

o Hacer tres tomas:o Superficieo Media alturao Fondo Sensibilidad 55%

MÉTODO DE RITCHIESEDIMENTACIÓN-CENTRIFUGACIÓN

o Homogeneizar materia fecal con SF (aprox. 25 ml).o Filtrar suspensión por embudo con triple gasa a tubo de centrífuga de fondo

cónico.o Centrifugar a 2300 rpm por 1 min, descartar sobrenadante, resuspender con SF

y agitar con varilla de vidrio. o Centrifugar nuevamente a 2300 rpm por 1 min, repitiendo hasta 3 veces o hasta

obtener un sobrenadante límpido.o Agregar al sedimento obtenido 3 a 5 ml de formol al 10%, homogeneizando con

varilla o pipeta Pasteur. o Dejar reposar por 5 min con fines de fijación.o Agregar 1 ml de éter o acetato de etilo, agitar vigorosamente el tubo tapado

para extraer las grasas.o Centrifugar tubo a 1500 rpm durante 2 min. o Descartar sobrenadante y limpiar la boca del tubo con hisopo de algodón.o Tomar con pipeta el sedimento obtenido .o Depositar sobre lamina y laminilla con SF y lugol parasitológico.

Restos vegetales y

grasa

Éter

Formol 10%

Sedimento (Parásitos)

MÉTODO DE RITCHIE

KITS COMERCIALES DE SEDIMENTACIÓN - CENTRIFUGACIÓN

Aspectos comunes

• Unidades de filtración

• Limpios

• Bioseguridad

Diferencias

• Tubos

• Con o sin conservantes

• Con o sin surfactante

• Cucharitas

• Hisopos

• Bolsas

FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN ®

• Remplaza embudo y gasa.• Los orificios del filtro permiten pasar larvas, huevos, quistes y retienen la mayorparte de los desechos fecales.• Surfactante Tritón x-100, disuelve y disgrega las heces y el mucus.

TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO POR

FLOTACIÓN

FLOTACIÓN SIMPLE

• Bass

FLOTACIÓN -CENTRIFUGACIÓN

• Faust (Sulfato de Zinc)

• Sheater modificado (azúcar). Para coccidios

• Bailinger (Éter y Sulfato de Zinc)

• Quinn (Sulfato de Magnesio)

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN FLOTACIÓN

Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de un líquido denso al cual ascienden por su menor peso específico.

Características a considerar:Densidad solución empleada, densidad de parásitos,concentración en superficie.Importante:

• Manipular rápidamente• Posible alteración en la morfología

de los huevos

Sedimento

Película superficial

Sulfato Zinc

MÉTODO DE BAERMANN TÉCNICAS BIOLÓGICAS DE

CONCENTRACIÓN

Basados en el conocimiento del ciclo vital del parásito

MÉTODO DE BAERMANN

Apropiado para el diagnóstico de Estrongiloidiasis (aprovechando la termofilia e hidrofilia de las larvas

de Strongyloides stercoralis)

MÉTODO HARADA - MORITÉCNICAS BIOLÓGICAS DE

CONCENTRACIÓN

Busca embrionar huevos de trematodes y cestodes.

Larvas de nematodes.

Strongyloides stercoralis

TÉCNICAS PARA RECUENTO DE HUEVOS

Intensidad de infección de helmintos transmitidos por el suelo.

Cuantifican el número de huevos por gramo de materia fecal.

Recuento en placa microscópica.

Técnica de Kato – Katz.

COLORACIONES

Coloraciones temporarias

Lugol, Negro de Clorazol, Azul de Tionina

Coloraciones permanentes (Frotis)

Ziehl Neelsen modificado o Kinyoun para diagnóstico de coccidiosis intestinales (Criptosporidiosis, Isosporosis, Ciclosporosis)

Hematoxilina Férrica para amibiasis

Tricrómica y Gram Cromotrope para microsporidiosis

COLORACIÓN DE KINYOUN ZIEHL NEELSEN MODIFICADO EN FRÍO

PARA COCCIDIOS INTESTINALES

Fijación frotis: Metanol por 30 seg

Tinción: 5 min (frío) con solución de Fucsina básica

Fucsina básica 4 g

Fenol 8 g

Etanol (95%) 90 ml

Agua destilada 100 ml

Lavado

Etanol 50%: 3-5 min

Agua corriente

Decoloración: Ácido sulfúrico 1% por 2 min

Contracoloración: Verde de Malaquita o Azul de Metileno por 1-2 min

OTROS EXAMENES DIRECTOS PARA DIAGNÓSTICO DE

ENTEROPARASITOSIS

EXAMEN DIRECTO DE LÍQUIDO DUODENALo Se obtiene por sondeo duodenal o con cápsula entérica o test del cordón o“Enterotest”

o Observación

o Fresco (directo o tras centrifugación)

o Frotis coloreados

o Utilidad / Rendimiento

o Trofozoítos de Giardia lamblia

o Ooquistes de Isospora y Cryptosporidium

o Huevos de Fasciola hepatica

o Larvas de Strongyloides stercoralis

o Restos alimenticios semi-digeridos

o Células epiteliales (mucosa intestinal)

o Células sanguíneas • Leucocitos (úlceras intestinales)• Macrófagos amebas patógenas• Hematíes

o Bacterias

o Hongos

ELEMENTOS NO PARASITARIOS EN LAS HECES

Restos alimenticios

o Tejido conjuntivo

o Fibras musculares estriadas (carne)

o Grasas neutras Glóbulos refringentes tamaño variable

o Ácidos grasos Agujas finas

o Almidón

o Crudo: Granos en capas concéntricaso Células reserva amilácea

o Celulosao Digerible: Masas celulósicas (células reserva)

o No digerible: Traqueadas, pelos vegetales, polen etc.

ELEMENTOS NO PARASITARIOS EN LAS HECES

Cristaleso Origen alimentario (oxalato de calcio)

o Endógeno:

o Oxalato de calcio

o Fosfato amónico-magnésico

o de Charcot-Leyden

o Medicamentos

ELEMENTOS NO PARASITARIOS EN LAS HECES

o Oxiurosis o Enterobiosis (Enterobius vermicularis)

o Observación microscópica del material recogido de la zona perianal, por aplicación de una superficie adhesiva

o La cinta se dispone sobre un soporte rígido, con la superficie adhesiva hacia el exterior

o Se aplica varias veces sobre la piel de la región perianal sin introducir en el recto

o Se envía al laboratorio y se observa al microscopio (10X)

IMPORTANTE

o Realizar la toma de muestra a 1ª hora por la mañana, antes de

levantarse de la cama, durante 3 mañanas consecutivas

MÉTODO DE ESPÁTULA ADHESIVA TÉCNICA DE GRAHAM

MÉTODO DE GRAHAMDIAGNÓSTICO OXIUROSIS

ETAPA POST-ANALÍTICA

ETAPA POST-ANALÍTICA

Validación

Informe de resultados

Importancia de relación con el médico clínico

Observaciones, orientaciones y sugerencias

METODOLOGÍA

ESPÁTULA ADHESIVA

EXAMEN DIRECTO

• Trofozoítos• B. hominis

ENRIQUECIMIENTO

• Quistes de patógenos:• Primarios• Oportunistas• Discutidos

• Huevos• Larvas

COLORACIONES

• Ziehl Neelsen• Tricrómica• H. férrica

MACROSCÓPICO

• Nematodes• Platelmintos

COPROANTÍGENOS

• G. lamblia• Crypto. spp• E. histolytica

COPROPARASITARIO

ORIENTACIÓN CLÍNICA

CUADROS CLÍNICOS

VINCULADOS A

ENTEROPARASITOSIS

EOSINOFILIAS: CPs+EA

SÍNTOMAS INESPECÍFICOS: CP+EA

DIARREA CRÓNICA CON MALABSORCIÓN:

CPs+CAg

DIARREA AGUDA INFANTIL,DIARREA

PROLONGADA: CP+ZN

INMUNODEPRIMIDOS CON DIARREA:

CPs+ZN+TRIC+CAg+CAcp

DIARREA DEL VIAJERO: CP+ZN

DIARREA DEL ADULTO: CP

DOLOR ABDOMINAL: CPs+EA