Jaké máme řešení pro teplárenství ? Palivová základna příštích desetiletí.
Metodická základna molekulární patologie
description
Transcript of Metodická základna molekulární patologie
Metodická základna molekulární patologie
Michala Fiurášková, Jan Bouchal, Zdeněk Kolář
Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc http://lmp.upol.cz http://ustavpatologie.upol.cz
Molekulární metody
• genová úroveň nemoci• přesné stanovení diagnózy
– infekční choroby– onkologická onemocnění– určení proliferační aktivity (imunohistochemické stanovení Ki67, PCNA)– predispozice k chorobám-ateroskleróza, diabetes– stanovení otcovství– stanovení DNA ploidie - počítačová analýza, průtoková cytometrie)– stanovení diferenciačních markerů (CD), onkoproteinů, onkofetálních antigenů (imunohistochemie, průtoková
cytometrie) – stanovení exprese receptorů pro růstové faktory (imunohistochemické: steroidní hormony, c-erbB-2…)– somatické a germinální mutace
ÚVOD
Molekulární diagnostika
Zásadní roli hrají:• Monoklonální protilátky• Hybridizace• PCR (polymerázová řetězová reakce)
• Imunohistochemie (téměř 200 protilátek na Ústavu patologie)
• Analýza proteinů v buněčných lyzátech (imunoblotting)
• ELISA test
Monoklonální protilátky
Imunohistochemie
afinita antigenu a specifické protilátky
aplikace imunologických metod při studiu tkání nebo buněk
• „sandwich“ protilátka-antigen
• Kvantitativní analýza exprese proteinů
• Těhotenské testy
• Detekce infekčních agens
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Western analýza=imunoblotting (proteiny)
elektroforéza(polyakrylamidový gel)
p53
Bcl-XL
nitrocelulózová membrána
kDa
66
45
97
bandy
prim, sek. protilátka
chemiluminiscence
220
3020
Southern-Northern blotting (DNA, RNA)
• rozštěpení NK – restrikční endonukleáza• elektroforéza• detekce specifického fragmentu kapilárním přenosem a hybridizací
Metody založené na hybridizaci
arteficiální spojení dvou vláken DNA komplementarita bází, DNA sonda (próba)
• ISH (in situ hybridizace)• FISH (fluorescenční ISH)• SKY (spektrální karyotypování)• mFISH (multi color FISH)• CGH – komparativní genomová hybridizace• DNA čipy
FISHfluorescenční in situ hybridizace
- Možnost analýzy interfázních chromozomů (nevyžaduje kultivaci buněk a přípravu metafázických chromozomů)
- Detekce polysomií, translokací, inverzí, delecí
SKY – spektrální karyotypování(spectral karyotyping)
- počítačové zobrazení a analýza-cytogenetické laboratoře-identifikace početních i
strukturálních chromozomálních aberací
mFISH
Multi color FISH/
high resolution banding
kombinace fluorochromů
CGH – komparativní genomová hybridizace(Comparative Genomic Hybridization)
vizualizace chromozomových poruch
hybridizace
DNA čipy (microarray)
Alterace DNA
změněná exprese a aktivita proteinů DNA sekvence (array)
1. izolace DNA2. hybridizace3. počítačové zpracování
DNA čipy
DNA čipy
- identifikace nových genů- unikátní informace o
změnách v expresi celého genomu v
odpovědi na pokusný zásah- nové diagnostické markery
(BRCA1, BRCA2-adenokarcinom mléčné žlázy nebo ovaria)
PCR – polymerázová řetězová reakce(polymerase chain reaction)
detekce abnormální funkce genu (onkogeny, viry, bakterie, paraziti)enzymatická syntéza a amplifikace specifických sekvencí NK
primer
Využití PCR- detekce libovolných mutací- identifikace virů, bakterií, buněčných parazitů- RT-PCR (reverzní transkriptáza) –pro detekci mRNA
3SR amplifikační reakce (self-sustained sequence replication)
• metoda detekující genové amplifikace• využívá kolektivního účinku reverzní transkriptázy
(např. z ptačího myeloblastového viru), RNázy H • (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerázy. • přírodní replikační proces retrovirů realizovaný in
vitro.
Přehled 1
• Diagnostika– Monoklonální protilátky (IHCH, elisa,
imunoblotting)– Hybridizace (FISH, CGH, DNA čipy)– PCR– detekční koncovka (fluorescenční,
radioaktivní, barevná)• Základní výzkum• Terapie
Základní výzkum
• Snaha o pochopení životních pochodů a možnosti jejich ovlivnění
• Může vycházet z dat získaných při klinické práci
• Buněčné kultury – ovlivňování chemickými látkami– cílené zásahy do vnitřního prostředí buněk (antisense
RNA, transientní nebo stabilní transfekce = zavádění cizích genů do buněk)
– studium proliferace, apoptózy, jednotlivých i globálních změn exprese genů (DNA čipy, WB, IHCH)
Základní výzkum
• In vivo na zvířatech (výsadní postavení myší)– athymické nahé myši pro studium nádorů– knock-out/in myši (inaktivace/nový gen transgenní organismy)
• Průtoková cytometrie• Tkáňová mikroarray• Mikrodisekce– mechanická– laserová
Průtoková cytometrie
• technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi
• cíleně separovat částice (buňky) splňující požadované parametry
• běžně užívané aplikace: – detekce apoptózy – analýza buněčného cyklu – mnohobarevná imunofenotypizace – buněčná proliferace
Tkáňová microarray (TMA)
0.06cm0.2cm1 parafinový blok – soubor různých tkání
Imunohistochemické barvení TMA
Lung
MB
H&E
MNF-116 (total keratin) barvení
Mechanická mikrodisekce
separace buněk z tkáně
Laserová mikrodisekce (LCM)
Restrikční endonukleázy
enzymy– vyštěpení určitých úseků DNA Molekulární klonování (plasmidy = extrachromozomální
kruhové molekuly DNA
- DNA knihovna (soubor sekvencí lidské DNA, DNA inzert) - cDNA knihovna (přepis mRNA) Sekvenování - lineární sekvence nukleotidů
Projekt HUGO
-složení lidského genomu -30-40 tisíc genů (jen 2x více než háďátko
nebo octomilka)-pouze 3-5% celého genomu jsou sekvence překládané do proteinů
-95% genomu představují repetice-nekódující sekvence
(Human Genome Mapping Organization)
Přehled 2
• Diagnostika– Monoklonální protilátky– Hybridizace– PCR
• Základní výzkum– Buněčné kultury + DNA manipulace– Zvířecí modely – Tkáňová mikroarray– mikrodisekce
• Terapie
Terapie
• Získání léku na základě poznání biologického procesu, na základě screeningu chemických knihoven
• Klinické testy• Genová terapie
Amplifikace HER2-NEU u nádorů prsu
Indikace léčby„herceptinem“ (blokace receptoru)Vyšetření 6 tis. x roční léčba 1 mil Kč
(červeně HER2, modře centromera 17, zeleně TOPO2a)
Imunohistochemické vyšetření
+FISH
Her2 = receptor z rodiny epidermálních růstových
faktorů, gen amplifikován u 25-30% karcinomu mléčné
žlázy
Genová Terapie
-Přenos genetického materiálu, jenž má léčebný
účinek -Cílené vyřazení aberantního proteinu (např.onkogenu u
rakoviny)-Obnova exprese mutovaného
genu u dědičných chorob-Problém obranných
mechanismů buňky k cizorodé DNA
-Problém selektivní terapie defektních buněk
Genová Terapie („antisense“ technologie)
Antisense RNA – RNA komplementární k určité mRNA
komplex
translace
umlčení genu
Shrnutí
• Diagnostika– Monoklonální protilátky– Hybridizace– PCR
• Základní výzkum– Buněčné kultury + DNA manipulace– Zvířecí modely– Tkáňová mikroarray– mikrodisekce
• Terapie – snaha o zacílení na molekulární úrovni