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Elena Pannunzi
Istituto Superiore di Sanità
Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari
Reparto OGM e Xenobiotici di Origine Fungina
METODI DI ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DELLE
AFLATOSSINENEGLI ALIMENTI
AFLATOSSINE NUCLEO BIS-FURANO CUMARINICO SERIE B: ANELLO PENTENONICO SERIE G: ANELLO LATTONICO A SEI TERMINI AFM1: METABOLITA OSSIDRILATO DELLA AFB1
SCALA DI TOSSICITÁ: AFB1 >AFM1≥ AFG1>AFB2 >AFG2
ALIMENTI SUSCETTIBILI DI CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE
ARACHIDI, PISTACCHI, FRUTTA SECCASPEZIECEREALI MANGIMIALIMENTI PER L’ INFANZIALATTE E FORMAGGI
Metodi ufficiali AOAC e CEN
Micotossina Matrice Riferimento Metodo
Aflatossine (AFB1 e AFtot)
Cereali, frutta a guscio e prodotti derivati
AOAC - 991.31 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione
fluorimetrica
CEN–EN 12955:1999
Aflatossine (AFB1, AFB2, AFG1,
AFG2)
Mais AOAC-993.16 ELISA
Aflatossina B1 Mangimi
AOAC–2003.02 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione
fluorimetrica
CEN–EN ISO 17375:2006
Aflatossina B1 Baby foods AOAC–2000.16
IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione
fluorimetrica
Micotossina Matrice Riferimento Metodo
Aflatossine (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2)
Burro di arachidi, pasta di pistacchio,
pasta di fichi, paprika
AOAC-999.07 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione
fluorimetrica
CEN–EN 14123:2003
AflatossineNocciole e prodotti
derivatiAOAC–2005.08
HPLC con derivatizzazione fotochimica post
colonna
AflatossineMandorle, arachidi, pistacchi, nocciole
brasilianeAOAC-994.08 Mycosep-HPLC
Aflatossine Burro di arachidi AOAC-991.45 ELISA
Aflatossine Arachidi e mais AOAC-993.17 TLC
Metodi ufficiali AOAC e CEN
Metodi ufficiali AOAC e CEN
Micotossina Matrice Riferimento Metodo
Aflatossina M1
Latte e latte in polvere
AOAC–2000.08 IAC-HPLC con
rivelazione fluorimetricaCEN–EN ISO
14501:1999
Aflatossina M1
Latte e latte in polvere
CEN–EN ISO 14675:2003
ELISA
Aflatossina M1
Latte e formaggio
AOAC-980.21 TLC
VANTAGGI SVANTAGGI
HPLC •Eccellenti performance•Bassi livelli di rivelabilità•Sicurezza per l’operatore
•Costoso•Richiede addestramento dell’operatore•Tempi di analisi
ELISA •Risultati rapidi•Alto numero di campioni•Non richiede attrezzature costose•Semplice da utilizzare dopo un breve training dell’operatore•Fase di automatizzazione
•Possibilità di falsi positivi•Reazioni collaterali•Interferenza della matrice•Precisione meno attendibile rispetto ai metodi di laboratorio jn HPLC
TLC •Permette determinazioni precise (per livelli superiori a 2ng/g)•Costi limitati
•Uso di solventi considerati pericolosi per l’ambiente
MS •Universale•Altamente sensibile e selettiva•Possibilità di determinare diverse micotossine contemporaneamente•Possibilità di ridurre ed eliminare la fase di clean-up
•Costi elevati•Richiede addestramento dell’operatore•Elevati costi di manutenzione
SAGGI ELISA IMMUNO-ENZIMATICI
Preparazione del campione
Saggio immunoenzimatico con kit
Lettura al colorimetro
INTEN
SIT
Á C
OLO
RAZIO
NE
CONCENTRAZIONE TOSSINA
INTEN
SIT
Á C
OLO
RAZIO
NE
CONCENTRAZIONE TOSSINA
SAGGIO DIRETTO
ANTICORPOTOSSINA
ANTICORPO-ENZIMA
SUBSTRATO
CROMOFORO
SUBSTRATO
CROMOFORO
SAGGIO COMPETITIVO
ANTICORPO
ENZIMA CONIUGATO
ALLA TOSSINATOSSINA
KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO
FORNITORE Test Kit Range di
quantificazioneLimite di
rivelabilità Tempo di
incubazione
Aflatossine Totali
1-20ppb 1ppb 20min
4-40ppb 3ppb 20min
Aflatossina M1
5-100ppt 5ppt 130min
Aflatossine Totali
1-20ppb 1ppb 15-20min
Aflatossina M1
5-100ppt 5ppt 120min
Aflatossine Totali
5-40,5ppb 5ppb 60min
1,7-45ppb 1,7ppb 15min
Aflatossina M1
5-80ppt5ppt (latte)
50ppt (form.)60min
250-2000ppt <3670ppt 15min
KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO
FORNITORE Test Kit Range di
quantificazioneLimite di
rivelabilità Tempo di
incubazione
Aflatossine Totali
2-80ppb (cereali) 2ppb 15min
3-100ppb (cereali) 3ppb 40min
1-16ppb (paprica) 1ppb 50min
-(qualitativo) 5ppb 3min
-(qualitativo
<20ppb o>20ppb
20min
Charm Toxi-Test Transia
Diagnostix Tepne Neogen
Diffchamb Strategic Diagnostics IncInternational Diagnostic
Systems
Elisa-Tek Vicam Idexx
API 4000 Q trap LC-MS/MS
M. Sulyok, F. Berthiller, R. Schuhmacher, R. Krska Rapid Commun. Mass Spectrom.
2006; 20: 2649–2659
DETERMINAZIONE SIMULTANEA LC-ESI-MS/MS DI 39 MICOTOSSINE IN CEREALI SENZA CLEAN-UP
IN GENERALE
GLI STEPS TIPICI PER L’ANALISI DELLE AFLATOSSINE
SONO:
ESTRAZIONE CLEAN-UP RIVELAZIONE
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB1 E TOTALI IN MAIS E MANGIMI
METODO INTERNO VALIDATO
ESTRAZIONE: Pesare 50.0g di campione in blender + 5.0g di NaCl
Estrarre con 250ml MeOH:H2O 80:20 (v:v)
Filtrare su filtro di carta
Prelevare 20ml di filtrato
Diluire con 20ml di PBS*
Filtrare su filtro a microfibra di vetro
Portare a pH 7.4 con HCl (0,1 mol/L) o con NaOH (0,1 mol/L). Portare ad un litro con acqua bibistillata.
*Phosphate Buffered Saline pH=7.4 0.20g di cloruro di potassio0.20g di di-idrogenofosfato di potassio1.16g di idrogeno fosfato disodico anidro8.00g di cloruro di sodio in 900 mL di acqua bidistillata
CLEAN-UP: Colonnine di immuno-affinità (IAC)
INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
Condizionare la colonnina di immunoaffinità con 5.0ml di PBS
Passare in IAC 20ml di campione
Lavare la IAC con 10ml di H2O
Eluire con 1000 l + 1000 l di MeOH per HPLC
Portare a volume in matraccio da 5ml con H2O bidistillata
L’estratto viene fatto passare attraverso la
colonnina. La micotossina si lega al sito
specifico dell’anticorpo. Il materiale
estraneo viene eliminato tramite lavaggio
con acqua. Il legame aflatossina-anticorpo
è rimosso mediante eluizione con
opportuno solvente.
CLEAN-UP
VANTAGGI SVANTAGGI
COLONNINE DI IMMUNO AFFINITÀ
(IAC)
Alta selettività accuratezza e sensibilità (anticorpi
specifici)
Costi elevati
Monouso
ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE)
Rapido
Possibilità di analisi multimicotossina
Minore selettività
POST/COLONNA
PBPB Brominazione del doppio
legameDerivatizzatore elettrochimico
Iodurazione del doppio legame
Soluzione sovrasatura di iodio cristallino
Derivatizzazione fotochimica
UV
PRE/COLONNA Acido Trifluoro Acetico (TFA)
Idratazione del doppio legame furanico
RIVELAZIONE: HPLC/FLUORIMETRICA
Le aflatossine B1 e G1 non hanno gruppi che diano elevata fluorescenza naturale alla molecola. È necessaria la formazione di un derivato stabile
Corsa cromatografica senza agente derivatizzante
Corsa cromatografica
con agente derivatizzante
RIVELAZIONE: HPLC/FLUORIMETRICA
PBPBUna soluzione di PBPB 50mg/L èpompata a 0.4ml/min da una pompaesterna nella valvola a T
Una soluzione satura di I2 è pompata a 0,7ml/min in tubo di Teflon a 60°C
DERIVATIZZATOREELETTROCHIMICO
Si fa passare nel derivatizzatore la fase mobilecontenente bromuro di potassio (precursoredell’agente derivatizzante). Si genera bromoELETTROCHIMICAMENTE applicando unpotenziale costante agli elettrodi di lavoro
(pyridine hydrobromide
perbromide) :
I2:
UV: Si irradia il campione mediante lampada UV a 254nm
Formazione dell’emiacetale per addizione di acqua al doppio legame furanicoTFA:
:
POMPA DERIVATIZZANTE
PBPB/I2
T
VALVOLA
A T
UV/DERIV.ELETTROCH.
TFA
FASE MOBILE/
F.M. + KBr
VALVOLA DI
INIEZIONE
POMPA ANALITICA
COLONNA CROMATOGRAFICA
SISTEMI DI DERIVATIZZAZIONE
RIVELATORE
VANTAGGI SVANTAGGI
PBPB•Attendibilità e ripetibilità•T ambiente•Brevi tempi di analisi
•Richiede seconda pompa•Manutenzione e pulizia delle linee•Preparazione della soluzione
DERIVATIZZATORE
ELETTROCHIMICO
•Non è necessaria una seconda pompa•Assenza di agenti derivatizzanti
•Costo per uno strumento dedicato•Manutenzione
I2
•Attendibilità e ripetibilità•Automatizzazione
•Richiede seconda pompa e bagno termostatico•Manutenzione•Preparazione della soluzione di fresco
UV •Non necessita di preparazione di soluzioni•Non è necessaria una seconda pompa
•Aumento dei tempi di ritenzione•Leggera perdita in sensibilità
TFA •Richiede una sola pompa per HPLC
•Pericolosità dell’acido trifluoroacetico•Scarsa ripetibilità
Pesare 50.0g di campione in blender o in beuta da 500ml + 5.0g di NaCl
Estrarre con 200/300ml MeOH:H2O 80:20 (v:v) + 100ml n-esano in blender per 3 min o con agitatore a braccia per 30 min (paprika)
Filtrare su filtro di carta
Prelevare 15ml di filtrato
Diluire con 90ml di PBS (Phosphate Buffered Saline pH=7.4)
Filtrare su filtro a microfibra
Condizionare la colonnina di immunoaffinità (I.A.C.) con 5.0ml di PBS
Passare in IAC 70ml di campione
Lavare la IAC con 15ml di H2O
Eluire con 500 l + 750 l di MeOH per HPLC
Portare a volume in matraccio da 5ml con H2O bidistillata
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB1, G1, B2, G2
IN BURRO DI ARACHIDI, PASTA DI PISTACCHIO, PASTA DI FICHI, PAPRIKA (CEN–EN 14123:2003)
CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE
Fase mobile AcCN : MeOH : H2O 17 : 29 : 54
Flusso: 1 ml/min
Derivatizzazione post colonna con PBPB
Flusso pompa derivatizzante 0.4 ml/min
Vinj= 150 l
Colonna C18 250x4.6 mm 5
La colonna termostatata a 40°C 1°C
Spettrofluorimetro: ecc = 365nm em = 435nm
Cromatogramma maisAFB1≈ 20µg/Kg
Cromatogramma pistacchi AFB1≈ 2µg/Kg
PARAMETRI DEI METODI
Campo di applicazione 0,10 - 20 µg/Kg
Criteri di rendimento per le aflatossine
(REG. (CE) N. 401/2006)
Livello di contaminazione
g/KgRSD(r)% Recupero %
1 40 50-120
1-10 20 70-110
> 10 15 80-120
Calibrazione e linearità 0,10 - 6,60 µg/Kg MAIS0,10 - 4,80 µg/Kg PISTACCHI
0,03 µg/KgLimite di rivelabilità
Limite di quantificazione 0,10 µg/Kg
Recupero (n=10) PISTACCHIAFB1 88%AFB2 93%AFG1 92%AFG2 93%
MAISAFB1 87%AFB2 91%AFG1 90%AFG2 70%
Incertezza espansa0,76 µg/Kg
(AFB1 liv. 1,58 µg/Kg)
FATTORE DI RECUPERO
BIANCO SPIKE
PROCEDURA ANALITICA
Contaminazione
spike
Livello di contaminazione
X 100
Contaminazione
bianco
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1 IN LATTE E LATTE IN POLVERE
(CEN–EN ISO 14501:1999)
Latte in polvere: ricostituire 15g con 75 ml di acqua a 50°C
Latte: preriscaldare il campione a 37°C
Centrifugare per 15 min a 10000rpm
Eliminare lo strato superiore di grasso
Filtrare e raccogliere 50 ml
CLEAN-UP:
Passare in IAC 50 ml di filtrato
Lavare la IAC con 15 ml di H2O
Eluire con 1000 l + 1000 l di AcCN per HPLC
Portare a secco
Riprendere con 1 ml di AcCN:H2O 90:10 (v/v)
ESTRAZIONE:Pesare 10.0g di campione in blender + 5g di celite
Estrarre con 80ml di CH2Cl2 Lavare con 40ml di CH2Cl2 Filtrare su filtro di carta
Evaporare il filtrato al Rotavapor
Sciogliere con 1ml di MeOH, 30ml H2O, 50ml n-esano
Trasferire in imbuto separatore
Recuperare la fase acquosa sottostante
Lavare la fase organica 2 volte con 10ml H2O e riunire le fasi
acquose
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1
NEL FORMAGGIO
CLEAN-UP: Passare in IAC un volume noto di fase acquosa
Lavare la IAC con 15ml di H2O
Eluire con 500 l + 500 l + 500 l di AcCN per HPLC
Portare a secco
Riprendere con 500 l di AcCN:H2O 90:10 (v/v)
ESTRAZIONE:
Pesare 5.0g di campione in beuta
Estrarre con 50ml di soluzione di pepsina allo 0,2% in HCl
0,1N
Porre in stufa o bagno ad acqua a 42°C per tutta la notte
(16 ore) sotto continua agitazione
Centrifugare a 10000 rpm per 10 min
Eliminare il grasso
Filtrare su filtro di carta a pieghe
Neutralizzare con NaOH 5N
METODO ENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1 NEL FORMAGGIO*
CLEAN-UP:
Passare in IAC un volume noto di filtrato
Lavare la IAC con 5ml di H2O
Eluire con 1000 l + 1000 l di MeOH per HPLC
Portare a secco
Riprendere con 1000 l di AcCN:H2O 25:75 (v/v)
*UNIVERSITÁ CATTOLICA DEL S. CUORE DI PIACENZAA. PIETRI, T. BERTUZZI, P. FORTUNATI, G. PIVA
CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE
Fase mobile AcCN : H2O 25 : 85
Flusso: 1 ml/min
Vinj= 150 l
Colonna C18 150x4.6 mm 5
La colonna termostatata a 40°C 1°C
Spettrofluorimetro: ecc = 360nm em = 435nm
Cromatogramma di un campione di latte ≈ 50ng/L
Cromatogramma di un campione di formaggio ≈ 300ng/Kg
PARAMETRI DEI METODI
Campo di applicazione
Calibrazione e linearità
LATTE 7 - 200 ng/LFORMAGGIO 100 – 2000ng/Kg
LATTE 10 – 160 ng/LFORMAGGIO 70 – 1600 ng/Kg
LATTE 3 ng/LFORMAGGIO 30ng/Kg
Limite di rivelabilità
Limite di quantificazioneLATTE 7 ng/L
FORMAGGIO 100 ng/Kg
Recupero (n=10) AFM1
Criteri di rendimento per la Aflatossina M1
(REG. (CE) N. 401/2006)
Livello di contaminazione (ng/Kg)
Recupero %
10-50 60-120
> 50 70-110
LATTE: 89%
FORMAGGIO: 88%
PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI RIFERIMENTO
Il titolo esatto di tale soluzione è determinato mediante lettura allo spettrofotometro UV
..100
max CCd
MA
ρ= concentrazione delle aflatossine in μg/mlAmax= assorbanza alla lunghezza d’onda di massimo assorbimentoM= peso molecolare dell’aflatossinaε = coefficiente di estinzione molare dell’ aflatossinad= cammino ottico in centimetriC.C. = fattore di correzione
Le soluzioni di riferimento di lavoro si preparano portando a secco sotto flusso di azoto una quantità nota di soluzione di riferimento a
titolo noto e riprendendo con opportuno solvente
PER DILUIZIONE DI UNA SOLUZIONE DI RIFERIMENTOCERTIFICATA PORTANDO A VOLUME NOTO UNA QUANTITÁ NOTA DI POLVERE CON TOLUENE: ACETONITRILE 90:10 PER AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 E CON CLOROFORMIO PER AFM1
INIEZIONI DI 5 LIVELLI DI STD DI
AFLATOSSINA B1, B2, G1, G2
INIEZIONI DI 5 LIVELLI DI STD DI AFLATOSSINA M1
CURVA DI CALIBRAZIONE AFB1
Livello μg/Kg (MAIS)μg/Kg
(PISTACCHI)
1 0.10 0,10
2 1,10 0.80
3 2,10 1.60
4 5,50 4.00
5 6,60 4.80
Numero minimo di
punti dalle norme
ISO: 5
Coefficiente di correlazioner2 = 0,999
Coefficiente di correlazioner2 = 0,999
CURVA DI CALIBRAZIONE M1 LATTE - FORMAGGIO
Livello ng/L (LATTE) ng/Kg(FORMAGGIO)
1 7 70
2 20 170
3 30 340
4 90 900
5 160 1600
MASSIMO FATTORE DI CONVERSIONE
LATTE FORMAGGIO = 9
PROCEDURA DI DECONTAMINAZIONERif. JAOAC Vol.48, 681 (1965)
American Ind.Hyg.Assoc.J., 42, 398 (1981)
IARC Sci.Publ. N. 37 (1980)
La vetreria, il materiale monouso e qualsiasi utensile sia stato acontatto con matrici alimentari possibilmente contaminate o constandard, DEVE essere decontaminato con una soluzione di IPOCLORITOdi SODIO allo 1% PER TUTTA LA NOTTE.
Gocce accidentali sulle mani o parti del corpo devono essere trattatecon la stessa soluzione di ipoclorito di sodio 1% per 10’, successivamentetrattate con una soluzione acquosa di acetone al 5%, infine sciacquatecon abbondante acqua.
I quantitativi di matrici alimentari superiori ai 2 Kg (p.e. slurry),vengono decontaminati nella stessa maniera (2L almeno di soluzioneNaClO 1%);in più per facilitare il successivo smaltimento si aggiunge unaquantità di segatura sufficiente per assorbire il liquido.
CONFERMA DELL’IDENTITÀ DELL’AFLATOSSINA B1
Spettro di assorbimento
della AFB1
Spettro di emissione della AFB1