P R I R UČN I K

Metode imunohemijskog bojenja

3. izdanje

P R I R UČN I K

Metode imunohemijskog bojenja

3. izdanje

UREDNIK mr TOMAS BOENIŠ DAKO korporacija ▪ Karpinterija, Kalifornija, SAD

TEKSTOVE DOPRINELI mr TOMAS BOENIŠ

DAKO korporacija ▪ Karpinterija, Kalifornija, SAD

dr A. J. FARMILO DAKO A/S ▪ Glostrup, Danska

dr RONALD H. STID Biohemijska korporacija Holburn ▪ Boumanvil, Ontario, Kanada

dr MARK KI DAKO korporacija ▪ Karpinterija, Kalifornija, SAD

dr ROZEN VELČER

DAKO korporacija ▪ Karpinterija, Kalifornija, SAD

dr RIČARD HARVI DAKO korporacija ▪ Karpinterija, Kalifornija, SAD

KAREN N. ATVUD, B.S. MT (ASCP) CLS DAKO korporacija ▪ Karpinterija, Kalifornija, SAD

© Zaštićeno autorskim pravom 2001. godine od strane DAKO korporacije,

Karpinterija, Kalifornija. Sva prava zadržana. Preštampavanje i umnožavanje

delimično ili u celini je zabranjeno. 25 USD

P R E D G O V O R

■ Više od jedanaest godina je prošlo od objavljivanja drugog izdanja

Dako priručnika o metodama imunohemijskog bojenja. Od tada sam

dva puta pokušao da se povučem, 1993. godine i, iznova, 2000.

godine, ali, oba puta se ispostavilo da je to lakše reći nego učiniti, tako

da sam nastavio svoj doprinos da dajem kao konsultant. Sa

zadovoljstvom sam prihvatio posao osavremenjavanja poslednjeg

izdanja i uređivanja ovog, trećeg izdanja DAKO priručnika.

Naš prvi priručnik, objavljen 1983. godine pod naslovom Priručnik o

metodama imunoperoksidskog bojenja, pružao je osnovne informacije i

metodologiju neophodnu kako bi imunoperoksidske tehnike postale

sastavni deo laboratorijske rutine. Drugo izdanje se detaljnije bavilo

nekim od osnovnih znanja, ali i prenelo Vam informacije o značajnim

naprecima do kojih je došlo u oblastima imunologije i imunohemije. Da

bismo nastavili ovu tradiciju, pripremili smo ovo treće izdanje.

I ovaj put, pored toga što smo uvrstili korisna osnovna znanja i ukratko

obnovili starije metode, priručnik sadrži i značajnije informacije,

proistekle iz nedavno objavljenih radova i važnih tehničkih poboljšanja.

Imajući to u vidu, nova poglavlja su posvećena oporavku antigena,

automatizaciji bojenja i in situ tehnologiji sredstava za ispitivanje.

Nekolicina poboljšanja, kada su u pitanju procedure bojenja, uključujući

dvostruko bojenje, amplifikaciju signala i tehniku polimer sprezanja,

uvrštena je u postojeća poglavlja. Poglavlje "Otkrivanje grešaka" je

detaljno obrađeno kako bi obuhvatilo, ne samo najnoviju tehnologiju,

već i svakodnevna pitanja i odgovore koje u čestim kontaktima

razmenjuju naši klijenti sa osobljem iz tehničke podrške. Glosar je

proširen kako bi doprineo boljem razumevanju etiologije i značenja

naučne nomenklature.

Nadamo se da će revidirano i osavremenjeno treće izdanje Priručnika

biti isto toliko korisno koliko i prethodna dva. Uživao sam, ne samo

prilikom istraživanja neophodnog za osavremenjavanje ranijih

poglavlja, već i tokom rada sa autorima novih poglavlja. Zahvalan sam

dr M. Nađiju koji je obezbedio fotografije obojenih pločica, koje su

poslužile kao ilustracije u poglavlju "Bojenje pozadine".

Želim da iskoristim ovu priliku i da se zahvalim mojim prijateljima i

kolegama iz DAKO korporacije sa kojima sam učestvovao u rastu naše

firme tokom mnogo godina. Svojom inspiracijom, predlozima i

pozitivnim kritikama, neki od njih su dali svoj vredan doprinos prilikom

rada na trećem izdanju prirupčnika. To su pre svega: Tereza Filips,

Karen Atvud, Uf Lovborg i Grečen Muri. Najiskrenije se zahvaljujem

svima.

Tomas Boeniš, urednik

Februar, 2001. godine

S A D R Ž A J

■ ANTITELA ▪ TOMAS BOENIŠ 8 Imunoglobulini ▪ Poliklonalna antitela ▪ Monoklonalna antitela ▪

Afinitet antitela ▪ Unakrsna reaktivnost antitela ▪ Brzina reakcije

antitela ▪ Stabilnost antitela ▪ Rukovođenje antitelima ▪ Reference

■ OSNOVNA IMUNOHEMIJA ▪ TOMAS BOENIŠ 28 Titar antitela ▪ Razblaživanje antitela ▪ Inkubacija antitela ▪ Reference

■ OSNOVNA ENZIMOLOGIJA ▪ TOMAS BOENIŠ 34 Enzimi ▪ Supstrati i hromogeni ▪ Preporučene procedure za

supstrat-hromogen reagense ▪ Reference

■ FIKSACIJA ▪ A.J. FARMILO I RONALD H. STID,

REVIZIJU URADILA KAREN N. ATVUD 44 Otisci krvi i pripreme za citocentrifugu ▪ Citološki otisci ▪

Kriostat preseci ▪ Parafinski preseci ▪ Fiksacija za

imunoelektronmikroskopiju ▪ Reference ▪ Bibliografija

■ OPORAVAK ANTIGENA ▪ MARK KI 59 Princip i tehnika ▪ Oporavak ciljnog antigena ▪ Citologija ▪

Oporavak ciljnog antigena za in situ hibridizaciju ▪ Oporavak

antigena i njegova upotreba u dvostrukom bojenju ▪ Zaključak ▪

Reference

■ METODE BOJENJA ▪ TOMAS BOENIŠ 66 Direktna metoda ▪ Indirektna metoda u dva koraka ▪ Indirektna metoda

u tri koraka ▪ Tehnike rastvorljivog enzimskog imuno kompleksa ▪

(Strept)Avidin-Biotin tehnike ▪ ABC procedura uz upotrebu katalizovane

amplifikacije signala (CSA) ▪ LSAB tehnologije ▪ Tehnika

lančanog polimer sprezanja ▪ EnVision procedure za simultano bojenje

više markera tkiva ▪ Metode brzog bojenja ▪ Reference

■ KONTROLE ▪ TOMAS BOENIŠ 83 Kontrole reagensa ▪ Status kvo ▪ Reference

■ BOJENJE POZADINE ▪ TOMAS BOENIŠ 88 Hidrofobična interakcija ▪ Jonske i elektrostatičke interakcije ▪

Aktivnosti endogenih enzima ▪ Prirodna i kontaminirajuća

endogena (Strept)Avidin-vezujuća aktivnost (EABA) ▪ Difuzija

antigena ▪ Unakrsna reaktivnost ▪ Fc receptori ▪ Dopunski posredovano

vezivanje ▪ Raznovrsni izvori ▪ Reference

■ AUTOMATIZACIJA U IMUNOHISTOHEMIJI ▪ ROZEN VELČER 102 Metoda kapilarnog prolaza ▪ Metoda tečnog prekrivača ▪

Otvoreni sistem ▪ Reference

■ IN SITU HIBRIDIZACIJA ▪ RIČARD HARVI 106 Uvod ▪ Kompleksnost uzorka ▪ Potrebna osetljivost ▪ Metoda

otkrivanja ▪ Sastav sredstva za ispitivanje ▪ Dužina ispitivanja ▪

Vrste oznaka ▪ Metode označavanja ▪ Zaključak ▪ Reference

■ OBRADA TKIVA ▪ KAREN N. ATVUD 115 Obrada uzorka ▪ Priprema tkivnih preseka ▪ Fiksacija i uklanjanje

voska ▪ Reference

■ OTKRIVANJE GREŠAKA ▪ KAREN N. ATVUD 122 Uzorci tkiva ▪ Puferi ▪ Demaskiranje antigena ▪ Endogena blokiranja ▪

Sistem bojenja ▪ Neadekvatno bojenje ▪ Opšta pozadina ▪

Ograničena pozadina ▪ Neželjeno "specifično" bojenje ▪

Razno

■ GLOSAR 152

■ INDEKS TERMINA 159

8

A N T I T E L A

TOMAS BOENIŠ

■ Antitelo je osnovni reagens, ono što sve imunohistohemijske* tehnike

imaju zajedničko. Raspoloživost antiseruma, imunoglobulinskih frakcija

i monoklonalnih antitela, uz konstantno rastući broj klinički korisnih

tkivnih antigena, u ogromnoj meri je povećala kvantitet i kvalitet

imunohistologijskog repertoara. Kako bi se bolje razumeo potencijal

metode imunohistohemijskog bojenja, kao i skriveni problemi u vezi sa

pomenutim, neophodno je posedovati osnovno znanje o antitelima i

njihovim potencijalima, kao i limitacijama.

IMUNOGLOBULINI ■ Antitela pripadaju grupi proteina koji se zovu imunoglobulini (Ig).

Navedeni po redosledu opadanja kvantiteta pronađenog u plazmi ili

serumu, imunoglobulini se svrstavaju u pet osnovnih klasa:

imunoglobulin G (IgG), IgA, IgM, IgD i IgE. Svaki imunoglobulin se

sastoji iz dva identična teška lanca (H) i dva identična laka lanca (L).

Lanci H se razlikuju po antigenskim i strukturalnim osobenostima i

određuju klasu i potklase molekula. Dva lanca L mogu biti tipa kappa ili

tip lambda. Distribucija kappa i lambda lanaca razlikuje se u svim Ig

klasama i potklasama, kao i među različitim vrstama. Kovalentni

međulančani disulfid mostovi spajaju lanac L i lanac H, kao i lanac H i

lanac H. Učestvovanjem u tercijarnoj strukturi, imunoglobulinskom

molekulu daju veću stabilnost.

Od pet klasa imunoglubulina ovde ćemo se detaljno baviti klasama IgG

i IgM, budući da su to ubedljivo najčešće upotrebljivana antitela u

imunohistohemiji. Ukoliko nije drugačije naznačeno, većina onoga

opisanog u ovom tekstu, u vezi sa strukturom IgG, potiče iz ispitivanja

ljudskog IgG potklase IgG1.

9

■ IgG Uobičajena formula IgG je gamma2 kappa2 ili gamma2 lambda2

što znači da se jedan molekul IgG (molekularne težine (MW) = 150 kD)

sastoji iz dva teška gamma lanca, i dva laka lanca koji mogu bili tipa

kappa ili lambda (Slika 1). Struktura IgG molekula određuje se

delimično proteolitičkim varenjima i reduktivnim odvajanjem molekula

(Slika 2). Varenjem papainom dovodi do rascepa osetljive veze na

strani terminala N međulančanih disulfid mostova koji spajaju teške

lance. Ovo proizvodi dva jednovalentna fragmenta za vezivanje

antigena (Fab) i jedan kristalinski fragment (Fc). Pepsin razdvaja

gamma lance na strani terminala C međulančanih disulfid mostova koji

spajaju teške lance, što proizvodi jedan bivalentan fragment za

vezivanje antigena, F(ab¹)2. U ovom slučaju Fc fragmenti se

uništavaju. Reduktivno odvajanje IgG molekula razdvaja međulančane

disulfid mostove i, ukoliko su slobodne sulfhidril grupe blokirane, dolazi

do formiranja dva lanca H (molekularne težine od po 50 kD) i dva lanca

L (od po 25 kD).

Slika 1: Na slici je prikazana struktura imunoglobulinskog molekula.

Sadrži dva identična teška lanca (H) i dva identična laka

lanca (L). Međulančani disulfid mostovi doprinose strukturi i

stabilnosti molekula.

10

Slika 2: Na slici je prikazana struktura IgG zeca (koji postoji kao

jedina osnovna potklasa). Proteolitičko varenje papainom

proizvodi dva fragmenta za vezivanje antigena (Fab) i jedan

kristalinski fragment (Fc), dok varenje pepsinom proizvodi

jedan F(ab¹)2 fragment.

* Treba naznačiti da termin "imunohistohemija", upotrebljen u ovom

poglavlju, označava i obuhvata i termin "imunocitohemija".

IgG molekul se može dalje podeliti na tzv. domene; naime, promenljive

domene (V) i nepromenljive domene (C). Svaki domen sadrži 110 do

120 amino kiselina i jednu međulančanu disulfid vezu. Na promenljivom

domenu lakog lanca (VL), i na promenljivom domenu teškog lanca (VH)

nalaze se amino terminali imunoglobulinskog molekula. VL i VH

zajedno formiraju mesto za kombinovanje antigena. Nekoliko

hiperaktivnih (HV) područja nalazi se unutar VL i VH domena antitela.

Tokom njihove reakcije sa antigenima, HV područja se dovode u blizinu

antigenske determinante (epitopa). Rastojanje između antigena i HV

područja antitela iznosi približno 0,2 do 0,3 nm. U ovom području se

nalaze jedinstvene strukturalne osobenosti zvane idiotipske

determinante. Svaki klon antitela predstavlja sopstveni idiotip. Svaki

lanac L, uz VL domen, poseduje i jedan nepromenljiv domen (CL).

Lanac H takođe poseduje tri nepromenljiva domena (CH1, CH2 i CH3) i

ZGLOBNO PODRUČJE

11

nosi deo karboksil terminala imunoglobulina. Na CH2 domenu se nalazi

polovina ugljen hidrata IgG molekula i mnoge izrazito hidrofobične

neutralne aromatične amino kiseline. Zglobna područja se nalaze

između CH1 i CH2 domena lanaca H. Neznatne razlike unutar ovih

zglobnih područja doprinose osobenosti potklase imunoglobulina G.

Pomenute potklase su označene znacima IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 i

IgG4. Dok je u ljudskom IgG globalna razmera kappa prema lambda

jednaka odnosu 2:1, u potklasama IgG2 i IgG4 razmere su, na primer,

1:1, odnosno 8:1. Miševi poseduju približno 95% kappa lanaca i prema

tome najveći broj monoklonalnih IgG antitela ove vrste ima kappa

lance. Broj disulfid mostova koji povezuju teške lance se takođe

razlikuje u zavisnoti od IgG potklase. IgG1 i IgG4 poseduju po dva, dok

IgG2 i IgG3 imaju četiri, odnosno pet. Zbog fleksibilnosti zglobnog

područja, ugao koji oba Fab fragmenta formiraju može se menjati radi

prilagođavanja promenljivim rastojanjima između identičnih antigenskih

determinanti.

■ IgM IgM je pentamer (MW približno 900 kD) koji se sastoji iz pet

podjedinica od po približno 180 kD (Slika 3). Uobičajena formula se

može prikazati kao (mu2 kappa2)5 ili (mu2 lambda2)5. Svaka

podjedinaca je povezana peptidom bogatim sulfhidrilom, lancem J (15

kD), i sastoji se iz dva teška lanca (mu) i dva laka lanca tipa kappa ili

lambda. Lanac J doprinosi integritetu i stabilnosti pentamera. Kao što je

to slučaj kod IgG, podjedinice IgM mogu se rastaviti enzimatskim i

reduktivnim razdvajanjem na F(ab¹)2, Fab i Fc fragmente, kako teški,

tako i laki lanci. Fc fragment IgM je ciklični pentamer (molekularna

težina od približno 340 kD). Tretiranje pentameričnog IgM sa 0,1%

merkaptoetanola razdvaja disulfid mostove između podjedinica radi

kreiranja pet monomera. Potklase IgM1 i IgM2 su zabeležene.

12

Slika 3: Slika prikazuje (A) pet podjedinica miševog IgM povezanih

disulfid mostovima i lancem J radi formiranja pentamerične

kružne strukture. Svaka podjedinica (B) sastoji se iz dva

teška (mu) lanca (H) i dva laka lanca (L) koji se pojedinačno

sastoje iz nepromenljivih (C) i promenljivih (V) domena.

Dok IgG predstavlja antitelo koje je u najvećem izobilju kada je u

pitanju hiperimunizovan domaćin, kod sveže imunizovane životinje IgM

je prvo humoralno antitelo koje se može detektovati. Osnovna

formacija antitela razvija se u nekoliko glavnih faza. Ubrizgani

imunogen prvo uspostavlja ravnotežu između ekstra- i intravaskularnog

prostora, zatim je podvrgnut katabolizmu posle kojeg je rasparčan u

manje fragmente, i konačno je eliminisan iz intravaskularnog prostora

od strane novoformiranih antitela. Period od unošenja imunogene

jedinice do prve pojave humoralnih antitela IgM naziva se latentnim

13

periodom i može trajati približno nedelju dana. Nakon dve nedelje, ili u

vidu reakcije na drugo ubrizgavanje, IgG klasa antitela uglavnom

preovlađuje. Kao svi proteini, antitela su podložna katabolizmu. Dok

antitela klase IgM imaju relativno kratak polu-život od samo četiri do

šest dana, antitela IgG opstaju približno tri nedelje. Sem ukoliko nije

došlo do ponovnog unošenja imunogena, nivo antitela u serumu će

opasti nakon ovog perioda.

Formacija antitela na molekularnom nivou prdstavlja kompleksan

proces i detaljno objašnjenje ovog procesa ne spada u obim ovog

priručnika. Zainteresovani čitaoci mogu pogledati Atasijev udžbenik

Molekularna imunologija.

POLIKLONALNA ANTITELA ■ Poliklonalna antitela proizvode različite ćelije, i kao posledica toga,

ona su imunohemijski različita; reaguju različitim epitopima na antigen

protiv kojeg se uzgajaju (Slika 4). Ubedljivo najčešće korišćena

životinja za proizvodnju poliklonalnih antitela je zec, zatim koza, svinja,

ovca, konj, zamorac i druge. Popularnost zečeva, kada je u pitanju

proizvodnja poliklonalnih antitela, pripisuje se pre svega lakoći njihovog

održavanja. Osim toga, dodatna prednost njihove upotrebe je to što su

ljudska antitela za zečije proteine mnogo ređa nego za proteine

preživara, kao što je koza. Uz to, zečija antitela talože ljudske proteine

u okviru šireg opsega viška antigena ili antitela, i manje su šanse da će

zalihe antitela dobijenih od većeg broja zečeva biti međusobno različite

nego što su to kada je u pitanju nekoliko većih životinja. Višegodišnje

selektivno uzgajanje za povoljnu reakciju na imunizaciju doprinelo je

tome da Novozelandski beli zec postane najčešće upotrebljivana

životinja za proizvodnju poliklonalnih antitela.²

14

Slika 4: Šematski dijagram poliklonalnih antitela koja se vezuju za

različite epitope na antigenu.

U zavisnosti od imunogeniteta antigena, doze od po 10 µg do 200 µg

se tradicionalno daju radi izazivanja imuno reakcije kod životinja.

Antigen se najčešće ubrizgava intradermalno ili supkutano, ali se

primenjuju i ubrizgavanja u mišić stopala ili trbušnu duplju. Kod zečeva,

količine od 0,1-0,5 mL se obično daju intradermalno i distribuiraju preko

nekoliko područja; antigen je dat u jednakoj količini kao i pomoćno

sredstvo, kao što je Kompletno ili nekompletno Frondovo pomoćno

sredstvo. Revakcinacije, koje se ponavljaju svakog meseca ili kada se

primeti opadanje titara, imaju za cilj održavanje ili povećavanje nivoa

antitela. Krv se najčešće uzima iz uveta (zečijeg), vratne žile (većih

životinja) ili iz srca, ponekad žrtvujući životinju. Nakon uklanjanja ćelija

iz krvi, poliklonalna antitela se mogu dobiti ili u obliku stabilnih

antiseruma ili kao imunoglobulinske frakcije purifikovane u različitim

stepenima. Taloženje solima, koje sledi hromatografija jonske

razmene, služi kako bi se otklonio najveći deo ostalih serumskih

proteina. Hromatografija afiniteta se može koristiti za izolovanje

specifičnih antigenskih antitela i time oslobađanje pomenutih od

antitela koja su unakrsno-reaktivna sa drugim vrstama.

15

MONOKLONALNA ANTITELA ■ Monoklonalna antitela su proizvod individualnog klona plazma ćelija.

Antitela datog klona su imunohemijski identična i reaguju specifičnim

epitopom na antigen protiv kojeg se uzgajaju (Slika 5). Verovatno iz

ekonomskih razloga, miševi se danas skoro isključivo upotrebljavaju pri

proizvodnji monoklonalnih antitela. Nakon što je postignuta imuno

reakcija, B limfociti iz slezine ili limfnih čvorova se uzimaju, pod

specifičnim uslovima, i spajaju sa nesekretornim ćelijama mišijeg

mijeloma. Dok B limfociti prenose spcifično antitelo, mijelom ćelije

pružaju hibridnim ćelijama (hibridom) dugovečnost unutar medijuma

kulture. Nereaktivne B ćelije i mijelom ćelije se odstranjuju i hibridom

ćelija, koja proizvodi antitela, se izvlači i testira se reaktivnost.

Razmnožavanje se može sprovesti unutar kulture ili transplantacijom

hibridoma u trbušnu duplju singeneičkih miševa, odakle se antitela

postavljaju u ascites tečnost. Prema tome, mogu se proizvoditi velike, i

bar teorijski neiscrpne, količine monoklonalnih antitela specifičnih

karakteristika.

Slika 5: Klon monoklonalnih antitela reaguje specifičnim epitopom na

antigen.

16

U imunohistohemiji postoje određene prednosti koje monoklonalna

antitela imaju u odnosu na svoje poliklonalne duplikate; neke od ovih

prednosti su visoka homogenost, odsustvo nespecifičnih antitela,

lakoća karakterizacije i odsustvo nepodudaranja među zalihama. Ipak,

treba navesti neke od zamki na koje možemo naići pri upotrebi

monoklonalnih antitela.

Metode testiranja pri odabiru korisnih klonova i pri kontroli kavaliteta

moraju biti identični metodama upotrebe. Previše često, monoklonalna

antitela su okarakterisana upotrebom zamrznutih tkiva kada su

namenjena za upotrebu na formalinski fiksiranim uzorcima. U ovom

slučaju, ciljni epitop mora da preživi fiksaciju. U nekim slučajevima

antigeni su opstali nakon formalinske fiksacije upotrebom poliklonalnih

antitela, ali specifičan epitop, između kojeg i monoklonalnog antitela

dolazi do interakcije, nije opstao.

Slično tome, reaktivnost epitopa posle optimalne fiksacije ne garantuje

njegov opstanak pod uslovima fiksacije koji nisu optimalni. Budući da

se neprekidno objavljuju nove i poboljšane procedure za oporavak

antigena, važno je da se pri svakoj potrazi za novim monoklonalnim

antitelima uzme u obzir ovaj dodatni faktor (pogledajte poglavlje

"Oporavak antigena").

Ciljni epitop takođe mora biti jedinstven u pogledu antigena.

Specifičnost, jedna od najvećih prednosti monoklonalnih antitela, gubi

se ukoliko je antitelo usmereno ka epitopu koji dele dva ili više različitih

antigena (pogledaje "Unakrsna reaktivnost antitela"). Za razliku od

unakrsne reaktivnosti poliklonalnog antitela koja se može odstraniti

apsorpcijom, to nije slučaj sa monoklonalnim antitelom.

17

Primenom metode provere treba uzeti u obzir i to da optimalan učinak

monoklonalnih antitela, u odnosu na poliklonalna antitela, više zavisi

od okolišnih faktora kao što su pH i rastvor.³

AFINITET ANTITELA ■ Antitela hiperimunizovanih životinja se ne razlikuju samo kada su u

pitanju determinante koje prepoznaju na multivalentnim antigenima,

već i u pogledu njihovog afiniteta ka istim. Termin afinitet obuhvata i

"suštinske" i "funkcionalne" afinitete.4

Suštinski afinitet antitela se nalazi u HV predelu i određuje ga isti niz

amino kiselina koji određuje specifičnost. Međutim, verovatno bi bilo

previše uprošteno kada bismo rekli da što je veća specifičnost, to je jači

afinitet. Jonske interakcije, vodonično jedinjenje i van-der-Valsove sile

predstavljaju osnovne saradnike suštinskog afiniteta između paratopa

na antitelu i epitopa na antigenu. Izgleda da hidrofobičnost ima

stabilizirajući efekat na formirani imuni kompleks i može prouzrokovati

taloženje. Do kovalentog vezivanja antitela i antigena ne dolazi.

Konstanta asocijacije (Ka) vezivanja antitela i njegove antigenske

determinante predstavlja meru afiniteta antitela. Radijus dejstva može

biti od 103 do 1010 litara po molu, što je recipročna vrednost

koncentracije u molovima po litru. Što je veći afinitet antitela, to je niži

stepen koncentracije slobognog antigena potrebnog za raspoloživa

mesta za vezivanje antitela kako bi postao zasićen (dostigao

ravnotežu). Kao što se kvantitet (titar) antitela povećava vremenom

tokom imunizacije, isti je slučaj i sa kvalitetom (afinitetom). Ovo je

nazvano "maturacija afiniteta".5 Manje doze imunogena povećavaju

brzinu sazrevanja afiniteta, ali prouzrukuju niže titare antitela, i obrnuto.

U imunohistohemiji, funkcionalni afinitet antitela ili antiseruma se može

veoma slobodno definisati vremenom potrebnim za postizanje

ravnoteže sa tkivnim antigenom. Ukoliko su jednaki delovi uzoraka dva

18

antitela ili antiserumi identičnih titara pod inkubacijom, u vremenskim

periodima koji su u porastu, sa antigenom na tkivu, antitelo koje prvo

dostigne nivo maksimalnog intenziteta bojenja, poseduje veći

funkcionalni afinitet. Termin "lakomost" je korišćen kao sinonim za

funkcionalni afinitet,5 ali je takođe korišćen za označavanje snage

vezivanja antitela i antigena.6 Termin lakomost je takođe često korišćen

za označavanje zbira svih suštinskih afiniteta otkrivenih u populaciji

poliklonalnih antitela.

Budući da su antigen-antitelo reakcije reverzibilne, jednostavni imuno

kompleksi formirani na tkivu se mogu odvojiti tokom programa pranja

koji se primenjuju u imunohistohemiji. Lakoća i stepen odvajanja se

razlikuju od antitela do antitela, i niske koncentracije soli, kao i niske

temperature, smanjiće verovatnoću slabog bojenja zbog odvajanja već

formiranog imuno kompleksa. Prema tome, antitela visokog afiniteta su

poželjna i njihova je prednost u tome što su manje šanse, u odnosu na

antitela niskog afiniteta, da tokom pranja dođe do odvajanja. Kao što je

ranije pomenuto, poliklonalna populacija antitela sadrži, manje više,

neprekidan spektar niskih i visokoh afiniteta spram nekoliko epitopa na

datom antigenu. Stoga, nakon inkubacije sa primarnim antitelima ovog

tipa, slabe su šanse da prekomerno pranje prouzrokuje primetan

gubitak bojenja.

Sa druge strane, monoklonalna antitela imaju jednolik afinitet i, ako je

afinitet nizak, gubitak bojenja je verovatan zbog odvajanja antitela od

svog epitopa. Prema tome, treba odabrati, ukoliko je moguće,

monoklonalna antitela visokog afiniteta. Kao što je naznačeno, treba

izbegavati faktore koji oslabljuju antigen-antitelo vezu, kao što su

visoke koncentracije soli, visoke temperature i veoma niska pH, tokom

pranja uzoraka. Iskustvo u radu sa antitelima u imunohistohemiji

pokazalo je da se pranje i inkubacija u pufer kupkama može bezbedno

umanjiti, i da nežna agitacija pomaže smanjenju pozadinskog bojenja.7

19

Afinitet antitela je takođe u vezi sa njihovom sposobnošću da formiraju

nerastvorljive imuno komplekse. Obično je slučaj da je veća tendencija

ka formiranju taloga što je viši afinitet antitela. Taloženje se nastavlja

kroz ubrzanu fazu u kojoj se formiraju rastvorljivi antigen-antitelo

kompleksi, koju sledi sporije skupljanje i, na kraju, taloženje. Antitela

koja se ne talože uglavnom imaju niži afinitet i nisu u stanju da

formiraju mrežu neophodnu za taloženje.

Monoklonalna antitela, nezavisno od toga da li su visokog ili niskog

afiniteta, ne mogu da formiraju mrežu sa antigenom, i , prema tome,

izuzetno retko formiraju nerastvorljive taloge. Međutim, u

imunohistohemiji, sposobnost primarnog antitela za formiranje imunih

kompleksa sposobnih za taloženje je od malog značaja budući da

reakcija sa antigenom imobilisanog tkiva iziskuje hvatanje antitela za

tkivo pre nego taloženje.

Prozon je svojstvo koje je prvo primećeno kada su u pitanju aglutinacije

izazvane antitelima. Primećeno je da neki antiserumi, kada su

nedovoljno razblaženi, ne uspevaju da aglutiniraju ćelije, iako to

uspevaju kada su više razblaženi. Dok se prozon može naći i u

precipitin reakcijama, u imunohistohemiji je to retka pojava.

UNAKRSNA REAKTIVNOST ANTITELA ■ Termin "unakrsna reaktivnost" označava imunohemijsku aktivnost do

koje može doći ili između antitela i dva ili više antigena, ili obratno,

kada antigen reaguje sa nekoliko različitih antitela. Tipični primeri su

kada dođe do interakcije antitela anti-L (ili –K) lanca i svih pet klasa Ig,

ili kada karcinoembrionski antigen (CEA) reaguje sa antitelima protiv

CEA, antigenima krvne grupe, odnosno normalnim tkivnim proteinima.

Zajednički činilac u oba slučaja je zajednička upotreba bar jednog

zajedničkog epitopa od strane nekoliko antigena.

20

Još jedna dobra upotreba termina unakrsna reaktivnost označava

eksperimentalno ili slučajno izazvane promene unutar jednog ili više

epitopa, kroz oporavak antigena,8 što dovodi do mogućeg gubitka

specifičnosti datim monoklonalnim antitelom ovog antigena. Termin

unakrsna reaktivnost opisuje i interakciju antitela sa sličnim ili različitim

epitopima ili nevezanim antigenima. Ovaj drugi fenomen je međutim

često svojstvo antitela niskog afiniteta, i obično je predmet promene

zbog sazrevanja afiniteta tokom imunizacije.

Unakrsna reaktivnost antitela, kada su u pitanju ljudski antigeni, sa

identičnim ili sličnim antigenima drugih vrsta ("Unakrsna reaktivnost

unakrsnih vrsta") može biti zanimljiva za istraživače i veterinare zbog

oskudnosti specifično-životinjskih antitela. Kako bi se ovo prevazišlo,

dva rada su objavila rezultate studija reaktivnosti unakrsnih vrsta

upotrebam komercijalno dostupnih antiljudskih poliklonalnih i

monoklonalnih antitela.9,10 Pokazano je da je većina odabranih

životinjskih antitela pokazala jaku reaktivnost sa antiljudskim antitelima.

Međutim, za preciznije tehničke detalje o oputrebi primarnih antitela

datog miša na životinjskim tkivima, čitača upućujemo na DAKO ARK

proizvode (oprema za istraživanje na životinjama).

Terminologija unakrse reaktivnosti se, međutim, gubi pri opisu bilo

kakvog posmatranog bojenja istim antitelom drugačijih ćelija ili tkivnih

komponenti, nezavisno od toga da li sadrže zajedničke antigene, pošto

bi to iskrivilo strogu imunohemijsku definiciju termina.

BRZINA REAKCIJE ANTITELA ■ Veličina i oblik molekula antitela i njegove sprege ili kompleksi su

uglavnom od neznatnog značaja u imunohistohemiji. Nedovoljna tkivna

penetracija, čak pri bojenju intranuklearnih ili citoplazmičnih antigena,

nikada nije viđena, nezavisno od toga da li su upotrebljena primarna

21

antitela klase IgM (9:0 kD), veliki kompleksi kao što su PAP (400-430

kD) ili APAAP (približno 560 kD) ili reagensi povezani dekstranom.

Međutim, razumno je pretpostaviti da ukupna preterana fiksacija tkiva

može otežati penetraciju za antitela i njihove komplekse.

Iako u savršenim uslovima antitela veoma brzo reaguju sa svojim

ligandima (antigenima), u imunohistohemiji uslovi su retko savršeni. U

zavisnosti od tkivne fiksacije, koncentracije antitela, temperature

okoline i drugih činilaca, vreme inkubacije primarnog antitela

neophodno za maksimalnu reaktivnost može dostići 48 sati. Prema

tome, ne čudi činjenica da je, budući da se imunohistohemijske

preocedure sve češće koriste u hirurškoj patologiji, ukazano na potrebu

za kraće vreme obrade. Veoma kratki periodi inkubacije su izvodljivi

zahvaljujući relativno brzim reakcijama do kojih dolazi kada su u

upotrebi veće koncentracije primarnih i veznih antitela visokog afiniteta.

Retko se postiže ravnoteža između vezanog antigena i slobodnog

antitela. Sa ovim ciljem, primenjuje se veoma dugo vreme inkubacije sa

pripremama manje koncentracije antitela. Ne zna se da li bi kraće

inkubacije sa pripremama veće koncentracije antitela brže dostigle

ravnotežu, zato što, po pravilu, u ovakvim okolnostima može doći do

nespecifičnog bojenja pozadine što bi sprečilo nedvosmislene

interpretacije. Elementi pod inkubacijom primarnog antitela su

eksperimentalno spašeni, posle njihove prve upotrebe, aspiracijom iz

jednog dela, i premešteni su u dodatne delove.7 Kada su u pitanju

neka antitela, do sedam identičnih uzoraka tkiva može biti bojeno

jednakim kvalitetom kada je primarno antitelo upotrebljeno u

koncentracijama potrebnim za rutinske inkubacije od 10 minuta. Ovo

ukazuje na to da je samo veoma mali deo raspoloživog antitela u

stvarnosti upotrebljen tokom ovog, relativno kratkog, vremena trajanja

inkubacije. Podrazumeva se da se odabrano vreme inkubacije mora

ujednačeno održavati ili se bojenje neće moći dosledno reprodukovati.

22

STABILNOST ANTITELA ■ Poliklonalna antitela, sačuvana u nezamrznutom stanju i zatim

korišćena u imunohistohemiji, kao imunoglubilnska frakcija biće donkle

manje stabilna u poređenju sa celim antiserumom.7 Međutim, otkriveno

je da pomenuta umanjena stabilnost zavisi velikim delom od metode

purifikacije i čuvanja, kao i od metode primene. Izloženost antitela

ekstremnim pH, kao i visokim ili izuzetno niskim koncentracijama soli

tokom purifikacije ima tendenciju da umanji njihovu stabilnost više nego

izloženost blagim uslovima kao što je hromatografija jonske razmene.

Najčešće primećene promene su formiranje rastvorljivih agregata i,

zatim, nataloženih polimera. Ove promene su verovatno rezultat

hidrofobičnih interakcija IgG molekula u rastvoru. Iako prisustvo

rastvorljivih agregata može da pojača njihov učinak, zato što su u

pitanju antitela koja se talože, pokazalo se da njihova povećana

hidrofobičnost izaziva povećana nespecifična vezivanja (vidite poglavlje

"Bojenje pozadine") u imunohistohemiji.7 Odstranjivanje ovih agregata i

polimera iz IgG frakcija je, prema tome, važno izvršiti pre

imunohistohemijskih primena.

Kao što čuvanje prečišćenih antitela može da poveća njihovu

hidrofobičnost zbog skupljanja i polimerizacije, isto može učiniti i

njihovo sprezanje sa drugim molekulima.11 Sprezanje sa

glutaraldehidom obuhvata epsilonamino grupe lizina i alfa-amino grupe

N-terminala amino kiselina što dovodi do njihovog unakrsnog

vezivanja. Zato što unutar IgG molekula postoje mnoga glutaraldehid-

reaktivna područja, hidrofobičnost spregnutih antitela se može znatno

povećati, prouzrokujući povećanu atrakciju ka hidrofobičnim područjima

unutar fiksnog tkiva i povećanu pozadinu.

■ Takođe se pokazalo da na učinak monoklonalnih antitela utiču i

metode purifikacije i čuvanja; u 42% monoklonalnih antitela, ispitanih

od strane Andervuda i Bina, došlo je do promena u specifičnosti,

23

afinitetu i unakrsnoj reaktivnosti.12 Antitela klase IgM i potklse IgG2b

bila su posebno osetljiva.

■ Prema tome, posebno je interesantna Baltonova studija.13 Nisu

primećene značajne razlike, kada su u pitanju imunohistohemijska

specifičnost, osetljivost ili obrasci bojenja, između 65 poliklonalnih i

monoklonalnih antitela, od kojih neka jesu, a neka nisu, premašila rok

trajanja preporučen od strane proizvođača. Autori su preporučili reviziju

direktiva za utvrđivanje rokova trajanja, budući da su zabeležene

mogućnost trajanja do jedanaest godina.

Međutim, mora se uzeti u obzir da neposredno testiranje proteinskih

reagenasa nije izvodljivo. Dok se u farmaciji uobičava,14,15

degradacijsko ubrzano testiranje na visokim temperaturama može biti

irelevantno ili čak varljivo kada se primenjuje na imunohemikalije kao

što su antiserumi ili antitela.16,17

■ Međutim, u Americi postoje regulativne direktive. Kada je u pitanju

klinička laboratorija, ovo je pod mandatom Dekreta o poboljšanju

kliničkih laboratorija, iz 1988. godine, i Fakulteta američkih patologa.

Jedini mogući korolar ovih uslova je odobravanje laboratorijama da

dokumentuju aktivnost proizvoda dok ona postoji. U vidu alternative,

laboratorija može uzeti deo uzorka i zamrznuti nerazblaženo antitelo na

-20°C radi kasnije upotrebe. Tom prilikom laboratorija mora da potvrdi

aktivnost pre upotrebe antitela za bilo kakvo testiranje.

Stabilnost antitela u komercijalno proizvedenim reagensima određuje

se realnim vremenskim i temeperaturnim testiranjem od strane svakog

proizvođača. Većina proizvođača pokazuje stabilnost za određeni

vremenski period. Iako mnoga antitela mogu nastaviti sa delovanjem i

tokom dužeg vremenskog perioda, jedini regulativni uslov koji

proizvođač mora da ispuni je da potvrdi vremenski period testiranja

24

antitela. Ne postoji zahtev da se testiranje nastavi sve dok antitelo ne

prestane da deluje.

Osim toga, iskustvo autora je pokazalo da uslovi čuvanja reagenasa u

laboratoriji korisnika često nisu identični uslovima koji preovlađuju

tokom ispitivanja roka trajanja. Zbog mogućnosti nepovoljnih usova za

čuvanje nakon kupovine proizvoda, proizvođač može da prihvati samo

delimičnu odgovornost, umesto da predvidi realan trenutak prestanka

delovanja reagensa.

MANIPULACIJA ANTITELIMA

■ Kako bi se postiglo optimalno delovanje reagenasa upotrebljivanih u

imunohistohemiji, obavezno je pridržavati se određenih osnovnih

pravila pri manipulisanju i čuvanju. Ukoliko se pravilno održavaju,

većina reagenasa će ostati stabilna mesecima, čak i godinama. Uvek

se treba pridržavati uputstava proizvođača datih na specifikacijama i

etiketama na bočicama.

■ PRIMANJE Iako se za mnoge komercijalno proizvedene

imunohemikalije garantuje stabilnost od nekoliko godina, unapred

razblažena antitela traju kraće (pogledajte "Stabilnost antitela"). Po

primanju, imunohemikalije bi trebalo brzo skloniti u skladu sa

preporukama proizvođača. Zavedite reagense unošenjem

proizvođačeve šifre, roka trajanja, datuma primanja i broja fakture. Ovo

su korisne informacije za korisnika, pogotovo u eventualnom slučaju

kasnije reklamacije.

■ ČUVANJE Verovatno dva najvažnija detalja, kada je u pitanju

čuvanje antitela, jesu posuda za čuvanje i temperatura.

POSUDE ZA ČUVANJE Optimalno, željeni materijali posuda za

čuvanje proteinskih rastvora bi trebalo da poseduju neznatnu

25

proteinsku adsorpciju. Preporučuju se polipropilensko, polikarbonatsko

ili borosilikatsko staklo, i u širokoj su upotrebi. Rastvorima koji sadrže

veoma nisku koncentraciju proteina (npr. Ispod 10-100µg/ml) trebalo bi

dodati dodatnu količinu proteina. Obično se koristi bovin albumin od

0,1% do 1,0% kako bi se umanjio gubitak polimerizacijom i adsorpcijom

na posudu. Preferiraju se posude napravljene od providnih i bezbojnih

materijala pošto omogućavaju provere stanja sadržine. Etikete na

posudama bi takođe trebalo da omoguće proveru stanja.

TEMPERATURA ČUVANJA Kada je u pitanju temperatura,

pridržavanje uputstava proizvođača je verovatno važnije od bilo kog

drugog faktora. Kontrolišite frižidere i zamrzivače korišćene za čuvanje

imunohemikalija kako bi se održale tačne i konzistentne temperature.

Vredne i velike količine imunohemijski reagenasa čuvajte služeći se

opremom koja ima temperaturni alarm i sisteme dodatnog napajanja.

Većinu unapred razblaženih (spremnih za upotrebu) antitela, njihove

sprege i rastvore monoklonoalnih antitela čuvajte na temperaturi od 2-

8°C, zato što zamrzavanje i odmrzavanje može štetno da utiče na

njihovo delovanje. Ovo se odnosi i na celokupne komplete u kojima se

nalaze unapred razblaženi reagensi, kao i monoklonalna antitela.

Koncentrisane proteinske rastvore, kao što su antiserumi i

imunoglobulinske frakcije, čuvajte zamrznute u alikvotima na

temperaturi ispod -20°C kako bi se sprečilo ponavljanje ciklusa

zamrzavanja i odmrzavanja. Polako dižite temperaturu proteinskih

rastvora do sobne, i izbegavajte temperature od preko 25°C.

■ UPOTREBA I ODRŽAVANJE Pravilno održavanje reagenasa može

umanjiti probleme koji potiču iz kontaminacije, toplote ili preteranog

izlaganja svetlosti. Kontaminacija reagenasa se može izbeći upotrebom

vrhova čiste pipete. Brzo vraćanje reagenasa u uslove pravilnog

čuvanja će produžiti njihov vek.

26

Izgled imunohemijskih reagenasa, posebno nerazblaženih antiseruma,

nije uvek indikator njihovog delovanja. Iako se beta-lipoproteini odlikuju

izuzetno jakom hidrofobičnošću, nije sistematično proučavano da li

lipemia ili lipoliza ometaju imunohistohemijsko bojenje. Tamo gde je

očigledno prisustvo lipemie u antiserumu i gde se smatra uzrokom

ometanja uspešnog bojenja, preporučuje se odstranjivanje lipida

upotrebom dekstran sulfata i kalcijuma,18 ili izvlačenjem organskim

rastvaračem. Alternativno, dodavanje 2g Aerosila (Degusa, Njujork)

antiserumu od 100 mL, praćeno inkubacijom u trajanju od 4 sata na

37°C, pokazalo se korisnim.

Blaga do umerene hemolize u serumu (plazmi) izazvana neoptimalnim

tehnikama krvarenja, verovatno ne utiče na većinu imunohistohemijskih

procedura bojenja, ali, izbegavajte preteranu hemolizu. Ukoliko se

primeti preterana hemoliza ili lipemia, može se desiti da je neophodna

izolacija imunoglobulinske frakcije iz antiseruma ili normalnog seruma.

Izolovani segmenti ovog tipa obično će delovati bezbojeno i providno.

Odbacite sve imunohemikalije, uključujući i antiserum i normalan

neimuni serum kontaminiran rastom bakterija. Njihova upotreba u

imunohistohemijskim procedurama, verovatno će prouzrokovati pojavu

novih elemenata i nespecifično bojenje..

Upoznatost sa prirodom antitela, njihovim mogućnostima i limitacijama,

omogući će korisniku da se bolje služi ovim reagensima i da efikasnije

rešava probleme, ako na njih naiđe. Sledeća poglavlja će dalje

doprineti razumevanju antitela: pružiće, takođe, detaljne informacije o

pomoćnim reagensima i procedurama korišćenim u imunohistohemiji.

27

REFERENCE 1. Atassi MZ et al. Molecular Immunology. Marcel Decker. Inc. New

York, 1984. 2. Harboe NMG and Inglid A. Scand J Immunol 1983; 17:345-351. 3. Boenisch T. Appl. Immunohistochem 1999; 7(4)300-306. 4. Hornick CL and Karush F. Immunochemistry 1979; 9:325-340. 5. Steward MW and Steensgaard J. Antibody Affinity: Thermodynamic

Aspects and Biological Significance. Boca Raton: CRC Press, 1983. 6. Herschowitz HID Immunophysiology: Cell function and cellular

interactions in antibody formation. In Bellanti JA. Immunology III. Philadelphia: Saunders. 1985.

7. Boenisch T. Appl Immunohistochem 2001; 9(2):176-179. 8. Alexander J and Dayal Y. Appl Immunohistochem 1997; 5(4):252-

253. 9. Smith RA. J Histotech 1990; 13(4):255-269. 10. Martin CA and Badran AF. Appl Immunohistochem 1998; 6(2):84-

88. 11. Sternberger LA. Immunocytochemistry (2nd ed.). New York: Wiley

1999. 12. Underwood PA and Bean PA. J Immunol Meth 1985; 80:189-197. 13. Balaton AJ et al. Appl Immunohistochem 1999; 7(3):221-225. 14. Kirkwood TBL et al. Biometrics 1977; 3:38-48. 15. Tydeman MS and Kirkwood TBL. J Biol Standard 1984; 12:195-206. 16. Jackson CM. IVD Technology 1997; 3:38-48. 17. vanErp R et al. J Biotech 1991; 20:249-262. 18. Kim YC and Nishida TJ. Biol Chem 1979; 254:9621-9626.

28

O S N O V N A I M U N O H E M I J A

TOMAS BOENIŠ

■ Titar i razblaživanje antitela, kao i vreme trajanja inkubacije i

temperatura, usko su povezani kada je reč o njihovom uticaju na

kvalitet imunohistohemijskog bojenja. Ovi faktori se mogu menjati

nezavisno, ili, kao što je to češće slučaj, komplementarno, kako bi se

izazvale znatne razlike u kvalitetu bojenja. Uglavnom, prilikom bilo

kakavih promena, najvažniji cilj bi trebalo da bude postizanje

optimalnog specifičnog bojenja praćenog minimalnim smetnjama

prilikom bojenja pozadine. Ovo poglavlje će istaći te činioce.

TITAR ANTITELA ■ U imunohistohemiji, optimalan titar antitela se može definisati kao

najviša razblaženost antiseruma (ili monoklonalnog antitela), do koje

dolazi tokom maksimalnog specifičnog bojenja, sa najmanjom

količinom pozadine pod specifičnim uslovima testiranja. Ova najviša

razblaženost se određuje, uglavnom, apsolutnom količinom prisutnih

specifičnih antitela.

Što se tiče poliklonalnih antiseruma, količine antitela se tradicionalno

izražavaju u natloženim mikrogramima antigena po mililitru antiseruma.

Iako interesantna, ovo nije neophodna informacija za

imunohistohemičara.

Za pripreme monoklonalnih antitela, apsolutna koncentracija specifičnih

antitela se može lako izmeriti, i čini osnovu pravljenja potrebnog

razblaženog rastvora. Najviša razblaženost zavisi i od suštinskog

afiniteta antitela; ukoliko titar ostane stalan, verovatno je da će antitelo

visokog afiniteta brže reagovati sa antigenom tkiva i doprineti

29

intenzivnijem bojenju, kada je reč o istom vremenu trajanja inkubacije,

nego što će antitelo nižeg afiniteta.

Povećavanje titara izolacijom i obogaćivanje imunoglobulinskih

frakacija poliklonalnih antiseruma od male je koristi kada su u pitanju

imunohistohemijske primene, zato što se nespecifična antitela i

rastvorljivi agregati - često dodatan uzrok nespecifične reakcije u

pozadini - takođe obogaćuju (vidite poglavlje "Bojenje pozadine").

Gore definisani titari variraju od 1:100 do 1:2000 kada su u pitanju

poliklonalni antiserumi; od 1:10 do 1:1000 kada je reč o monoklonalnim

antitelima u supernatanti kulture ćelije; i do 1:1,000,000 kada su u

pitanju antitela u ascites tečnosti. Ovi razblaženi rastvori bi, u

budućnosti, mogli biti prevaziđeni, zahvaljujući povećanju stepena

osetljivosti novih metoda detektovanja i, u nekim slučajevima,

upotrebom podesne procedure za oporavak antigena.

RAZBLAŽIVANJE ANTITELA

■ Proizvođač često nudi unapred razblažene reagense spremne za

upotrebu, ili preporučuje domete razblaživanja u skladu sa drugim

činiocima kao što su metoda, vreme trajanja inkubacije i temperatura.

Ukoliko ove informacije nisu date, razblažene rastvore imunohemijskih

reagenasa optimalne za rad odredite titracijom. Tačni razblaženi

rastvori doprineće kvalitetu bojenja ukoliko su precizno i dosledno

pripremljeni. Najbolje se određuju prvo biranjem fiksnog vremena

trajanja inkubacije i, zatim, pripremanjem malih količina serije

eksperimentalnih razblaženih rastvora. U zavisnosti od veličine uzorka,

obično je dovoljno primeniti od 0,1-0,4 mL rastvora po preseku. Kada

su u pitanju parafinski preseci, optimalni razblaženi rastvori primarnih

antitela se ističu ne samo vrhuncem intenziteta bojenja, već i

minimalnim prisustvom pozadine (maksimalni odnosi signal-buka).

30

Nakon što je određen optimalan razblaženi rastvor za rad, mogu se

pripremiti veće količine u skladu sa potrebom i stabilnošću.

Mera do koje se monoklonalna antitela mogu razblažiti zavisi od

dodatnih kriterijuma. Zbog veće ograničenosti njihovog pI i molekularne

konformacije, monoklonalna antitela su osetljivija na pH i jone

rasblaženih pufera.1 Prema tome, predloženo je da svaka procena

monoklonalnih antitela uključuje i njihovu titraciju pri pH od 6,0 i 8,6 u

odsustvu NaCl. Taj spoj najviše razblaženog rastvora i pH koji je

zadržao najjaču imunoreaktivnost, nazvan je optimalnim razblaženim

rastvorom i preporučen je za buduću upotrebu. Od testiranih tečnosti

za razblaživanje, otkriveno je da salin razblažen fosfatom, iako

naširoko korišćen kao sredstvo za razblaživanje primarnih antitela,

potiskuje reaktivnost većine testiranih monoklonalnih antitela.

Razblaženi rastvori su obično prikazani u vidu odnosa rastvora veće

koncentracije prema ukupnoj količini željenog razblaženog rastvora. Na

primer, razblažen rastvor 1:10 se pravi mešanjem jednog dela rastvora

sa devet delova tečnosti za razblaživanje. Dvostruki serijski razblaženi

rastvori se prave uzastopnim 1:2 razblaživanjem prethodnog

razblaženog rastvora. Kako bi se napravila veoma mala količina visoko

razblaženog rastvora, možda će biti neophodno pripremanje u dva

koraka. Na primer, kako biste pripremili 1,0 mL razblaženog rastvora

1:1000, prvo napravite 100 µl razbalženog rastvora 1:10 (10 µl + 90 µl)

i, zatim, 1000 µl razblaženog rastvora 1:100, služeći se sa 10 µl prvog

razblaženog rastvora (10 µl + 990 µl).

Prilikom pripremanja razblaženih rastvora, upotreba podešljivih pipeta

omogućava veću fleksibilnost i precizniju predaju. Za merenje količina

koje premašuju 1,0 mL, koristite serologijske ili volumetrijske pipete.

Tabela 1 pokazuje količine reagenasa i tečnosti za razblaživanje

neophodnih za postizanje razblaženih rastvora od 1:50 do 1:200.

31

Checkerboard titracije se koriste kako bi se odredio optimalni

razblaženi rastvor više od jednog reagensa istovremeno. U ovom

primeru checkerboard titracije, mogu se pronaći optimalni razblaženi

rastvori primarnog antitela i streptavidin-HRP reagensa, dok se

razblaženi rastvor vezanog antitela koje sadrži biotin održava u

nepromenjenom stanju (nije prikazano). Potrebno je devet preseka

tkiva kako bi se testirala tri razblažena rastvora.

■ TABELA 1 Streptavidin-HRP Razblaženi rastvori primarnog antitela.

1:50 1:50 1:100 1:200

1:100 1:50 1:100 1:200

1:200 1:50 1:100 1:200

Kao što je ranije primećeno, rezultati bojenja, postignuti upotrebom

nekoliko različitih razblaženih rastvora, često su slični ili identični, u

kom slučaju cena reagensa može postati dodatni faktor pri izboru

optimalnog razblaženog rastvora.

Precizna definicija optimalnog odnosa "signal-buka", kao funkcije

razblaženog rastvora primarnog antitela, verovatno će biti kritičnija kod

nekih metoda nego kod drugih. Na primer, otkriveno je da je više

ograničena kada je u pitanju upotreba neoznačenih enzim-antienzim

komplekasa (PAP, APAAP), nego kada je reč o metodama koje koriste

(strept)avidin-biotin tehnologiju.2 Ovo je verovatno u saglasnoti sa

opservacijom da, za razliku od PAP metode, ABC metoda nije u stanju

da razlikuje visoke i niske koncentracije tkivnih antigena.3

INKUBACIJA ANTITELA

■ U skladu sa prethodno pomenutim, vreme trajanja inkubacije,

temperatura i titari antitela su međusobno zavisni; promena kada je u

pitanju jedan od faktora uticaće na druge.

32

■ VREME TRAJANJA INKUBACIJE Postoji inverzna veza između

vremena trajanja inkubacije i titara antitela – što je titar antitela veći, to

je kraće vreme trajanja inkubacije potrebno za postizanje optimalnih

rezultata. U primeni je, međutim, celishodno prvo postaviti

odgovarajuće vreme trajanja inkubacije pre određivanja optimalnog

razblaženog rastvora antitela. Više koncentracije specifičnih antitela (i

viši afiniteti) dozvoljavaju skraćivanje vremena trajanja inkubacije.

Razlika u vremenu trajanja inkubacije, kada su u pitanju primarna

antitela, može varirati do 48 sati, s tim što se, vreme od 10 do 30

minuta najčešće primenjuje. Da bi antitelo dovoljno jako reagovalo sa

vezanim antigenom, u okviru veoma kratkog vremenskog perioda, ono

mora biti visokog afiniteta i relativno visoke koncentracije. Činioce, za

koje se veruje da doprinose povećanom nespecifičnom bojenju

pozadine, trebalo bi smanjiti na minimum (vidite poglavlje "Bojenje

pozadine"). Inkubacije primarnog antitela u trajanju od 48 sati

doprinose, više nego bilo šta drugo, boljoj ekonomiji, zato što

omogućavaju upotrebu izuzetno visokih razblaženih rastvora

antiseruma. Dok je, kada su u pitanju antitela niskog afiniteta i/ili niskog

titra, obavezna duga inkubacija kako bi se dostigla ravnoteža*, ništa se

ne postiže prolongiranjem inkubacije primarnih antitela preko vremena

kada dolazi do saturacije tkivnog antigena antitelom.

Ravnoteža se uglavnom ne postiže prilikom inkubacije primarnog

antitela u trajanju ispod 20 minuta. Dosledno podešavanje vremena

trajanja inkubacije primarnog antitela je od velikog značaja.

Nedosledno podešavanje vremena trajanja inkubacije može

prouzrokovati varijacije u ukupnom kvalitetu i intenzitetu bojenja.

Doslednost, kada je reč o intenzitetu bojenja, je posebno bitna u

pokušajima koji se trude da procene stepen diferencijacije tumora.

* Termin ravnoteža u ovom slučaju označava saturaciju antigena sa antitelom.

33

■ INKUBACIONA TEMPERATURA Budući da se, u antigen-antitelo

reakcijama, ravnoteža brže postiže na 37°C nego na sobnoj

temperaturi, neki radnici preferiraju inkubaciju na višoj temperaturi.

Povećavanje inkubacione temperature omogućava bolje razblaživanje

antitela ili kraće vreme trajanja inkubacije. Ne zna se da li temperatura

unapređuje antigen-antitelo reakciju na selektivnoj osnovi pre nego

različite reakcije koje prouzrokuju pozadinu.

Često se koristi temperatura od 4°C u kombinaciji sa prekonoćnim ili

dužim inkubacijama. Pločice pod dužom inkubacijom, ili na temperaturi

od 37°C, trebalo bi staviti u vlažnu komoru kako bi se sprečilo

isparavanje i sušenje tkivnih preseka. Slično, i tkiva pod inkubacijom na

sobnoj temperaturi, u izuzetno suvoj sredini ili sredini izloženoj promaji,

zahtevaće upotrebu vlažne komore.

REFERENCE 1. Boenisch T. Appl. Immunohistochem 1999; 7(4): 300-306. 2. Boenisch T. Appl. Immunohistochem 2001; 9(2): 176-179. 3. Sternberger LA and Sternberger NH. J Histochem Cytochem

1986;34:599-605.

34

O S N O V N A E N Z I M O L O G I J A

TOMAS BOENIŠ

■ Metode imunoenzimatskog bojenja služe se reakcijama enzim-

supstrata u cilju pretvaranja bezbojnih hromogena u obojene krajnje

proizvode. Od enzima upotrebljenih u ovim primenama, detaljno ćemo

razmotriti jedino peroksidazu hrena i alkalnu fosfatazu telećih creva.

Zbog svoje niske osetljivost, glikozna oksidaza (Aspergillus niger) se

danas retko koristi.

Ovo poglavlje, pored toga što će se baviti predloženim procedurama za

pripremu nekih supstrat rastvora, razmatraće i razne hromogene i

supstrate koji se mogu upotrebljavati u vezi sa peroksidazom i

fosfatazom.

ENZIMI ■ Enzimi su proteinski katalizatori svojstveni živim bićima. Stotine su u

upotrebi u purifikovanom i kristalinskom obliku. Njihova katalitička

efikasnost je izuzetno visoka – jedan mol čistog enzima može da

katalizuje transformaciju od 10.000 do 1.000.000 molova supstrata u

minutu. Dok su neki enzimi visoko specijalizovani za samo jedan

supstrat, drugi mogu da napadnu mnoge srodne supstrate. Izuzetno

široka klasifikacija enzima obuhvatala bi hidrolitične enzime (esteraze,

proteaze), fosforilaze, oksidoreduktivne enzime (dehidrogenaze,

oksidaze, peroksidaze), prenosne enzime, dekarboksilaze i druge.

Enzimatska aktivnost zavisi od nekoliko činilaca, kao što su

koncentracije enzima i supstrata, pH, koncentracija soli pufer sredine,

temperatura i svetlost. Mnogi enzimi takođe poseduju neproteinske

hemijske delove zvane prostetične grupe. Tipične prostetične grupe su

gvožđe-protoporfirin peroksidaza i biotin CO2 transferaze. Uz to, mnogi

35

enzimi zahtevaju prisustvo metalnih jona kao što su Mg++, Mn++ i

Zn++, koji funkcionišu kao elektrofilični (koji privlače elektrone) agensi.

Uobičajena formula, koja opisuje reakcije enzima sa svojim supstratom,

može se napisati na sledeći način:

1. Enzim (E) + Supstrat (S) = ES kompleks

2. ES → E + Proizvodi (P)

Prema tome, pre formiranja proizvoda, prolazni enzim-supstrat

kompleks se formira na "aktivnom području" (prostetičnoj grupi)

enzima.

Supstance koje ometaju spcifično vezivanje supstrata sa prostetičkom

grupom su specifični inhibitori i znatno se razlikuju od agenata koji

izazivaju nespecifičnu denaturizaciju enzima (ili bilo kojeg proteina).

Prepoznaju se dve osnovne vrste inhibicije, konkurentna ihibicija i

nekonkurentna inhibicija. Konkurentna inhibicija je rezultat reverzibilne

formacije enzim-inhibitor kompleksa (EI):

E + Inhibitor (I) + S = EI +S

Formacija EI kompleksa se može obrnuti promenom u koncentraciji

supstrata ili inhibitora, sem u slučaju kada je afinitet I ka E veći od

afiniteta S ka E. Dejstvo ugljen-monoksida ili azida na teške metale

respiratornih enzima je tipičan primer konkurentne inhibicije.

Kada je u pitanju nekonkurentna inhibicija, inhibicija zavisi jedino od

koncentracije inhibitora i, uglavnom, nije reverzibilna. Nekonkurentna

inhibicija može, ali ne mora, da uključuje prostetične grupe enzima, i

manifestuje se usporavanjem ili zaustavljanjem brzine reakcije enzima

nad supstratom.

36

E + I + S → E I S

Izbor najpogodnijeg enzima za datu imunohistohemijsku primenu zavisi

od nekoliko kriterijuma:

■ Enzim bi trebalo da je na raspolaganju u visoko purifikovanom

obliku i da je relativno jeftin.

■ Sprezanje (kovalentno vezivanje za antitelo ili avidin, na primer) ili

nekovalentno vezivanje ne bi trebalo da poništi aktivnost enzima,

mada je može smanjiti.

■ Vezani enzim bi trebalo da je stabilan u rastvoru.

■ Aktivnost endogenog enzima bi trebalo minimalno da ometa

specifično bojenje u vezi sa antigenom.

■ Proizvodi enzimičnih reakcija bi trebalo da su jednostavni za

detektovanje i stabilni.

Peroksidaza hrena i alkalna fosfataza telećih creva zadovoljavaju

većinu od ovih kriterijuma, i u nastavku ćemo se detaljnije baviti

njihovim osobinama.

■ PEROKSIDAZA HRENA (HRP): Ovaj enzim (molekularna težina 40

kD) je izolovan iz korena biljke hren. HRP ima hem grupu koja sadrži

gvožđe (hematin) kao aktivno područje i braon je boje u rastvoru.

Hematin u HRP prvo formira kompleks sa vodonik-peroksidom i, zatim,

izaziva njegov raspad, što stvara vodu i atomski kiseonik. HRP oksidiše

nekoliko supstanci, od kojih su dve polifenoli i nitrati. Kao i mnogi drugi

enzimi, HRP i neke slične aktivnosti mogu biti inhibirane suvišnim

supstratom. Kompleks formiran između HRP i suvišnog vodonik-

peroksida je katalitički neaktivan i, u odsustvu davaoca elektrona (npr.

hromogenske supstance), reverzibilno je inhibiran. Suvišni vodonik-

peroksid i odsustvo davaoca elektrona izazivaju gašenje endogenih

HRP aktivnosti. Cijanid i azid su druga dva jaka (reverzibilna) inhibitora

HRP.

37

HRP može biti vezan za proteine kovalentno ili nekovalentno.

Kovalentno vezivanje za druge proteine se može vršiti upotrebom

procedura u jednom ili dva koraka uključujući gluteraldehid. Hemijski

4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenil sulfon (FNPS) se ređe koristi s ovim ciljem.

U svim slučajevima, u ovoj reakciji učestvuju epsilonamino grupe lizina

i amino grupe N-terminala oba proteina. Preferira se procedura

sprezanja u dva koraka zato što, u odnosu na molekul antitela, HRP

molekul ima mali broj reaktivnih grupa. Kao posledica, dodavanje

gluteraldehida rastvoru koji sadrži mešavinu HRP i antitela,

prouzrokovaće više međusobnog sprezanje molekula antitela nego

sprezanja istih sa enzimima. Kada je reč o proceduri u dva koraka,

HRP prvo reaguje sa bifunkcionalnim reagensima. U drugoj fazi, samo

aktivirani HRP se meša sa antitelom, što dovodi do mnogo efikasnijeg

označavanja i bez polimerizacije.

HRP je takođe spregnut sa (strept)avidinom, primenom gluteraldehid

procedure u dva koraka. Ovaj oblik se koristi, na primer, u LAB i LSAB

procedurama. Sprezanje sa biotinom takođe zateva proceduru u dva

koraka, budući da biotin mora prvo podleći derivaciji, kako bi se dobio

biotin-N-hidroksisukcinimid ester ili biotin hidrazid, pre nego što može

da reaguje sa epsilonamino grupama enzima.

Nekovalentno vezivanje HRP i antitela (poznato i kao neoznačeno

vezivanje antitela) detaljno je opisano od strane Sternbergera.1 Umesto

upotrebe bifunkcionalnih reagenasa, antitela IgG klase i HRP se koriste

radi formiranja rastvorljivog polucikličnog imuno kompleksa koji se

sastoji iz dva molekula antitela i tri molekula enzima. Molekularna

težina peroksidaza-antiperoksidaza ili PAP kompleksa je 400-430 kD.

■ ALKALNA FOSFATAZA TELEĆIH CREVA (AP): Alkalna fosfataza

telećih creva (molekularne težine od 100 kD) otklanja (hidrolizom) i

prenosi grupe fosfata iz organskih estera prekidajući P-0 vezu;

38

kratkotrajno se formira prelazna veza enzim-supstrat. Glavni metalni

aktivatori za AP su Mg++, Mn++ i Ca++. AP se nije naširoko koristila u

imunohistohemiji do publikacije procedure pod nazivom neoznačena

alkalna fosfataza-antialkalna fosfataza (APAAP).2,3 Rastvorljivi imuno

kompleksi korišćeni u ovoj proceduri su molekularne težine od približno

560 kD. Glavna prednost APAAP procedure, u odnosu na PAP tehniku,

jeste odsustvo ometanja od strane aktivnosti endogenih peroksidaza.

Zbog potencijalnog ometanja PAP bojenja od strane aktivnosti

endogenih peroksidaza, APAAP tehnika se preporučuje za upotrebu

kada su u pitanju otisci krvi ili koštane srži. Aktivnost alkalnih

endogenih peroksidaza kosti, bubrega, jetre i nekih belih krvnih ćelija

može biti inhibirana dodavanjem 1mM levamisola rastvoru supstrata,4

mada se 5 mM pokazalo kao efektnije.5 Intestinalne alkalne fosfataze

nisu adekvatno inhibirane levamisolom.

SUPSTRATI I HROMOGENI ■ PEROKSIDAZA Kao što je gore opisano, HRP aktivnost u prisustvu

davaoca elektrona dovodi prvo do formiranja enzim-supstrat

kompleksa, a zatim do oksidacije davaoca elektrona. Davaoc elektrona

pruža "pokretnu" snagu u nastavljenoj katalizi H2O2, dok njegovo

odsustvo efektno zaustavlja reakciju.

Postoji nekoliko davaoca elektrona koji, nakon oksidacije, postaju

obojeni proizvodi i nazivaju se, prema tome, hromogeni. Ovo, i

sposobnost da postanu nerastvorljivi u oksidaciji, čine takve davaoce

elektrona korisnim u imunohistohemiji.

3,3'-DIAMINOBENZIDIN (DAB) proizvodi braon krajnji proizvod koji je

izuzetno nerastvorljiv u alkoholu i drugim organskim rastvaračima.

Oksidacija DAB takođe dovodi do polimerizacije, koja prouzrokuje

sposobnost reagovanja sa osmijum tetroksidom i time povećava svoj

intenzitet bojenja i zbijenost elektrona. Od nekoliko metala i metoda

korišćenih kako bi se pojačala optička zbijenost polimerizovanog DAB,

39

zlato hlorid u kombinaciji sa srebro sulfidom se pokazao kao

najuspešniji.6

3-AMINO-9-ETILKARBAZOL (AEC), prilikom oksidacije, formira crveni

krajnji proizvod koji je rastvorljiv u alkoholu. Prema tome, uzorci koji se

procesuju sa AEC-om ne smeju se umočiti u alkohol ili alkoholske

rastvore (npr. Harisov hematoksilin). Umesto toga, trebalo bi upotrebiti

razvođenu kontrastnu boju i sredstvo za postavljanje. AEC je, na

žalost, podložan daljoj oksidaciji i, kada je izložen prekomernoj

svetlosti, oslabiće u intenzitetu. Prema tome, preporučuje se držanje u

mraku.

4-HLORO-1-NAFTOL (CL) taloži se u obliku plavog krajnjeg proizvoda.

Budući da je CN rastvorljiv u alkoholu ili drugim organskim

rastvaračima, uzorak ne sme dehidrirati, biti izložen alkoholnim

kontrastnim bojama, ili biti prekriven pločicom zajedno sa sredstvom za

postavljnje koje sadrži organske rastvarače. Za razliku od DAB, CN ima

tendenciju da se raširi van područja taloženja.

p-FENILEN-DIAMIN DIHIDROHLORID/pirokatehol (Hanker-Jejts

reagens) daje reakcioni proizvod plavo-crne boje koji je nerastvorljiv u

alkoholu i drugim organskim rastvaračima. Kao i polimerizovan DAB,

ovaj reakcioni produkt može da reaguje sa osmijumom. Raznovrsni

rezultati su postignuti sa Hanker-Jejts reagensom u tehnikama

imunoperoksidaze.

■ ALKALNA FOSFATAZA U metodi bojenja imunoalkalne fosfataze,

enzim hidroliše naftol fosfat estere (supstrate) do stanja fenolskih

jedinjenja i fosfata. Fenoli se sparuju formirajući bezbojne diazonium

soli (hromogene) radi proizvodnje nerastvorljivih, azo boja. Nekoliko

različitih kombinacija supstrata i hromogena uspešno je upotrebljivano.

NAFTANOL AS-MX FOSFAT se može koristiti u obliku kiseline ili u

obliku soli natrijuma. Hromogeni Brza crvena TR i Brza plava BB

40

proizvode jasno crveni, odnosno plavi, krajnji proizvod. Oba su

rastvorljivi u alkoholskim i drugim organskim rastvaračima, tako da je

neophodna upotreba razvodnjenog sredstva za postavljanje. Brza

crvena TR se preferira kada je u pitanju bojenje otisaka ćelija.

NOVI FUKSIN takođe daje crveni proizvod. Za razliku od Brze crvene

TR i Brze plave BB, boja koju proizvodi Novi fuksin je nerastvorljiva u

alkoholu i drugim organskim rastvaračima, što dozvoljava uzorcima da

dehidriraju pre nego što su stavljeni pod mikroskopsko staklo. Intenzitet

bojenja koji se dobija upotrebom Novog fuksina veći je od intenziteta

dobijenog upoterbom Brze crvene TR ili Brze plave BB.

DRUGI SUPSTRATI I HROMOGENI Među dodatne supstrate ubrajaju

se naftol AS-BI fosfat, naftol AS-TR fosfat i 5-bromo-4-hloro-3-indoksil

fosfat (BCIP). Drugi mogući hromogeni obuhvataju Brzu crvenu LB,

Brzi granat GBC, Nitro plavi tetrazolium (NBT) i jodonitrotetrazolium

ljubičastu (INT).

Dostupni su detaljni opisi i informacije u vezi sa pripremom najčešće

upotrebljivanih supstrat-hromogen mešavina za HRP7 i AP8, kao i

njihova pravilna primena i prednosti ili mane.9-12

PREPORUČENE PROCEDURE ZA SUPSTRAT-HROMOGEN REAGENSE

■ PEROKSIDAZA RASTVOR AEC SUPSTRATA (preporučen za otiske ćelija)

1. Rastvorite 4 mg AEC u 1 mL N, N-dimetilformamida.

2. Dodajte 14 mL 0,1 M acetat pufera, pH 5,2 i 0,15 mL vodonik-

peroksida od 3%.

3. Promešajte, i filtrirajte ukoliko se formira talog.

4. Dodajte rastvor tkivu i izložite ga inkubaciji u trajanju od 5-15

minuta na sobnoj temperaturi.

41

5. Isperite destilovanom vodom.

6. Izvršite kontrastiranje i prekrijte razvodnjenim sredstvom.

RASTVOR DAB SUPSTRATA 1. Rastvorite 6 mg DAB-a u 10 mL 0,05 M Tris pufera, pH 7,6.

2. Dodajte 0,1 mL vodenik-peroksida od 3%. Promešajte, i filtrirajte

ukoliko se formira talog.

3. Dodajte rastvor tkivu i izložite ga inkubaciji u trajanju od 3-10

minuta na sobnoj temperaturi.

4. Isperite destilovanom vodom.

5. Izvršite kontrastiranje i prekrijte organskim ili razvodnjenim

sredstvom.

■ ALKALNE FOSFATAZE

RASTVOR SUPSTRATA BRZE CRVENE (preporučen za otiske ćelija)

1. Rastvorite 2 mg naftol AS-MX fosfata, slobodnu kiselinu (Sigma

N 4875) u 0,2 mL N,N-dimetilformamida u staklenoj epruveti.

2. Dodajte 9,8 mL 0,1 M Tris pufera, pH 8,2.

3. Dodajte 0,01mL 1 M levamisola (Sigma L 9756) radi blokiranja

endogenih alkalnih fosfataza. (Rastvor se može čuvati na

temperaturi od 4°C nekoliko nedelja, ili duže na temperaturi od -

20°C.)

4. Neposredno pre bojenja, rastvorite 10 mg soli Brze crvene TR

(Sigma F 1500) u gore opisanom rastvoru i filtrirajte na pločice.

5. Izložite inkubaciji u trajanju od 10-20 minuta na sobnoj

temperaturi.

6. Isperite destilovanom vodom.

7. Izvršite kontrastiranje i prekrijte razvodnjenim sredstvom.

RASTVOR SUPSTRATA NOVOG FUKSINA (preporučen za otiske

ćelija)

1. Rastvor A: Pomešajte 18 mL 0,2 M 2-amino-2-metil-1, 3-

propanediol (Merck 801464) sa 50 mL 0,05 M Tris pufera, pH

42

9,7 i 600 mg natrijum-hlorida. Dodajte 28 mg levamisola (Sigma

L 9756).

2. Rastvor B: Rastvorite 35 mg naftola AS-BI fosfata (Sigma N

2250) u 0,42 mL N,N-dimetilformamida.

3. Rastvor C: Pod zaštitom od isparenja, pomešajte 0,14 mL

Novog fuksina od 5% (Sigma N 0638, 5 g u 100 mL 2 N HCI-a)

sa 0,35 mL sveže pripremljenog natrijum-nitrata od 4% (Sigma S

2252, 40 mg u 1 mL destilovane vode). Mešajte 60 sekundi.

4. Pomešajte rastvore A i B, zatim dodajte rastvor C; podesite pH

na 8,7 sa HCI. Dobro promešajte i filtrirajte na pločice.

5. Izložite inkubaciji u trajanju od 10-20 minuta na sobnoj

temperaturi.

6. Isperite destilovanom vodom.

7. Izvršite kontrastiranje i prekrijte organskim ili razvodnjenim

sredstvom.

RASTVOR SUPSTRATA NOVOG FUKSINA (alternativna procedura)

1. Rastvor A: Pod zaštitom od isparenja, dodajte 0,2 mL Novog

fuksina od 5% (Merck 4041, u 2 N HCI-a) 0,5 mL svežeg

natrijum-nitrata od 4%. Mućkajte 30-60 sekundi. Dodajte 100 mL

0,05 Tris pufera, pH 8,7, i 100 µL 1 M levamisola radi blokiranja

endogenih alkalnih fosfataza.

2. Rastvor B: Rastvorite 50 mg naftola AS-BI fosfata (Sigma 2250)

u 0,6 mL N,N-dimetilformamida.

3. Dodajte rastvor B rastvoru A i dobro promešajte. Filtrirajte

direktno na pločice.

4. Izložite inkubaciji u trajanju od 10-20 minuta na sobnoj

temperaturi.

5. Isperite destilovanom vodom.

6. Izvršite kontrastiranje i prekrijte organskim ili razvodnjenim

sredstvom.

43

REFERENCE

1. Sternberger LA. Immunocytochemistry (2nd ed.). New York: Wiley 1999.

2. Mason DY et al. J. Cancer Res Clin Oncol 1981; 101:13-22. 3. Cordell JL et al. J Histochem Cytochem 1984; 32:219-229. 4. Ponder BA and Wilkinson MM J. Histochem Cytochem 1981;

29:981-984. 5. Gown AM In DeLellis RA (ed) Advances in Immunohistochemistry.

New York: Raven Press, 1988, pp 31-45. 6. Newman GR et al. J Microscopy 1983; 132:PRI-2. 7. DAKO Specifications No. K0597, K0598, K0599, K0624, K0698. 8. DAKO Specifications No. K3461, K3465, K3467. 9. Newman GR et al. J Microscopy 1983; 132:PR1-2. 10. Clark CA et al. J J Histochem Cytochem 1982; 30:27-34. 11. Gay et al. J Histochem Cytochem 1982; 32:447-451. 12. Bondi A et al. Histochemistry 1982; 76:153-158.

44

F I K S A C I J A

A.J. FARMILO I RONALD H. STID,

REVIZIJU URADILA KAREN N. ATVUD

■ Bitan deo histologičnih i citologičnih tehnika je očuvanje ćelija i tkiva

u što reproduktivnijem obliku i u obliku koji je što bliži živom uzorku.

Kako bi se ovo postiglo, uzorci tkiva, preseci ili otisci se obično

potapaju u fiksirajuću tečnost, mada je, kada su u pitanju otisci,

dovoljno samo sušenje pripremljenog uzorka da bi se očuvao.

Upotreba fiksirajućih tečnosti sprečava autolizu onemogućavajući

aktiviranje lizosomalnih enzima i sprečavajući rast bakterija i buđi, što

bi prouzrokovalo promene izazvane truljenjem. Osim toga, fiksirajuće

tečnosti stabilizuju ćelije i tkiva kako bi ih zaštitili od tegoba daljih

tehnika obrade i bojenja.

Vršeći svoju zaštitnu ulogu, fiksirajuće tečnosti denaturišu proteine

zgrušavanjem, formiranjem dodatnih jedinjenja ili kombinacijom ova

dva. Prema tome, dolazi do promena prilagođavanja u strukturi

proteina koje prouzrokuju neaktiviranje enzima. Dobijeni kompleksi se

razlikuju od proteina koji nisu denaturisani u hemijskim i antigenskim

profilima. Dilemu, kada je reč o fiksaciji, oduvek je predstavljalo

obavezno uvođenje nekog elementa kako bi se došlo do zaštitnog

efekta; po definiciji, fiksirajuće tečnosti menjaju originalnu kompoziciju

upotrebljenog tkiva.

Pored toga što svojom primenom menjaju hemijsku prirodu ćelija i

tkiva, fiksirajuće tečnosti takođe dovode do fizičkih promena ćelijskih i

vanćelijskih sastavnih delova. Ćelije sposobne za život su obložene

nepropustljivom membranom. Fiksacija ruši ovu prepreku i omogućava

relativno velikim molekulima da je probiju i da se izvuku. Osim toga,

citoplazma prolazi kroz sol-gel transformaciju formiranjem proteinske

45

mreže dovoljno porozne da omogući dalje probijanje velikih molekula.

Međutim, važno je prepoznati da različite fiksirajuće tečnosti dovode do

različitih stepena poroznosti; zgrušavajuće fiksirajuće tečnosti, kao što

su B5 i formlani sublimat, doprinose stvaranju većih pora nego kada su

u pitanju nezgrušavajuće fiksirajuće tečnosti, kao što je formalin. Ove

vrste promena su svakako od velikog značaja u imunohemiji kada je

neophodno pokazati sve osim najpovršnijih antigena preseka ili otiska.

Većina fiksirajućih rastvora sadrže hemikalije koje stabilizuju proteine,

budući da je ovo način na koji se najbolje štiti struktura ćelije. Neke od

tečnosti su osmišljene za očuvanje ugljen hidrata ili lipida. One se

rutinski ne primenjuju, budući da histolizi i anatomisti uglavnom

zahtevaju očuvanje mikroanatomije.

Fiksacija uvek predstavlja kompromis, i potrebe za fiksirajućom

tečnošću se razlikuju u skladu sa različitim tehnikama primenjenim u

vizualizaciji strukture ćelija ili tkiva. Prema tome, citološke tehnike se u

potpunosti razlikuju od histoloških, ili tehnika elektronske mikroskopije.

Osim toga, primena različitih metoda bojenja zahteva druge promene u

protokolu fiksacije, kao što su vazdušno sušenje pre Giemsa bojenja, i

vlažnu fiksaciju za metodu Papanikolau.

OTISCI KRVI I PRIPREME ZA CITOCENTRIFUGU

■ Otisci krvi su očuvani vazdušnim sušenjem. Sledeća primenjena

metoda fiksacije zavisi od tehnike bojenja. Za rutinsko bojenje

Romanovski-tipa, za adekvatnu fiksaciju treba primeniti

visokokvalitetan metanol 1-3 minuta.

Kako bi se proizvela željena morfologija upotrebom rutinskih krvnih

boja, važno je da je otisak suv, što dokazuje morfologija leukocita u

gustom kraju rutinskog krvnog razmaza. Na sreću, rutinsko vazdušno

sušenje od 1-2 sata nema štetan efekat na većinu imunohistohemijski

46

proučenih antigena. Zapravo, pokazalo se da se mnogi površinski

markeri leukocita mogu očuvati više od nedelju dana nakon rutinskog

vazdušnog sušenja, prilikom čuvanja na sobnoj temperaturi.1 Prema

tome, moguće je dostići pripreme ovih markera, kvaliteta sličnog

pripremana korišćenim prilikom rutinskih morfoloških procena.

Upotrebom adekvatnog hromogena, kao što je diaminobenzidin,

moguće je čak kontrastiranje rutinskim metodama tipa Romanovski.

Jedna od prednosti vazdušnog sušenja otisaka je čvršće vezivanje

ćelija za pločicu u odnosu na vlažnu fiksaciju. Ovo je izuzetno važno

ako će pločica da opstane nakon primene dinamičnijih

imunohistohemijskih tehnika. Međutim, kada je u pitanju izbor

fiksirajuće tečnosti, metanol nije optimalan za sve antigene; često je

neophodno fiksiranje tkiva uz pomoć bezvodnog acetona u trajanju od

1-3 minuta, posebno u slučaju površinskih antigena leukocita. Uprkos

navedenom, alternativna fiksirajuća sredstva se korisno upotrebljavaju

kada su u pitanju ovi, i drugi, antigeni. Na primer, fiksirajuće tečnosti na

bazi formalina su podesne za upotrebu na citoplazmičnim antigenima i

membranski vezanim imunoglobulinima, dok se formal-aceton

mešavine upotrebljavaju sa određenim limfocitičnim markerima.2

Konačno, treba pomenuti da pripreme vazdušnim sušenjem često

pokazuju relativno slabe mogućnosti imunobojenja. Ovo je verovatno

zato što suve ćelije pokazuju uopšteno nižu gustinu antigena. Ovo se

može nadoknaditi produžavanjem vremena inkubacije antitela i/ili

hromogena, ili uptrebom osetljivijih imunocitohemijskih tehnika u više

koraka.

CITOLOŠKI OTISCI ■ Za razliku od hematologa, većina citologa preferira vlažno fiksiranje

otisaka odmah nakon pripreme. Ovo doprinosi očuvanju fine strukture

hromatina i pomaže u proceni nuklearnih promena. Prema tome,

47

većina citoloških otisaka se odmah fiksira u etanolu od 95% ili sprej-

fiksacijom karbovaksom koji sadrži alkoholnu tečnost. Etanol

zadovoljava potrebe kada je reč o očuvanju mnogih antigena, posebno

onih upotrebljivanih za razlikovanje melanoma i karcinoma. Međutim,

fiksacija etanolom sprečava bojenje većine leukocit markera, kao što

su T i B ćeiljski antigeni. Prema tome, predlažemo pravljenje dve

pripreme, jedne vlažnom fiksacijom i jedne vazdušno sušenom. Kod

otisaka fiksiranih vlažnom fiksacijom, jedan od osnovnih problema je

gubitak ćelija, posebno grumena, tokom inkubacija imunobojenja. Bitno

je što više smanjiti vreme trajanja inkubacija upotrebom viših

koncentracija antitela ili upotrebom povišenih temperatura.

KRIOSTAT PRESECI ■ Kada je u pitanju imunocitohemija, kriostat preseci pružaju mnogo

bolje očuvanje antigena nego parafinski preseci. Pored toga, uz kriostat

preseke se može koristiti fiksirajuća tečnost, što omogućava

imunohemičaru da odabere različitu i optimalnu fiksirajuću tečnost za

svaki antigen, sve iz istog bloka. Međutim, morfološka pojedinost i

rezolucija zamrznutih preseka je obično znatno inferiornija u odnosu na

tkivo koje je ukalupljeno tokom obrade uzorka.

Mnogi antigeni, kao što su površinski markeri leukocita, ne opstaju ni

nakon parafinske obrade, ni nakon fiksacije dodatnim fiksirajućim

tečnostima. Prema tome, upotrebite ili alkohol ili aceton. Kada su u

pitanju površinski antigeni leukocita, većina laboratorija preferira

aceton. Na žalost, očuvanje uz pomoć acetona nije potpuno;

zamrznute preseke izložene dužim imunohemijskim procedurama

često pokazuju štetne morfološke promene, uključujući hromatolizu i

vidljiv gubitak membrana. Među mnoge pokušaje da se poboljša

acetonska fiksacija ubraja se i dodavanje hloroforma ili desikacijom,

nijedan od kojih se nije pokazao kao u potpunosti zadovoljavajući.3

Međutim, tanki preseki i produženo sušenje sprečavaju elemente često

48

viđene u imunobojama zamrznutih preseka ili limfoidnim tkivima

fiksiranim u acetonu. Produživanje perioda za sušenje do 48 sati

uglavnom će rezultirati poboljšanjem morfologije. Ukoliko je neophodno

presek obojiti istog dana kada je sečen, može se fiksirati u hladnom

acetonu ili staviti pod infracrvenu lampu kako bi se ugrejao do 70°C

nakon izloženosti u trajanju od 5 sekundi. Pločice se zatim sklanjaju,

ostavljaju da se ohlade, i preseci se imunoboje. Ova procedura se

mora pažljivo kontrolisati kako bi se izbeglo pregrejavanje preseka.

Budući da različitih procedura postoji koliko i laboratorija, ostaje na

tehnologu ili patologu da odredi koje će sekvence fiksacije, i koraci pri

sušenju, njima dati najbolje rezultate, s obzirom na antigene koje

pokušavaju da otkriju. Za više informacija, pogledajte poglavlje

"Obrada tkiva" sa radnom procedurom.

PARAFINSKI PRESECI ■ Ubedljivo najveći broj uzoraka korišćenih za imunobojenje ukalupljen

je u parafin. Mnoge fiksirajuće tečnosti su formulisane s tim u vidu.

Ovde se bavimo najčešće upotrebljivanim fiksirajućim tečnostima.

Postoji preobilje specijalizovanih fiksirajućih tečnosti koje nisu

obuhvaćene ali se mogu pojaviti u referencama datim u bibliografiji.

■ FIKSIRAJUĆE TEČNOSTI NA BAZI FORMALDEHIDA

Najpopularnije fiksirajuće tečnosti sadrže formalin (40% w/v

formaldehid u vodi), obično neutralnu so radi održavanja tonusa, i često

sistem razblaživanja radi održavanja pH. Tkiva uspešno tolerišu ove

fiksirajuće tečnosti, i one imaju dobru penetraciju. Ovo je važno budući

da su uzorci često veliki, i fiksacija se može proširiti mimo optimalnog

vremena u rutinskim situacijama. Može doći do smanjenja ili

deformacije tokom fiksacije sledećeg uzorka ukalupljenog u parafin, ali,

obično su fiksirajuće tečnosti bazirane na formalinu odlične kada je u

pitanju većina imunoboja.

49

Formaldehid fiksira, ne zgrušavanjem, već reagovanjem prvobitno sa

primarnim amino kiselinama radi formiranja unakrsno vezujućih

"metilen mostova". To znači da postoji relativno niska permeabilnost

makromolekula i da strukture intracitoplazmičnih proteina nisu bitno

promenjene. Premda mnogi ne vole fiksirajuće tečnosti na bazi

formalina, njihovo mišljenje je često zasnovano na studijama u kojima

su korišćena neoptimalno formalinski fiksirana tkiva. Mali delovi

(10x10x3 mm) tkiva, brzo fiksirani u neutralno razblaženom formalinu

na 6-24 sata, uglavnom pokazuju dobru citološku očuvanost i

imunolokalizaciju, sa minimalnim maskiranjem antigena. Većina

problema u imunohemiji prouzrokovana je velikim varijacijama u

vremenu i uslovima fiksacije.

Iako se neki antigeni nisu dobro pokazali nakon fiksacije u fiksirajućim

tečnostima na bazi formaldehida, mnogi se mogu pokazati nakon

upotrebe adekvatnih metoda predtretmana, kao što su proteolitičko

varenje enzima i/ili oporavak antigena, posebno ukoliko se

upotrebljavaju poliklonalni antiserumi. Ukoliko će se koristiti

monoklonalna antitela na formalinski fiksiranim, parafinskim presecima,

treba imati u vidu tri aspekta:

■ Da li formaldehid reaguje sa ispitivanim epitopom?

■ Da li reaguje sa susednim amino kiselinama prouzrokujući promene

prilagođavanja?

■ Da li obrada parafinom uništava ispitivani epitop?

Monoklonalna antitela su odabrana zbog njihove sposobnosti da se

vezuju specifično za epitop na imunogenu. Ovaj izbor se obično

zasniva na imunoenzimskim tehnikama ili radio imuno analizama koji

upotrebljavaju urođeni antigen. Ukoliko formaldehid reaguje sa amino

kiselinama unutar epitopa, antitelo neće moći da se veže i, prema

tome, neće biti od koristi u formalinski fiksiranom tkivu. Isti problem bi

50

mogao da se pojavi kada su u pitanju druge fiksirajuće tečnosti, i može

da utiče na različita antitela.

Ukoliko postoje promene prilagođavanja izazvane reakcijom

formaldehida sa amino kiselinama susednim epitopu, one se često

mogu preokrenuti upotrebom proteolitičkog varenja enzima ili

oporavkom antigena. Ako postoje promene prilagođavanja u epitopu

prouzrokovane obradom tkiva, one se nepovratne. Prema tome, jasno

je da fiksirajuće tečnosti koje formiraju dodatna jedinjenja mogu da

blokiraju imunoreaktivnost, ali, sa adekvatnim izborom monoklonalnih

antitela i adekvatnim tretmanom nakon fiksacije, formaldehid je

podesan za monoklonalna antitela nasuprot mnogim antigenima.

Do promena prilagođavanja, koje uništavaju epitope, ili ih menjaju kako

bi smanjili njihovu reaktivnost sa antitelom, može doći na nekoliko

načina. Do najčešćih promena dolazi hemijski, fiksacijom, ili fizički,

toplotom pri prožimanju parafinom. Mnogi epitopi su osetljivi na toplotu,

a tkiva se tokom kalupljenja u parafin greju do tačke topljenja voska,

što je obično između 50-60°C. Studije su pokazale da epitopi

vimentina, u reakciji sa nekim monoklonalnim antitelima, na 60°C imaju

vreme poluraspada od 10-15 minuta. Prema tome, pregrejavanje

preseka prilikom sušenja može prouzrokovati efekte štetne po

imunobojenje. Važno je ne pregrejati, ni u jednoj fazi obrade, da bi se

postigla optimalna osetljivost u imunobojenju.

Kada se upoređuju fiksirajuće tečnosti na bazi formaldehida i formalina,

i kada se pravi poređenje između imunocitohemijskih rezultata

dobijenih u dve različite laboratorije, rezultati se često razlikuju. Ovo ni

malo ne iznenađuje budući da postoje mnoge formule za ove

fiksirajuće tečnosti, i čak posebne zalihe formaldehida mogu da sadrže

različite količine mravlje kiseline i metanola. Svi ovi faktori mogu da

utiču na rezultate bojenja fiksiranih tkiva. Prema tome, iako rezultati iz

51

dve različite laboratorije mogu biti slični, ne može se očekivati da će biti

identični.

Uzimajući u obzir sve ove rizike, sledi standardna metoda fiksacije

upotrebom prirodno razblaženog formalinski rastvora:

PRIRODNO RAZBLAŽEN FORMALINSKI RASTVOR (NBF) Formalin (40% w/v formaldehyde) 100 mL

Natrijum-fosfat, jednobazičan, monohidrat 4 g

Natrijum-fosfat, dvobazičan, bezvodan 6,5 g

Destilovana voda do 1 litar

Ovaj rastvor je na sobnoj temperaturi stabilan nekoliko meseci.

Spremite male blokove tkiva (10x10x3 mm) u periodu do 24 časa.

Veliki delovi se mogu potopiti u NBF na nekoliko sati, ali blokove bi

trebalo obraditi što pre.

Još jedna česta fiksirajuća tečnost je Bovinov rastvor, koji predstavlja

mešavinu formalina i pikrinske kiseline. Ova fiksirajuća tečnost brzo

probija i vrlo dobro fiksira sva tkiva osim bubrega. Vreme fiksacije je 1-

12 sati u zavisnosti od debljine tkiva. Tkiva fiksirana duže od 12-24

sata postaju izuzetno lomljiva. Smanjuje se kvantitet lipida i oni se

menjaju, tako da antigeni koji sadrže lipid mogu biti pod uticajem. Tkiva

fiksirana u Bovinovom rastvoru se moraju oprati u etanolu od 70% radi

taloženja rastvorljivih pikrata pre pranja u vodi. Nakon isecanja

preseka, žuta boja tkiva se može otkloniti tretmanom sa natrijum-

tiosulfatom od 5% (w/v), praćenim pranjem u vodi.

BOVINOV RASTVOR Zasićena (1,2% w/v) razvodnjena pikrinska kiselina 75 mL

Formalin (40% w/v formaldehyde) 25 mL

Glacijalna sirćetna kiselina 5 mL

52

Zasićena pikrinska kiselina je komercionalno dostupna, što znači da se

može izbeći rukovanje veoma eksplozivnim kristalima pikrinske

kiseline. Zasićeni rastvor (w/v) sadrži 1,17 g/100 mL destilovane vode.

■ FIKSIRAJUĆE TEČNOSTI NA BAZI ŽIVIN HLORIDA U pokušaju da

se poboljša citološko očuvanje i minimizira deformisanost u vezi sa

fiksirajućim sredstvima na bazi formaldehida, kao i da se poboljšaju

kvaliteti bojenih parafinskih preseka, fiksirajuće tečnosti na bazi živin

hlorida, kao što su formal sublimat i B5, dobile su na popularnosti u

histopatologiji. Kao i gore navedene tečnosti na bazi formalina, i ove

često uključuju prirodnu so kako bi se održao tonus, i mogu se mešati

sa drugim osnovnim fiksirajućim tečnostima u pokušaju stvaranja

uravnoteženog rastvora. Ove tečnosti su uglavnom loši probijači i tkiva

ih ne tolerišu na najbolji način. Stoga, treba koristiti male blokove i

period fiksacije bi treblao da je kratak. Često je upotreba fiksirajuće

tečnosti na bazi živin hlorida na drugom mestu, iza formalina. Tkiva se

prvobitno fiksiraju u formal salinu ili neutralno razblaženom formalinu,

blokovi se uzimaju i potapaju u tečnost koja sadrži živin hlorid radi

daljeg fiksiranja.

Fiksirajuće tečnosti koje sadrže živin hlorid su zgrušavajuće i dodaju

se. Njihove zgrušavajuće osobine prouzrokuju znatno učvršćenje tkiva,

iz čega potiče njihova prvobitna upotreba u vidu "agenasa za

zakrečavanje". Pre pojave sredstava za kalupljenje, bilo je neophodno

potapati tkiva u tečnost, što je, pored sprečavanja autolize i truljenja, i

očvršćavalo tkivo dovoljno da bi se omogućilo isecanje tankih delova.

Ove vrste fiksirajućih tečnosti su posebno pogodne za prikazivanje

intracitoplazmičnih antigena. Zbog činjenice da je permeabilnost tkiva

veća nakon upotrebe fiksirajućih tečnosti za zgrušavanje, penetracija

antitela je bolja, što daje intenzivniju imuno boju. Međutim, moramo se

setiti da su ove tečnosti takođe aditivi. Prema tome, kao i kod

fiksirajućih tečnosti na bazi formaldehida, do gubitka imunoreaktivnosti

53

će doći kroz blokiranje specifičnih epitopa, i ovo će biti posebno

očigledno kod monoklonalnih antitela. Druga velika prednost ovih

sredstava za zgrušavanje, fiksirajućih tečnosti na bazi živin hlorida, je

to što je citološki detalj dobro očuvan, što ne samo da poboljšava

lokalizaciju krajnjeg proizvoda imunohemijske tehnike, već i

omogućava lakšu morfološku interpretaciju.

B5 se naširoko podržava za fiksaciju biopsija limfnog čvora, kako u cilju

poboljšanja citološkog detalja tako i povećanja imunoreaktivnosti sa

anti-imunoglobulinskim antiserumima korišćenim u neoplazmama ćelija

B-fenotipa. Imunohistohemijski rezultati takvih B5-fiksiranih, ćelijskih

preseka ukalupljenih parafinom su odlični, ukoliko je potrebno samo

citoplazmično imunoglobulinsko bojenje. Međutim, nije tako lako obojiti

imunoglobulin površinske membrane. Budući da B5 sadrži nizak

procenat formalina, moguće je da formalin reaguje sa površinskim

imunoglobulinom. Ograničeno proteolitičko varenje enzima ili oporavak

antigena će ovo nadoknaditi, dozvoljavajući jasno prikazivanje

površinskog imunoglobulina. Međutim, kao opšte pravilo, enzimski

predtretmani ne poboljšavaju, a mogu čak i da spreče, imunobojenje

tkiva fiksiranih u zgrušujućim fiksirajućim sredstvima.

B5 RASTVOR Živin hlorid 2 g

Natrijum-acetat 2,5 g

Destilovana voda 200 mL

B5 RADNI RASTVOR

B5 rastvor 20 mL

Formalin (40% w/v formaldehid) 2 mL

Još jedna od popularnijih fiksirajućih tečnosti ba bazi živin hlorida je

Zenkerov rastvor. Zenkerov rastvor ima iste prednosti i mane kao i B5.

54

Morfološki detalj je uglavnom dobro očuvan, ali penetracija je izuzetno

slaba ukoliko su blokovi deblji od 3-4 mm. Za Zenkerov rastvor, blokovi

i preseci moraju biti očišćeni od živinog taloga pre imunobojenja.

Vreme fiksacije je 2-15 sati na sobnoj temperaturi, u zavisnosti od

debljine tkiva. Preseci se peru u tekućoj vodi minimum sat vremena

kako bi se uklonile naslage kalijum-dihromata. Tkivo se zatim dehidrira

upotrebom rastvora za raščišćavanje A u prvom potapanju, koje

pomaže u odstranjivanju taloga žive pre sečenja. Nakon sečenja i

postavljanja preseka na čiste staklene pločicame, tkivo se ponovo

izlaže inkubaciji u rastvoru za raščišćavanje A u trajanju od 1-2 minuta.

Preseci se ispiraju u vodi, i stavljaju se u rastvor za raščišćavanje gde

se drže 1-2 minuta.

ZENKEROV RASTVOR Živin hlorid 50 g

Kalijum-dihromat 25 g

Natrijum-sulfat 10 g

Destilovana voda do 1 litar

ZENKEROV RADNI RASTVOR Zenkerov rastvor 100 mL

Glacijalna sirćetna kiselina 5 mL

RASTVOR ZA RAŠČIŠĆAVANJE A Jod 0,5 g

Etanol od 70% 100 mL

RASTVOR ZA RAŠČIŠĆAVANJE B Natrijum tiosulfat od 5% (w/v) u destilovanoj vodi

55

■ SIRĆETNA KISELINA-CINK HLORID Ova fiksirajuća tečnost sve

više raste po popularnosti, delimično zato što je u stanju da očuva

proteine membrane.

Cink hlorid 500 g

Formalin (40% w/v formaldehid) 3 L

Glacijalna sirćetna kiselina 19 mL

Destilovana voda 20 L

■ PERIODAT-LIZIN-PARAFORMALDEHID (PLP) Mnoge složene

fiksirajuće tečnosti preporučene su imunohemiji. Kao sa rutinskim

histološkim tehnikama, ove tečnosti moraju da očuvaju

mikroanatomsku vezu ćelija i citoloških detalja. Za periodat-lizin-

paraformaldehid (PLP), prvobitno opisan od strane Meklina i Nakejna4,

se veruje da je posebno koristan budući da periodat oksidira šećere u

cilju formiranja aldehida koji su međusobno vezani sa lizinom.

Paraformaldehid stabilizuje proteine. Nedavna modifikacija ovog

rastvora odnosi se na dodavanje kalijum-dihromata (PLDP).5 Ova

hemikalija se dodaje radi očuvanja lipida i fiksirajuća tečnost bi, prema

tome, trebalo da očuva sve antigenske determinante proteina, ugljen

hidrata i lipida. Međutim, mora se uzeti u obzir da, zbog formiranja

dodatnih jedinjenja, imunoreaktivnost bi mogla biti blokirana. Pored

toga, citološki detalj nije tako dobar kao kod drugih tečnosti.

PLP RADNI RASTVOR Paraformaldehid od 3% (w/v) 50 mL

M dinatrijum vodonik-ortofosfat 100 mL

Lizin 0,9 g

Natrijum periodat 0,15 g

Podesiti na pH 7,4.

56

■ ETANOL Etanol se ne koristi naširoko kao fiksirajuća tečnost za

rutinske histološke tehnike zbog svoje slabe sposobnosti penetracije.

Međutim, mali delovi tkiva se brzo fiksiraju i pokazuju dobru citološku

očuvanost. Budući da alkoholi fiksiraju zgrušavanjem, bez formiranja

dodatnih jedinjenja, na neki način su idealne fiksirajuće tečnosti za

imunocitohemiju. Seint-Mari prvi put opisuje korišćenje alkoholne

fiksacije i parafinske obrade za imunocitohemiju.6 Alkoholna fiksacija

se od tada naširoko primenjuje, posebno u istraživačkim laboratorijama

gde se veličina uzoraka i uslovi rukovanja razlikuju od rutinske

histopatološke situacije.

Budući da alkoholi spadaju u tečnosti za zgrušavanje i ne formiraju

dodatna jedinjenja, oni dozvoljavaju dobru penetraciju antitela i ne

blokiraju imunoreaktivne determinante. Međutim, promene

prilagođavanja mogu da se dogode. Alkoholi talože ugljen hidrate i,

prema tome, posebno su korisni za antigene površinske membrane,

koji često pokazuju epitope koji sadrže ugljen hidrate. U tom kontekstu,

uglavnom se primenjuju na zamrznute preseke ili otiske. Proteolitičko

varenje ili oporavak antigena nije od koristi nakon alkoholne fiksacije i

dovodi do razaranja preseka tkiva ili otiska.

■ ACETON Aceton je odlično zaštitno sredstvo imunoreaktivnih

područja, koje ostavlja većinu područja netaknute, ali je izuzetno loš

kada je reč o penetraciji. Iz ovog razloga, koristi se samo za otiske i

kriostat preseke. Fiksacija nije kompletna, i produžena inkubacija u

puferima može prouzrokovati hromatolizu ili gubitak membrana. Za

procedure, pogledajte delove o otiscima krvi i kriostat presecima.

FIKSACIJA ZA IMUNOELEKTRONMIKROSKOPIJU ■ Dilema prilikom pokušaja da se dođe do dobrog morfološkog

očuvanja održavajući imunoreaktivnost je još očiglednija u

ultrastrukturalnim imunohemijskim studijama. Za rutinsku

57

elektronmikroskopiju, uobičajena je primena prvobitne fiksacije

glutaraldehida postfiksacijom u osmijum tetroksidu. Ova kombinacija

proizvodi odličan ultrastrukturalni detalj sa dobrim očuvanjem

membrana. Međutim, kada je u pitanju imunohemija, kombinacija

glutaraldehida i osmijum tetroksida uglavnom nije korisna. U nekim

slučajevima, moguće je pretretirati ultratanke preseke vodonik-

peroksidom ili natrijum-metaperiodatom u cilju protivdelovanja na

štetne efekte osmijuma. Na žalost, ovo nije moguće u svim

slučajevima. Osim toga, prvobitna fiksacija glutaraldehida nije podesna

kada su u pitanju mnogi antigeni, bar ne pri upotrebi koncentracija

glutaraldehida korišćenih za rutinsku elektronmikroskopiju. Stoga, za

studije imunoelektronske mikroskopije, paraformaldehid se često

primenjuje samostalno ili u mešavinama koje sadrže veoma male (0,1-

0,2%) koncentracije glutaraldehida. Ili perfuzirajte životinju fiksirajućom

tečnošću nakon ispiranja salinom, ili potopite male (1x1x1 mm) delove i

ostavite 2 sata na sobnoj temperaturi. Ne fiksirajte naknadno u

osmijumu. Rutinski obradite za Epon, Lowicryl, LR belo ili LR zlatno.

RADNI RASTVOR PARAFORMALDEHID-GLUTARALDEHIDA 0,2 M Fosfat pufer, pH 7,4 50 mL

Paraformaldehid od 8% (w/v) 25 mL

Glutaraldehid od 25% (w/v) 0,8 mL

Destilovana voda 24,2 mL

Za detaljnije razmatranje o fiksaciji u elektronskj imunocitohemiji,

konsultujte tekstove navedene u Bibliografiji.

58

REFERENCE 1. Banks PM et al Am J Clin Pathol 79:438-442, 1983. 2. Moir DJ et al Br J Heamatol 55:395-410, 1983. 3. Stead RH et al Can J Med Technol 47:162-170 & 178, 1985. 4. McLean IW and Nakane PK J Histochem Cytochem 22:1077-1083,

1974. 5. Holgate CS et al J Pathol 149:293-300, 1986. 6. Sainte-Marie G J Histochem Cytochem 10:250-256, 1962.

BIBLIOGRAFIJA 1. Baker JR Principles of Biological Microtechnique. London: Methuen,

1970. 2. Lillie RD Histopathologic Technic and Practical Histochemistry (3rd

ed). New York: McGraw Hill, 1965. 3. Bullock GR and Petrusz P (eds) Techniques in

Immunocytochemistry Vol. 1. London: Academic Press, 1982. 4. Polak JM and Van Noorden S (eds) Immunocytochemistry: Modern

Methods and Applications. Bristol: Wright, 1986. 5. Polak JM and Vamdell IM (eds) Immunolabelling for Electron

microscopy. Amsterdam: Elsevier, 1984.

59

O P O R A V A K A N T I G E N A

MARK KI

■ Zbog superiornog očuvanja morfologije, formalinski fiksirano tkivo

ukalupljeno u parafin (FFPE) i dalje je metoda izbora većine kliničkih i

istraživačkih studija. Međutim, gubitak imunoreaktivnosti mnogih

antigena, izazvan kao posledica fiksacije u formalinu, postavio je

mnoge izazove. Radi boljeg razumevanja hemijske kompleksnosti

fiksacije tkiva u formalinu, čitaču se preporučuje da konsultuje dva

pregleda na tu temu.1,2

Nedostatak konzistencije, u upotrebi formalina za fiksaciju, između

laboratorija, posebno kada je reč o činiocima kao što su koncentracija,

pH i vreme izlaganja, doprinelo je pomenutoj kompleksnosti, budući da

ovi faktori znatno utiču na ishod bojenja u imunohistohemiji (IHC). Osim

toga, fiziološke i patološke promene u kompoziciji tkiva, uključujući

jukstapoziciju tkivnih proteina i njihovih antigenskih područja (epitopa),

ne dozvoljavaju precizno predviđanje ishoda fiksacije. Svaki antigen

može da sadrži od jednog do više epitopa, i svaki epitop može da se

sastoji iz pet ili više amino kiselina. Pomenute mogu biti neprekidno

vezane i/ili grupisane u trodimenzionalnoj blizini kao posledica

međumolekularnog sklapanja. Iako će formalinska fiksacija omogućiti

da se neki epitopi pojave u nepromenjenom obliku (formalin-otporni),

drugi će pretrpeti znatne promene (formalin-osetljivi). Tokom ovog

procesa, takođe je moguće unakrsno vezivanje nevezanih proteina za

ciljni antigen. Krajnji ishodi su delimičan ili kompletan gubitak

imunoreaktivnosti antigena i/ili "maskiranje" iste.

Prvi pokušaj "poboljšavanja" imunoreaktivnosti formalinski fiksiranih

antigena tkiva bio je upotrebom triptičkog varenja pre

imunofluorescentnog bojenja.3 Proteolitičko varenje nadoknađuje

60

nepropustljivu prirodu nezgrušavajućih fiksirajućih tečnosti

"graviranjem" tkiva i omogućavanjem skrivenim determinantama da se

pokažu. Od tada, drugi proteolitički enzimi, kao što su bromelain,

kimotripsin, ficin, pepsin, pronaza i mnoge druge proteaze, prijavljeni

su da su vratili imunoreaktivnost tkivnim antigenima sa različitim

stepenima uspešnosti. Međutim, upotreba enzima može, takođe, da sa

sobom nosi rizik uništavanja nekih epitopa. Formalinska fiksacija, u

spoju sa procedurama varenja, mora se optimizovati i zatim čvrsto

poštovati.4

Potpuno novi pristup za vraćanje imunoreaktivnosti u FFPE tkivnim

presecima prijavljen je od strane Šija i saradnika 1991.godine.5 Ova

tehnologija je koristila rastvore koji sadrže razne metale i mikrotalasno

grejanje za vraćanje imunoreaktivnost, i termin "oporavak antigena"

prvi put je primenjen.*

Koncept ponovnog sticanja izgubljene imunoreaktivnosti izlaganjem

toploti koja je blizu tačke ključanja vode, prvobitno je naišao na

skepticizam budući da se protivio načelu zaštite proteina od štetnog

efekta toplote. Međutim, još jedan važan korak unapred, kada je reč o

upotrobi toplote, prijavljen je od strane Katoretija i saradnika6, koji su

upotrebili citrat pufer od 6,0 pH, umesto prvobitnog metal rastvora, u

prvom uspešnom prikazivanju markera za proliferaciju Ki-67 u FFPE

tkivu. Neposredno posle toga, Goun7 i Leong8 su uspeli da primene

svoje modifikacije metoda oporavka antigena na razne vrste dodatnih

markera. Ne samo da se bojenje mnogih markera tkiva poboljšalo, već

su se, što je još značajnije, potpuno nove klase antigena, prethodno

ocenjene kao nereaktivne kada je reč o FFPE tkivima, po prvi put

uspešno pokazale. Ovde spadaju i dodatni markeri za proliferaciju,

* U alternativnu terminologiju koja se koristi danas umesto "oporavak antigena" spadaju: oporavak epitopa, grejanjem-izazvan oporavak epitopa (HIER), oporavak ciljnog antigena i demaskiranje ciljnog antigena. Dve poslednje verzije su opštije i takođe se primenjuju kada je u pitanju oporavak meta nukleinske kiseline za in situ hibridizaciju.

61

receptori za hormone (ER i PR), receptori za faktor rasta (HER2/neu),

CD markeri i drugi.

Nedavno su prijavljene kombinacije enzimskog varenja i grejanjem-

izazvanog oporavka antigena. Ickovski i saradnici9 su kombinovali

toplotu pare sa varenjem proteaze, EDTA pufer od 8,0 pH, i ostvarili

bojenje monoklonalnim anti-keratin antitelom 34ßE12. Pronađeno je da

je ovo bojenje superiorno u odnosu na bojenje ostvareno kada je

primenjena samo jedna od ovih mera. Detaljne informacije se mogu

naći na specifikaciji proizvoda za IVD odobrena antitela.

PRINCIP I TEHNIKA

■ Princip oporavka antigena se oslanja na primenu toplote u različitom

vremenskom trajanju na FFPE preseke tkiva u razvodnjenom sredstvu.

Nakon deparafinizacije i rehidracije preseka tkiva, pločice se potapaju u

razvodnjeni rastvor poznat pod nazivom "rastvor za oporavak

antigena". Iako su preporučene različite vrste hemikalija, većina

rastvora za oporavak antigena deli pH u blizini 2, 6, 8 ili 10. Nedavna

sistematska poređenja raznih rastvora za oporavak antigena pokazala

su da je 0,01 M TRIS-HCI, pH 1 ili 10, malo iznad citrat pufera od 6,0

pH i postiže globalno najbolje rezultate.10

Nakon njihovog potapanja u prethodno zagrejan rastvor za oporavak

antigena, posude koje sadrže pločice se izlažu toploti. Ovo je

najkritičniji korak i stepen do kojeg se imunoreaktivnost može povratiti

direktno zavisi od trajanja inkubacije i postignute temperature.

Najčešće primenjene metode zagrevanja obuhvataju upotrebu

mikrotalasnih rerni, autoklava, kotlova za kuvanje, hermetičkih lonaca i

vodenih kupki.7,8,11-14 Međutim, njihove prednosti i mane su predmet

ispitivanja koja su u toku, čiji su prvobitni rezultati ukratko izloženi od

strane Batifore i saradnika.15 Iako nije ustanovljena optimalna

temperatura, većina metoda oporavka antigena primenjuje temperaturu

62

u blizini tačke ključanja vode. Optimalno trajanje izlaganja toploti može

da varira između 10 i 60 minuta i, u izvesnoj meri, zavisi od dužine

formalinske fiksacije. Deluje da 20 minuta najviše zadovoljava kada je

u pitanju većina antigena i protokola fiksacije. Uglavnom se dozvoljava

postepeno rashlađivanje, što zahteva još 20-30 minuta.

Protokol za oporavak antigena (38031) dostupan je po želji. Isti je

korišćen i znatno vreme je pružao konzistentno dobre rezultate u

DAKO korporaciji.

Na većim visinama (preko 4500 stopa ili 1200 metara), do ključanja

rastvora za oporavak ciljnog antigena može doći pre nego što se

dostigne optimalna temperatura. U takvim situacijama, preporučena

alternativna procedura sastoji se u zagrevanju pločica na maksimalnoj

dostižnoj temperaturi i produženju vremena inkubacije pločica u

rastvoru za oporavak ciljnog antigena dok se ne dostigne željeni

intenzitet bojenja.16 Dodatno moguće rešenje je upotreba sistema

zatvorenog pritiska kao što je hermetički lonac ili autoklav kako bi se

dostigla temperatura od 95°C. Međutim, svaka laboratorija mora da

odredi najbolju metodu i vreme za oporavak ciljnog antigena prema

svojim specifičnim uslovima.

OPORAVAK CILJNOG ANTIGENA

■ Uprkos mnogim špekulativnim publikacijama u vezi sa tačnim

mehanizmom akcije procedura za oporavak antigena, to je i danas

uglavnom nepoznato. Ovo ne iznenađuje s obzirom na složenost

velikog broja različitih antigena i uglavnom nepoznatih promena koje

formalinska fiksacija nosi sa sobom. Jasno je da je toplota od velikog

značaja u promeni oštećenja prouzrokovanim formalinskom fiksacijom i

kalupljenjem u parafin. Koji god mehanizam da je u pitanju, neke od

uzajamnih veza izazvane formalinom moraju ostati nepromenjene jer bi

se bez tih veza proteini denaturisali toplotom primenjenom tokom

63

oporavka antigena. Ova naizgled kontradiktorna primedba se jedino

može objasniti činjenicom da su neke od uzajamnih veza reverzibilne

(Šif baze) i, prema tome, vraćaju imunohemijski integritet proteina, dok

druge to nisu (metilenski mostovi).

Iako dosta toga tek treba da se nauči, naša prvobitna briga je da

oporavak antigena funkcioniše. Buduće studije će sigurno pružiti

objašnjenja i pomoći nam da razumemo ono što za sad možemo samo

da prihvatimo.

CITOLOGIJA ■ Metode oporavka antigena su uspešno upotrebljivane i kada su u

pitanju neki citološki uzorci. Pokazano je da se, uz određene

modifikacije, procedure za oporavak antigena mogu uspešno koristiti

za ponovno sticanje estrogen receptora, Ki-67, LCA, HER2/neu i

citokeratina. Za razliku od FFPE materijala, uspeh ove metode ne

vezuje se toliko za način fiksacije budući da je lako primenljiv i na

fiksirajuće tečnosti na bazi aldehida i alkohola. Ponuđeno je mišljenje

da je imunoreaktivnost olakšana povećanjem propustljivosti ćelijskih

membrana, time dozvoljavajući pristup prethodno maskiranim ćilijama i

nuklearnim antigenima. Modifikacija obuhvata dodavanje, u rastvor za

oporavak antigena, male količine deterdženta. Takođe je bilo

neophodno smanjiti temperaturu na 37°C kako bi se održala

morfologija.

OPORAVAK CILJNOG ANTIGENA ZA IN SITU HIBRIDIZACIJU

■ Uskoro nakon otkrivanja oporavka antigena u imunohistohemiji,

istraživači su primenili slične pristupe za ponovno uspostavljanje ciljeva

nukleinskih kiselina u FFPE. Danas, mnoge metode oporavka antigena

optimizirane za nukleinske kiseline kombinuju proteolitičko varenje sa

oporavkom ciljnog antigena. Ovaj kombinovani protokol je dao bolje

globalne rezultate od bilo kojeg metoda samostalno.

Za više detalja, pročitajte poglavlje o DNA tehnologiji ispitivanja.

64

OPORAVAK ANTIGENA I NJEGOVA UPOTREBA U DVOSTRUKOM BOJENJU ■ Jedan od preduslova za uspešno bojenje nekoliko antigena u istom

preseku tkiva jeste odstranjivanje svih reaktivnih elemenata pre

primene sledećeg primarnog antitela. Ovo je postignuto upotrebom

koraka za eluciju kiseline, što za sobom ostavlja samo preobraćene

hromogene prvog ciklusa.

Upotreba DAKO EnVision sistema dvostrukog bojenja (pogledajte

poglavlje "Metode bojenja") omogućila je bojenje dva ili više tkivnih

antigena, odvojenih naizmeničnom upotrebom reagensa za oporavak

antigena umesto koraka za eluciju kiseline. Metoda dvostrukog bojenja

zasnovana na ovoj proceduri je dostupna.

Delovanje reagensa za oporavak antigena sastoji se u tome da ili fizički

odstrani reaktivne elemente i/ili da ih izmeni dovoljno kako više ne bi

bili imunoreaktivni. Ova osnovna metoda se može produžiti kako bi se

prilagodila višestrukom bojenju unutar istog tkivnog uzorka, ako se

upotrebljavaju različiti hromogeni. Sledeći hromogeni (i njihove boje)

koristili su se za simultano bojenje: DAB (braon), Fuksin (crvena), Brza

crvena (crvena), BCIP/NBT (ljubičasta) i nikal-DAB (siva).

ZAKLJUČAK

■ Dok se imunohistohemijske tehnike i dalje usavršavaju, njihova

primena u rutinskoj i istraživačkoj patologiji postaje sve korisnija.

Oporavak antigena pružio je značajan doprinos u ovom nastojanju

budući da se mnogi markeri, za koje se ranije verovalo da su izgubljeni

u FFPE procesu, sada mogu rutinski prikazati. Koristi su posebno

očigledne kada je reč o značajnim dijagnostičnim markerima kao što su

estrogen i progesteron receptori, Ki-67 i HER2/neu. Međutim, veća

osetljivost pri njihovom prikazivanju, stečena kroz oporavak antigena,

može da zahteva ponovno ocenjivanje ishoda bojenja i njegovu kliničku

interpretaciju.

65

Kao što su mnoge nedavne publikacije izložile, oporavak antigena

izazvan toplotom se pokazao kao znatno uspešniji od upotrebe

proteolitičkih enzima, i, prema tome, duboko je uticao na

imunohistohemijsku praksu. Međutim, zbog porasta broja alternativnih

metoda oporavka antigena, koji je u toku i koji obuhvata nove i bolje

rastvore za oporavak različitih antigena, neka zbunjenost postoji danas

među patolozima i histolozima. Prema tome, u budućnosti će biti

neophodno da se veća pažnja posveti standardizaciji fiksacije u vezi sa

oporavkom antigena,4,10 i vrlo verovatno da se optimizuje za svaki

pojedinačni antigen.17

REFERENCE

1. Fox CH et al. J Histochem Cytochem 1985; 33:845-853. 2. Puchtler H and Meloan SN. Histochem 1985; 82:201-204. 3. Huang SN et al. Lab Invest 1976; 35:383-390. 4. Taylor CR et al. Appl Immunohistochem 1996; 4:144-166. 5. Shi S-R et al. J Histotech Cytochem 1991; 39:741-748. 6. Cattoretti G and Suurmeijer AJH. Adv Anatomic Pathol 1994; 2:2-9. 7. Gown AM et al. Appl Immunohistochem 1993; 1:256-266. 8. Leong AS-Y and Milios J Appl Immunohistochem 1993; 1:267-274. 9. Iczkowski et al. Mod Pathol 1999; 6:889-96. 10. Shi S-R et al. Appl immunohistochem 1998; 6:89-96. 11. Shi S-R et al. J Histotech Cytochem 1995; 43:193-201. 12. Bankfalvi A et al. J Pathol 1994; 174:223-228. 13. Miller RT and Estran C. Appl Immunohistochem 1995; 3:190-193. 14. Portiansky EL and Gimeno J Appl Immunohistochem 196; 4:208-

214. 15. Battifora H et al. Adv Pathol Lab Med 2000; 8:2-19. 16. Koopal SA, Coma MI, Tiebosch ATMG, and Suurmeijer AJH. Appl

Immunohistochem 1998; 6:228-233. 17. Boenisch T. Appl Immunohistochem 2001; 9(2):176-179.

66

M E T O D E B O J E N J A

TOMAS BOENIŠ

■ Ovo poglavlje će ukratko ponoviti neke od starijih metoda i istaći

aspekte kojima nije posvećena dovoljna pažnja u prethodna dva

izdanja ovog priručnika. Nakon toga, uslediće detaljniji opis nekoliko

novijih radnih procedura, uključujući njihove prednosti i mane. Zbog sve

većeg repertoara imunohisto(cito)hemijske metodologije, istraživač će

morati pažljivo da odabere, zasnivajući svoj izbor prvobitno na tipu

uzorka za ispitivanje, dostupnom primarnom antitelu, stepenu

osetljivosti i potrebnom vremenu obrade, kao i ceni reagenasa.

Iako objavljen pre više od deset godina, danas se Specijalni izveštaj o

upotrebi metoda imunohemijskog bojenja u dijagnostičnoj citologiji, čiji

su autori Nađi i Ganđel1, smatra reper izveštajem kada je u pitanju ova

tema. Među obrađenim temama ubrajaju se važni tehnički aspekti,

procena rezultata bojenja i njihova specifična dijagnostička primena.

Pripremom uzorka ćelijskih blokova, uključujući i njihovo citohemijsko

bojenje, bavili su se i drugi.2

Još jedna tema kojom se nismo bavili u prethodnom izdanju jeste uticaj

koji dekalcifikacija biopsija kosti može da ima na imunoreaktivnost

nekih antigena. Za značajne dodatne informacije o ovoj temi, pročitajte

publikacije Mulinka i saradnika3 i Mukaija sa sardnicima.4

Kada je reč o primarnim antitelima monoklonalnog tipa, trebalo bi

obratiti pažnju na tip razblažujućeg pufera koji se upotrebljava. Bolje je

da pažljivo odaberete tečnosti za razblaživanje koje će se koristiti sa

monoklonalnim antitelima potpuno različitih karakteristika,5-9 nego da

ekstrapolaciju izvršite na osnovu višegodišnjeg iskustva u upotrebi

homogenizovanih poliklonalnih antitela.5 Na primer, 0,02M fosfat

67

razblaženog salina (PBS) se toplo preporučivao8, i još uvek se naširoko

koristi kao sredstvo za rablaživanje kada su u pitanju primarna antitela,

uključujući i ona monoklonalnog tipa. Međutim, dve nedavne

sistematske studije su pokazale da je ovaj razblažujući pufer smanjio

osetljivost imuno reakcije između većine proučavanih tkivnih antigena i

njihovih monoklonalnih antitela.7,9 Ova studija je takođe potvrdila da

dodavanje 0,15M Na++ jona Tris razblažujućim puferima može

negativno da utiče na delovanje monoklonalnih antitela, za razliku od

Tris pufera koji ne sadrže ovaj jon.7,10

Kada alkalne fosfataze služe kao enzimska marka u proceduri,

izbegavajte upotrebu fosfat pufera, jer oni sprečavaju aktivnost enzima.

Natrijum-azid, antibakterijski agens prisutan u mnogim komercijalno

pripremljenim puferima, može da spreči vezivanje enzima peroksidaze

sa svojim supstratom i da koči razvoj boja. Treba izbegavati njihovu

upoterbu u puferima za pranje i razblaživanje.

DIREKTNA METODA

■ U ovoj najstarijoj tehnici, primarno antitelo označeno kao enzim

reaguje sa antigenom u tkivu (Slika 6). Sledi upotreba supstrat-

hromogena, što zaključuje reakcioni niz. Zato što je ova metoda

upotrebila samo jedno antitelo, mogla se brzo završiti, i nespecifične

reakcije su bile ograničene. Međutim, budući da bojenje upotrebljava

samo jedno označeno antitelo, mala amplifikacija signala je postignuta i

metoda više nije dovoljno osetljiva za danšnje potrebe.

Slika 6: Direktna metoda: primarno antitelo označeno kao enzim

reaguje sa antigenom tkiva.

68

INDIREKTNA METODA U DVA KORAKA ■ U ovoj metodi, nekonjugovano primarno antitelo se prvo vezuje za

antigen. Zatim se primenjuje sekundarno antitelo označeno kao enzim

usmereno ka primarnom antitelu (sada antigenu) (Slika 7), praćeno

supstrat-hromogen rastvorom. Ukoliko je primarno antitelo napravljeno

u zecu ili mišu, sekundarno antitelo mora biti usmereno ka zečijim,

odnosno mišijim imunoglobulinima.

Ova metoda je prilagodljivija od direktne metode zato što se razna

primarna antitela iste vrste mogu koristiti sa spregnutim sekundarnim

antitelima. Procedura je, takođe, osetljivija od procedure direktne

metode, budući da će veći broj sekundarnih antitela verovatno da

reaguje sa nekoliko različitih epitopa primarnog antitela, time

pojačavajući signal pošto je veći broj molekula enzima vezan na

svakom ciljnom području.

Slika 7: Indirektna metoda u dva koraka: sekundarno antitelo

označeno kao enzim reaguje sa primarnim antitelom

vezanim za antigen tkiva.

Do neželjenih reakcija može doći ukoliko sekundarno antitelo uzajamno

reaguje sa imunoglobulinima tkivnog uzorka. Međutim, ova uzajamna

reaktivnost se danas rutinski eliminiše upotrebom unapred

69

apsorbovnog sekundarnog antiseruma, npr. antiseruma apsorbovanog

sa imunoglobulinima ispitivane vrste.

Verovatno jedna od najstarijih upotreba ove tehnike vezuje se za

detektovanje autoimunih antitela (npr. antinuklearnih antitela) u

ljudskom serumu. U ovom slučaju, pacijentov serum je poslužio kao

izvor primarnog antitela i nanet je na uzorke tkiva koji sadrže nuklearni

antigen, a zatim je naneto i sekundarno antitelo ljudskog

imunoglobulina vezano za enzim. Ukoliko bi pacijentov serum sadržao

antitela za ovaj antigen, sekundarno telo vezano za enzim bi reagovalo

sa pacijentovim antitelom i tako ukazalo na pozitivan rezultat.

INDIREKTNA METODA U TRI KORAKA ■ U indirektnoj metodi u tri koraka, drugo antitelo konjugovano

enzimom se dodaje prethodno opisanoj indirektnoj tehnici. Dva

sekundarna antitela konjugovana enzimom se nanose jedan za drugim

(Slika 8). Na primer, ukoliko je sekundarno antitelo napravljeno u kozi,

treće antitelo mora biti specifično za kozji imunoglobulin. Oba antitela, i

sekundarno i tercijarno, moraju biti konjugovana sa istim enzimom.

Dodavanje trećeg sloja antitela služi kako bi se dalje pojačao signal,

budući da je još antitela u stanju da se veže za prethodno vezani

sekundarni reagens. Ova procedura je posebno od koristi pri bojenju

antigena sa ograničenim brojem epitopa.

Indirektna metoda u tri koraka pruža jednostavan način za dalje

povećanje intenziteta bojenja u odnosu na prethodne tehnike.

70

Slika 8: Indirektna metoda u tri koraka: tercijarno antitelo označeno

kao enzim reaguje sa sekundarnim antitelom označenim

kao enzim.

TEHNIKE RASTVORLJIVOG ENZIMSKOG IMUNO KOMPLEKSA

■ Ove tehnike, ponekad zvane metodama neoznačenih antitela, koriste

unapred formirani rastvorljiv enzim-anti-enzim imuno kompleks. Kako bi

se dobio ovaj rastvorljiv kompleks, višak enzima se dodaje antitelu i

otklanja se svaka vrsta taloga.

Sekvenca bojenja ove tehnike sastoji se iz upotrebe nekonjugovanog

primarnog antitela, sekundarnog antitela, rastvorljivog enzim-anti-enzim

kompleksa i supstrat rastvora. Primarno antitelo i antitelo enzimskog

imuno kompleksa moraju biti napravljeni u istoj vrsti. Sekundarno

antitelo mora biti usmereno ka imunoglobulinima vrste koja proizvodi

primarno antitelo i enzimski imuno kompleks. Dodaje se previše

sekundarnog antitela kako bi se jedno od dva Fab područja vezalo za

primarno antitelo ostavljajući drugo područje slobodnim za vezivanje

antitela enzimskog imuno kompleksa.

Tehnike rastvorljivog enzim-anti-enzim imuno kompleksa dobile su ime

po posebnom enzimskom imuno kompleksu koji koriste. Na primer,

PAP metoda je koristila peroksidaza-antiperoksidaza kompleks.

APAAP metoda je upotrebljavala alkalna fosfataza-antialkalna

71

fosfataza kompleks. PAP kompleks se sastoji iz tri molekula

peroksidaze i dva antitela i APAAP kompleks ima dva molekula alkalne

fosfataze i jedno antitelo (Slika 9).

Slika 9: APAAP imuno kompleks reaguje sa sekundarnim antitelom.

Primarno antitelo i antitelo imuno kompleksa moraju biti

napravljeni u istoj vrsti.

Ove metode su bile osetljivije od prethodno opisanih. Tehnika se

poslužila afinitetom antitela ka antigenu (enzimu) u cilju formiranja

stabilnog imuno kompleksa, za razliku od strožeg procesa hemijskog

sprezanja. Veći stepen osetljivosti u odnosu na prethodno opisane

metode se uglavnom pripisuje većem broju lokalizovanih molekula

enzima po antigenskom području.

Godinama su PAP i APAAP procedure predstavljale najosetljivije i

najpouzdanije, i, prema tome, najpopularnije tehnike u mnogim

patološkim laboratorijama. Međutim, danas se ove tehnike samo retko

primenjuju.

(STREPT)AVIDIN-BIOTIN TEHNOLOGIJE ■ Većina metoda imunohemijskog bojenja danas u upotrebi zasnovana

je na visokom afinitetu (K = 10-15M) koji (strept)avidin (Streptomyces

72

avidinii) i avidin (kokošije jaje) poseduju ka biotinu. Oba sadrže četiri

područja za vezivanje biotina, ali zbog molekularne orijentacije

područja za vezivanje, manje od četiri molekula biotina će se u

stvarnosti vezati. Budući da je avidin glikoprotein i ima izoelektričnu

tačku (pl) od 10, ima sklonost ka ne specifičnom vezivanju za

komponente tkiva koje su nalik lektinu i koje imaju negativni naboj kod

fiziološkog pH. Danas je u velikoj meri zamenjen streptavidinom

(takođe vidite poglavlje "Bojenje pozadine").

Inherentna amplifikacija osetljivosti učinila je avidin- i streptavidin-biotin

metode poželjnijim od prethodno opisanih PAP i APAAP metoda.

Osnovna sekvenca primene reagensa sastoji se iz primarnog antitela,

sekundarnog antitela koje sadrži biotin, praćenog ili unapred formiranim

(strept)avidin-biotin-enzim kompleksom tehnike avidin-biotin kompleksa

(ABC) (Slika 10), ili streptavidinom označenim kao enzim (Slika 11). I

jedan i drugi završavaju supstrat rastvorom. Peroksidaza hrena i

alkalna fosfataza su najčešće uptrebljivani enzimski markeri. Dok su

autori ABC metoda11 objavili da je ova procedura osetljivija od PAP

metoda, Điorno12 je nakon toga pronašao da je osetljivost označene

avidin-biotin (LAB) metode približno četvorostruko do petostruko veća

od osetljivosti ABC metode. U obe metode, avidin je danas zamenjen

upotrebom streptavidina što dovodi do označene streptavidin-biotin

(LSAB) metode, odnosno do modifikovane ABC procedure.

Nekoliko modifikacija ovih tehnologija je ili povećalo osetljivost, ili

doprinelo olakšavanju procesa bojenja. Njima ćemo se baviti u

nastavku ovog poglavlja.

73

Slika 10: U ABC tehnologiji, avidin- ili streptavidin-biotin-enzim

kompleks reaguje sa sekundarnim antitelom koje sadrži

biotin.

Slika 11: U LAB ili LSAB tehnologiji, (strept)avidin označen kao enzim

reaguje sa sekundarnim antitelom koje sadrži biotin.

■ OPŠTA "ABC" PROCEDURA Formiranje ABC kompleksa zahteva

da se rastvori (strept)avidina i enzima koji sadrži biotin pomešaju u

optimalnoj razmeri, i da se pripreme minimum 30 minuta pre upotrebe.

Sve inkubacije se vrše na sobnoj temperaturi.

1. Izložite tkivo inkubaciji u trajanju od 30 minuta sa normalnim

svinjskim (zečijim) serumom.

2. Otresite serum i obrišite višak. NE ISPIRAJTE.

Izložite inkubaciji u trajanju od 30 minuta sa svakim od sledeća 3

reagensa: isperite i ostavite 3-5 minuta u puferu za pranje nakon

svakog koraka.

74

3. Primarno antitelo.

4. Sekundarno antitelo koje sadrži biotin.

5. (Strept)avidin-biotin kompleks (pripremljen minimum 30 minuta

pre upotrebe).

6. Izložite inkubaciji sa supstratom do razvoja željenog intenziteta

bojenja.

7. Isperite destilovanom vodom, izvršite kontrastiranje i prekrijte

mikroskopskim staklom.

ABC PROCEDURA UZ UPOTREBU KATALIZOVANE AMPLIFIKACIJE SIGNALA (CSA) ■ Katalizovana amplifikacija signala (CSA) koristi amplifikacioni

reagens koji prati upotrebu kompleksa streptavidin-biotin-peroksidaza

ABC protokola. Amplifikacioni reagens sadrži fenolski supstrat (biotin-

tiramid) koji je katalizovan od strane vezane peroksidaze u cilju

formiranja nerastvorljivih fenola koji sadrže biotin.13-15 Nataloženi biotini

zatim reaguju sa peroksidazom označenom kao strepatvidin,

prouzrokujući time taloženje dodatnih enzimskih molekula (Slika 12).

Sano i saradnici16 su prijavili bojenje hipofiznih hormona upotrebom

CSA sa procenjenom osetljivošću stostruko većom od oseljivosti

standardne ABC metode. U poređenju sa LSAB metodom, otkriveno je

da preko 40 primarnih antitela pozitivno reaguje primenom CSA

sistema u razblažujućim tečnostima od 20 do 200 puta većim.17 Osim

toga, pokazalo se da je CSA sistem dovoljno osetljiv da detektuje

mnoge antigene formalinski fiksiranih i tkiva ukalupljena u parafin

prethodno smatrana nereaktivnim u ovoj sredini. U kombinaciji sa

termalno izazvanim oporavkom antigena (pogledajte poglavlje

"Oporavak antigena"), CSA je znatno proširila granice

imunohistohemije.

75

KORAK 5 KORAK 6 KORAK 7

KORAK 8 KORAK 9

Slika 12: U CSA tehnologiji, primarno antitelo (korak 5) je praćeno

sekundarnim antitelom koje sadži biotin (korak 6),

streptavidin-biotin kompleksom (korak 7), amplifikacionim

reagensom (korak 8), i niz se zaključuje streptavidin-enzim

kompleksom (korak 9).

■ OPŠTA CSA PROCEDURA ZA UPOTREBU SA MONOKLONALNIM MIŠJIM PRIMARNIM ANTITELIMA 1. Izložite tkivo inkubaciji u trajanju od 5 minuta sa reagensom koji

blokira peroksidazu (neobavezno).

2. Isperite i ostavite 3 do 5 minuta u puferu.

3. Izložite inkubaciji u trajanju od 5 minuta sa reagensom koji blokira

protein kako be se smanjila pozadina.

4. Otresite suvišni proteinski blok. NE ISPIRAJTE.

Izložite inkubaciji u trajanju od 15 minuta sa svakim od narednih 5

reagenasa, ponovite drugi korak nakon svakog:

5. Primarno mišije antitelo (ili reagens negativne kontrole).

6. Zečije anti-mišije vezno antitelo koje sadži biotin.

7. Streptavidin-biotin kompleks.

8. Amplifikacioni reagens.

9. Streptavidin-peroksidaza kompleks.

76

10. Izložite inkubaciji u trajanju od 5 minuta sa supstrat-hromogen

rastvorom.

11. Isperite destilovanom vodom.

12. Izvršite kontrastiranje hematoksilinom (neobavezno) i prekrijte

mikroskopskim staklom.

LSAB TEHNOLOGIJE ■ LSAB reagensi se primenjuju sledećim redom: primarno zečije

(mišije) antitelo, anti-zečiji (anti-mišiji) imunoglobulini koji sadrže biotin i

streptavidin-enzim sprega (Slika 13). Zatim se razvija reakcija boje sa

adekvatnim supstratom/hromogenom. Iako se uglavnom preporučuju

relativno kratkotrajne inkubacije od 10 minuta, znatno povećanje

osetljivosti se može postignuti inkubacijom sa ovim reagensima

(posebno sa primarnim antitelom) u trajanju od 30 minuta.

Izuzev upotrebe adekvatno razblaženog streptavidina označenog kao

enzim, treba pratiti isti protokol kao i kod ABC procedure. Treba imati u

vidu da se antitelo koje sadrži biotin i streptavidin označen kao enzim

mogu unapred pomešati i primeniti kao kompleks, skraćivajući time ovu

proceduru za jedan korak.

KORAK 3 KORAK 4 KORAK 5

Slika 13: Tri koraka LSAB tehnologije sastoje se iz primarnog antitela

(korak 3), veznog antitela koje sadrži biotin (korak 4) i

streptavidina označenog kao enzim (korak 5).

77

■ OPŠTA LSAB PROCEDURA (HRP) ZA UPOTREBU SA MONOKLONALNIM MIŠJIM PRIMARNIM ANTITELOM 1. Izložite inkubaciji u trajanju od 5 minuta sa reagensom koji blokira

peroksidazu (neobavezno).

2. Isperite i ostavite 3 do 5 minuta u puferu za pranje.

Izložite inkubaciji u trajanju od 10 minuta sa svakim od naredna 4

reagensa; ponovite drugi korak nakon svakog:

3. Primarno antitelo (reagens negativne kontrole).

4. Vezno antitelo koje sarži biotin.

5. Streptavidin-HRP.

6. Supstrat-hromogen rastvor.

7. Izvršite kontrastiranje hematoksilinom (neobavezno) i prekrijte

mikroskopskim staklom.

TEHNIKA LANČANOG POLIMER SPREZANJA ■ Ova tehnologija (DAKO EPOSTM i DAKO EnVision sistemi) je

zaštićena patentima u Americi i Evropi, i koristi inertan "kičmeni"

molekul dekstrana označen kao enzim (Slika 14). Pored prosečnih 70

enzimskih molekula, 10 molekula antitela se mogu vezati za kičmeni

molekul. U EPOS sistemu (Povećana polimer metoda iz jednog koraka)

primarno antitelo je u sprezi sa dekstranom označenim kao enzim,

zbog čega je bojenje svedeno na jedan imunohemijski korak. Nasuprot

tome, sprezanje sekundarnog antitela dovodi do EnVision sistema u

kojem se bojenje izvodi prvo inkubacijom sa primarnim antitelom

praćenim polimerom. Sprezanje anti-zečijih i anti-mišijih sekundarnih

antitela pruža sistem koristna za poliklonlana, odnosno monoklonalna

antitela. Budući da ovi sistemi izbegavaju upotrebu (strept)avidina i

biotina, nespecifično bojenje, kao rezultat endogenog biotina, je

eliminisano.

Kao što je pomenuto, glavna prednost dobijena upotrebom EPOS i

EnVision tehnologija odnosi se na smanjen broj inkubacija obično

78

traženog protokola bojenja. Upotrebom EPOS sistema, Ćilosi i

saradnici18 su prijavili brzo bojenje izvršeno u jednom koraku i za 10

minuta. S druge strane, produženje vremena inkubacije sa primarnim

antitelom i označenim polimerom EnVision sistema, takođe može

prouzrokovati razblažene rastvore višestruko veće od upotrebljenih u

standardnom ABC ili LSAB protokolu.

Nije utvrđeno do koje mere, ukoliko uopšte, veličina molekula polimer

sprege može da predstavlja smetnju neometanoj penetraciji tkivnih

preseka.19

■ OPŠTA EPOS PROCEDURA (PEROKSIDAZA) 1. Suzbijte aktivnost endogene peroksidaze (neobavezno).

2. Isperite i ostavite 3 do 5 minuta u puferu za pranje.

3. Izložite inkubaciji u trajanju od 10-60 minuta sa EPOS spregom.

4. Ponovite drugi korak.

5. Izložite inkubaciji u trajanju od 5-15 minuta sa supstrat-

hromogenom.

6. Izvršite kontrastiranje (neobavezno) i prekrijte mikroskopskim

staklom.

■ OPŠTA ENVISION PROCEDURA (PEROKSIDAZA) 1. Izložite inkubaciji u trajanju od 5 minuta sa reagensom koji blokira

peroksidaze (neobavezno).

2. Isperite i izložite inkubaciji u trajanju od 3 do 5 minuta u puferu za

pranje.

3. Izložite inkubaciji u trajanju od 10* minuta sa primarnim antitelom.

4. Ponovite drugi korak.

5. Izložite inkubaciji u trajanju od 5-10 minuta u polimer rastvoru.

6. Dva puta ponovite drugi korak.

* Inkubacije u trajanju od 30 minuta se koriste u "EnVision+" sistemu i doprinose povećanju osetljivosti.

79

7. Izložite inkubaciji u trajanju od 5-10 minuta u supstrat-hromogenu

supstrata.

8. Ponovite drugi korak.

9. Izvršite kontrastiranje i prekrijte mikroskopskim staklom.

KORAK 3 KORAK 5

Slika 14: U EnVision sistemu koji se sastoji iz dva koraka, primarno

antitelo (korak 3) je praćeno kičmenim molekulom (korak 5)

koji sadrži u proseku 10 molekula sekundarnog antitela i 70

molekula enzima. (Koraci blokiranja peroksidaze i pranja su

izostavljeni.)

ENVISION PROCEDURE ZA SIMULTANO BOJENJE VIŠE MARKERA TKIVA ■ Procedure za simultano bojenje dva ili više antigena tkiva su često

podnosile ograničenja koja su učinila njihovu upotrebu nepraktičnom.

Međutim, tehnologija na bazi lančanog polimera EnVision sistema se

uspešno koristi u ovoj vrsti primene.20 Slika 15 pokazuje sistem u

kojem su primeri označeni kao peroksidaza i alkalna fosfataza u sprezi

sa sekundarnim antitelima protiv zeca ili miša. Korak koji se odnosi na

eluciju pre upotrebe dodatnih primarnih antitela služi za otklanjanje

prethodno vezanih primarnih i veznih antitela, ostavljajući time jedino

talog hromogena iz prethodnih koraka,21 time eliminišući proteine za

uzajamnu reaktivnost.

■ OPŠTA PROCEDURA DVOSTRUKOG BOJENJA 1. Suzbijte aktivnost endogene peroksidaze (neobavezno).

80

2. Isperite i izložite inkubaciji u trajanju od 3 do 5 minuta u puferu za

pranje.

Izložite inkubaciji u trajanju od 10* minuta sa svakim reagensom u

koracima 3, 4, 8 i 9; nakon svakog ponovite drugi korak:

3. Prvo primarno antitelo.

4. Prvo vezno antitelo/peroksidazom-spregnuti polimer.

5. Izložite inkubaciji u trajanju od 5-10 minuta sa prvim supstrat-

hromogenom.

6. Isperite destilovanom vodom.

7. Izložite inkubaciji u trajanju od 3 minuta sa reagensom za

blokiranje dvostrukog bojenja.

8. Drugo primarno antitelo.

9. Drugo vezno antitelo/polimer spregnut alikalnom fosfatazom.

10. Izložite inkubaciji u trajanju od 5-10 minuta sa drugim supstrat-

hromogenom.

11. Isperite destilovanom vodom.

12. Izvršite kontrastiranje (neobavezno) i prekrijte mikroskopskim

staklom.

KORAK 3 KORAK 4 KORAK 5 KORAK 7

KORAK 8 KORAK 9 KORAK 10

* Inkubacije u trajanju od 30 minuta se koriste u "EnVision+" sistemu i doprinose povećanju osetljivosti.

81

prvo primarno antitelo (monoklonalno) drugi anitgen tkiva

drugo primarno antitelo (monoklonalno)

HRP enzim AP enzim

sekundarno antitelo (anti-zečije) blokiranje dvostrukog bojenja

sekundarno antitelo (anti-mišije)

DAB Brza crvena

prvi antigen tkiva polimer (kičmeni molekul)

Slika 15: Za simultano bojenje dva ili više tkivnih markera EnVision

sistemom, prvo antitelo (korak 3) je praćeno kičmenim

molekulom (korak 4), upotreba hromogena za bojenje prvog

antigena (korak 5) praćena je blokirajućim reagensom (korak

7), primenom drugog primarnog antitela (korak 8), drugim

kičmenim molekulom (korak 9) i sekvenca se završava

upotrebom drugog hromogena (korak 10). Sistem dozvoljava

upotrebu kombinacije zečijih poliklonalnih i/ili mišijih

monoklonalnih primarnih antitela, peroksidaze i/ili alkalne

fosfataze, kao i hromogena kao što su DAB, Povećani DAB,

Brza crvena, Fuksin i BCIP/NBT. (Koraci blokiranja

peroksidaze i pranja su izostavljeni.)

METODE BRZOG BOJENJA ■ Mogu se desiti situacije u kojima brza histopatološka procena postaje

neophodna ili poželjna, kao, na primer, za vreme operacije.

Tradicionalno, ta vrsta procene se zasnivala skoro potpuno na

morfološkim parametrima nakon rutinskog hematoksilin ili eozin

bojenja. Razvoj primarnih antitela visokog kvaliteta i osetljivijih tehnika

bojenja, omogućio je i brzo sticanje imunohemijskih parametara koji bi

dopunili morfologiju.

Pažljiv izbor metodologije (npr. EPOS), uključujući izbor primarnih

antitela i tečnosti za razblaživanje antitela (pH, joni), znatno su

doprineli uspešnom brzom bojenju sa minimalnim smetnjama prilikom

82

bojenja pozadine.7,18,22 Međutim, protokoli brzog bojenja ne služe za

obradu više tkivnih preseka istovremeno.

REFERENCE 1. Nadji M and Ganjei P. Am J Clin Pathol 1990; 94:470-475. 2. Leung SW and Bedard YC. Modern Pathol 1993; 6:630-632. 3. Mullink H et al. J Histochem Cytochem 1985; 33:1103-1109. 4. Mukai K et al. Am J Surg Pthol 1986; 10(6):413-419. 5. Milstein C. In: Weir DM. ed. Handbook of experimental immunology.

Oxford; Blackwell Scientific Publications, 1986; 107, 1-12. 6. Larsson L-I. In: Larsson L-I. Immunocytochemistry: Theory and

practice. Boca Raton: CRC Press, 1988; 147-170. 7. Boenisch T. Appl. Immunohistochem 1999; 7(4)300-306. 8. Reimer HM and Wick MR, In: Wick MR, Siegal GP, eds. Monoclonal

antibodies in diagnostic immunohistochemistry. New York: Marcel Decker, 1988; 1-30.

9. Boenisch T. Appl Immunohistochem 2001; 9(2):176-179. 10. Van Oss CJ and Absalom DR. In Atassi MZ et al (eds). Molecular

immunology. New York: Marcel Decker, 1984:337-360. 11. Hsu S-M et al. J Histochem Cytochem 1981; 29:577-580. 12. Giorno R. Diagnostic Immunol 1984; 2:161-166. 13. Gross AJ and Sizer IW. J Biol Chem 1959; 1611-1614. 14. Bobrow et al. J immunol Meth: 1989; 125:279-285. 15. Bobrow et al. J immunol Meth: 1992; 150:145-149. 16. Sanno et al. Am J Clin Path 1996; 106:16-21. 17. Key ME and Phillips T. DAKO Research Connection, Vol. 2, #1,

1997. 18. Chilosi M et al. Biotech Histochem 1994; 69:235-239. 19. Chan JK. Seminar Diagn Pathol 2000; 17(3):170-177. 20. Spezialetti R et al. Presented at the U.S & Canada Ac Pathol 1997,

Orlando, FL. 21. Allen MH et al. Am J Dermapathol 1991; 13(3); 221-227. 22. Tacha DE and McKinney LA. J Histotech 1992; 15:127-132.

83

K O N T R O L E

TOMAS BOENIŠ

■ Kontrole reagensa i tkiva su neophodne za potvrdu rezultata

imunohistohemijskog bojenja. Bez njihove upotrebe, interpretacija

bojenja bi bila nepotpuna i rezultati sumnjive vrednosti. Naime, kontrole

utvrđuju da li su tačno praćeni protokoli bojenja, da li je došlo do

svakodnevnih varijacija ili varijacija između radnika, i da li reagensi i

dalje dobro funkcionišu. Osim toga, sve procedure namenjene za in

vitro dijagnostičku upotrebu moraju se proveravati kontrolama

reagensa i tkiva.

KONTROLE REAGENSA ■ Zbog subjektivne prirode testiranja, relevantni reagensi se moraju

kontrolisati u okviru rutinski održavanih programa za potvrdu kvaliteta, i

od strane proizvođača, i od strane korisnika. Osnovni cilj je konstatovati

da li su primarna i sekundarna antitela specifična za svoje ciljne

antigene. Kako bi se došlo do ovih informacija, od koristi mogu biti

razne imunohemijske tehnike, kao što su difuzija, imunoelektroforeza i

roketna elektroforeza. Međutim, obavezno je testiranje primarnog

antitela u imunohemiji, prvo za optimalno razblaživanje na pozitivnom

tkivu i zatim na proširenoj listi dodatnih tkiva za koje se zna da, ili

poseduju ili ne poseduju, antigen. Sekundarno (vezno) antitelo bi

trebalo da je apsorbovanog afiniteta kako bi se odredilo nereaktivnim

na proteine tkiva. Programe kvalitetne kontrole bi trebalo

dokumentovati adekvatnim vođenjem evidencije o razblažujućim

rastvorima, razblaživačima, vremenu inkubacije, i datumima kada je

bilo kakva promena uvedena u proceduru.

84

Od svih komponenti sistema imunohemijskog bojenja, primarno antitelo

je, sigurno, najkritičnija, iako će možda, s vremena na vreme, biti

potrebna promena nekog od drugih reagenasa.

Kako bi se utvrdila specifičnost primarnog antitela poliklonalnog tipa,

najbolje je zameniti ga antiserumom apsorbovanog afiniteta ili frakcijom

imunoglobulina. Apsorpcija afiniteta primarnog antitela visoko

prečišćenim antigenom, idealan je način za se postigne vredna

negativna kontrola za razlikovanje specifičnog od nespecifičnog

bojenja. Problem leži u tome što je prečišćeni antigen retko dostupan u

kliničkim histološkim laboratorijama, i u činjenici da su takve pripreme

izuzetno skupe. Prema tome, radi praktičnosti, većina laboratorija

koristi, u vidu kontrole, neimuni serum ili njegovu imunoglobulinsku

frakciju od iste vrste od koje potiče primarno antitelo, ili se opredeljuju

za primarno antitelo nerelevantne specifičnosti.

Budući da rastvorljivi agregati prisutni u imunoglobulinskim frakcijama

mogu da doprinesu nespecifičnom bojenju, ove frakcije, ukoliko se

upotrebe kao kontrole, trebalo bi da budu proizvod identičnih metoda

izolacije, da su uporedive starosti i da poseduju skoro identične

koncentracije proteina. Prema tome, verovatno je da će posedovati

slične količine agregata. Izostavljanje primarnog antitela, ili upotreba

rastvarača na njegovom mestu, ne predstavlja efektnu kontrolu. Primer

pripreme kontrole negativnim reagensom za IgG frakciju poliklonalnog

antiseruma dalje je ilustrovana:

KONCENTRACIJA PROTEINA IGG FRAKCIJE: 4,8 g/L, preporučen

razblažujući rastvor je 1:200, što dovodi do konačne proteinske

koncentracije od 4,8/200=0,024 g/L.

85

NEIMUNA ZEČIJA IMUNOGLOBULINSKA FRAKCIJA: 20 g/L;

potreban razblažujući rastvor treba odrediti na sledeći način: 20 g/L ÷

0,024 g/L = 833

RAZBLAŽUJUĆI RASTVOR KONTROLE NEGATIVNOG REAGENSA: 1:833, ili jedan deo neimune zečije imunoglobulinske

frakcije u 832 dela pufera.

Za primarna antitela monoklonalnog tipa, upotreba drugog

nerelevantog antitela verovatno predstavlj najbolju kontrolu negativnog

reagensa, iako su neimuna mišija antitela iste potklase danas dostupna

i za ovu primenu. Ponekad se koriste sredine za kulture tkiva

upotrebljivane za razmnožavanje monoklonalnih antitela, ali se njihova

upotreba ne preporučuje.

Glavni cilj, pri izboru dobre kontrole u svim klasama, je imitiranje svih

aspekata primarnog antitela izuzev specifičnosti antigena. Puferi koji se

koriste za razblaživanje antitela i kontrola moraju biti identični. Ukoliko

se ne obrati pažnja na ove činioce, može doći do konfuzije izazvane

bojenjem pozadine u pozitivno obojenom preseku, ali ne i u negativno

obrađenoj kontroli, ili obratno.

■ KONTROLE TKIVA mogu biti negativnog, pozitivnog ili internog tipa.

NEGATIVNE KONTROLE TKIVA Uzorci koji služe kao negativne

kontrole moraju se obraditi (fiksirati, ukalupiti) identično nepoznatim, ali

ne smeju da sadrže relevantan tkivni marker. Uzmimo za primer

normalnu jetru koja služi kao kontrola za jetru sa pozitivnim

površinskim antigenom hepatitis B.

POZITIVNE KONTROLE TKIVA Ponavljamo, ove kontrole se moraju

obraditi identično uzorku, ali i sadržati ciljni protein. U nekim

slučajevima, biće povoljno da boja ovog kontrolnog tkiva bude

86

delimično pozitivna, kako bi se proverilo, ne samo prisustvo antigena,

već i bilo koji mogući vid gubitka osetljivosti. Gubitak možda neće biti

očigledan ukoliko se primenjuju isključivo kontrole intenzivnog bojenja.

Kontrole gubitka osetljivosti bi bile od posebnong značaja, na primer,

prilikom bojenja tumora. U ovom slučaju, intenzitet bojenja često varila

u odnosu na stepen diferencijacije tumora.

INTERNE KONTROLE TKIVA Poznata i kao "ugrađena" kontrola, ova

kontrola je idealna zato što su eliminisani promenljivi činioci tkivne

fiksacije između uzorka i kontrola. Ugrađene kontrole sadrže ciljni

antigen, ne samo u tkivnim elementima pod nadzorom, npr. u

tumorima, već i u susednim normalnim tkivnim elementima. Jedan od

primera je prisustvo S-100 proteina i u melanomu i u normalnim tkivnim

elementima, kao što su periferni nervi i melanociti. Ugrađene kontrole

imaju dodatnu prednost koja leži u tome da odvojeni preseci pozitivne

kontrole nisu potrebni.

Batifora1 preporučuje bojenje sa vimentinom kao sredstvom za internu

kontrolu. Zbog prisustva u krvnim sudovima i stromalnim ćelijama,

vimentin se sveprisutno distribuira i, prema tome, može se naći u

svokom tkivnom uzorku. Monoklonalno antitelo V9 prepoznaje epitop

na vimentinu koji je delimično osetljiv na fiksaciju sa formaldehidom i,

stoga, deluje kao "izveštač" o kvalitetu tkivne fiksacije. Drugi

dijagnostički korisni tkivni markeri često pokazuju fiksacijom izazvane

promene paralelne onim prouzrokovanim vimentinom. Ekstrapolacijom

nad drugim antigenima, moguće je proceniti kvalitet fiksacije i olakšati

izbor terena za dijagnostičku interpretaciju.

STATUS KVO ■ Kao i u kliničkoj laboratoriji, kontrola kvaliteta u imunohemiji je od

velikog značaja. Međutim, nasuprot kvantitativnim imuno analizama,

npr. enzimskim imuno analizama (EIA ili ELISA) u kojima brojevi

pružaju definitivne kvantitativne informacije o standardizaciji i kontroli,

87

rezultati imunohemijskog bojenja, koje je samo po sebi veština, takođe

se moraju podvrći subjektivnoj interpretaciji patologa koji imaju iskustva

u različitim disciplinama.2-4

Prema tome, kontrola kvaliteta i potvrda kvaliteta u imunohistohemiji će

i dalje ostati jedna od najvažnijih tema koje zahtevaju pažnju, kako

proizvođača tako i korisnika u histopatološkoj laboratoriji. Tejlor2 je

1993. godine predložio razvoj i distribuciju standarda, koji se tiču tkiva,

za kontrolu kvaliteta i potvrdu kvaliteta za sve patološke laboratorije.

Ovo još uvek nije realizovano. Upoznavanje sa mnoštvom različitih

procedura za oporavak antigena, koje je u toku, koje ističe prednosti

jednog pufera za oporavak ili izvora toplote spram drugog, učinilo je

napore ka standardizaciji i kontroli kvalitatvne procedure još

izazovnijim.5,6 Međutim, kao i u drugim granama kliničke laboratorije,

automatizacija je znatno doprinela porastu konzistencije i kontrole kada

je reč o imunohemijskom bojenju.

U proteklih deset godina, mnoge publikacije su se pojavile koje se

ovom temom bave uopšteno, njenim specifičnim delovima i primenom

kontrole kvaliteta. Za više informacija, pročitajte Tejlorov4 uvodnik i

odobrenu direktivu za internu kontrolu kvaliteta.

REFERENCE

1 Battifora H. Am J Clin Pathol 1991; 96:669-671. 2. Taylor CR. Applied Immunohistochem 1993; 1:232-243. 3. Elias JM et al. Am J Clin Pathol 1989; 92:836-843. 4. Taylor CR. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:945-951. 5. Shi S-R et al. Appl Immunohistochm 1998; 6(2):89-96. 6. Battifora H et al. Adv Pathol and Lab Med 2000; 8:2-19. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards; Approved

Guideline; Internal Quality Control Testing: Principles and Definitions. NCCLS Document C24-A; vol 11, number 6.

88

B O J E N J E P O Z A D I N E

TOMAS BOENIŠ

■ Bojenje pozadine je verovatno najtipičniji problem u imunohistohemiji.

Tekst koji sledi baviće se glavnim uzrocima bojenja pozadine, i zatim

mogućim rešenjima kada je u pitanju ovaj problem.

HIDROFOBIČNA INTERAKCIJA ■ U razvodnjenom okruženju, do hidrofobičnih interakcija između

makromolekula dolazi kada su njihovi površinski naboji niži od naboja

vode. Međusobna privlačenja prouzrokovana ovim zovu se van-der-

Valsove sile. One mogu biti među-atomske kao i među-molekularne i

poticati iz fluktuirajuće dvopolarne strukture unutar ovih

makromolekula.

Hidrofobičnost je zajednička osobina, u različitim stepenima, većine

proteina i prenosi si se na njih uglavnom kroz bočne lance neutralnih

aromatičnih amino kiselina fenilalanin, tirozin i triptofan. Zbog svoje

niže atrakcije kada su u pitanju molekuli vode, ove amino kiseline imaju

tendenciju da se međusobno vezuju, time izbacujući vodu iz molekula.

Dok je hidrofobičnost jedna od prirodnih sila koje prenose stabilnost na

tercijarnu strukturu peptida, ona takođe prenosi stabilnost i na

formirane imuno komplekse i, u zavisnosti od faktora okoline, može da

postiji i između različitih molekula.

TKIVNI PROTEINI U tkivu, proteini su više hidrofobični kada je reč o

fiksaciji sa reagensima koji sadrže aldehid kao što je formalin ili

glutaraldehid. Povećana hidrofobičnost je često rezultat unakrsnog

vezivanja reaktivnih epsilon- i alfa-amino kiselina, koje se obe nalaze

unutar i između susednih tkivnih proteina. Stepen do kojeg doseže ovo

89

hidrofobično unakrsno vezivanje tkivnih proteina tokom fiksacije,

uglavnom zavisi od vremena, temperature i pH.

Slika 16: Nespecifično bojenje kolagena.

Promene u ovim faktorima, verovatno će prouzrokovati promenljivu

hidrofobičnost zbog promenljivog unakrsnog vezivanja tkivnih proteina.

Prema tome, nakon optimizacije, procedure fiksacije se moraju

održavati i kontrolisati. Među tkiva koja obično imaju najviše

pozadinskog bojenja izazvanog hidrofobičnim (kao i jonskim)

interakcijama spadaju vezivna tkiva (kolagen laminin, elastin,

proteoglicani i dr.) (Slika 16), epitel (keratini) (Slika 17) i adipociti

(lipoidi) ukoliko su nepravilno otstranjeni prilikom obrade ksilenom.

Preterano pozadinsko bojenje izazvano preteranom fiksacijom

formalinom, može se popraviti naknadnom fiksacijom Bovinovim,

Zenkerovim ili B5 fiksirajućim sredstvom.1

ANTITELA Kada su u pitanju glavni serumski proteini, imunoglobulini

su, na žalost, posebno hidrofobični. Generalno gledano, antitela

potklasa IgG3 i IgG1 su više hidrofobična od antitela koja pripadaju

potklasama IgG2 i IgG4. Pored toga, neke od izolacionih procedura za

antitela IgG klase promovišu formaciju agregata, time dalje

povećavajući njihovu hidrofobičnost. Čuvanje imunoglobulina takođe

može da poveća njihovu hidrofobičnost i da prouzrokuje skupljanje i

90

polimerizaciju, što često dovodi do smanjenja ili gubitka imuno

reaktivnosti. Pokazano je prateće povećanje nespecifičnog

pozadinskog bojenja upotrebom poliklonalnih IgG frakcija u odnosu na

nespecifično pozadinsko bojenje do kojeg je došlo upotrebom

originalnog celog antiseruma.2 Međutim, ova hidrofobična interakcija

između unakrsno vezanih proteina fiksiranog tkiva i frakcije antitela (ili

njihovih agregata i sprega) se može minimalizovati pažljivom

karakterizacijom reagenasa i strogim posmatranjem i održavanjem

optimalnih uslova fiksacije. Osim toga, imperativno je imati u vidu da

optimalna fiksacija može da varira od tkiva do tkiva.

Slika 17: Nespecifično bojenje epitela.

Na hidrofobično vezivanje između monoklonalnog IgG i tkivnih proteina

takođe može uticati formulacija razblažujućeg pufera. Što je veća

blizina pH razblaživača i izoelektrične tačke (pI) antitela, to će biti jača

hidrofobična interakcija. Što je niža jonska jačina razblaživača, to je

slabija jačina hidrofobične atrakcije. Sledeći anjoni i katjoni su poređani

po redosledu smanjujućeg uticaja na hidrofobičnost:

ANJONI: PO4-3, SO4-2,C1-, NO3-,SCN-

KATJONI: NH4+, K+, Na+, Ca2+

91

Među druge moguće metode smanjenja hidrofobičnih interakcija

između tkiva i proteina reagenasa ubraja se i dodavanje deterdženta

(npr. Tvin 20) ili etilen glikola razblaživaču, ili povećavanje pH vrednosti

razblaživača koji se koristi samo sa poliklonalnim antitelima.

Najšire primenjen način da se smanji pozadina izazvana hidrofobičnom

interakcijom jeste upotreba proteina za blokiranje, bilo u odvojenom

koraku, bilo dodavanjem u razblaživač antitela. Međutim, ovaj način će

biti uspešan samo ukoliko je protein za blokiranje tipa koji može

efektivno da se takmiči sa IgG-om (ili njegovim agregatima ili

spregama) za područja hidrofobičnog vezivanja u tkivu. Odvojena

inkubacija sa rastvorom koji sadrži protein za blokiranje se najbolje

obavlja neposredno pre primene primarnog antitela. Rastvor bi trebalo

da sadrži proteine identične onim prisutnim u sekundarnoj vezi ili

označenom antitelu (ali ne onim u primarnom antitelu), kako bi se

sprečilo nespecifično vezivanje sekundarnog antitela.

Dodavanje razblaživaču primarnog antitela bovin serum albumina od

1% (BSA) je verovatno najšire primenjen korak za smanjenje

nespecifičnog vezivanja izazvanog hidrofobičnom interakcijom.

Takođe se preporučuje upotreba nemasnog suvog mleka3, ili, od

nedavno, kazeina4 u cilju smanjenja pozadinskog bojenja. U poređenju

sa normalnim serumima svinje i ovce, kazein, kada se koristi kao

agens za blokiranje, kao razblaživač antietla i kao pufer kupka, je

pokazao da dovodi do značajno manje količine pozadinskog bojenja.4

Zbog današnjih različitih upotreba antitela koja sadrže biotin, treba

pomenuti da prisustvo biotina može da promeni pI antitela za 3 merne

jedinice, npr. sa pI 8, koliko sadrži antitelo, na ispod 5, koliko sadrži

sprega.5 Istaknuto je da ovo može znatno da deluje na rastvorljivost

ovih sprega, eventualno zbog povećane hidrofobičnosti.

92

JONSKE I ELEKTROSTATIČKE INTERAKCIJE

■ Jonske interakcije predstavljaju jednu od osnovnih sila koje kontrolišu

imunohemijsku interakciju između antigena i njihovih odgovarajućih

antitela. Međutim, one takođe mogu biti jedan od faktora koji doprinose

stvaranju nespecifične pozadine.

Većina poliklonalnih IgG poseduje pI u rasponu od približno 5,8 do 8,5.

Kod fizioloških pH i kada je reč o pH korišćenim za razblaživače,

antitela mogu da imaju neto negativne ili pozitivne površinske naboje.

Jonska interakcija nekih antitela sa tkivnim proteinima se može

očekivati ukoliko ovi drugi poseduju suprotne neto površinske naboje.

Zabeleženo je da područja negativnog naboja na endotelima i kolagen

vlaknima međusobno reaguju sa katjonskim spregama koje se sastoje

iz zečijih Fab fragmenata i peroksidaze hrena tipa VI (pI 10,0).6

Generalno gledano, interakcije jonskog tipa se mogu smanjiti

upotrebom razblažujućih pufera više jonske jačine. Iako dodavanje

NaCl razblažujućem puferu može da smanji pozadinsko bojenje

izazvanom jonskim interakcijama, ne preporučuje se njegova rutinska

upotreba u razblaživačima za monoklonalna antitela.7

Uprkos upotrebi antitela za citoplazmične antigene, nedavno je

ustanovljeno da je nespecifično nuklearno bojenje posledica oporavka

antigena cink sulfatom od 1%, 0,01 M citratom (pH 6,0), ili 0,01 M

Trisom (pH 9,0).8 U 2,7% ispitanih tkiva, ponavljana i intenzivna imuno

reaktivnost se jedino mogla eliminisati upotrebom viših rastvora

primarnog antitela. Kombinacija elektrostataičnih i polarnih (elektron-

primalac/elektron-davalac) sila postavljene su kao uzrok ove pozadine.

Autori su pregledali još pet dodatnih izveštaja o nespecifičnom

citoplazmičnom i nuklernom bojenju kao posledicama oporavka

antigena.

93

Na žalost, naveći deo difuznog pozadinskog bojenja je ishod

kombinacije jonskih i hidrofobičnih interakcija, i rešenja za jedan tip

interakcije mogu da pogoršaju drugi. Jedan primer mogućih

istovremenih hidrofobičnih i jonskih interakcija je nespecifično vezivanje

IgG molekula za kolagen i elastin. Još jedan primer je prianjanje

kompleksa antitela koja sadrže biotin za plastične5 i staklene površine.9

Uzroci ovog vezivanja mogu biti nepogodni uslovi pri dodavanju biotina

što dovodi do skupljnja antitela i smanjene rastvorljivosti,5 eventualno

zbog povećane hidrofobičnosti (vidite gore). Slične okolnosti mogu

doprineti i pozadinskom bojenju tkiva.

AKTIVNOSTI ENDOGENIH ENZIMA ■ Zarad praktičnosti u imunohistohemiji, "aktivnost endogene

peroksidaze" i "aktivnost pseudoperoksidaze" mogu se smatrati isitm.

Aktivnost peroksidaze rezultira raspadom H2O2 molekula, i predstavlja

često svojstvo svih hemoproteina kao što su hemoglobin (crvene

ćelije), mioglobin (mišićne ćelije), citohrom (granulociti, monociti) i

katalaze (jetra i bubreg). Do aktivnost intersticijalne peroksidaze može

doći zbog difuzije krvi pre fiksacije.

Najčešće korišćena procedura za suzbijanje aktivnosti endogene

peroksidaze u formalinski fiksiranom tkivu je inkubacija preseka, u 3%

H2O2 rastvoru, u trajanju od 5-10 minuta. Metanolski H2O2 tretman

(11 delova 3% H2O2 plus 4 dela čistog metanola) u trajanju od 20

minuta se takođe primenjuje, ali se ne preporučuje kada su u pitanju

uzorci u kojima se planira bojenje površinskih markera ćelije.

Metanolski tretman takođe može da odvoji zamrznute preseke od

njihovog staklenog nosača. Aktivnost endogene peroksidaze se može

suzbiti i mešanjem natrijum-azida i H2O2.10 Međutim, u većini

slučajeva kada se radi sa formalinski fiksiranim tkivom, uspešna

interpretacija specifičnog bojenja nije oštećena nikakvom aktivnošću

94

endogene peroksidaze. Kada je reč o pripremi ćelija i zamrznutih

preseka, preporučuje se rutinsko suzbijanje endogene peroksidaze.

Pored toga, uzorci bogati aktivnošću endogene peroksidaze se mogu

obraditi upotrebom enzimske oznake alkalne fosfataze telećih creva,

umesto peroksidazom. Tehnologija imunoalkalne fosfataze ne zahteva

suzbijanje aktivnosti endogene peroksidaze. Suzbijanje aktivnosti

endogene alkalne fosfataze tkiva, umesto iste aktivnosti creva, postiže

se jednostavno dodavanjem 5 mM levamisola u rastvor supstrata.

Aktivnost gastrointestinalne alkalne fosfataze se može poništiti

tretmanom ovih tkivnih preseka pranjem u slaboj kiselini.

PRIRODNA I KONTAMINIRAJUĆA ANTITELA

■ PRIRODNA ANTITELA Prirodna antitela niskog nivoa, prisutna u

antiserumu kao ishod prethodne središne antigenske simulacije,

verovatno mogu da povećaju svoj titar, tokom imunizacije, upotrebom

pomoćnih sredstava i, kao posledica toga, mogu prouzrokovati

nespecifično bojenje. Osborn i saradnici11 su 1979. godine objavili da

serumi neimunizovanih začeva i koza, ali ne i zamoraca, sadrže

središna antitela za keratine. Ovo može poslužiti kao primer

specifičnog epitelnog pozadinskog bojenja prouzrokovanog prirodnim

antitelima. Iako su i drugi ovo primetili, pokušaji da se izoluju ili udalje

ova antitela iz seruma, bili su neuspešni.2

Većina prirodnih antitela su netaložećeg tipa i pojvaljuju se samo u

relativno niskim koncentracijama. Ova antitela se uglavnom smatraju

nereaktivnim na tkivu ukoliko se antiserum koristi u dovoljno visokoj

razblaženosti ili ako se skrate periodi inkubacije.

■ KONTAMINIRAJUĆA ANTITELA Izolovani antigeni korišćeni za

imunizaciju su retko čisti. Ukoliko imuni sistem domaćina reaguje na

nečistoće, pojaviće se kontaminirajuća antitela. Ova kontaminirajuća

95

antitela su obično prisutna u niskim koncentracijama i neće oduzeti od

imunohistohemijske specifičnosti antiseruma visokog titra ukoliko su

dovoljno razblažena. Međutim, ukoliko kontaminirajuća antitela utiču na

specifičnost, obično se vrši apsorpcija afiniteta antiseruma. Antiserumi

"apsorbovane zalihe" skoro uvek sadrže preostale nivoe

kontaminirajućih antitela (uglavnom netaložećeg tipa) i izazvaće

nespecifično bojenje tkiva ukoliko se koriste u previše visokim

koncentracijama.2

Nadgledanje i ocena rezultata apsorpcije, upotrebom tehnika kao što

su imunodifuzija, imunoelektroforeza i raketna imunoelektroforeza,

mogu se upotrebiti jedino za određivanje nespecifičnosti, ali ne mogu

da utvrde specifičnost antiseruma. Krajnja monospecifičnost se mora

pokazati upotrebom određene tehnike i opsežnom upotrebom tkiva.

Problemi koji potiču od prirodnih i kontaminirajućih antitela, naravno, ne

pojavljuju se kada su u pitanju monoklonalna antitela.

ENDOGENA (STREPT)AVIDIN-VEZUJUĆA AKTIVNOST (EABA) ■ Endogena avidin-vezujuća aktivnost (EABA) je primećena kada je reč

o svim tehnikama na bazi biotina, i uglavnom je zasluga endogenog

biotina. Biotin, vitamin (B7) i koenzim, distribuiran je u velikom broju

raznovrsnih tkiva, posebno u jetri (jetreni čvorovi), bubregu (cevni

epiteli) i limfoidnom tkivu (parakortikalni histiociti), gde se vezuje za

enzime i druge proteine. Manje količine se nalaze u tkivu centralnog

nervnog sistema i u adipoznom tkivu (dojka). EABA se obično

posmatra unutar citoplazme i najistaknutija je upotrebom kriostat

preseka, ali je viđena i u tkivima ukalupljenim u parafin.12

Biohemijska osnova EABA se bolje razume ako se uzme u obzir

činjenica da dok avidin poseduje 4 područja za vezivanje biotina, svaki

96

molekul biotina može da veže jedan avidin molekul, time dodajući

uzorku još tri potencijalna područja za vezivanje biotina. Prema tome,

EABA se praktično najbolje suzbija izlaganjem preseka, u sekvencama,

inkubaciji u trajnaju od 10-20 minuta, prvo sa avidinom od 0,01%-

0, 1%, zatim sa biotinom od 0,001%-0,01% pre protokola bojenja.13

Slika 18: Avidin-vezujući kompleks (ABC) koji se vezuje za mastocit.

Drugi izveštaji i EABA obuhvataju neimunohemijsko bojenje mielin14 i

mastocit ćelija (Slika 18) kada su u pitanju i zamrznuta i tkiva

ukalupljena u parafin.12 Uz to, Gedson i saradnici15 su otkrili EABA u

granulocitima mišije slezine.

Budući da je avidin glikoprotein koji sadrži 10% ugljen hidrata i ima pI

od 10, on poseduje sklonost ka nespecifičnom vezivanju za tkivne

komponente nalik lektinu, odnosno za tkivne komponente negativnog

naboja kod fiziološkog pH. Streptavidin ne sadrži ugljen hidrate i ima pI

od 5, što znači da je njegovo unošenje u IHC znatno eliminisalo ove

probleme.

DIFUZIJA ANTIGENA

■ Do specifičnog pozadinskog bojenja može doći kada se tkivni

marker, namenjen za bojenje, proširi mimo svojih područja sinteze ili

97

čuvanja na okolna tkiva. Tipičan primer je difuzija tiroglobulina iz

štitastog folikularnog epitela i lumena koji sadrži koloid na okolno

stromalno tkivo (Slika 19). Slično tome, do specifične pozadine može

doći i kada je tkivni marker prisutan u velikim koncentracijama u krvnoj

plazmi i kada je prelio tkivo pre fiksacije. Ovo se može videti prilikom

bojenja tkiva krajnika radi otkrivanja imunoglobulinskih teških i lakih

lanaca (Slika 20), posebno kada fiksacija nije izvršena brzo i kada

upotrebljeni antiserumi nisu dovolno razblaženi. Još jedan oblik

specifičnog pozadinskog bojenja može biti izazvan uzimanjem ciljnih

antigena od strane fagocita, što prouzrokuje bojenje koje se obično ne

vidi kada su u pitanju takve ćelije.

UNAKRSNA REAKTIVNOST

■ Do pozadinskog bojenja izazvanog unakrsnom reaktivnošću antitela

(monoklonalnog i poliklonalnog) može doći kada se jedan ili više

epitopa antigena ciljnog tkiva dele sa drugim proteinima. Tipičan primer

je upotreba neapsorbovanog antiseruma na karcinoembrionskom

antigenu (CEA). Do nespecifičnog bojenja može doći zato što CEA deli

epitope sa nekim proteinima normalnog tkiva i antigenima krvne grupe.

Pažljiva apsorpcija takvih antiseruma ili, kada je reč o monoklonalnim

antitelima, pažljiva provera klonova, eliminisaće ovu vrstu pozadinskog

bojenja.

Nespecifična unakrsna reaktivnost antitela, sa sličnim ili različitim

epitopima na različitim antigenima, takođe može biti uzrok nejasne

pozadine. Međutim, ovo je retkost i može se izbeći upotrebom antitela

hiperimunizovanih životinja ili pažljivo odabranih klonova.

Za detaljnije informacije o unakrsnoj reaktivnost, pogledajte poglavalje

"Antitela".

98

Slika 19: Neželjeno bojenje prouzrokovano difuzijom antigena

(tiroglobulin).

Slika 20: Neželjeno bojenje proteina plazme sa antitelom na kappa

lancu. Plazme ćelije se specifično boje.

FC RECEPTORI ■ Fc receptori (FcR) predstavljaju porodicu membranskih glikoproteina

rastvorljivih u deterdžentu sa približnim molekularnim težinama od 50-

70 kD. Oni čine manje od 1% ukupnih membranskih proteina i najčešće

se nalaze na makrofagama i granulocitima, ali su zabeleženi i na B

ćelijama i nekim T ćelijama. Suštinski afinitet FcR ka monomeričnim

IgG je približno 1x106 do 1x108 M-1, ali je veći kada su u pitanju

polimeri i imuno kompleksi IgG. Postoji znatna specifičnost

klasa/potklasa i vrsta među različitim FcR. Na primer, utvrđeno je da

FcR na nekim ljudskim ćelijama vezuje mišiji monoklonalni IgG2a i

99

IgG3, ali ne druge IgG potklase.16 Kozji serumi ne reaguju sa FcR

ljudskih leukocita.17

Nespecifično pozadinsko bojenje prouzrokovano FcR je tipičnije kada

su u pitanju zamrznuti preseci i otisci, nego kada je reč o tkivima

fiksiranim grubljim procedurama. Može se izbeći upotrebom F(ab¹)2

fragmenata umesto celih IgG molekula, i pažljivom proverom

monoklonalnih antitela.

DOPUNSKI POSREDOVANO VEZIVANJE

■ Dopunski posredovano vezivanje ponekad može biti uzrok pozadine

kod zamrznutih tkiva, kada se upotrebljavaju celi antiserumi; međutim,

dok se velike zalihe antiseruma pripreme za upotrebu, mnogi dopunski

faktori postaju neaktivni.

RAZNI IZVORI ■ Difuzno bojenje svih ili većine tkivnih elemenata unutar medijuma

pod uticajem, može biti izazvano fizičkom povredom tkiva (Slika 21),

isušenjem tkiva pre fiksacije ili nepotpunom penetracijom fiksirajućeg

sredstva u tkivo (Slika 22). Primećeno je slično difuzno pozadinsko

bojenje preseka i staklene pločice, obično ograničeno na površinu

antitela pod inkubacijom, i može biti prouzrokovano sredstvom za

kalupljenje ostataka. Preseci koji se često potapaju u vodene kupke

koje sadrže proteinske dodatke, kao što su Knoks želatin ili Elmerov

lepak, takođe mogu da pokažu ovu vrstu proširene pozadine kada se

koriste u imunohistohemiji, posebno u procedurama visoke osetljivosti

bojenja. Vodene kupke bi trebalo da su oslobođene bakterijske ili

kvaščane kontaminacije.

100

Slika 21: Nespecifično bojenje smrskanih ćelija.

Slika 22: Nespecifično bojenje prouzrokovano lošom penetracijom

fiksirajućeg sredstva (donji deo).

Ponekad se može naići na nespecifično bojenje prouzrokovano

nerastvorenim zrncima hromogena.

Neimunološko vezivanje peroksidaze hrena, u slobodnom obliku ili u

obliku sprege, sa HbsAg u hepatocitima, zabeleženo je od strane

Omate i saradnika.18 Prava priroda ovog vezivanja je nepoznata.

Nekrotična područja izazvana autolizom tkiva mogu da se boje sa svim

reagensima. Nađi i Morales19 pružaju izvrsnu kolekciju obojenih ploča

koje ilustruju pozadinsko bojenje, kao i objašnjenja uzroka pozadinskog

bojenja.

Preterano kontrastiranje može da ugrozi signal specifičnog bojenja.

101

REFERENCE

1. Carol BL and Banks PM. Lab Investig 1979; 40:244-245. 2. Boenisch T. Unpublished observations. 3. Duhamel RC and Johnson DA. J Histochem Cytochem 1985; 7:711-

714. 4. Tacha DE and McKinney LA. J Histotech 1992; 15:127-132. 5. Wadsley JJ and Watt RM. J Immunol Meth 1987; 103:1-7. 6. Pino RM. J Histochem Cytochem 1985; 33:55-58. 7. Boenisch T. Appl. Immunohistochem 1999; 7(4)300-306. 8. Wieczorek R et al. J Histotech 1997; 20:139-143. 9. Conway de Macario E et al. J Immunol Meth 1986; 90:137-141. 10. Li C-Y et al. J Histochem Cytochem 1987; 35:1457-1460. 11. Osborn M et al. Proc Natl Acad Sci (USA) 1977; 74:2490-2494. 12. Hsu S-M and Raine L. In DeLellis RA(ed) Advances in

Immunohistochemistry. New York: Masson, 1984, 31-42. 13. Wood GS and Warnke R. J Histochem Cytochem 1981; 29:1196-

1204. 14. Sternberger LA and Sternberger NH. J Histochem Cytochem 1986;

34:599-605. 15. Guesdon J-L et al. J Histochem Cytochem 1979; 27:1131-1139. 16. Gadd J and Ashman LK. Clin Exp Immunol 1983; 54:811-818. 17. Alexander EL and Sanders SK. J Immunol. 1977; 119:1084-1088. 18. Omata et al. Am J Clin Pathol 1980; 5:626-632. 19. Nadji M and Morales AR Immunoperoxidase Techniques: A

Practical Approach to Tumor Diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists, 1986.

102

A U T O M A T I Z A C I J A U I M U N O H I S T O H E M I J I

ROZEN VELČER

■ Automatizacija je često suštinski ishod kada se više ne pojavljuju

ručni pokušaji. Zbog potreba visokog učinka i strogih zahteva za

reproducibilnošću ovo načelo postoji u mnogim granama medicinske

nauke, uključujući kliničku hemiju, hematologiju i bakteriologiju. Ove

službe su danas u velikoj meri automatizovane. Iako su mnogi

prvobitno verovali da je imunohistohemija (IHC) previše opšta i, prema

tome, isključena iz ovog kretanja, poslednjih nekoliko godina došlo je

do drastične promene ovog stava.

Mnogi zahtevi su doprineli automatizaciji imunohistohemije, i nijedan od

njih nije se znatno razlikovao od onih koji su preovladavali pre

automatizacije drugih kliničkih službi. To su:

■ Povećanje učinka

■ Poboljšanje reproducibilnosti i kvaliteta

■ Smanjenje cene rada i materijala

■ Poboljšanje standardizacije i među-laboratorijskih poređenja

Tipovi automatizovanih IHC bojača, koji se danas nalaze na tržištu,

međusobno se razlikuju u više aspekata, po tehnologiji za obradu

pločice, nosivosti pločice po seriji (20 do 500) i fleksibilnosti reagenasa

("otvoreni" spram "zatvorenih" sistema).

METODA KAPILARNOG PROLAZA

Jedna od prvih metoda primenjenih za automatizovano bojenje pločice

bila je upotreba principa kapilarnog prolaza. U ovoj tehnologiji, uzorci

tkiva na dve mikroskopske pločice, ili jedna mikroskopska pločica i

staklo, spajaju se formirajući između sebe prolaz definisane širine. Ovaj

103

prolaz je, uglavnom, širok 50 mikrona, i uvući će i zadržati konzistentnu

zapreminu, npr. 150 mikrolitara, time znatno doprinoseći

reproducibilnosti pri bojenju. Tokom serije, pločice se delimično

potapaju u vrele reagense, prilikom čega dolazi do popunjavanja

prolaza kapilarnom atrakcijom. Nakon svakog perioda inkubacije,

prolazi između pločica se prazne dodirivanjem upijača. Ponovno

punjenje kapilarnih prolaza i dodirivanje upijača se ponavlja prilikom

svakog koraka u kojem se koristi reagens i koraka pranja. Kada su u

pitanju sistemi u kojima se upotrebljava staklo za prekrivanje umesto

jedne od pločica, reagensi se ubacuju pipetom kroz mali levak koji se

nalazi na vrhu stakla. Kapilarni prolaz zadržava definisanu količinu

tečnosti posredstvom površinske tenzije dok se višak izliva i automatski

odstranjuje. Pranje se vrši proticanjem pufera kroz prolaze. Dovoljna

količina tečnosti je u svakom trenutku zadržana kako bi se sprečilo

sušenje preseka.

Jedan manji nedostatak, kada je u pitanju ovaj pristup, odnosi se na

činjenicu da lakoća punjenja i pražnjenja kapilarnih prolaza donekle

zavisi od individualne površinske tenzije tečnosti. Kada je reč o

sistemima koji koriste staklo za prekrivanje, formacija zarobljenih

vazdušnih mehurića se može minimalizovati nežnim tokom reagensa, u

jednom pravcu, kroz prolaz.

METODA TEČNOG PREKRIVAČA Još jedna tehnologija koja se koristila u automatizovanom bojenju

poznata je kao metoda tečnog prekrivača. U ovom slučaju, reakcijama

je dozvoljeno da deluju unutar inkubacione komore uravnotežene

toplote. Ulje se koristi da prekrije reagense kako bi se sprečilo

isparavanje prilikom inkubacije. Sistem zahteva reagense koji su

specifično optimizovani da najbolje deluju pod višim temperaturama.

104

OTVORENI SISTEM

Drugi instrumenti koji se koriste za automatizaciju, imitiraju ručno

bojenje, npr. pločice su horizontalno obezbeđene i reagensi se nanose

na tkivo upotrebom pipeta obloženih teflonom ili jednokratnim vrhovima

pipeta. Slede inkubacije na sobnoj temperaturi. Ova tehnologija

dozvoljava upotrebu istih reagenasa kao i kod ručnih procedura. Često

se naziva otvorenim sistemom zato što se mogu primenjivati reagensi i

protokoli iz bilo kojeg izvora.

Potreba za automatizacijom u anatomskoj patologiji širi se na druga

područja, kao što su in situ hibridizacija i Specijalne boje. Međutim, ove

primene zahtevaju karakteristike koje se ne nalaze često kada su u

pitanju današnji instrumenti.

Budući da nabavka instrumenata za automatizaciju obično predstavlja

veliku investiciju, individualne laboratorije bi trebalo da u obzir uzmu

sledeće:

■ NOSIVOST PLOČICE S obzirom da se različiti instrumenti razlikuju

kada je reč o broju pločica koje mogu da obrade, pažljivo treba

razmotriti trenutne i buduće potrebe.

■ OSOBLJE Procenite uticaj koji će automatizacija imati na vreme

utrošeno na ručno ispitivanje.

■ FLEKSIBILNOST Neke laboratorije zahtevaju veću fleksibilnost, u

pogledu protokola i reagenasa, od drugih. Ovo se mora uzeti u obzir pri

izboru sistema otvorenog/zatvorenog reagensa.

■ RASPOLOŽIVOST RADNOG PROSTORA Neki instrumenti

zahtevaju više laboratorijskog prostora od drugih. Uzmite u obzir da li je

105

za laboratoriju korisnija upotreba jednog velikog instrumenta, ili više

manjih.

■ IZBOR PRODAVCA Specifične potrebe laboratorije mogu uticati na

izbor prodavca. Osnovna cena instrumenta, reagenasa i softvera, kao i

kvalitet održavanja, neki su od važnih faktora.

U budućnosti, službe kliničkih laboratorija uopšte, i posebno anatomska

patologija, sve više će se oslanjati na automatizaciju. Efektno uvođenje

automatizacije, kada je reč o laboratorijskim službama, u prošlosti je

doprinelo pružanju bolje nege za pacijente, i budući napreci će,

sigurno, nastaviti ovu tradiciju.

REFERENCE

Donje reference pružaju dodatne korisne informacije o automatizaciji u

anatomskoj patologiji.

1. Floyd AD. Automated Immunostainin: The Technology and its Application. NHS Workshop, 1997.

2. Markin RS. Pathol Patterns. 1992; 98(4): Suppl. 1. 3. Barrows GH and Dowd P. ASCP Teleconference Series od Dec 7,

1995.

106

I N S I T U H I B R I D I Z A C I J A

RIČARD HARVI

UVOD ■ Skoro tri decenije, nukleinske kiseline se koriste kao sredstva za

ispitivanje bioloških materijala. Danas, postoje dve glavne kategorije

sredstava za ispitivanje koja sadrže nukleinske kiseline: čvrsta podrška

i na bazi rastvora. Ispitivanja čvrste podrške su dalje podeljena na dve

različite oblasti: in situ hibridizaciju (ISH) i sintetičku podršku. Za

potrebe ovog pregleda, detaljno ćemo se baviti samo ispitivanjima

čvrste podrške.

Najstarija i najšire upotrebljena ispitivanja nukleinskim kiselinama

spadaju u kategoriju sintetičke podrške. Tehnike Southern blot i

Northern blot, prvi put opisane sedamdesetih godina prošlog veka su,

verovatno, najpoznatije.1,2 Osnovni princip svih ispitivanja čvrste

podrške je to što su nukleinske kiseline fiksirane na veštačkoj površini,

ali i dalje dostupne za hibridizaciju. Ove nukleinske kiseline se mogu

ponašati kao ciljevi ili sredstva za ispitivanje. Ono što je interesantno,

neka od nedavno razvijenih ispitivanja ovog tipa, mikrozraci, su u

suštini samo varijacije standardnih blot-ova. Dok se kod Southern blot-

a i Northern blot-a nukleinske kiseline razdvajaju elektroforezom, i

zatim prebacuju do membrane, mikrozraci su konstruisani

sintetizovanjem ili nanošenjem nukleinskih kiselina direktno na

specifična područja površine.3 Drugi često korišćeni tipovi čvrste

podrške, korišćeni u ispitivanjima nukelinskom kiselinom, su

mikročestice ili mikrosfere.

ISH ispitivanja su u blikoj vezi sa kategorijom čvrste podrške. Glavna

razlika se sastoji u tome da su nukleinske kiseline u ISH ispitivanjima

fiksirane in situ unutar ćelije radije nego prethodno izvučene. Značajna

107

prednost ISH ispitivanja leži u tome da dozvoljava lokalizaciju

materijala za hibridizaciju unutar ćelije ili tkiva. Glavne smetnje su to

što održavajući morfologiju i strukturu ćelije, takođe uvodimo još

potencijalno inhibitornih elemenata. Istorijski gledano, većina tkiva

upotrebljenih u ISH ispitivanjima fiksirana je u formalinu i ukalupljena u

parafin. Kako bi nukleinske kiseline ovih tkivnih preseka bile dostupne

za hibridizaciju, tipično se vrši predtretman proteazom. Kao dodatak ili

alternativa tretmanu proteaze, studije opisuju primenu mikrotalasa ili

autoklava.4,5

KOMPLEKSNOST UZORKA

■ Jedan od značajnijih faktora pri izboru sistema za ispitivanje i

detekciju jeste kompleksnost uzorka. Što je kompleksnost uzorka veća,

verovatnije je da će doći do nespecifične hibridizacije. Čak i kada je

stepen unakrsne hibridizacije nizak, ukoliko je nespecifičan cilj prisutan

u dovoljnoj količini, verovatno je da će se pojaviti lažan pozitivan signal.

Postoje dva glavna koraka u ispitivanju kada se može posvetiti

problemu kompleksnosti: obrada uzoraka i dizajn sredstva za

ispitivanje. Primenom tehnike Southern and Northern blot, otklanjanje

kontaminirajućeg DNA, odnosno RNA, prilikom pripreme uzorka,

dramatično smanjuje kompleksnost uzorka. U slučaju primene tehnike

Northern blot radi identifikovanja mRNA cilja, dalje otklanjanje

ribosomalnog RNA dovešće do još 25 do 50 puta većeg obogaćenja.

Slično tome, prilikom sprovođenja ISH eksperimenta, tkivo se može

unapred tretirati hemijski ili enzimski kako bi se otklonile neke od

neželjenih nukleinskih kiselina. Pored toga, ukoliko vršimo ISH

ispitivanje za RNA metu, mogućnost unakrsne hibridizacije do

genomičnog DNA se može minimalizovati izbegavanjem jako

denaturisućih uslova. Obično se sekundarna struktura RNA može

108

otkloniti pod mnogo blažim uslovima od onih potrebnih za denaturisući

DNA.

Verovatno najbolja prilika za minimizovanje potencijlane unakrsne

hibridizacije jeste u fazi biranja sredstva za ispitivanje. Dobar izbor

sredstva za ispitivanje, delimično zahteva neko znanje kada je u pitanju

uzorak. Posedovanjem informacija o kompleksnosti uzorka, lakše je

odrediti sredstvo za ispitivanje koje ograničava homologiju na

neželjene sekvence čije je prisustvo verovatno. Zahvaljujući, delimično,

značajnom napretku koji je izazvao Projekat ljudskog genoma, postaje

sve lakše odrediti bolja sredstva za ispitivanje za sekvence ljudskog

DNA. Baza podataka, koja neprestano raste, i alatke za analizu

sekvenci, proistekli iz ovog projekta, učinili su mnogo lakšom ocenu

potencijalnih sredstava za ispitivanje.

Međutim, kada su u pitanju RNA ISH ispitivanja, ovo još uvek

predstavlja veliki problem. Zbog često varirajuće ekspresije gena u

različitim tkivima, nije verovatno da možemo da predvidimo bilo

razumljiv spisak potencijalnih RNA-a unakrsne hibridizacije, ili njihovu

količinu. Iako danas postoje neke baze podataka sa informacijama o

izrazu ljudskih gena u različitim tkivima, ove informacije su još uvek

dosta ograničene i ponekad pristrasne. Kao prvi korak u razvoju ISH

ispitivanja, verovatno još uvek vredi prvo primeniti tehniku Northern blot

na nekim uzorcima. Ovo bi trebalo da pomogne u utvrđivanju da li

primećeni signal u tkivu proističe iz prave mete ili homologa.

POTREBNA OSETLJIVOST

■ Verovatno jedan od najčešće zanemarenih, ali najvažnijih aspekata

bilo kog ispitivanja jeste potrebna osetljivost za izvršenje zadatka.

Veliki broj meta zahteva manje ukrštajućih signala kako bi se došlo do

rezultata. Iako ovo deluje da je očigledno, često je zanemareno. Kao

prvi korak pri izboru sredstva za ispitivanje, važno je proceniti broj meta

109

koje treba otkriti. Kada je u pitanju tehnika Southern blot, na primer,

unikantan ljudski gen ili sekvenca pojavljuju se približno tri miliona puta

u traci sa 10 µg DNA.6 Iako izraz RNA široko varira preko različitih

tkiva, mnoge ćelije imaju približno iste količine RNA i DNA. Kao opšte

načelo, traka sa 10 µg ukupnog RNA sadrži materijal od približno 1,4

miliona vrednih ćelija. Budući da je broj ciljnih molekula relativno visok

kod nekih od ovih ispitivanja, manja sredstva za ispitivanje ili ona sa

nižom specifičnom aktivnošću još uvek mogu biti od koristi.7

Naravno, kada je u pitanju ISH, situacija je sasvim drugačija. Za DNA

mete u normalnoj diploidnoj ćeliji, postoje samo dve kopije svake

sekvence po neoštećenoj ćeliji. Uzimajući u obzir da fiksacija i obrada

uzoraka takođe stvaraju neke od ovih materijala nepodesnih za

analizu, ovo ubrzano počinje da se približava otkrivanju unikata. Iz

ovog razloga, većina ISH ispitivanja, za otkrivanje DNA sa niskim

brojem kopija, koristi izuzetno velika sredstva za ispitivanje (tipično >

100 kb). Na ovaj način, signal koji se može detektovati može proizići i

iz malog broja ciljnih molekula.

Kada je reč o RNA analizi, izgledi su malo bolji. Relativno visoko

izražen gen može biti prisutan u stotinama hiljada kopija po ćeliji.

Međutim, i inherentna nestabilnost mRNA, i procedure obrade uzorka,

negativno će uticati na ovu figuru. Ipak, ukoliko je poruka izražena na

više od dve kopije po ćeliji, ovo ne be trebalo da je gore od DNA

analize unikata, gore opisane. U zavisnosti od upletene prirode i

količine RNA, mogućnost lažnog pozitivnog signala, prouzrokovanog

geonimičnim DNA, takođe može predstavljati dodatnu brigu.

METODA OTKRIVANJA

■ Postoji mnogo različith metoda otkrivanja na raspolaganju za

ispitivanja nukleinskim kiselinama. U suštini, one se dele na dve

kategorije: direktne i indirektne. Najstarija, i jedna od najosetljivijih

110

direktnih metoda, jeste radioaktivnost. Obeleženo sredstvo za

ispitivanje otkriva se izlaganjem filmu ili sličnom slikovnom pristupu. U

zavisnosti od toga koji se izotop koristi, tipično vreme izlaganja može

da obuhvata od nekoliko minuta, do nekoliko meseci. Još jedna

relativno stara metoda direktnog otkrivanja jeste fluorescencija.

Fluorescentne oznake na sredstvima za ispitivanje direkno se vide

upotrebom fluorometra ili fluorescentnog mikroskopa. Ostale direktne

metode obuhvataju hemijska luminescenciju i zlato. Osetljivost ovih je

obično mnogo niža od radioaktivnosti ili fluorescencije.

Postoji, takođe, i mnoštvo različitih indirektnih metoda za otkrivanje

sredstava za ispitivanje. Slično polju imunohistohemije, sredstvo za

ispitivanje može biti označeno hapetenom ili biotinom koji se koristi da

dovede enzim do područja za hibridizaciju. Enzim zatim prouzrokuje

primetan događaj (npr. hemijski luminiscentan, kolorimetričan ili

fluorescentan). Pored toga, postoje i neke novije, opširnije metode

amplifikacije signala koje su korisne kada je reč o metama u manjim

količinama.8,9

SASTAV SREDSTVA ZA ISPITIVANJE ■ DNA DNA sredstva za ispitivanje su i dalje najčešće upotrebljivan i

tip sredstava za ispitavanje u kliničkim i istraživačkim laboratorijama.

Ovo je tačno iz više razloga. Kao prvo, relativno je jednostavno

napraviti velike količine, bilo sintezom ili rastom u vektoru. Kao drugo,

najbolje su karakterizovana. Kinetika i svojstva DNA sredstava za

ispitivanje su bolje shvaćeni od RNA ili PNA sredstava za ispitivanje

(pogledajte dole). Kao treće, dolazak tehnika amplifikacije nukleinskih

kiselina, kao što je PCR, znatno je povećao njihovu raspoloživost.

Konačno, DNA sredstva za ispitivanje se mogu naći u svim veličinama

(od kratkih oligonukleotidi do megabazičnih sinteza).

111

■ RNA RNA sredstva za ispitivanje se, takođe, dosta često koriste.

Često nazivana "ribo sredstvima za ispitivanje", predstavljaju

jednostruke materijale koji su tipično sintetizovani iz vektora

posredstvom RNA polimeraze. Neke od njihovih prednosti su to što su

jednostruki (npr. ne zahtevaju prvobitnu denaturizaciju), i ukrštaju se

malo bolje, od svojih DNA duplikata, sa DNA metama. Njihove veličine

variraju od kraktkih oligonukleotida do nekoliko kilobaza. Ribo sredstva

za ispitivanje veća od nekoliko kilobaza su retkost. Jedan od glavnih

nedostataka RNA sredstava za ispitivanje je njihova inherentna

nestabilnost. RNA-ze su dosta brojne u okruženju, i izuzetno ih je teško

neaktivirati.

■ PNA Peptid nukleinska kiselina (PNA) kao sredstvo za ispitivanje

predstavlja novog člana ove kategorije.10 PNA sredstva mogu imati iste

baze kao i DNA i RNA sredstva, međutim, povezana su osloncem

amidskih spojeva (kao što su proteini) umesto šećerima i fosfatima

DNA ili RNA. Krajnji ishod ove modifikovane strukture je to da, dok se

baze i dalje povinuju pravilima Vatson-Krik vezivanja baza, kinetička

svojstva se sasvim razlikuju. PNA sredstva imaju tendenciju da se

ukrštaju mnogo brže od svojih DNA duplikata, i takođe su vrlo efektni u

razlikovanju jednobazičnih loših spojeva. PNA sredstva su, uz to, i vrlo

korisna pri ukršatnju u delovim koji učestvuju obimnoj sekundarnoj

strukturi. Osnovni nedostaci PNA sredstava za ispitivanje su to što

njihova svojstva još uvek nisu dovoljno shvaćena kao oligonukelotidi

DNA, i to što je njihova rastvorljivost mnogo niža nego kod

odgovarajućeg DNA. Uglavnom su dosta kratki (obično ispod 30 baza) i

trenutno se moraju praviti sintetički.

DUŽINA ISPITIVANJA

■ Dužina ispitivanja velikim delom zavisi od namenjene primene

sredstva za ispitivanje. Uzmimo u obzir i visoke i niske ekstreme

112

veličine sredstva za ispitivanje. Oligonukleotid od samo 16 baza

statistički je dovoljno velik da bi bio unikantan u ljudskom genomu

ukoliko se može pretpostviti da su 3,2 x 109 baze ljudskog genoma

sastavljene od nasumičnih sekvenci. Dok genom gotovo sigurno nije

sastavljen od potpuno nasumičnih sekvenci, ovo je i dalje koristan broj

za početak dizajna sredstva za ispitivanje. Sekvence od ispod 16 baza

će se, vrlo verovatno, pojaviti više puta, dok one od preko 16 baza

imaju bolju šansu da budu unikatne.

Na suprotnom kraju spektra, velika sredstva za ispitivanje takođe imaju

granice. Zbog elemenata koji se ponavljaju pronađenih u genomu, što

ispitiavnje postane veće, to je verovatnije da će doći do nekih

ponavljanja. Uz to, kada us u pitanju ISH eksperimenti, važno je da

sredstvo za ispitivanje bude dovoljno malo da probije kroz ćelijske

skele i dođe do mete. Iako je ograničenje veličine sporno, uglavnom se

smatra da je gornja granica od približno 500 baza prihvatljiva za ISH.

Veća sredstva za ispitivanje su obično rasparčana (akustičnošću ili

enzimski) do ove veličine.

VRSTE OZNAKA

■ Kao što je ranije pomenuto, izbor oznake zavisi od metode otkrivanja.

Najčešće upotrebljivane oznake su radioaktivne, fluorescentne,

hemijski luminiscentne i bioreaktivne (npr. biotin, hapten ili enzim). Iako

postoji još nekoliko oznaka koje se koriste kao sredstva za ispitivanje,

ovo su najčešće upotrebljivana. Kada je reč o prve tri vrste oznaka,

ukoliko je meta u dovoljnoj količini, ove oznake se direktno mogu otkriti.

U suprotnom, može se primeniti indirektna ili tehnika amplifikacije

signala. Tokom protekle decenije postojao je trend smanjene upotrebe

radioaktivnosti. Ovo je delimično prouzrokovano regulacionim i

bezbednosnim ograničenjima. Ovo je, takođe, i rezultat činjenice da

druge metode otkrivanja pružaju sličnu osetljivost.

113

METODE OZNAČAVANJA

■ Postoje mnogi načini za stavljanje oznake na sredstvo za ispitivanje.

Kada je u pitanju radioaktivno sredstvo, izotop je obično modifikovan

atom jedne od baza. Uglavnom, oznaka se uvodi tokom polimerizacije

sredstva za ispitivanje (sintetički ili enzimatično). U nekim slučajevima,

radioaktivnost se dodaje nakon sinteze (npr. kinaza). Za neke od

drugih vrsta oznaka, koristi se spona radi spajanja oznake i sredstva za

ispitivanje (ili na, ili između baza). U ovim slučajevima, modifikovana

baza se može uključiti tokom sinteze, ili se spona može uvesti tokom

sinteze, a oznaka vezati kasnije. Još jedna metoda je sintetičko

dodavanje oznake na 5' ili 3' kraj nukleinske kiseline. Enzimi se mogu

vezati direktno za sredstva za ispitivanje primenom jedne od ovih

tehnika.

Postoje i manje direktne metode za stavljanje ozanka na sredstva za

ispitivanje. Psoralen i platina predstavljaju druga dva načina dodavanja

označenog materijla sredstvu za ispitivanje nakon sinteze. Obe metode

dozvoljavaju dodavanje različitih oznaka. Još jedna prednost ovih

metoda je to što veličina sredstva za ispitivanje može pažljivo da se

podesi pre označavanja. Sve u svemu, većina ovih metoda dozvoljava

selektivno označavanje sredstava za ispitivanje u raličitim stepenima

specifične aktivnosti.

ZAKLJUČAK

■ Postoji mnogo različitih vrsta sredstava za ispitivanje i metoda

njihovog označavanja. Izbor velikim delom zavisi od željene primene.

Veoma je važno kombinovati dizajn sredstva za ispitivanje sa

namenjenom primenom i metodom otkrivanja. Nezavisno od koraka

napravljenih ka optimiziranju delovanja sredstva za ispitivanje, obrada

uzorka i predtretmani i dalje predstavljaju dva najveća izvora

promenljivosti kada je u pitanju delovanje ispitivanja.

114

Nedavni napreci, kada je reč o dizajnu sredstava za ispitivanje i

amplifikaciji signala, danas su učinili mogućim posmatranje mRNA

izraza ISH-om. Kada se ove metode povećaju, verovatno je da će ISH

mRNA ispitivanja početi da postaje rutinsko testiranje u klinikčoj

laboratoriji. Do tada, ostaju u osnovi sredstva za istraživanje.

REFERENCE

1. Southern, EM. (1975). J. Mol. Biol. 98:503. 2. Alwine JC, Kemp DJ and Stark GR. (1977).

Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 74:5350. 3. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. (1995). Science

270:467. 4. Sperry A, Jin L and Lloyd RV. (1996). Diagn. Mol. Pathol. 5:291. 5. Oliver KR, Wainwright A, Heavens RP and Sirinathsinghji DJ.

(1997). J. Neuorsci. Methods 77:169. 6. Human genome (haploid) = 3.2 x 1012 base pairs; at 660 g/mol bp,

this gives approximately 7 pg DNA per diploid cell; so, 10 µg DNA @ 2 copies/7 pg = 2.86 million copies.

7. Specific activity of a probe is defined as the number of labels per unit mass of probe.

8. Bobrow MN, Litt GJ, Shaughnessy KJ, Mayer PC and Conlon J. (1992). J. Immunol. Methods 150:145.

9. Lizardi PM, Huang X, Zhu Z, Bray-Ward P, Thomas DC and Ward DC. (1998). Nat Genet. 19:225.

10. Egholm M, Buchrdt O, Christensen L, Behrens C, Freier SM, Driver DA, Berg RH, Kim SK, Norden B, Nielsen PE. (1993). Nature 365:566.

115

O B R A D A T K I V A

KAREN N. ATVUD I GRUPA TEHNIČKIH SLUŽBI

DAKO KORPORACIJE

■ Kao što je ilustrovano u poglavlju Rešavanje problema, pravilna

obrada tkiva i fiksacija su obavezni kada je reč o pripermi uzoraka za

imunohistohemijsko bojenje. Iako pravilne tehnike predstavljaju samu

osnovu odgovornog IHC bojenja, često su zanemarene. Naredne

metode obrade uzoraka, predstavljene u ovom poglavlju, ne bi trebalo

da se smatraju sveobuhvatnim. Naime, one su ponuđene kao mogući

protokoli za usvajanje u IHC laboratoriji.

OBRADA UZORKA

■ PRIPREMA OTISAKA ĆELIJE

PERIFERNI OTISCI KRVI:

NANOŠENJE GURANJEM:

1. Sakupite svežu krv i odmah pripremite pločice ili sakupite krv u

epruvetu koja je obložena sredstvom protiv zgrušavanja i

pripremite pločice u naredna 2 sata.

2. Nanesite kap sveže ili nezgrušane cele krvi na čistu,

nezamašćenu pločicu par centimetara od kraja.

3. Palcem i kažiprstom desne ruke, držite kraj druge pločice za

razmazivanje naslonjenu na centralni deo prve pločice pod uglom

od približno 30-45 stepeni.

4. Povucite pločicu za razmazivanje unazad da bi dodirnula kap krvi,

dozvoljavajući da se uzorak raznese po njenoj ivici. Gurnite

pločicu za razmazivanje napred dok se sva krv ne razmaže

stvarajući tanak sloj.

5. Vazdušno sušite 2-18 sati.

116

NANOŠENJE POVLAČENJEM:

1. Sakupite svežu krv i odmah pripremite pločice ili sakupite krv u

epruvetu koja je obložena sredstvom protiv zgrušavanja i

pripremite pločice u naredna 2 sata.

2. Nanesite kap sveže ili nezgrušane cele krvi na čistu,

nezamašćenu pločicu par centimetara od kraja.

3. Drugom pločicom prekrijte uzorak i dozvolite da se krv razmaže

između dve pločice. Izbegavajte pritiskanje pločice.

4. Odvojite pločice povlačenjem u pravcu paralelnom u odnosu na

njihove površine.

5. Vazdušno sušite 2-18 sati.

■ OTISCI KOŠTANE SRŽI DIREKTNO NANOŠENJE:

1. Nanesite kap sveže, nezgrušene srži na staklenu mikroskopsku

pločicu par centimetara od kraja. Sive čestice srži bi trebalo da se

mogu videti golim okom.

2. Palcem i kažiprstom desne ruke, držite kraj druge pločice za

razmazivanje naslonjenu na centralni deo prve pločice pod uglom

od približno 30-45 stepeni. Pločica za razmazivanje ne bi trebalo

da je šira od 2 cm.

3. Povucite pločicu za razmazivanje unazad da bi dodirnula kap srži,

dozvoljavajući da se uzorak raznese po njenoj ivici. Gurnite

pločicu za razmazivanje napred dok se ćelijski elementi ne

razmažu formirajući sloj dugačak 3-5 cm. Čestice srži se vuku iza

pločice, ali treba voditi računa da se ne smrskaju ćelije.

Optimalno, svaka čestica je ostavila trag ćelija.

4. Vazdušno sušite 2-18 sati.

PRIPREME SMRSKAVANJA:

1. Nanesite kap sveže, nezgrušene srži na staklenu mikroskopsku

pločicu par centimetara od kraja.

117

2. Drugom pločicom prekrijte uzorak i lagano pritisnite dok se ćelijski

elementi ne spljoskaju.

3. Odvojite pločice povlačenjem u pravcu paralelnom u odnosu na

njihove površine. Pojava neobičnih rupa na sloju prouzrokovana je

mašću i pruža potvrdu da je u upotrebi srž, a ne samo krv.

4. Vazdušno sušite 2-18 sati.1

■ CITOCENTRIFUGOVANE ĆELIJE

1. Sakupite perifernu krv ili koštanu srž u epruvetu koja je tretirana

heparinom. Pripreme za citocentrifugu normalnih ljudskih

mononuklearnih ćelija se moraju pripremiti upotrebom sveže

sakupljenih uzoraka.

2. Odvojite leukocite prvo razblaživanjem sa jednakim delovima

Hankovog uravnoteženog slanog rastvora (GIBCO) i zatim

nanošenjem slojeva preko FicollPaque sredstva za odvajanje

limfocita (Pharmacia) i centrifugovanjem 15 minuta na 750xg.

Kao alternativa, za razdvajanje ćelija, može se koristiti

Lymphoprep (Nycomed).

3. Mononuklearni sloj ćelije se zatim aspirira i resuspenduje u

adekvatnom sredstvu kako bi se dostigla gustina ćelije od 1x106

ćelija/mL u TRIS-razblaženom salinu (TBS), koji sadrži 1-5%

bovin serum albumina.

4. Citocentrifugalne pripreme se vrše upotrebom četiri kapi ćelijske

suspenzije centrifugom na 500 rpm (prilbližno 20xg) u trajanju od

3-4 minuta.

5. Pločice bi trebalo brzo izvaditi iz rotora i brzo vazdušno sušiti 2-18

sati.

■ OTISCI LEUKOCITA (UBLAŽENI SLOJ) 1. Pomešajte svežu celu krv sa jednakom količinom dekstran

rastvora, kao što je 6% Lomodex, i dozvolite da se eritrociti

talože.

2. Centrifugujte i odstranite supernatant plazmu.

118

3. Koristeći resuspendovane ćelije iz palete belih zrnca, nanesite

kap na steklenu mikroskopsku pločicu par centimetara od kraja.

4. Drugom pločicom prekrijte uzorak i dozvolite da se krv razmaže

između dve pločice. Izbegavajte pritiskanje pločice.

5. Odvojite pločice povlačenjem u pravcu paralelnom u odnosu na

njihove površine.

6. Vazdušno sušite 2-18 sati.

POSLE SUŠENJA: Pločice koje nisu namenjene za bojenje treba

postaviti jednu uz drugu, umotati u aluminijumsku foliju i čuvati na

temperaturi od -20 do -70°C najviše 6 meseci.

PRE FIKSACIJE: Dozvolite zamrznutim i rashlađenim pločicama da

dostignu sobnu temperaturu pre nego što ih otpakujete.

FIKSACIJA:

1. Fiksirajte u aceton:metanolu* ili aceton:metanol*:formalinu 90

sekundi na sobnoj temperaturi.

2. Prenesite pločicu direknto do TBS-a.

3. Ostavite u TBS-u 1-5 minuta.

Ne dozvolite da se pločice osuše ni u jednoj fazi posle fiksacije.

Aceton:metanol*

Aceton 1 deo

Metanol* 1 deo

Aceton:metanol*:formalin

Aceton 19 delova

Metanol* 19 delova

Formaldehid (40%) 2 dela

PRIPREMA PRESEKA TKIVA

* Ukoliko je antigen pripremljen za bojenje osetljiv na metanol, etanol se može koristiti kao rezervni reagens.

119

■ KRIOSTAT ZAMRZNUTI PRESECI 1. Isecite tkivo do približno 4mm³.

2. Brzo zamrznite u tečnom azotu i čuvajte na temperaturi od -70°C.

Po želji, tkivo se može ukalupiti u mešavinu polivinil

alkohol/polietilen glikol ili želatin.

3. Kleštima, polako potopite bazni kalup u približno 2 inča tečnog

azota, dok se potpuno ne zaledi.

4. Zamrznute kocke se uvijaju u aluminijumsku foliju i čuvaju se na

temperatori od -70°C.

5. Kocke namenjene za sečenje se ostavljaju u kriostatu od -20°C

najmanje sat vremena pre sečenja.

6. Isecite preseke debljine 4-10µ i postavite za raskravljenje na

čistim staklenim pločicama. Upotreba lepljivog premaza ili

rezervnog agensa, kao što je poli-L-lizin, elektrisanje, ili

salinizacija, može poboljšati prianjanje tkiva.

7. Odmah fiksirajte u acetonu 10 sekundi na sobnoj temperaturi.

8. Vazdušno sušite 12-24 sata.

Alternativna metoda: Kako bi se proces sušenja ubrzao, vazdušno

sušite 30 minuta, fiksirajte 10 minuta u svežem acetonu, zatim opet

vazdušno sušite 30 minuta.

■ PARAFINSKI PRESECI 1. Fiksirajte uzorke tkiva u skladu sa utvrđenim laboratorijskim

protokolima. Najčešće upotrebljivana sredstva za fiksiranje sadrže

formalin. Kako biste odredili da li ove fiksirajuće tečnosti

odgovaraju markeru namenjenom za upotrebu, proverite

specifikaciju primarnog antitela za dodatne informacije. Pored

formalina, nekoliko drugih fiksirajućih tečnosti se često koristi za

održavanje tkiva. Molimo vas da, za dodatne informacije,

pogledate poglavlje o fiksaciji u ovom priručniku.

120

2. Isecite tkivo do približno 4mm³ i dehidrirajte u alkoholima rastućih

koncentracija. Tipično su koncentracije sledeće:

a. 60%

b. 65%

c. 95%

d. apsolutni alkohol

3. Uklanjanje alkohola sa tkiva se može izvršiti upotrebom ksilena ili

njegove zamene.

4. Ubacite ili ukalupite tkivo u tečni parafin. Temperatura ne bi

trebalo da prelazi ~58°C. Treba imati u vidu da, u zavisnosti od

melekularne težine parafina, tačka topljenja će varirati od 48-

66°C. Uglavnom, tačka topljenja parafina korišćenog u histološkoj

laboratoriji je ~55-58°C.

5. Isecite preseke debljine 4-8µ i stavite na čiste staklene pločice.

Upotreba lepljivog premaza ili rezervnog agensa, kao što je poli-L-

lizin, elektrisanje, ili silanizacija, može poboljšati prianjanje tkiva.

6. Vazdušno sušite 12-24 sata na sobnoj temperaturi, preko noći na

37°C ili na 60°C sat vremena.

NAPOMENA: Upotreba proizvoda koji sadrže proteine, kao što su

komercijalno dostupna jedinjenja koja eventualno sadrže želatin,

Elmerov lepak ili Knoks želatin, u vodenoj kupki dovodi do

kontraindikacije ukoliko se tkivo postavlja radi IHC bojenja. Proteini u

kupki će se vezivati za lepljivi premaz pre nego što se tkivo postavi na

staklenu pločicu. Tokom predtretmana i/ili IHC precedura, može se

desiti da se tkivo delimično odvoji od staklene pločice, time

omogućavajući IHC reagensima da ostanu ispod, ili može doći do

potpunog odvajanja uzorka. Pored toga, IHC reagensi se mogu

nespecifično vezati za ovaj proteinski sloj, doprinoseći time

pozadinskom bojenju.

121

POSLE SUŠENJA: Pločice koje nisu namenjene za bojenje treba

postaviti jednu uz drugu, umotati u aluminijumsku foliju i čuvati na

temperaturi od -20 do -70°C. Pločice sa parafinskim presecima bi

trebalo čuvati na sobnoj temperaturi ili na 2-8°C.

PRE FIKSACIJE: Dozvolite zamrznutim i rashlađenim pločicama da

dostignu sobnu temperaturu pre nego što ih otpakujete.

FIKSACIJA I OTKLANJANJE VOSKA

■ KRIOSTAT ZAMRZNUTI PRESECI 1. Fiksirajte pločicu u hladan aceton od 100% na 10 minuta.

2. Ostavite 1-5 minuta u TBS-u.

3. Ne vršite blokiranje peroksidaze upotrebom H2O2 ili

H2O2/metanol pre nego što se završi korak koji se tiče primarnog

antitela.

■ PARAFINSKI PRESECI 1. Stavite pločice u ksilensku kupku i izvršite inkubaciju u trajanju od

5 minuta. Promenite kupku i ponovite još jednom.

2. Otresite suvišnu tečnost i stavite pločice u etanol od 95-96% na 3

minuta. Promenite kupku i ponovite još jednom.

3. Otresite suvišnu tečnost i stavite pločice u etanol od 70% na 3

minuta. Promenite kupku i ponovite još jednom.

4. Otresite suvišnu tečnost i stavite pločice u DI vodu na najmanje

30 sekundi.

REFERENCE 1. Henry, John Bernard MD; Clinical Diagnosis & Managment by

Laboratory Methods 18th edition; Philadelphia, W. B. Saunders, 1991 p. 621-622.

2. Sheehan, Dezna: Hrapchak, Barbara; Theory and Practice of Histotechnology, 2nd edition; Columbus, Battelle Press, 1987.

3. National Committee for Clinical Laboratory Standards; Approved Guideline; Internal Quality Control Testing: Principles and Definitions. NCCLS Document C24-A; vol 11, number 6.

122

O T K R I V A N J E G R E Š A K A

KAREN N. ATVUD I GRUPA TEHNIČKIH SLUŽBI

DAKO KORPORACIJE

■ Imunohistohemija je dug proces koji zahteva specijalizovanu obuku u

obradi tkiva, izboru podesnih reagenasa i u interpretaciji obojenih

tkivnih preseka. Uopšte, IHC tehnike bojenja dozvoljavaju vizuelno

predstavljanje antigena sekvencijalnom primenom specifičnog antitela

na antigen, sekundarnog antitela na primarno antitelo, enzimski

kompleks i hromogenski supstrat. Enzimsko aktiviranje hromogena

dovodi do vidnog ishoda reakcije na području antigena. Zbog svoje

kompleksne prirode, uzroci neočekivanih negativnih reakcija,

neželjenog specifičnog bojenja ili neželjene pozadine, teško da bi se

mogli izolovati. Mi, Tehnička služba DAKO korporacije, se nadamo da

će vam informacije u ovom poglavlju omogućiti da odredite tačno

ležište problema sa kojima se susrećete prilikom procedure bojenja, i

da ih rešite. S ovim ciljem, razvili smo sistem pomoćnih sredstava za

otkrivanje grešaka u histološkoj laboratoriji.

Prvi deo je kompilacija tipičnih problema koji se pojavljuju pri upotrebi

imunohistohemijskih reagenasa za bojenje, fundamentalnih uzroka

neuspešnog bojenja i preporučenih korektivnih radnji. Tabela je

podeljena na deolove koji opisuju malo ili ni malo bojenja, opšte i

delimično bojenje pozadine.

Drugi deo predstavlja metodu sistematskog dodavanja jednog po

jednog IHC reagensa kako bi se utvrdilo u kojoj fazi dolazi do

nespecifičnog ili neželjenog bojenja u sistemu bojenja peroksidaze ili

alkalne fosfataze.

123

Treći deo je jednostavna tabela koja se koristi kako bi se definisali tip

uzorka tkiva, reagensi IHC bojenja i pomoćni reagensi koji već postoje

u laboratoriji, i protokol bojenja koji primenjuje osoblje u laboratoriji.

Predlažemo vam da napravite duplikat ove tabele i da je koristite kao

pomoć pri otklanjanju problema unutar vašeg sistema bojenja.

PRVI DEO

■ Problemi otkrivanja grešaka na koje najčešće nailazimo kada je u

pitanju imunohistohemijsko bojenje.

Slika 23

Slika 24

Ispitivanja koja su u toku, i vrše se u Laboratoriji za istraživanje i razvoj

DAKO korporacije, potvrđuju da pH i jonska sadržina razblaživača

antitela mogu da imaju značajan uticaj kada je u pitanju osetljivost

monoklonalnih antitela.

124

Hodžkinova limfoma obojena sa CD30 (klon Ber-H2) antitelom,

upotrebom trodelnog sistema bojenja imunoperoksidaze. Slika 23: anti-

CD30 razblažen 1:50 sa Tris-HCI-om, pH 7,6. Slika 24: anti-CD30

razblažen 1:50 sa PBS-om, pH 7,0.

NEADEKVATNO BOJENJE

■ Malo ili ni malo bojenja kontrola ili tkiva uzoraka, izuzev kontrastiranja. Može se videti malo ili ni malo pozadinskog

bojenja.

MOGUĆI UZROK REŠENJE STR.

Izostavljeno primarno

antitelo ili označeni

reagens.

Reagensi upotrebljeni

pogrešnim redosledom.

Ponovite proceduru služeći se

specifikacijom proizvođačevog

sistema bojenja ili ček listom

reagensa standardne operacione

procedure utvrđenom od strane

indivudualne laboratorije.

Preterano razblaženi ili

preterano koncentrisani

reagensi; neadekvatno

vreme i temperatura

inkubacije.

Odredite tačnu koncentraciju za

svaki reagens. U zavisnosti od

stepena u kojem je postigunuto

bojenje, ako je postignuto, može biti

potrebna promena (od dvostruke do

petostruke) u koncentraciji. Vreme i

temperatura inkubacije su

međusobno proporcijalni i uticaće

na ishod. Kako bi odredili optimalan

inkubacioni protokol, menjajte ili

vreme ili temperaturu za svaki

reagens u IHC sistemu bojenja.

Obično, vreme trajanja inkubacije se

može produžiti ukoliko se primeti

mala količina ili odsustvo pozadine.

125

Primarno antitelo

razblaženo neadekvatnim

puferom.

■ Upotreba PBS ili TBS

kao razblaživača za

antitelo.

■ Nedostatak

stabilizujućeg ili

nosećeg proteina.

■ Deterdžent u

razblaživaču.

Proverite formulu i kompatibilnost

razblaživača antitela. Promena jona

i/ili pH razblaživača antitela može

da prouzrokuje smanjenje

osetljivosti antitela. Treba izbegavati

dodavanje NaCl. Ovaj problem se

uglavnom susreće kada su u pitanju

monoklonalna antitela.

Defektno primarno

antitelo; defektan jedan ili

više sekundarnih

pomoćnih reagenasa.

NEMOJTE koristiti

proizvod nakon isteka

roka upotrebe

obeleženog na bočici.

Zamenite defektno antitelo ili

antietlo kome je istekao rok trajanja;

ponovite protokol bojenja,

zamenjujući jedan po jedan reagens

svežim reagensima kojima nije

istekao rok trajanja.

■ Čuvajte proizvode u skladu sa

specifičnim umetkom svakog

proizvoda.

■ Ukoliko koristite uredno ili

koncentrisano antitelo, može biti

uzorkovano i zamrznuto.

Izbegavajte ponavljanje

zamrzavanja i odmrzavanja.

■ Ne zamrzavajte proizvode koji se

prodaju spremni za upotrebu ili

razblaženi.

Poštujte preporuke proizvođača

koje se nalaze na specifikaciji,

umecima pri pakovanju i oznakama

na reagensima.

126

Odvajanje primarnog

antitela prilikom pranja ili

inkubacije sa veznim

antitelima.

Svojstvo antitela niskog afiniteta:

■ Poliklonalni primarni antiserum:

Pokušajte da bojite u nižim

rastvorima.

■ Monoklonalno primarno antitelo:

Zamenite antitelom identične

specifičnosti ali višeg afiniteta.

Ponovo optimizirajte vreme

inkubacije za pufer za pranje i

vezno antitelo.

Upotreba kontrastne boje

na bazi alkohola i/ili

sredstva za postavljanje

na bazi alkohola sa

hromogenima na bazi

vode.

■ Ponovite bojenje, upotrebom

kontrastne boje i sredstva za

postavljanje na bazi vode.

■ Upotrebite permanentan

hromogen, kao što je DAB, koji ne

podleže uticaju organskih

rastvarača.

Preterano kontrastiranje

može da ugrozi pravu

interpretaciju rezultata.

Koristite kontrastnu boju koja:

■ Neće preterano bojiti preseke

tkiva.

■ Može da se razblaži a da ne uništi

specifičan signal.

■ Umanjuje trajanje inkubacije

kontrastnih boja.

Nepravilna priprema

supstrat-hromogen

mešavine. (Pogledajte

specifikaciju)

■ Ponovite supstrat-hromogen

tretman sa pravilno pripremljenim

reagensom.

■ Intenzitet bojenja se umanjuje

kada je višak DAB prisutan u

reagensu.

Nekompatabilan pufer

upotrebljen u pripremi

Proverite kompatibilnost sastojaka

pufera sa enzimskim i supstrat-

127

enzimskih i supstrat-

hromogen reagenasa:

■ Upotreba PBS pufera

za pranje sa sistemom

za bojenje označenim

kao alkalna fosfataza.

■ Natrijum-azid u

razblaživaču reagensa

ili pufer kupkama za

metodologije

imunoperoksidaze.

hromogen reagensima. Ponovite

bojenje.

■ Komercijalni fosfatski puferi mogu

da sadrže dodatke koji će

inhibirati aktivnost alkalne

fosfataze.

■ Izbegavajte natrijum-azid u

razblaživačima i puferima.

Koncentracija od 15mM/L

natrijum-azida, koji se rutinski

dodaje IHC reagensima radi

inhibiranja rasta bakterija, neće

umanjiti HRP spregnute oznake.

Nivoi antigena su suviše

niski za otkrivanje

primenjenom metodom

bojenja. Može biti

posledica gubitka

antigenske diferencijacije

u nekim tumorima ili

gubitka antigeniteta zbog

neoptimalne fiksacije

tkiva.

■ Koristite sistem bojenja više

osetljivost.

■ Produžite vreme inkubacije

primarnog antitela.

■ Ponovo optimizirajte trajanje

inkubacije i koncentracije

pomoćnih reagenasa.

■ Izvršite oporavak antigena ukoliko

je moguće.

Prostorna smetnja čiji su

uzroci visoki nivo

antigena i mogući prozon

efekat.

Ponovo optimizirajte koncentraciju

primarnog antitela i pomoćnih

reagenasa. Može biti da je

koncentracija antitela previsoka.

Upotreba neadekvatne

fiksirajuće tečnosti.

■ Upotreba određenih

fiksirajućih tečnosti

može da ošteti ili uništi

Proverite specifikaciju proizovđača

u vezi sa preporučenom

fiksirajućom tečnošću.

128

antigene ili epitope u

tkivnom uzorku.

■ Upotreba fiksirajućih

tečnosti koje se

unakrsno ne vezuju

može da dozvoli eluciju

antigena rastvorljivih u

IHC reagensima.

■ Različite fiksirajuće

tečnosti mogu da utiču

na standrdizaciju ćelija.

Imunoreaktivnost koja je

smanjena ili uništena u

procesu kalupljenja.

Koristite parafinski vosak koji se topi

na temperaturi od 58°C ili manje.

Vosak koji se koristi za kalupljenje

ne bi trebalo da prelazi temperaturu

od 60°C.

Imunoreaktivnost koja je

smanjena ili uništena u

procesu uklanjanja voska

na visokoj temperaturi.

Temperatura peći ne bi trebalo da je

veća od 60°C. Obratite pažnju na to

da intenzitet imunobojenja može da

se smanji ukoliko se tkivo izlaže

produženom uticaju toplote.

Konsultujte specifikaciju za

primarna antitela za dodatne

informacije.

Zadržavanje viška pufera

za pranje ili seruma za

blokiranje na preseku

tkiva pre nanošenja IHC

reagenasa.

Višak preostalog reagensa na

preseku tkiva će rastvoriti sledeći

reagens. Ponovite bojenje s tim što

ćete obrisati ostatke pufera za

pranje i seruma za blokiranje.

Protokol demaskiranja

antigena je neprikladan ili

izostavljen.

Neki tkivni antigeni zahtevaju da se

proteolitičko varenje enzima ili

oporavak antigena izazvan toplotom

129

izvrši pre bojenja.

Potreba za predtretmanom zavisi od

tipa i stepena fiksacije, specifičnih

karakteristika antigena i tipa

upotrebljivanog antitela. Primenite

metodu predtretmana predloženu

od strane proizvođača. Nijedan

pojedinačni predtretman nije

pogodan za sve primene.

Višestruko ponavljana

upotreba pufera za

oporavak antigena.

(Pogledajte specifikaciju)

Nemojte više puta da upotrebljavate

pufer.

Nepravilno otklanjanje

voska sa preseka.

Pripremite nove preseke i uklonite

parafin u skladu sa standardnim

laboratorijskim protokolom,

upotrebom svežeg ksilena ili

ksilenske zamene.

Neuspeh u postizanju

optimalne temperature

potrebne za oporavak

antigena izazvan

toplotom. (Pogledajte

specifikaciju)

■ Pružite dovoljno vremena da

pufer za oporavak antigena

postigne ravnotežu sa

temperaturom u rasponu od 95-

99°C.

■ Na velikoj visini, pufer će ključati

na temperaturi ispod 95°C.

Koristite zatvoren sistem grejanja,

kao što je hermetički lonac ili

autoklav, ili protokol koji zahteva

nisku temperaturu ukoliko ne

utiče na standardizaciju

procedure.

Prekomerno ili nepotpuno Ponovo optimizujte koncentraciju

130

kontrastiranje.

(Pogledajte specifikaciju)

kontrastne boje i trajanje inkubacije.

Neispravnost

instrumenata (Pogledajte

uputstvo proizvođača za

rukovanje instrumentima)

Budite sigurni da je automatizovano

sredstvo za bojenje pravilno

podešeno i da funkcioniše u skladu

sa specifikacijom proizvođača.

■ Pozitivno kontrolno tkivo pokazuje adekvatno specifično bojenje sa malo ili ni malo pozadinskog bojenja. Tkivni uzorak pokazuje malo ili ni malo specifičnog bojenja sa varirajućim pozadinskim bojenjem nekoliko tkivnih elemenata.

Uzorci koji se predugo

drže u unakrsno

vezujućoj fiksirajućoj

tečnosti, uglavnom

formalinu, što prouzrokuje

"maskiranje" antigenskih

determinanti zbog

unakrnsog vezivanja

aldehida i povećane

hidrofobičnosti tkiva.

Standardizujte rutinsku fiksaciju.

Proteolitičko varenje ili oporavak

antigena će prekinuti unakrsno

vezivanje i učiniti neke od tkivnih

antigena reaktivnim. Konsultujte

specifikaciju za primarna antitela za

dodatne informacije.

Sečeni deo sadrži

smrskani element izazvan

grubim sečenjem tkiva

tupim skalpelom ili

žiletom. Proteini seruma

se šire kroz tkivo i

fiksiraju u mestu.

Ponovo isecite tkivo služeći se

oštrim sečivom.

Sečeni deo uzorka sadrži

nekrotične ili na drugi

način oštećene elemente.

Ignorišite fizički oštećene delove

obojenih tkivnih preseka.

Sečeni deo uzorka kroz Fiksirajte biopsiju tkiva u dužem

131

koji fiksirajuća tečnost

nije uspela da probije.

Gubitak antigeniteta u

nefiksiranom tkivu.

vremenskom periodu ili fiksirajte

manje delove kako biste obezbedili

potpunu penetraciju. Nefiksirano

tkivo ima tendenciju da nespecifično

vezuje sve reagense.

OPŠTA POZADINA

■ Pozadina viđena u svim kontrolnim tkivima i tkivima uzoraka. Može se primetiti markirano pozadinsko bojenje u nekoliko tkivnih elemenata kao što su vezivno tkivo, adipozno tkivo i

epitel.

MOGUĆI UZROK REŠENJE STR.

Preterana inkubacija sa

supstrat-hromogen

reagensom. (Pogledajte

specifikaciju)

Skratite vreme trajanja inkubacije.

Nepravilno pripremljen

supstrat-hromogen

reagens. (Pogledajte

specifikaciju)

Ponovite inkubaciju sa pravilno

pripremljenim hromogenskim

reagensom.

Vezno antitelo unaksno

reaguje sa antigenima

davaoca tkiva.

Apsorbujte vezno antitelo sa

ekstraktom tkivnog proteina ili

normalan serum, specifičan za

svaku vrstu, davaoca tkiva.

Previše koncentrovano

sekundarno (vezno

antitelo) i/ili tercijarni

reagensi.

Ponovite bojenje. Odredite tačnu

koncentraciju za svaki reagens.

Temperatura i vreme trajanja

inkubacije će uticati na rezultate.

Kako bi se odredio optimalni

inkubacioni protokol, menjajte i

vreme trajanja i temperaturu

132

inkubacije za svaki reagens u IHC

protokolu bojenja.

Neadekvatno isprane

pločice.

Nežno isperite pločicu sa flašom

pufera za pranje i ostavite 5 minuta

u kupki za pranje. Nežna agitacija

kupke može da poveća efektnost

kada se koristi sa citoplazimičnim ili

nuklearnim protokolima bojenja.

Nedovoljna količina salina

ili deterdženta u puferu za

pranje.

Sistem bojenja visoke osetljivosti

može da zahteva veće koncentracije

salina ili deterdženta u puferu za

pranje. Konsultujte specifikaciju

sistema bojenja za optimalnu

formulaciju.

Upotreba pogrešnog

seruma za blokiranje.

Serum za blokiranje i vezno antitelo

bi trebalo da potiču iz iste vrste. Kao

alternativa, univerzalini proteinski

blok bez seruma, kome nedostaju

imunoglobulini, može se koristiti

umesto serumskog bloka.

Nepravilno otklanjanje

voska sa preseka.

Pripremite nove preseke i uklonite

parafin u skladu sa standardnim

laboratorijskim protokolom,

upotrebom svežeg ksilena ili

ksilenske zamene.

Nespecifično vezivanje

sekundarnog antitela sa

uzorkom životinjskog

tkiva.

Upotrebite sekundarno apsorbovano

antitelo protiv uzoraka te vrste.

Neispravnost

instrumenata (Pogledajte

Budite sigurni da je automatizovano

sredstvo za bojenje pravilno

133

uputstvo proizvođača za

rukovanje instrumentima)

podešeno i da funkcioniše u skladu

sa specifikacijom proizvođača.

■ Tkivo uzorka i pločice negativne kontrole reagensa pokazuju pozadinsko bojenje. Pozitivna i negativna kontrolna tkiva pokazuju podesno specifično bojenje. Mogu da uključuju nekoliko tkivnih elemenata kao što su vezivno tkivo, adipozno tkivo i epitel.

Uzorci koji se predugo

drže u unakrsno

vezujućoj fiksirajućoj

tečnosti, uglavnom

formalinu, što prouzrokuje

"maskiranje" antigenskih

determinanti zbog

unakrnsog vezivanja

aldehida i povećane

hidrofobičnosti tkiva.

Standardizujte rutinsku fiksaciju.

Proteolitičko varenje ili oporavak

antigena će prekinuti unakrsno

vezivanje i učiniti neke od tkivnih

antigena reaktivnim. Konsultujte

specifikaciju za primarna antitela za

dodatne informacije.

Sečeni deo uzorka kroz

koji fiksirajuća tečnost

nije uspela da probije.

Gubitak antigeniteta u

nefiksiranom tkivu.

Nefiksirano tkivo ima

tendenciju da

nespecifično vezuje sve

reagense.

Fiksirajte biopsiju tkiva u dužem

vremenskom periodu ili fiksirajte

manje delove kako biste obezbedili

potpunu penetraciju.

Sečeni deo sadrži

smrskani element izazvan

grubim sečenjem tkiva

tupim skalpelom ili

žiletom. Proteini seruma

Ponovo isecite tkivo služeći se

oštrim sečivom.

134

se šire kroz tkivo i

fiksiraju u mestu.

Sečeni deo uzorka sadrži

nekrotične ili na drugi

način oštećene elemente.

Ignorišite fizički oštećene delove

obojenih tkivnih preseka.

Preterano ili nedovoljno

nanešeno lepljivo

sredstvo (rezervni agens)

na poli-L-lizin, ili

silanizovane pločice.

IHC reagensi se vezuju za ove

proizvode, što prouzrokuje pojavu

svetle fleke preko cele površine

pločice. Neke pločice mogu biti

nejednako premazane, i pojaviće se

gore navedeni problemi na samo

jednom delu tkiva ili stakla.

Difuzija antigena pre

fiksacije koja prouzrokuje

pojavu specifične

pozadine van očekivanog

antigenskog područja.

Izbegavajte odlaganja pri fiksaciji

tkiva.

Predebeli preseci tkiva. Isecite tanje preseke tkiva. Tkivo

fiksirano u farmalinu, utvrđeno u

parafinu, trebalo bi da je približno 4-

6µ; kriostat preseci <10µ.

■ Pločica negativne kontrole reagensa pokazuje pozadinu. Tkivo pozitivne kontrole, tkivo negativne kontrole i tkivo uzorka pokazuju očekivano specifično bojenje.

Nedovoljno razblažen

serum negativne kontrole.

Koristite odekvatno razblažen serum

negativne kontrole reagensa.

■ Za poliklonalna antitela, razblažite

serum negativne kontrole

reagensa dok se koncentracija

proteina ne izjednači sa

koncentracijom primarnog antitela.

135

■ Za monoklonalna antitela,

razblažite serum negativne

kontrole reagensa dok se

koncentracija Ig ne izjednači sa

koncentracijom primarnog antitela.

Kontaminirajuća antitela u

serumu negativne

kontrole unakrsno

reaguju sa proteinima iz

tkiva uzorka.

Zamenite serum negativne kontrole

reagensa; ponovite protokol bojenja.

Kontaminiran serum

negativne kontrole

reagensa bakterijalnim ili

gljivičnim rastom.

Zamenite proizvod

nekontaminiranim serumom.

OGRANIČENA POZADINA

■ Predeli nedoslednog bojenja na kontrolama, uzorcima i staklenim pločicama.

MOGUĆI UZROK REŠENJE STR.

Protein koji je zarobljen

ispod tkiva prilikom

procesa postavljanja

dozvoliće delimično

podizanje preseka.

Može doći do udruživanja

IHC reagenasa ispod

preseka, ili delimičnog

odvajanja tkiva od

pločice.

Izbegavajte upotrebu komercijalnih

lepljivih sredstava, lepaka, štirka ili

želatina u vodenim kupkama

prilikom postavljanja preseka tkiva.

Ovo je posebno važno kada se

koriste naelektrisane pločice.

Nerastvorene granule

hromogena.

Budite sigurni da je hromogen u

obliku pudera ili tablete potpuno

136

rastvoren, ili se opredelite za tečni

hromogen.

Nekompletno

odstranjivanje sredstva

za kalupljenje.

Potpuno otklonite sredstvo za

kalupljenje upotrebom svežih

reagenasa.

Nekompletna

dezenkerizacija tkiva

fiksiranog sa B5 ili

reagensima koji sadrže

živu.

Izvršite dezenkerizaciju sa svežim

reagensima.

Bakterijska ili kvaščana

kontaminacija.

Očistite i dopunite vodenu kupku.

Delimično sušenje tkiva

pre fiksacije.

Područja koja nisu pod

uticajem pokazuju znake

normlanog bojenja.

■ Brzo potopite tkivo u fiksirajuću

tečnost ili reagens za održavanje.

■ Održavajte vlažnost tokom celog

procesa bojenja.

■ Koristite vlažnu ili ovlaženu

komoru prilikom inkubacije.

Neispravnost

instrumenata

Budite sigurni da je automatizovano

sredstvo za bojenje pravilno

podešeno i da funkcioniše u skladu

sa specifikacijom proizvođača.

■ Adipozno ili vezivno tkivo u uzorku, tkivu negativne kontrole, tkivu pozitivne kontrole i na pločicama negativne kontrole reagensa. Pozadina u vezivnom i epitelnom tkivu.

Hidrofobične i jonske

interakcije između

imunoglobulina i lipoidnih

supstanci u masnom

tkivu.

Nespecifično bojenje masnog tkiva

retko ometa interpretaciju

specifičnog bojenja i uglavnom se

može zanemariti. Posebno bojenje

sa Sudanom IV; mast će proizvesti

narandžastu do crvene boje

137

(normalan mielin i masne kiseline ne

ostavljaju boje).

Primarno antitelo i serum

negativne kontrole

reagensa su nedovoljno

rastvoreni.

Ponovo optimizujte razblaženi

rastvor primarnog antitela i seruma

negativne kontrole.

■ Epitelno tkivo u uzorku, tkivu negativne kontrole, tkivu pozitivne kontrole i na pločicama negativne kontrole reagensa. Bojenje je umereno do markiranog, posebno u epidermalnom epitelu. Pozadina u epitelima prati pozadinu vezivnog tkiva.

I primarno antitelo i

serum negativne kontrole

sadrže antitela koja

kontaminiraju epitelne

elemente, možda

citokeratine.

■ Upotrebite više razblaženi rastvor

primarnog antitela i seruma

negativne kontrole.

■ Produžite vreme trajanja

inkubacije.

■ Zamenite antitelo.

Preterana formalinska

fiksacija tkiva može da

poveća unakrsno

vezivanje proteina,

prouzrokujući

hidrofobičnost tkiva.

Proteolitičko varenje ili oporavak

antigena će prekinuti unakrsno

vezivanje i učiniti neke od tkivnih

antigena reaktivnim. Konsultujte

specifikaciju za primarna antitela i/ili

negativnu kontrolu reagensa za

podesni predtretman.

■ Žižno citoplazmično bojenje primećeno u epitelu u tkivu uzorka.

Žižno citoplazmično

bojenje je vidljivo,

posebno u srednjim i

površnim slojevima

epiderme.

Može biti prouzrokovano

prolaznom apsorpcijom

Ovo zapažanje je retko i ne bi

trebalo da utiče na interpretaciju

specifičnog bojenja.

138

proteina plazme u

degenerisućim ćelijama

epiderme.

■ Pozadina vidljiva u svim kontrolnim tkivima i tkivima uzoraka kada se koristi sistem bojenja imunoperoksidazom.

Nesuzbijena endogena

aktivnost peroksidaze se

može videti u svim

uzorcima koji sadrže

hemoproteine, uključujući

hemoglobin u eritrocitima,

mioglobin u mišićnim

ćelijama, citohrom u

granulocitima i monocite i

katalaze u jetri i bubregu.

■ Koristite alternativne ili produžene

blokove peroksidaze ili koristite

drugu enzimsku oznaku kao što je

alkalna fosfataza.

■ Eozinofili su posebno otporni na

suzbijanje peroksidaze. Upotrebite

posebno bojenje: eozin će ovim

ćelijama dati jarku crveno-

narandžastu boju.

■ Pozadina vidljiva u svim kontrolnim tkivima i tkivima uzoraka kada se koristi sistem bojenja alkalnom fosfatazom.

Nesuzbijena endogena

aktivnost alkalne

fosfataze se može videti

u lukocitima, bubregu,

jetri, kostima, jajniku,

bešici, pljuvačnim

žlezdama, posteljici i

gastro-intestinalnom tkvu.

Dodajte levamisol hromogenskom

reagensu alkalne fosfataze ili

koristite drugu enzimsku oznaku kao

što je peroksidaza hrena.

Intestinalna alkalna fosfataza se ne

suzbija dodavanjem levamisola.

Ukolio je neophodna upotreba

sistema alkalne fosfataze, tkivo

možete unapred tretirati sa 0,3N

HCI.

■ Pozadina vidljiva u svim kontrolnim tkivima i tkivima uzoraka kada se koristi sistem bojenja biotin-streptavidinom (avidinom).

Endogeni proteinski

vezan biotin (B vitamin

Koristite biotin blok ili drugi sistem

bojenja koji nije na bazi biotin

139

rastvorljiv u vodi). Visoke

do umerenih količina se

mogu naći u

nadbubrežnom,

bubrežnom, jetrenom,

gastrointestinalnom,

plućnom, adipoznom,

limfoidnom tkivu, tkivu

slezine i tkivu centralnog

nervnog sistema. Bojenje

se može primetiti i na

ćelijama izraslim u

kulturnom medijumu koje

sadrže biotin kao hranljiv

sastojak.

(strept) avidina.

■ Pozadina skeletnog ili glatkog mišićnog tkiva u tkivu pozitivne kontrole, tkivu negativne kontrole, tkivu uzorka i reagensu negativne kontrole.

Uzrok se ne razume.

Moguće je da je reč o

posledici antitela spram

mišićnih antigena u

serumu primarne i

negativne kontrole

reagensa.

Ne bi trebalo da utiče na

interpretaciju specifičnog bojenja.

NEŽELJENO "SPECIFIČNO" BOJENJE

■ Pozitivno bojenje membrana leukocita u tkivu uzorka, pozitivnoj kontroli, negativnoj kontroli tkiva i negativnoj

kontroli reagensa.

140

MOGUĆI UZROK REŠENJE STR.

Vezivanje Fc dela

imunoglobulina sa Fc

receptorima na ćelijskoj

membrani koja se sastoji

is makrofaga, monocita,

granulocita i nekih

limfocita.

■ Upotrebite F(ab¹)2 ili F(ab)

fragmente za primarna i

sekundarna antitela pre nego

čitava antitela.

■ Dodajte deterdžent puferu za

pranje.

■ Pozitivno bojenje histiocita i granulocita samo u tkivu uzorka, sa markerom koji nije normalno reaktivan sa ovim ćelijama.

Fagocitoza antigena

može kreirati fagocite

pozitivne na isto.

Retkost: ne bi trebalo da utiče na

interpretaciju specifičnog bojenja.

■ Pozitivno bojenje membrane tkiva uzorka i tkiva negativne kontrole reagensa kada se koristi sistem bojenja peroksidazom hrena.

Tkivo osoba inficiranih

hepatitis B virusom i koje

istiskuje površinski

antigen hepatitisa B može

pokazati neželjeno

bojenje.

Koristite sistem bojenja bez

peroksidaze.

RAZNO

■ Gubitak sposobnosti za život ćelijskih kultura.

MOGUĆI UZROK REŠENJE

DAKO proizvodi sva

antitela isljučivo za in

vitro upotrebu. Ovi

proizvodi sadrže zaštitna

Koristite in vivo proizvod samo za primenu

na ili za ubrizgivanje u ćelije sposobne za

život. Isključivo za upotrebu na ćelijskim

kulturama: Natrijum-azid se može odvojiti

141

sredstva, obično natrijum-

azid. Azid je poznati

otrov.

(Pogledajte Specifikacije

proizvoda)

dijalizom iz DAKO reagenasa. Kontaktirajte

Tehničku službu za dodatne informacije.

DRUGI DEO

Blok-dijagram otkrivanja grešaka: Koristite ovaj dijagram kako biste

otkrili izvor(e) nespecifičnog bojenja kada primenjujete

imunohistohemijski protokol.

POZADINSKO BOJENJE NA KOJE SE NAILAZI PRI UPOTRBI REAGENASA HRP-PEROKSIDAZE

REAGENSI ISHOD/DEJSTVO

PLOČICA BR. 1 Tkivo pozitivne kontrole: Kontrastna boja sa hematoksilinom

Primećen braon pigment (melanin): U cilju razlikovanja melanin pigmenta od DAB hromogena, Azure B se može koristiti kao kontrastna boja. Melanin daje plavo-zelenu boju, dok DAB ostaje braon. Alternativna metoda zahteva da se AEC koristi kao hromogen. Međutim, ukoliko u tkivu postoje visoki nivoi pigmenta, crveni hromogen može delimično da potamni. Budući da protokoli izbeljivanja radi odstranjivanja melanina mogu da ugroze antigenitet tkiva, treba ih izbegaviti koloko je to moguće.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK PLOČICA BR. 2 Tkivo pozitivne kontrole: DAB/AEC + Kontrastna boja

Primećena braon/crvena boja: Ukazuje na aktivnost endogene peroksidaze u tkivnim presecima. Prisutna je u svim tkivima koja sadrže hemoprotein, uključujući eritrocite, mišić, jetru, bubreg, granulocite i monocite. Izvršite blokiranje sa hidrogen peroksidom od 3%, natrijum-azidom ili Reagensom za blokiranje peroksidaze korporacije DAKO (S2001).

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK

142

PLOČICA BR. 3 Tkivo pozitivne kontrole: Blok peroksidaze + Streptavidin-HRP + DBA/AEC + Kontrastna boja

Primećena braon/crvena boja: Ukazuje na aktivnost endogenog biotina u tkivnim presecima. Proteinski vezan biotin se može naći u nadbubrežnom, bubrežnom, plućnom, moždanom, adipoznom, limfoidnom tkivu, tkivu jetre, gastrointestinalnog trakta, slezine, mlečne žlezde i u ćeliji koja je rasla u medijumu kulture koji sadrži biotin (RPMI, NCTC, MEME). Izvršite blokiranje Biotin blokom korporacije DAKO (X0590) ili se opredelite za sistem bojenja koji ne zavisi od streptavidin/biotin reakcije, kao što je EnVision sistem korporacije DAKO.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK PLOČICA BR. 4 Tkivo pozitivne kontrole: Blok peroksidaze + Biotinski blok (ukoliko je potreban) + Sekundarno antitelo + Streptavidin-HRP + DAB/AEC + Kontrastna boja

Primećena braon/crvena boja: Ukazuje na nespecifično ili neželjeno vezivanje sekundarnog antitela za tkivni presek. Ovo se uglavnom dešava kada sekundarni antiserum nije pripremljen za upotrebu na tkivu specifične vrste. Kako biste utvrdili da li je ovaj problem u pitanju, apsorbujte, i time odstranite, nespecifične proteine dodavanjem 2,5 ili 10µL normalnog seruma (koji potiče iz vrste čije je tkivo pripremljeno za bojenje) prema 100 µL sekundarnog antitela.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK PLOČICA BR. 5 Tkivo pozitivne kontrole: Blok peroksidaze + Biotinski blok (ukoliko je potreban) + Negativna kontrola reagensa + Sekundarno antitelo + Streptavidin-HRP + DAB/AEC + Kontrastna boja

Primećena braon-crvena boja: ■ Može da ukazuje na nespecifično vezivanje

nosioca proteina primarnog antitela. Izvršite blokiranje proteina normalnim serumom domaćina vezanog antitela ili Proteinskim blokom DAKO korporacije (X0909); dodajte TWEEN 20 od 0,05-0,1% puferu za pranje kako biste smanjili vezivanje proteina.

■ Predmet lipofuzije oporavka antigena može da se pojavi kao zrnasto bojenje u jetrenom i srčanom tkivu, ili kao specifično bojenje u presecima pankreasa.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK

143

PLOČICA BR. 6 Tkivo negativne kontrole: Izvršite kompletan protokol bojenja

Primećena braon-crvena boja na tkivu negativne kontrole: ■ Monoklonalno antitelo: Moguća kontaminacija. ■ Poliklonalno antitelo: Moguća kontaminacija ili

neželjeno antitelo u Ig frakciji domaćina ■ Predmet lipofuzije oporavka antigena može da

se pojavi kao zrnasto bojenje u jetrenom i srčanom tkivu, ili kao specifično bojenje u presecima pankreasa.

POZADINSKO BOJENJE NA KOJE SE NAILAZI PRI UPOTRBI ALKALNE FOSFATAZE

REAGENSI ISHOD/DEJSTVO

PLOČICA BR. 1 Tkivo pozitivne kontrole: Brz crvena, Fuksin ili BCIP/NBT + Kontrastna boja

Primećena crvena/plava boja: Ukazuje na aktivnost endogene alkalne fosfataze u tkivnim presecima. Prisutna je u tkivu jetre, bubrega, gastrointestinalnog trakta, kosti, bešike, jajnika, pljuvačne žlezde, posteljice, i u leukemijskim, nekroznim ili degenerisanim ćelijama. Izvršite blokiranje Levamisolom X3021 DAKO korporacije (Intestinalna alkalna fosfataza se može suzbiti dodavanjem 0,3N HCL pre dodavanja strept-avidin-AP).

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK PLOČICA BR. 2 Tkivo pozitivne kontrole: Streptavidin-AP + Brza crvena, Fuksin ili BCIP/NBT + Kontrastna boja

Primećena crvena/plava boja: Ukazuje na aktivnost endogenog biotina u tkivnim presecima. Proteinski vezan biotin se može naći u nadbubrežnom, bubrežnom, plućnom, moždanom, adipoznom, limfoidnom tkivu, tkivu jetre, gastrointestinalnog trakta, slezine, mlečne žlezde i u ćeliji koja je rasla u medijumu kulture koji sadrži biotin (RPMI, NCTC, MEME). Izvršite blokiranje Biotin blokom korporacije DAKO (X0590) ili se opredelite za sistem bojenja koji ne zavisi od streptavidin/biotin reakcije, kao što je EnVision sistem korporacije DAKO.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK

144

PLOČICA BR. 3 Tkivo pozitivne kontrole: Biotinski blok (ukoliko je potreban) + Sekundarno antitelo + Streptavidin-AP + Brza crvena, Fuksin ili BCIP/NBT + Kontrastna boja

Primećena crvena/plava boja: Ukazuje na nespecifično ili neželjeno vezivnje sekundarnog antitela za tkivni presek. Ovo se uglavnom dešava kada sekundarni antiserum nije pripremljen za upotrebu na tkivu specifične vrste. Kako biste utvrdili da li je ovaj problem u pitanju, apsorbujte, i time odstranite, nespecifične proteine dodavanjem 2,5 ili 10µL normalnog seruma (koji potiče iz vrste čije je tkivo pripremljeno za bojenje) prema 100 µL sekundarnog antitela.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK PLOČICA BR. 4 Tkivo pozitivne kontrole: Biotinski blok (ukoliko je potreban) + Negativna kontrola reagensa + Sekundarno antitelo + Streptavidin-AP + Brza crvena, Fuksin ili BCIP/NBT + Kontrastna boja

Primećena crvena/plava boja: ■ Može da ukazuje na nespecifično vezivanje

nosioca proteina primarnog antitela. Izvršite blokiranje proteina normalnim serumom domaćina vezanog antitela ili Proteinskim blokom DAKO korporacije (X0909); dodajte TWEEN 20 od 0,05-0,1% puferu za pranje kako biste smanjili vezivanje proteina.

■ Predmet lipofuzije oporavka antigena može da se pojavi kao zrnasto bojenje u jetrenom i srčanom tkivu, ili kao specifično bojenje u presecima pankreasa.

NIJE PRIMEĆENO BOJENJE. PREĐITE NA SLEDEĆI KORAK PLOČICA BR. 5 Tkivo negativne kontrole: Izvršite kompletan protokol bojenja

Primećena crvena/plava boja na tkivu negativne kontrole: ■ Monoklonalno antitelo: Moguća kontaminacija. ■ Poliklonalno antitelo: Moguća kontaminacija ili

neželjeno antitelo u Ig frakciji domaćina ■ Predmet lipofuzije oporavka antigena može da

se pojavi kao zrnasto bojenje u jetrenom i srčanom tkivu, ili kao specifično bojenje u presecima pankreasa.

145

TREĆI DEO

TKIVNI UZORCI ■ Tkivni uzorci: Uspešno bojenje tkiva upotrebom IHC markera zavisi

od tipa i pripreme uzorka. U donjoj tabeli zabeležite sledeće podatke:

vrstu životinje koja se testira, izvor tkiva ili organ iz kojeg je uzet

uzorak, način uzimanja uzorka, kako je uzorak fiksiran i pripremu tkiva.

Vrsta:

Organ/izvor tkiva:

Način uzimanja :

□ Hirurški uzorak/biopsija

□ Uzorak obdukcije

□ Aspirator sa malom iglom

□ Periferna krv (uključujući antikoagulante)

□ Četkanje

□ Biološka tečnost

□ Kultura ćelije

□ Drugo

Priprema tkiva:

□ Ukalupljeno u parafin

□ Ukalupljeno u plastiku

□ Kriostat presek

□ Citospin

□ Ćelijski otisak

□ Ćelija jednoslojne kulture

□ Drugo

146

Fiksacija tkiva:

Tip fiksirajućeg sredstva

Dužina trajanja

Veličina uzorka

Postavljanje tkiva:

□ Postavljanje na pločicu

□ Debljina tkiva

□ Želatin, lepak, komercijalno lepljivo sredstvo ili štirak u vodenoj

kupki

□ Drugo

PUFERI

■ Tip pufera odabranog za razblaživanje primarnog antitela,

sekundarnog antitela i puferi pranja, imaće značajan uticaj na kvalitet

IHC boje. Varijacije uključuju količinu deterdženta prisutnog u puferu,

pH, jonsku sadržinu i temperaturu na kojoj se koristi.

Razblažujuća tečnost antitela:

□ Tris

□ TBS

□ PBS

□ Drugo

Pufer pranja:

□ Salin razblažen fosfatom

□ Salin razblažen Tris puferom

□ TWEEN 20 (procenat)

□ pH na 25°C

□ Drugo

147

DEMASKIRANJE ANTIGENA

■ Predtretman: Tkivni uzorci, kada su fiksirani unakrsno vezujućom

fiksirajućom tečnošću, mogli bi iziskivati predtretman kako bi se došlo

do željenih rezultata. Konsultujte specifikaciju proizvođača o primarnim

antitelima pri određivanju tačnog protokola.

Pufer za oporavak antigena:

□ DAKO Rastvor za oporavak ciljnog antigena (S1700)

□ DAKO Rastvor za oporavak ciljnog antigena sa visokom pH

(S3308)

□ EDTA

□ pH od 8,0

□ Drugo

Izvor toplote:

□ Kotao

□ Vodena kupka

□ Autoklav/Hermetički lonac

□ Mikrotalasi

□ Drugo

Vreme trajanja inkubacije:

Temperatura prilikom inkubacije:

Vreme hlađenja:

Proteolitičko enzimsko varenje:

□ Proteinaza K

□ Proteaza XXIV

□ Pepsin

□ Tripsin

□ Drugo

Vreme trajanja inkubacije:

148

ENDOGENE BLOKADE ■ Pozadinsko bojenje je definisano kao neočekivano ili neželjeno

bojenje koje se vidi na testiranom ili kontrolnom tkivu, koje ne

predstavlja ciljni antigen. Česti uzroci pozadinskog bojenja su

endogena enzimska aktivnost i endogeni biotin.

Peroksidaza je enzim koji spada u klasu oksido-reduktaze i reaguje sa

supstratom koji sadrži vodonik-peroksid kao primač elektrona. Kako bi

se ova aktivnost blokirala, razni reagensi vodonik-peroksidaze se mogu

primeniti na ćelije stvarajući ovaj enzim.

Alkalna fosfataza je enzim koji sadrži razne izoforme, koje se stvaraju u

leukocitima, jetri, kostima, crevima, posteljici i Reganu (karcinomu).

Dodavanje levamisola hromogenu/supstratu će sprečiti aktivnost

endogene alkalne fosfataze, izuzev kada je u pitanju intestinalna

izoforma. Ukoliko je neophodno, ovo se može blokirati slabom kiselom

kupkom, kao što je 0,03-0,5N HCI.

Biotin, vitamin B, može biti proteinom vezan za tkivo i može da utiče na

pravu interpretaciju obrasca bojenja kada je u upotrebi streptavidin ili

avidin reagens. Kako bi se ovo vezivanje blokiralo, biotin/avidin blok se

može naneti na tkivne preseke koji sadrže umerene do visokih količina

ovog vitamina.

Blokiranje peroksidaze:

□ 3% H2O2

□ Metanol/ H2O2

□ Natrijum azid

□ Blok peroksidaze DAKO korporacije (S2001)

□ Drugo

149

Blokiranje alkalne fosfataze:

□ Levamisol

□ 0,03N HCI (nije za uoptrebu sa kriostat tkivom)

□ Drugo

Biotinska blokada:

□ Biotinski blok DAKO korporacije (X0590)

□ Drugo

Proteinska blokada:

□ Proteinski blok DAKO korporacije (X0909)

□ Normalni serumi od vrste domaćina sekundarnog antitela

□ Drugo

SISTEM BOJENJA ■ Razni rutinski upotrebljivani imunohistohemijski sistemi ili oprema su

danas komercijalno dostupni. Oni obuhvataju indirektne metode,

označeni streptavidin-biotin (LSAB), avidin-biotin kompleks (ABC),

biotin tiramid amplifikaciju (CSA) i označenu polimer tehnologiju

(EnVision).

Kako biste sebi olakšali otkrivanje grešaka, popunite donju tabelu

Proizvođač:

□ Automatksi

□ Ručno

150

Oprema za bojenje:

□ Imunoperoksidaza u tri faze

□ LSAB

□ EnVision

□ Drugo

Primarno antitelo:

Razblaženi rastvor: (Konsultujte specifikaciju za primarna

antitela)

Vreme trajanja inkubacije i temperatura:

Negativna kontrola reagensa:

□ Poliklonalna Ig frakcija neimunizovanog domaćina primarnog

seruma

□ Izotipični Ig (Monoklonalno antitelo stvoreno kao supernat

kulture ćelije ili ascites fluid)

□ Drugo

Sekundarno antitelo:

Vreme trajanja inkubacije i temperatura:

Oznaka:

Vreme trajanja inkubacije i temperatura:

Hromogen:

Inkubacija:

151

Kontrastna boja kompatibilna sa hromogenom:

□ Harisov hematoksilin

□ Majersov hematoksilin

□ Gilov hematoksilin

□ Metil zelena

□ Nuklearna brza crvena

□ Drugo

Agens za raščišćavanje:

Sredstvo za postavljanje:

152

G L O S A R

Ovaj glosar nije osmišljen kao sveobuhvatan spisak terminologije koja

se koristi u imunohistohemijskom bojenju. Tačnije, podrazumeva

posedovanje osnovnog tehničkog znanja, mimo kojeg su uključene

definicije odabrane kako bi pomogle u razjašnjenju teksta ovog

priručnika.

■ POMOĆNO SREDSTVO U imunohemiji, svaka supstanca koja

pojačava imunogenitet antigena i prouzrokuje bolju imuno reakciju.

Postoje dva tipa, oni koji imaju sposobnost da pojačaju i ćelijsku i

humoralnu reakciju na veliki broj antigena (opšta potencijacija), i oni

koji jačaju specifičnu reakciju na samo nekoliko antigena (specifična

potencijacija). Pomoćna sredstva deluju posredstvom nekoliko

mehanizama uključujući produženje oslobađanja antigena, regrutaciju

drugih imunokompetentnih ćelija i indukciju zapaljenja.

■ APSORPCIJA AFINITETA Metoda odvajanja hromatografijom

afiniteta. Može se koristiti, na primer, za odstranjivanje neželjenih

antitela iz pripreme antitela. Priprema prolazi kroz matriks stub koji

sadrži antigene protiv kojih su neželjena antitela okrenuta. Prema

tome, neželjena antitela ostaju vezana za stub. Rastvor antitela koji

napušta stub sadrži isključivo željena antitela, purifikovana apsorpcijom

afiniteta.

■ IZOLACIJA AFINITETA Metoda odvajanja hromatografijom

afiniteta. Na primer, antitela izolovanog afiniteta se mogu pripremiti

prolazom rastvora antitela kroz matriks stub za koji se antigeni sprežu.

Antitela okrenuta protiv spregnutih antigena ostaju vezana na stubu i

mogu se izdvojiti upotrebom rastvora koji remeti vezivanje antigena i

antitela.

153

■ AGLUTINACIJA Nagomilavanje ćelija koje su rasuto distribuirane u

tečnosti. Izazvana je aglutininima, antitelima koja su se razvila spram

specifičnog tipa ćelije, i vidi se kada se bakterijska kultura tretira

serumom životinje imunizovane protiv tog specifičnog organizma ili

kada je suspenzija ćelija, posebno crvenih krvnih zrnaca, izložena

antiserumima. Ovaj fenomen se uglavnom primenjuje u skladištenju

rezervi krvi kao indikator antigen-antitelo reakcije između crvenih krvnih

zrnaca i specifičnog antiseruma ili plazme davaoca.

■ ANTIGEN Molekul koji može da se vezuje za antitelo.

■ ANTIGENSKA DETERMINANTA Pogledajte Epitop.

■ OPORAVAK ANTIGENA Poznato i pod nazivima "oporavak

epitopa" ili "oporavak ciljnog antigena", odnosi se na vraćanje

antigeniteta (imunoreaktivnosti) antigenu.

■ ANTISERUM Serum koji sadrži antitela.

■ ACITES ILI ASCITIČNA TEČNOST Akumilacija tečnosti u trbušnoj

duplji.

■ POZADINA Sem ukoliko nije drugačije definisano, pozadinsko

bojenje obuhvata svo nespecifično bojenje koje je rezultat elemenata

procedure. S vremena na vreme, može da obuhavata i "nepoželjno"

bojenje, npr., prouzrokovano raširenim antigenom.

■ HROMOGEN Jedan iz grupe hemijskih vrsta koje su u stanju da

formiraju poseban bojeni materijal ili se mogu identifikovati takvom

reakcijom sa podesnim reagensom.

154

■ KONTRASTNA BOJA Druga boja koja nekoj drugoj boji pruža

efekat kontrastiranja.

■ UNAKRSNA REAKTIVNOST Sposobnost antitela da reaguje sa

antigenima pored imunogena. Ne bi trebalo koristiti termin kada se

govori o reakcijama do kojih dolazi između antitela i komponenti

različite ćelije ili tkiva.

■ EPITOP Strukturni deo antigena koji reaguje sa antitelom. Ovo su

grupacije amino kiselina u globalnim proteinima i šećernim bočnim

lancima u polisaharidima. Najkritičniji deo se naziva

imunodominantnom tačkom.

■ OPORAVAK EPITOPA Pogledajte "Oporavak antigena".

■ ROK TRAJANJA Ovaj termin označava minimalno vreme trajanja

biloških materija pri skladištenju, uključujući imunohemikalije.

(Pogldeajte Rok trajanja pri skladištenju)

■ HIPERIMUNIZACIJA Praktikovanje uspostavljanja povećanog

stanja aktivno stečene imunosti ponavljanim davanjem antigena.

■ IDIOTIP Tradicionalno, antigenske determinante koje imaju veze sa

specifičnošću antitela. Smatralo se da idiotipsko uređenje više grupa

amino kiselina u hiperpromenljivim regionima lakih i teških lanaca daje

posebne antigenske determinante molekulu antitela i, kao posledica,

visoki stepen specifičnosti. Međutim, od tada je otkriveno da antiserumi

okrenuti protiv ovih anitgenskih determinanti unakrsno reaguju sa

drugim molekulima antitela. Termin idiotip tek treba da se ponovo

definiše.

155

■ IMUNOHEMIJA Grana imunologije koja se bavi hemijskim

supstancama i reakcijama imuno sistema, specifičnom studijom

antigena i antitela, i njihovim međusobnim interakcijama.

■ IMUNOCITOHEMIJA Imunohemija primenjena u izučavanju

intraćelijskih aktivnosti. (Danas se često zamenljivo koristi sa

imunohistohemijom.)

■ IMUNOGEN Svaka supstanca koja je u stanju da proizvede imuno

reakciju, za razliku od svake supstance koja se vezuje za antitelo (npr.

antigen).

■ IMUNOGENITET Sposobnost imunogena da izazove imuno

reakciju. Imunogenitet zavisi od mere u kojoj je domaćin stran, veličine

imunogena, kompleksnosti molekularne strukture, dužine vremena

zadržavanja u domaćinu i sposobnosti dosezanja do određenih

imunokompetentnih ćelija kako bi se proizvela imunost.

■ IMUNOHISTOHEMIJA Imunohemija primenjena u izučavanju ćelija

i tkiva. (Danas se često zamenljivo koristi sa imunocitohemijom.)

■ IN SITU HIBRIDIZACIJA Ispitivanje u cilju otkrivanja nukleinskih

kiselina "na licu mesta" u fiksiranim tkivnim presecima upotrebom

toplote kako bi se prvo denaturisali i, zatim, ponovo prekalili sa

specifičnim DNA, RNA ili PNA sredstvima za ispitivanje.

■ INTERNA KONTROLA TKIVA Uzorak pacijenta davaoca koji

sadrži ciljni marker, ne samo u tumoru za identifikaciju, već i u

susednom zdravom tkivu. Prema tome, nisu potrebni odvojeni preseci

pozitivne kontrole.

156

■ LIGAND Molekul, jon ili atom koji je vezan za centralni atom (obično

metalni atom) koordinacijskog jedinjenja ili helat.

■ VEZANO ANTITELO Pogledajte Sekundarno antitelo.

■ MONOKLONALNA ANTITELA Imunohemijski identična antitela

proizvedena od strane jednog klona plazma ćelija koje reaguju sa

specifičnim epitopom na dati antigen. Komercijalno se proizvode

upotrebom hibridom ćelija.

■ MONOSPECIFIČNO Posedovanje efekta samo na psebnu vrstu

ćelije ili tkiva, ili reagovanje sa pojedinačnim antigenom, kao

monospecifični antiserum.

■ NEGATIVNA KONTROLA TKIVA Tkivni uzorak iz istog organa

kome nedostaje ciljni antigen i koji se obrađuje upotrebom primarnog

antitela.

■ NEIMUNI SERUM Serum dobijen iz životinja koje nisu imunizovane.

■ POLIKLONALNA ANTITELA Imunohemijski različita antitela

proizvedena od strane različitih ćelija i koja reaguju sa različitim

epitopima na dati antigen.

■ POZITIVNA KONTROLA TKIVA Uzorak koji je prethodno pokazao

da specifično boji ciljni antigen nakon izlaganja primarnom antitelu.

Nespecifično pozadinsko bojenje bi trebalo da je svedeno na minimum.

Obratite pažnju da, kada su u pitanju neki ciljni antigeni (npr. specifični

antigen prostate), intenzitet bojenja bi optimalno trebalo da je ispod

maksimalnog kako bi se dozvolilo posmatranje, ne samo pozitivnosti,

već i varijacije u intenzitetu.

157

■ PRIMARNO ANTITELO Antitelo koje se prvo koristi u proceduri

bojenja.

■ PROZON FENOMEN Fenomen koji pokazuju neki antiserumi, koji

pružaju efektne reackije aglutinacije kada su razblaženi nekoliko stotina

ili hiljada puta, ali ne reaguju vidno sa antigenom kada nisu razblaženi

ili kada su nedovoljno razblaženi. Fenomen nije jednostavno

prouzrokovan viškom antitela, već često obuhvata posebnu klasu

antitela (blokirajućih ili nekompletnih) koja reaguju sa odgovarajućim

antigenom na anomalan način. Vezano antitelo ne samo da ne uspeva

da izazove aglutinaciju, već je aktivno sprečava. Do fenomena može

doći i taloženjem il drugim imunološkim reakcijama.

■ SUZBIJANJE Odnosi se na neaktiviranje hemijske aktivnosti

viškom učesnika u reakciji ili proizvoda. U enzimologiji, višak supstrata

ili proizvoda može da spreči enzimsku aktivnost.

■ SEKUNDARNO ANTITELO Antitelo koje se drugo koristi u

proceduri bojenja; reaguje sa primarnim antitelom, sada antigenom, i

formira most između primarnog antitela i sledećeg reagensa, ukoliko

postoji. Poznato je i kao "vezno" antitelo.

■ ROK TRAJANJA PRI SKLADIŠTENJU Ovaj termin se odnosi na

očekivano trajanje funkcionalne stabilnosti bioloških supstanci,

uključujući imunohemikalije, i najčešće se ocenjuje eksperimentalnim

testiranjem, vođenjem statistika i opservacijom. U laboratoriji korisnika,

preporučuju se periodična poređenja radnog rastvora sa alikvotima

zamrznutim na -20°C. Skladištenje se završava po isteku roka trajanja.

■ SPECIFIČNO BOJENJE Pozitivno bojenje tkiva ili ćelija upotrebom

primarnog antiseruma. Ponekad ovo obuhvata rašireni, apsorbovan ili

fagocitovan antigen, što dovodi do "nepoželjnog" bojenja. Bojenje vidno

158

zahvaljujući kontaminirajućim antitelima u primarnom antiserumu bi

trebalo smatrati nespecifičnim.

■ STANDARDIZACIJA Tradicionalno, standardizovati znači porediti

sa ili napraviti ispitivanje nepoznatih kako bi se odredili standardi. Kada

je u pitanju kvantitativan analitičan rad, brojevi lako dozvoljavaju

povinovanje takvim standardima. U polu-kvantitativnim ili kvalitativnim

ispitivanjima, kao što je imunocito- ili imunohistohemija, koja se često

završavaju mišljenjem, samo se subjektivna poređenja sa pažljivo

odabranim kontrolama tkiva i reagensa mogu koristiti za nadgledanje i

održavanje izvrsnosti.

■ OPORAVAK CILJNOG ANTIGENA Pogledajte "Oporavak

antigena".

■ TITAR U imunohistohemiji, najviši razblaženi rastvor antiseruma

koji prouzrokuje optimalno specifično bojenje sa najmanjom količinom

pozadine.

159

I N D E K S T E R M I N A

ABC (Avidin-biotin-enzim kompleks) i amplifikacija katalizovanog signala (pogledati CSA)

formiranje kompleksa

opšta procedura

Acetična kiselina – zink hlorid fiksirajuća tečnost Aceton Adipociti Pomoćno sredstvo AEC (3-Amino-9-etilkarbazol) Aerosil Afinitet apsorpcija

hromatografija

funkcionalni

i nerastvorljivi imuno

kompleks

suštinski

maturacija

antitela

i taloženje

i ciklusi pranja

Vazdušno sušenje

Albumin, bovin

Alkohol (pogledati Metanol i Etanol) Alkalna fosfataza

aktivnost

hromogeni

endogena

160

ugušenje

inhibitori

metalna aktivirajuća sredstva

molekularna težina

supstrati

supstrat-hromogen

reagens

Alkalna fosfataza-antialkalna fosfataza kompleks (APAAP) prednosti

kompozicija

molekularna težina

3-Amino-9-etilkarbazol (AEC) Životinjska unakrsna reaktivnost Antitela

adsorpcija

afinitet

agregati

anti-ruminant

konstanta asocijacije

lakomost

sprege

sprezanje

mogući efekti

kontaminacija

unakrsna reaktivnost

životinjska

definicija

i zajednički epitopi

razblaženi rastvori

i temperatura inkubacije

i vreme trajanja inkubacije

i prirodna antitela

161

i brzo bojenje

serijski

izolacija, efekti

okolišna

ravnoteža, sa anitgenom

rokovi trajanja

Fab fragment

F(ab¹)2 fragment

Fc fragment

Fc receptor

formacija

polu-život

rukovođenje

zavisni region

inkubacijsko

vreme

temperatura

irelevantna specifičnost

monoklonalno (pogledati Monoklonalna antitela)

pI

poliklonalno (pogledat Poliklonalna antitela)

polimerizacija

unapred razblaženo

proizvodnja

latentni period

brzina reakcije

i molekularna veličina

odnos signal-buka

stabilnost

i isticanje roka trajanja

testovi

skladištenje

162

posude

temperatura

raskravljenje

tkivna penetracija

titar

definicija

povećanje

titracija

upotreba i briga

Antigeni (pogledati Epitopi) ugljen-hidrat

citoplazmičan

difuzija

ubrizgavanje

koji sadrži lipid

maskiranje

fagocitično uzimanje

očuvanje

purifikovan

čistota

oporavak (pogledati Oporavak antigena)

površinska membrana

otkrivanje nereaktivnih

Antigen-antitelo interakcije konstanta asocijacije

odvajanje

udaljenost

ravnoteža

talozi

brzine reakcije

Antigen-vezujući framgenit (F(ab¹)2, Fab) Antigenska determinanta (pogledati Epitop)

163

Oporavak antigena i unakrsna reaktivnost

i citologija

dijagnostičkih markera

i dvostruko bojenje

metode grejanja

mehanizam

princip

i proteolitičko varenje

rastvori za oporavak antigena

i specifičnost, gubitak

tehnika

Anti-ruminant antitela

Antiserum apsorpcija

izgled

varijacije unutar zaliha

kontaminacija

unakrsno reagovanje

razblaženi rastvor

delovi

hemoliza

lipemia

stabilizovan

skladištenje

titar

neapsorbovan

APAAP (pogledati Alkalna fosfataza-antialkalna fosfataza)

Predmetno bojenje (pogledati Pozadinsko bojenje)

Autoimuna antitela

Autoliza tkiva Automatizacija

164

i in situ hibridizacija

Avidin (pogledati Streptavidin i Biotin)

biotin-vezujuća područja

endogeno vezivanje (pogledati EABA)

označen kao enzim

svojstva

Avidin-biotin (pogledati Streptavidin-biotin)

afinitet

primene

endogena aktivnost

ugušenje

metode

kompleksne (ABC)

označene (LAB)

osetljivost

Azid (pogledati Natrijum-azid)

B5 fiksirajuće sredstvo

Pozadina u adipocitima

difuzija antigena

i oporavak antigena

i antitela koja sadrže biotin

u kolagenu

komplementarna

vezivno tkivo

kontaminirajuća antitela

unakrsna reaktivnost

endogena avidin-vezujuća (EABA)

elastin

endogena aktivnost enzima (pogledati APAAP i PAP)

Fc receptori

HbsAg

165

hidrofobičnost

vreme trajanja inkubacije

jonske interakcije

raznoliki izvori

prirodna antitela

nuklearno bojenje

fagocitoza

specifično

epitel

Bakterijalna kontaminacija

B ćelija(e) antigeni i fiksacija

i Fc receptori

neoplazme

nereaktivne

Beta-lipoproteini Biotin (pogledati Avidin-biotin)

Antitelo koje sadrži biotin

Sredstva za ispitivanje koja sadrže biotin

Krvni otisci Bovinova fiksirajuća tečnost Bovin albumin

Bromelain

5-Bromo-4-hloro-3-indoksil fosfat (BCIP) Karcinoembrionski antigen (CEA) Kalcijum

Ugljen hidrati Katalaze

Katalizovana amplifikacija signala (CSA)

i ABC

amplifikacioni reagens

i oporavak antigena

166

biotin-tiramid

osetljivost

Ćelijska membrana

Ćelijski otisci Ćelijski površinski markeri Lančana tehnologija spregnuta polimerom

dekstran

EnVision sisitem

i dvostruko bojenje

EPOS sistem

i brzo bojenje

"kičmeni molekul"

Checkerboard titracije

4-Hloro-1-naftol (CN)

Hloroform

Hromatin Hromatoliza

Hromogen(i) (pogledati specifični hromogeni)

Kolagen

Komplement Sprezanje

enzim-antitelo (pogledati Glutaraldehid)

i hidrofočičnost

peroksidaza-avidina

peroksidaza-biotina

Vezivno tkivo

Kontrole

antiserum apsorbovanog afiniteta

i oporavak antigena

i automatizacija

tečnost za razblaživanje, upotreba

neimuni serum

167

i nerelevantna specifičnost

negativna

odsustvo

purifikovan antigen

potvrda kvaliteta

kontrole kvaliteta

programi kontrole kvaliteta

kontrole reagensa

tečnost za razblaživanje, upotreba

i rastvorljivi agregati

monoklonalna antitela

poliklonalna antitela

i sredstvo tkivne kontrole

nerelevantna antitela

"standardizacija"

tkivne kontrole

interne ("ugrađene")

negativne

pozitivne

osetljivost

tkivna veza

Kontrastna boja

Unakrsno vezivanje

Unakrsna reaktivnost Kriostat preseci morfologija

Citohrom

Citocentrifugalne pripreme

Citološki otisci Citoplazmični antigeni Dekalcifikacija Dekstran

168

Dekstran sulfat Dijagnostička citologija

Dijagnositčki markeri i oporavak antigena

3'-Diaminobenzidin tetrahidrohlorid (DAB) 4,4'-Difluoro-3,3'-dinitrofenil sulfon (FNPS) Razblažujući puferi i monoklonalna antitela

Direktna metoda

Odvajanje imuno kompleksa

reduktivno

Disulfid mosotvi DNA analiza (pogledati In situ hibridizacija)

Dvostruka difuzija

Dvostruko bojenje

i izdvajanje kiselina

i oporavak antigena

i hromogeni

i EnVision procedura

Elastin Elektromikroskopija

Elektrostatične interakcije (pogledati Jonske interakcije)

Kalupljenje (pogledati Parafin)

Endogena (strept)avidin-vezujuća aktivnost (EABA) i biotin

blokiranje

Endogena enzimska aktivnost katalaza

citohrom

hemglobin

intestinalna

169

neintestinalna

suzbijanje

jetra

mioglobin

ugušenje

Okolišna antitela

EnVision tehnika

Enzim(i) (pogledati specifični enzimi)

aktivnost

endogena

hromogeni

klasifikacija

sprezanje

definicija

varenje (pogledati specifični enzimi)

inhibitori

i metalni joni

prostetične grupe

reakcije

izbor

supstrati

Enzim-antienzim imuno kompleks (pogledati APAAP i PAP)

Enzim-supstrat reakcije (pogledati Enzim)

Enzimologija

Epitel Epitop i odvajanje antitela

i oporavak antigena

koji sadrži ugljen hidrat

konformacionalne promene

i varenje

i fiksacija

170

formalinski otporan

formalinski osetljiv

maskiranje

i parafin

reaktivnost

unikatnost

Oporavak epitopa (pogledati Oporavak antigena)

Ravnoteža antigen-antitelo vezivanja

ubrizganog imunogena

EPOS tehnika

Etanol Brzi Garnet GBC

Brza plava BB

Brza crvena LB

Brza crvena TR

Supstrat Brze crvene

Fc receptor Ficin

Fiksacija

vazdušnim sušenjem

i oporavak antigena

i predmetno bojenje

ćelijskih otisaka

i hromatoliza

i konformacijske promene

kriostat presek

kriostat priprema

citoloških otisaka

citoplazmični antigeni

etanol

preterana

171

formalin

standardna metoda

toplotna

i hidrofobičnost

za imunoelektronmikroskopiju

leukocitnih površinskih markera

limfoidnih tkiva

i monoklonalna antitela

parafinskih preseka

posle-fiksacija

i proteolitičko varenje

sprej

Fiksirajuće tečnosti - (pogledati specifične fiksirajuće tečnosti)

ascetični kiselina-cink hlorid

aceton

delovanje

dodatak

Bovinov rastvor

B5

ćelijski otisci

karbovaks

srestvo za zgrušavanje

kriostat preseci

efekti

na ćelijsku membranu

na citoplazmu

etanol

formaldehid na bazi (formalina)

metilenski mostovi

neutralno razblažen formalin

na bazi formal-acetona

glutaraldehid

172

infra-crveno grejanje

na bazi živin hlorida

metanol

nezgrušavajuće sredstvo

i kalupljenje u parafin

penetracija

paraformaldehid-glutaraldehid

periodat-lizin-paraformaldehid (PLP)

i kalijum dihromat (PLDP)

sprej

Zenkerov rastvor

Formal aceton

sublimat

Formaldehid delovanje

i konformacione promene

i monoklonalna antitela

i proteolitičko varenje

-zasnovane fiksirajuće tečnosti

Formalin kompozicija

fiksacija

i imunizacija

nekonzistencija

i proteolitičko varenje

-otporni epitopi

-osetljivi epitopi

standardna metoda

i hidrofobičnost

neutralno razblažen

Zamrzavanje

173

antitela

tkiva

Zamrznuti preseci i Fc receptor(i)

Giemesa bojenje

Glutaraldehid

i elektronmikroskopija

i hidrofobičnost

i sprezanje sa peroksidazom

sprezanje

u jednom koraku

u dva koraka

Granulociti Hanker-Jejts reagens

Učvršćujući agensi Hemoglobin

Hemoliza

Peroksidaza hrena (pogledati Peroksidaza)

Vlažna komora

Hibridom Vodonik-peroksid

Hidrofobičnost i adipociti

i agregacija

i aldehidska fiksacija

i anjoni

i antitela

i antigen-antitelo vezivanje

i pozadina

i beta-lipoproteini

i antitela kaja sadrže biotin

i blokirajući protein

174

bovin albumin

kazein

nemasno suvo mleko

i katjoni

i sprezanje

i vezivno tkivo

i unakrsno vezivanje

i razblaženi pufer

i epitel

i fiksacija

i formalin

i glutaraldehid

i imunoglobulini

i joni

i jonska jačina

i nespecifično vezivanje

i stabilnost

i čuvanje antitela

naknadna fiksacija

redukcija

tkivo

Hiperimunizacija

Idiotip

IgA

IgD

IgE

IgG (pogledati Imunoglobulin G)

IgG1 IgG2

IgG2a

IgG2b

IgG3

175

IgG4 IgM (pogledati Imunoglobulin M)

IgM1

IgM2

Imuno kompleks i hidrofobičnost

odvajanje

nerstvorljiv

suštinski afinitet FcR

rastvorljiv enzim-antienzim (pogledati APAAP i PAP)

Imunizacija Metoda imunoalkalne fosfataze (pogledati APAAP)

Metoda imunoenzimskog bojenja (pogledati APAAP i PAP)

Imunocitohemija fiksacija

Imunodifuzija

Imunoelektronmikroskopija fiksacija

Imunoelektroforeza

Imunogen

pomoćno sredstvo

doza

ubrizgavanje

čistoća

Imunoglobulini (pogledati IgG i IgM)

lanci

klasa

citoplazmični

disulfid mostovi

frakcija

i hidrofobičnost

laki lanci

176

vezani za membranu

purifikacija

stabilnost

struktura

potklasa

površinska membrana

Imunoglobulin G

afinitet

agregati

alotipičan marker

amino terminal

i blokirajući protein

i kontrole

i hidrofobičnost

i hiperimunizacija

područje kombinovanja antigena

polovina ugljen hidrata

karboksil terminal

lanci

disulfid mostovi

domeni

formula

fragmetni

molekularna težina

glutaraldehid-reaktivna područja

polu-život

zavisno područje

ljudski

hiperpromenljiv region

idiotipske determinante

izoelektrične tačke

kappa/lambda odnos

177

molekularna težina

monoklonalni (pogledati Monoklonalna antitela)

mišiji

i papain

pepsin

poliklonalni (pogledati Poliklonalna antitela)

preteolitičko varenje

purifikacija

reduktivno odvajanje

skladištenje

struktura

potklase

površinski naboj

vreme opstanka

Imunoglobulin M

lanci

disulfid mostovi

enzimsko varenje

fragmenti

molekularna težina

formacija

formula

polu-život

J lanaca

purifikacija, osetljivost na

reduktivni rascep

skladištenje, osetljivost na strukturu

potklase

vreme opstanka

tkivna penetracija

Inkubaciona temperatura i vreme trajanja

i brzina reakcije antitela

178

i titar antitela

Indirektna metoda

u tri koraka

u dva koraka

In situ hibridizacija (pogledati DNA i RNA analize)

oporavak ciljnog antigena

Jodonitrotetrazolium ljubičasta (INT) Jonske interakcije

i afinitet antitela

i oporavak antigena

i pozadina

i HRP sprege

i hidrofobičnost

redukcija

Izolacija antitela

Metoda označenog avidin-biotina (LAB) Metoda označenog streptavidn-biotina (LSAB) Laminin Leukocit površinski markeri

Fc receptori

Levamisol Vezno antitelo apsorbovanog afiniteta

koje sadrži biotin

unakrsna reaktivnost

i nespecifično vezivanje

zahtevi

Lipemia

Lipidi i aerosil

179

Lipoliza

Lipoproteini Limfocit(i) markeri

Limfoidno tkivo

Makrofage

Fiksirajuće tečnosti na bazi živin-hlorida

Metanol Metanolčki H2O2

Monoklonalna antitela

prednosti

afinitet

i ascites tečnost

i pozadina

i kontrole

i supernatant ćelijske strukture

koncentracija

unakrsna reaktivnost

razblaženi pufer

razblaživanje

optimalno

priprema

mane

rokovi trajanja

Fc receptori

unakrsna reaktivnost

i formalinska fiksacija

i zamrznuto tkivo

i taloženje

i procedure bojenja

učinak

i PBS

180

i pH

i pI

proizvodnja

razmnožavanje

svojstva

purifikacija

provera klonova

osetljivost

na rastvoljive elemente

na pH

specifičnost

stabilnost

skladištenje

titar

Morfologija

Mijeloma ćelije

Mioglobin

Naftol AS-BI fosfat Naftol AS-MX fosfat Naftol AS-TR forsfat Prirodna antitela

Nekrotično tkivo

Negativna kontrola

Neutralno razblažen formalin

Novi fuksin

Novozelandski beli zec

Nitro plava tetrazolium (NBT) Nezgrušavajuće fiksirajuće tečnosti Neimuni serum (pogledati Preimuni serum)

Netaložeća antitela

Nespecifična antitela

Nespecifično bojenje (pogledati Bojenje pozadine)

181

Northern blot

Ispitivanja nukleinskom kiselinom

kompozicija

metode detektovanja

ozanke

metode označivanja

dužina ispitivanja

i tretman proteazom

kompleksnost uzorka

veličina

osetljivost

i oporavak ciljnog antigena

tipovi

Osmium tetroksid

Papain

Papanikolau bojenje

Kalupljenje u parafin

Paraformaldehid-glutaraldehid rastvor PBS (pogledati Salin razblažen fosforom)

Penetracija antitela

fiksirajućih tečnosti

Pepsin

Ispitivanja peptid nukleinskom kiselinom (PNA) Periodat-lizin-dihromat-parafomaldehid (PLDP) Periodat-lizin-parafomaldehid (PLP) Peroksidaza aktivno područje

aktivnost

endogena

antitela

-spregnuta antitela

182

spezanje

kovalentno vezivanje

endogena

klasifikacija enzima

kočenje

jonske interakcije

molekularna težina

nekovalentno vezivanje

prostetična grupa

reaktivne grupe

rastvorljiv imuno kompleks (pogledati APAA i PAP)

supstrat-hromogen reagensi

streptavidin sprega

Peroksidaza-antiperoksidaza (PAP) kompleks

i endogena peroksidaza

kompozicija

metoda

molekularna težina

proizvodnja

osetljivost

pH i monoklonalna antitela

i poliklonalna antitela

Fagociti p-Fenilenediamin dihidrohlorid Salin razblažen fosfatom (PBS) i monoklonalna antitela

pI Pikrenska kiselina

Poliklonalna antitela

(pogledati Antiserum)

afinitet

183

pozadina

unakrsna reaktivnost

hemoliza

hiperimunizacija

proizvodnja

proteolitičko varenje

purifikacija

zečija primarna

titar

Bazeni antiseruma

Naknadna fiksacija

Preimuni serum

Primarno antitelo

afinitet

i pozadina

i blokirajući reagens

i checkerboard titracija

i kontrole

i vreme inkubacije

i negativna kontrola

i taloženje

imuno kompleksa

i prozon

koncentracija

specifičnost

skladištenje

tkivna penetracija

Prostetična grupa

Pronaza Proteinska struktura,

konformacione promene

Proteolitičko varenje (pogledati Tripsin i Proteaza)

184

i oporavak antigena

i zgružavajuće fiksirajuće tečnosti

i nezgrušavajuće fiksirajuće tečnosti

Prozon

Aktivnost pseudoperoksidaze (pogledati Aktivnost endogene peroksidaze)

Kontrola kvaliteta Zečiji antiserum

Brzo bojenje i EPOS sistem

metoda "brzog" bojenja

Cena reagensa

Regulacioni zahtevi Rastvor za oporavak antigena

RNA analiza (pogledati In situ hibridizacija) Raketna imunoelektroforeza

Metode Romanovski-tipa

Rok trajanja neupotrebljivanih reagenasa

Pojačanje signala

Odnos signal-buka

Otisci (pogledati Krvni otisci i Citološki otisci) Natrijum-azid

Natrijum-hlorid i monoklonalna antitela

Natrijum tiosulfat Imuno kompleks rastvorljivog enzima (pogledati APAAP i PAP)

Southern blot

Specifično pozadinsko bojenje

Specifičnost (pogledati Kontrole)

Obrada uzoraka

otisci koštane srži

ćelijski otisci

185

citocentrifugalne ćelije

otisci leukocita (meki sloj)

tkivni preseci

zamrznuti preseci

parafinski preseci

Stabilnost i hidrofobičnost

dodeljena fiksacijom

antitela

imunoglobulina

unapred razblaženih antitela

purifikovanih IgG frakcija

Bojenje amplifikacija

pozadina (pogledati Bojenje pozadine)

konzistencija

kontrole (pogledati Kontrole)

cena

intenzitet

interpretacija

metode (pogledati specifične metode)

kvalitet

brzo bojenje

specifična opravdanost (pogledati Kontrole) Streptavidin (Strept)avidin-biotin tehnologije

pozadina

modifikacije

Supstrati Supstrat-hromogen rastvori Antigeni površinske membrane

Oporavak ciljnog antigena (pogledati Oporavak antigena)

186

T ćelija i Fc receptori

Temperatura antigen-antitelo reakcija

enzimska aktivnost

fiksacija

i vreme inkubacije

i skladištenje

Tiroglobulin

Tiroidni folikularni epitel Kontrole tkiva Tkivni marker difuzija

Obrada tkiva (pogledati Obrada uzoraka)

Titar antitela (pogledati Antitela)

Otkrivanje grešaka

pozadina

puferi

demaskiranje antigena

bojenje

neadekvatno

nepoželjno

uzorak tkiva

Tripsin

Diferencijacija tumora

Metoda neoznačenog antitela (pogledati APAAP i PAP)

van-der-Valsove sile

Pranje

Vlažna fiksacija

Zenkerova fiksirajuća tečnost