Méthodes d’étudesen biologie cellulaire
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7/24/2019 Mthodes dtudesen biologie cellulaire
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Chapitre 2 :Mthodes dtudes
en biologie cellulaireDocteur Laurent PELLETIER
Anne universitaire 2010/2011
Universit Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits rservs.
UE2 : Biologie cellulaire
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Mthodes dtudes
Cellule animale : 10-20 m
Microscopie photonique
0,2 m 1 mm
1838 : Doctrine cellulaire de Schleiden et Schwann
Microscopie lectronique
1940 : 1-2 nm
Fixation, colorations
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Mthodes dtude
DNA : 1944 O.T. Avery
1953 J.D. Watson & F.H.C. Crick
Genetic code : 1961-1966 M. Nirenberg
& H.G. Khorana
DNA cloning : 1972 P. Berg
Hybridization : 1975 E.M. Southern
Fast Sequencing : 1977 W. Gilbert & F. Sanger
PCR : 1983 K. Mullis
Transgenesis : 1993 S. Spielberg Human genome sequenced : 2001
Historique
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Mthodes dtude
Lancet 2010; 375: 152535
Aujourdhui
Squenage du gnomedun patient :
- Infarctus du myocarde
- Diabte type II
- cancers
Cet exemple nest pas
apprendre
par coeur
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Mthodes dtude
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Mthodes dtude
Mme gnomeAdipocyte Neurone
Expression diffrente
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Mthodes dtude
Genome Statique, connu
Transcriptome Dynamique, dpendant ducontext, inconnu
Proteome Dynamique, dpendant ducontext, inconnu
30 000 gnes30 000 gnes
100 000 protines100 000 protines
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Mthodes dtude
Immuno-histochimie
Immuno-fluorescence
Hybridation In Situ
Les techniques de ciblage molculaire
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Mthodes dtude
Immuno-histochimie, Immunofluorescence, FACS,
Hybridation In Situ, Southern-blot, western blot,
northern-blot
mme combat !
Cible
Sonde
Secondaire
Enzyme, fluorochrome
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Mthodes dtude
Immuno-histochimie
CD31
Les techniques de ciblage molculaire
PCNA
Fort immuno-marquage nuclaire
PCNA des cellules pithliales
normales du colon.Marquage modrdans les cellules musculaires.
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Mthodes dtude
Immuno-fluorescence
Immunohistochemistry markers
to distinguish between vascular
smooth muscle and endothelial
cells. A cryosection of mouse
heart ventricle was
simultaneously stained with
FITC-conjugated smooth muscle
-actin antibody (A) and an
antibody against the apical
endothelial membrane protein,ICAM-2 (B). The secondary
antibodies to detect ICAM-2 was
Cy-5 conjugated donkey anti-rat
(pseudo-colored red for clarity).
Panel C is an overlay of the
preceding two panels.ICAM-2 (Cy5)
Actine -SM (FITC)
Les techniques de ciblage molculaire
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Mthodes dtude
Hybridation in situ (HIS)
Les techniques de ciblage molculaire
Section de cerveau de
souris :
Les points noirs indiquent
lexpression dun gne dansdes rgions spcifiques
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FACS
Cytomtrie en flux
(FACS : FluorescenceActivated Cell Sorter)
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FACS
2N-2C 2N-4C
2N-2C
2N-4C
2N-42C
2N-24C
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FACS
DNA Analysis
0 200 400 600 800 1000
Intensit de Fluorescence1Q 2Q
Nombre
decellules
75
15
0
225
300
Pic daneuplodie
(DNA index 1.21)
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ELISA
(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Dosage dun anticorps
Dosage dun antigne
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ELISA
ELISA
anticorps anti-HIV GP120
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/dosages/D3.html
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Southern blot Sparation des fragmentsgnomiques dans un gel
Fragmentation mnage
du gnome
Transfert des fragments
spars sur une membrane
Incubation de la membrane
avec une sonde
Rvlation du marquage
(visualisation de la cible)
W t bl t
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Western blot
Coloration des
protines au bleu deCoomassie
Sparation & transfert des protines+ dtection protine dintrt
= WB
Electrophorse en gel dacrylamide
ou PAGE-SDS
(PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis SodiumDodecyl Sulfate)
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Western blot
Prparation et sparation des protines
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Western blot
Electro-transfert sur nylon ou nitrocellulose
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Western blot
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Culture cellulaire
Culture cellulaire 1907 : doctrine neuronale
Explants tissulaires
Cellules isoles
Dissociation mcanique, enzymatique, EDTA
Slection
EDTA : Acide thylne diamine ttractique
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Culture cellulaire
Slection
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Culture cellulaire
Culture primaire :
Population polymorphede cellules
Cellule unique
(clonage)
Culture primaire
Culture secondaire
Culture
secondaire
Culture
secondaire
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Culture cellulaire
Observation
Microscopie contraste de phase
Vido-microscopie
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Culture cellulaire
Observation
Immunofluorescence
Mitochondries : jaune
Filaments dactine : vertADN : rouge
Mitochondries : rouge
Filaments dactine : vertADN : bleu
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Culture cellulaire
Conditions de culture
37C, pH, sels, CO2
Milieu de culture
Milieu de base
+/- Srum
Facteurs de croissance
Support
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Culture cellulaire
Immortalisation
Les cellules normales ont un nombre dedivisions limit
Cr
oissance
cellulaire
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Culture cellulaire
Immortalisation
Introduction dun oncogne (SV 40, Myc)qui immortalise la cellule sans la rendre
tumorale
Cellules tumorales
exple : He(nrietta) La(cks)
Culture cellulaire
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Culture cellulaire
Cellulenormale
Celluleimmortalise
Celluletransforme
Divisions
Ancrage,
Fact. Croiss.,
Inhib. Contact.
Cellules normales cellules cancreuses
Culture cellulaire
Ulex Europeaus Agglutinin-1
(UEA 1)
Culture de cellules de
ll h i
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Culture cellulaire(UEA-1)
Collagne IV
Facteur de Von Willebrand (vWF)
moelle osseuse humaine
N
N
NN
C lt ll l i
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Culture cellulaire
vWFActine SMABC
Techniques dtude des fonctions
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C E
Ultrasonicdissociation
Aspirating canula
"human auto-culture medium"
Dissociatedtissues
Techniques d tude des fonctions
cellulaires
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Mthodes dtude in vivo
Greffes de cellules
cellules souchescellules tumorales
Transfert de gnes Souris transgniques
souris mucoviscidose
souris prdisposes au cancer
Souris Knock-out
Mthodes dtude in vivo
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0 3 6 9 12 15
Tmoin
Anti-angiognique
Temps (jours)
Volumetumoral
Mthodes d tude in vivo
Tmoin
Modles de tumorigense
Anti-angiognique
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Mthodes dtude in vivo
Transfert de gnes :
Modifications exprimentales du patrimoine gntique
Transfert de gnes in vitro ou in vivo
Vecteurs viraux ou non viraux
Une exprience heureuse ou malheureuse lhpital Necker ?
Mth d dt d i i
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Mthodes dtude in vivo
Transfert de gne
Promoteur
Profil dexpression
spatial et temporel
cDNA Intron
Gne dintrt
AAAA
AAAA
Transgne
200kb
Mth d dt d i i
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Mthodes dtude in vivo
Transfert de gne
Promoteur
cDNAGain de fonction
- Gne sauvage
- mutant
1- Constitutif2- Spcifique dun tissu (Cerveau, foie, muscle )
3- Inductible (ttracycline, interfron...)
Perte de fonction
- dominant ngatif
- antisens
Mth d dt d i i
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Mthodes dtude in vivo
Gne rapporteur :
Gne X
Promoteur
du gne X
Gne rapporteur
-galactosidase
- Lucifrase
- GFP
- autres.
Promoteur
du gne X
GFP : Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria
Mth d dt d i i
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Mthodes dtude in vivo
Green FluorescentProtein (GFP)
Tmoin
Mth d dt d i i
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Mthodes dtude in vivo
Mthodes dtude in vivo
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Cellules demoelle osseuse
GFP
Souris irradielthalement
Coupes de cervelet
4 semaines 15 semaines
?Cellules sanguines
Mthodes d tude in vivo
Mthodes dtude in vivo
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A
C D
BHmisphre tmoin Hmisphre ls
1 jAprs lsion
14 j
Aprs lsion
Mthodes dtude in vivo
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Mthodes d tude in vivo
FVB/N-TgN(MMTVneu)202Mul
Promoter: MMTV, mouse mammary tumor virus
Gene : Erbb-2 (HER-2; HER2; Neu; Neu oncogene; c-erbB2; c-
neu; neu protooncogene)
Souris homozygotes viables et fertiles
Pas de phnotype chez les mles
Expression du transgne dtectable dans lpithliummammaire normal, les glandes salivaires et le poumon.
Tumeurs focales apparaissent autour de 4 mois
Exemple de thrapie gnique
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Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Dficit Immunitaire Combin Svre li lX
(DICS-X)
Moelle osseuse : cellules prcurseurs
c : sous-unit des R des IL-2, 4, 7, 9, 15
c absente ou inoprante
p p g q
Exemple de thrapie gnique
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Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Dficit Immunitaire Combin Svre li lX (DICS-X)
10 patients de 1-9 mois
Aspiration mdullaire
Selection des progniteurs CD34+
Exposition des vecteurs rtroviraux contenant le
cDNA de la chane c
Greffe des cellules
Exemple de thrapie gnique
Exemple de thrapie gnique
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Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Exemple de thrapie gnique
Suivi prcoce :
T, NK Reconstitution normale du pool
Rponses vaccinales normales
3 mois : Retour la maison
Exemple de thrapie gnique
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Science 17th October 2003
Octobre 2002 : 2 patients dveloppent une leucmie
Vecteur rtroviral intgr dans ou proximit de LMO2
Surexpression de LMO2
Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Exemple de thrapie gnique
Exemple de thrapie gnique
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NON !!!
Insertion dans
la chromatine ouverte
transcriptionnellement active
Intgration alatoire
Des rtrovirus
Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
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