Méthodes de séquençage d’ADN
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Méthodes de séquençage d’ADN
Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse
Méthode chimique de Maxam et Gilbert
Méthode enzymatique de Sanger
Détails des techniques utilisées au début des années 1990
Séquençage de grands fragments : marche sur le chromosome, sous-clonage, etc.
Automatisation
Méthode Shotgun
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Rappel sur l’ADN
http://www.dgpc.ulaval.ca/bio90192/chap4/notesadn/notesadn1.htm
Base azotéeDésoxyribose Phosphate
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Enzymes de restriction
http://www.dil.univ-mrs.fr/~vancan/optionBio1/documents/1ercours2003_4.pdf
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Clonage d’ADN
http://www.sesep.uvsq.fr/formation/strucplasm.JPEG
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Clonage d’ADN
http://www.sesep.uvsq.fr/formation/princlon1.JPEG http://www.fhcrc.org/education/courses/cancer_course/basic/approaches/screening.html
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Principe de l’électrophorèse
http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/techgen/html/electro.htm
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Exemple d’électrophorèse
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Méthode de Maxam et Gilbert
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Méthode de Maxam et Gilbert
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Méthode de Maxam et Gilbert
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ADN polymérase
5’
3’
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http://www.finnzymes.fi/products/pcr/phusion_high_fidelity_dna_polymerase.htm
Méthode de Sanger
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Méthode de Sanger1. Préparation d’une grande quantité d’ADN (~1g via
miniprep)Dénaturation et ajoût de l’amorce, des 4 dNTP (dont 1 radioactif, S35 ou P32) et de l’ADN polyméraseFaire 4 aliquots et mettre un peu de ddNTP dans chaque tubeElongation et terminaison par incorporation de didéoxynucléotides spécifiques
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Méthode de Sanger5. Préparation du gel du
polyacrylamideDénaturation et dépôt sur gelMigration par électrophorèse
ddGddA ddT ddC
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Méthode de Sanger8. Transfert du gel sur papier filtre
(Whatman 3MM)Séchage du gelCassette autoradiographique (+ écran amplificateur)Développement du film autoradiographiqueLecture sur table lumineuseSaisie sur ordinateur
Longueur typique de lecture : 400 nucléotidesDurée totale de l’expérience : environ 3 jours
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Séquençage de grands fragments
Marche sur le chromosome
10 kpb
Synthèse de 2 * 10 amorcesDurée totale du séquençage : > 11 * 3 joursQualité des séquences Lecture double brin ~ 3 mois
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Séquençage de grands fragments
Sous-clonage
10 kpb
~ 5 enzymes de restriction à 6 nucléotides (HindIII, EcoRI, BamHI, PstI, SmaI)Carte de restriction pour décider quelles enzymes retenirSous-clonage avec BamHI des 8 fragments
BamHI PstI BamHI SmaI BamHI PstI BamHI SmaI BamHI BamHI SmaI EcoRI BamHI
Durée totale du séquençage : ~ 5 * 3 jours
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Séquençage de grands fragments
Digestion avec une exonucléase
10 kpb
2 enzymes de restriction (5’ sortant et 5’ rentrant)
PolylinkerInsert
Plasmide
………
Prélévements toutes les ~30’’, ligation, clonage, séquençage ~10 jours
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Étapes limitantes du séquençageTemps, coûts, difficulté de robotiser :
Obtention de l’ADN (miniprep) Autoradiographie : 12h à des jours Couler les gels Détermination et fabrication des amorces
(marche sur le chromosome) Sous-clonage
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Polymerase Chain Reaction PCR
http://www.rit.edu/~gtfsbi/IntroBiol/images/CH11/figure-11-21.jpg
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Utilisation des fluorochromes
http://www.bioteach.ubc.ca/Bioinformatics/GenomeProjects/
Cycle sequencing
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Utilisation des fluorochromes
http://www.genotype.de/d/p/d_gel_plasmid_prep.htm
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Capillaires
http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp2_2.shtml
http://www.aecom.yu.edu/cancer/new/cores/sequencing/abi3700.htm
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Séquençage par shotgun
http://www.kisac.ki.se/education/slides/data/genomedbs/shotgun.html
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Séquençage par shotgun
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Evolution de la vitesse de séquençage
Année #réactions/personne/semaine
Longueur moyenne de
lecture
#nucléotides/personne/semaine
1977 4 50 200
1980 20 100 2 000
1990 60 300 18 000
1997 180 500 90 000
1999 500 650 325 000
2000 5000 600 3 000 000
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Construction d’une carte de restriction
http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html