GAIPE Groupe danalyse interdisciplinaire de problématiques délèves.
Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence...
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Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulairede protéines d’adhérence cellulaire
Laurence Martel
19 décembre 2002
UMR 5819 CNRS-CEA-UJF
Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires
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Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
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C-Cadhérine : résolution 0,308 nm(T. Boggon et al. 2002)
Positions des atomes
Relations structure/fonction des protéinesRelations structure/fonction des protéines
• Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de
• Cristaux 3D par Rayons X
résolution atomique (jusqu’à 0,1 nm)
Objectifs de cette étudeDévelopper une méthodologie pour étudier les interactions
entre protéines immobilisées et protéines en solution
• Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm
Hypothèses sur la fonction de la protéine
• Formation de complexes de protéines
– Immobilisation des protéines sur une surface
Informations sur les interactions entre protéines
Reconstruction 3D de la structureEnveloppe de la protéine
Sticholysine II : résolution 1,5 nm(Martin-Benito et al. 2000)
1,2nm
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Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
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Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
1ère Étape : Formation d’une monocouche de lipides à la surface de l’eau– Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni2+ : Ni-NTA-DLGE– + Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche
lipides ligandslipides diluants
OO
O
O
O
O
NHO
N
O
OH
OOH
OOH
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Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
2ème Étape : Injection de protéines
Ancrage par liaison de coordination
histidine-nickel
Exemple: Injection de cadhérines-His6
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Exemple: Injection de fragments
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase
Étude des interactions entre protéines
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3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
Étude des interactions entre protéines
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Techniques d’étude expérimentaleTechniques d’étude expérimentale
Informations recherchées
Mesurer la quantité de protéines ancrées aux lipides– Sans marqueur
– Sans transfert de la couche de protéines
Suivi de l’évolution en temps réel et in situ
– Ellipsométrie à la surface de l’eau
Résolution 0,5 mg/m2 = 0,5 ng/mm2
– Résonance des plasmons de surface sur surface solide
Déterminer la structure verticale de la couche
– Réflectivité des rayons X
Résolution verticale 1 nm
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1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Ligne de lumière Troïka II, ESRF (Responsable O. Konovalov)
Goniomètre Cellule échantillon
Faisceau synchrotron monochromatique
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10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
Réf
lect
ivité
(I/I
0)
0.50.40.30.20.10q z (Å
-1)
qc
1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Mesure de l’intensité réfléchie spéculaire
sin4
irzq kk
Réflectivité I/I0
Cas d’une interface simple :Air-Eau
qz-4
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1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
Ré
flect
ivité
(I/I
0)
0.50.40.30.20.10q z (Å
-1)
Lipides Ni-NTA-DLGE
qc
Réflectivité I/I0
Cas d’une couche sur un substrat :Lipides sur eau
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1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
– Monocouche de fragments de C-cadhérine
– Lipides ligands Ni-NTA-DLGE
Cas d’une couche complexe sur un substrat :
Protéines ancrées aux lipides sur eau
Courbe de réflectivité complexe• Avantage de l’ESRF : la brillance du faisceau
synchrotron permet de mesurer jusqu ’à des vecteurs de diffusion q~0,5 Å-1 soit une résolution de ~6,5 Å
• Nécessité d’une méthode d’analyse des données avec un modèle du système étudié
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2. Ellipsométrie2. Ellipsométrie
Suivi des variations des angles ellipsométriques et en fonction du temps, de , de
...,,,,.tan 110 dnnfer
r i
s
p
Relation entre la mesure et l’indice de réfraction 3
2
1
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
180
150
120
90
60
30
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
Cas des lipides sur l'eau
Indice eau n=1.333
Paramètres des lipides : n=1.448 d=2,5 nm
Mesure du rapport des coefficients de réflexion des polarisations p et s de la lumière autour de l’angle de Brewster
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3
2
1
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
180
150
120
90
60
30
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
2. Ellipsométrie2. Ellipsométrie
Suivi de l’adsorption de C-cadhérine à une monocouche de lipides ligands Ni-NTA-DLGE [Ca2+] = 0,5 mM
Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30
Conséquences– Non-linéarité de la variation de et de
avec l’adsorption à angle fixe– Interprétation des mesures cinétiques ?
Problème soulevé pour une couche épaisse (>10nm)
– Déplacement de la courbe ellipsométrique angulaire vers les grands angles
2h
2h17h30
17h30
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Modélisation du système lipides+protéinesModélisation du système lipides+protéines
Objectif : Comparer les données expérimentales avec une courbe théorique pour déduire les paramètres (, d) caractérisant le système
Programmes de calcul : – Réflectivité X : Parratt32 (HMI Berlin), R. Ober
Paramètres ajustables : densité électronique , épaisseur d, rugosité – Ellipsométrie (et Résonance de Plasmon de Surface) : ce travail
Paramètres ajustables : indice de réfraction n, épaisseur d
Système à N couches (, d)N
• Équations de Fresnel
• Simulation des courbes par un calcul matriciel d’Abélès
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10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
Réf
lect
ivité
(I/I
0)
0.50.40.30.20.10q z (Å
-1)
Lipides Ni-NTA-DLGE
qc
Réflectivité des rayons X en incidence rasanteRéflectivité des rayons X en incidence rasante
Chaîne carbonée Tête polaire et groupement Ni-NTA
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
6040200-20Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
Réflectivité I/I0Modèle de profil de densité électronique des lipides • 2 couches : 7 paramètres d'ajustement (,d,)
Air Eau
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Réflectivité des rayons X en incidence rasanteRéflectivité des rayons X en incidence rasante
Modèle de profil de densité électronique d’une monocouche de fragments de C-cadhérine
• 30 couches : d=0,7 nm, =0 nm 30 paramètres d'ajustement ()N
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niq
ue
(e.Å
-3)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
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• Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits
Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :masse adsorbée par unité de surfacemasse adsorbée par unité de surface
dzRz
mmg emPOHP
OHelX
2
22 )()/(
Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipidesEllipsométrie [Ca2+] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca2+] = 5 mM
Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m2 Après 4h : 8,1 mg/m2
Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m2
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
<P> ~ 0,417 e.Å-3 : densité électronique moyenne de la protéine
Rem rapport masse / électron dans la protéine sèche
• Ellipsométrie : Approximation de De Feijter et al. (1978)
)Å()/( 22
POHP
el h
dcdn
nnmmg
dn/dc ~ 0,19 cm3/g : incrément d’indice de la solution de protéine
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RésultatsRésultats
Mises au point1. Technique d’élaboration de monocouches de protéines2. Techniques expérimentales d’analyse de surface complémentaires3. Modélisation du système en multicouches
Ellipsométrie
• Mesure des angles ellipsométriques et
• Ajustement pour obtenir <n> et <h>
• Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides
• Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes
Réflectivité des rayons X
• Mesure de l’intensité réfléchie
• Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface
• Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides
Application à l’étude des interactions entre protéines d’adhérence cellulaire
![Page 21: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/21.jpg)
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
![Page 22: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/22.jpg)
Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Exemple des cellules de l’endothélium vasculaire
Plusieurs familles de Protéines d’Adhérence Cellulaire
![Page 23: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/23.jpg)
Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Famille des cadhérines
– Glycoprotéines transmembranaires
– Sur tous types de cellules
– Différentes cadhérines selon les cellules :• VE-cadhérine humaine
(Vascular Endothelium)
• C-cadhérine de Xenopus
– 5 domaines extracellulaires homologues (EC)
– 12 ions Ca2+/cadhérine pour un bon repliement
~23nm
![Page 24: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/24.jpg)
Interaction entre molécules d ’adhérenceInteraction entre molécules d ’adhérence
Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine
parallèles et anti-parallèles
Concentrations critiques en calciumPerz et al. 1999
mM [Ca2+]
0
0,05
0,5
1
pas d’interaction
dénaturation
cis
trans
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Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?
Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?
Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution
C-cadhérine : Interactions transselon 3 alignements
(mesures de force de surface)
E- et N-cadhérine : Interaction trans par domaines N-terminaux
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Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?
VE-cadhérine : Formation d’hexamères du fragment VE-EC1-4
modèle d’interaction trans
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?
Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?
Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution
![Page 27: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/27.jpg)
Les protéines recombinantes étudiéesLes protéines recombinantes étudiées
C-cadhérineCollaboration Deborah Leckband - UIUC, Urbana
Fragment principal : C-EC1-5 His
VE-cadhérineCollaboration Danielle Gulino - IBS, Grenoble
Fragment principal : VE-EC1-4 His
~19 nm
Parties extracellulaires seulement
~23 nm
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Objectif de l’étude des cadhérinesObjectif de l’étude des cadhérines
Approche expérimentale
Caractérisation de couches de cadhérines• par ellipsométrie : masse adsorbée
• par réflectivité X : structure verticale
1) Variation de la concentration en calcium• Suivi de la masse adsorbée
• Évolution de la structure des couches
2) Interactions entre fragments de différentes longueurs
Questions posées
Structure et alignement cis ou trans
• le long des complexes de C-cadhérine?
• le long des hexamères de VE-cadhérine?
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Monocouche de C-cadhérine en présence de Monocouche de C-cadhérine en présence de calciumcalcium
Monocouche de fragments C-EC1-5His avec [Ca2+] = 5 mM
– Lipides ligands Ni-NTA-DLGE
– Après 4 heures d’incubation
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
Épaisseur totale ~16 nm
Modèle d’interactions des cadhérines dans la couche
Complexes cis ou trans ?
• D’après la structure de T. Boggon et al. (2002)• Inclinaison moyenne de 50° / surface
![Page 30: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/30.jpg)
Influence de la concentration en calcium sur une Influence de la concentration en calcium sur une couche de cadhérinescouche de cadhérines
Cadhérine sensible aux variations de la concentration calcium ?
Monomères ou
complexes cis
Complexes trans
[Ca2+] > 1 mM
Perte de masse due àDécrochement de cadhérines Dissociation des complexes
Pas de variation attendue
- calcium
[Ca2+] < 0,5 mM
![Page 31: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/31.jpg)
Influence de l’agent chélatant d’ions divalents EGTA sur une monocouche de C-cadhérine
Dissociation de complexes de C-cadhérineDissociation de complexes de C-cadhérine
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
(°)
20191817Temps (h)
180
170
160
150
140
130
(°)
EGTACalcium10 mM10 mM
=459 nm, =52°5
A B C
Ellipsométrie : Suivi cinétique de et Masse apparente de protéine adsorbée
[Ca2+] =10mM[EGTA]=10mM[Ca2+] =5mM
-5%-17%
6,7 mg/m25,8 mg/m27,0 mg/m2
CBA
Perte de masse après l’ajout d’EGTA
La masse initiale de C-cadhérine est retrouvée à 95% par simple ajout de calcium
34% des fragments en complexes trans
![Page 32: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/32.jpg)
Dissociation de complexes de C-cadhérineDissociation de complexes de C-cadhérine
À partir d’une couche élaborée sur forte concentration en calcium
3
4
5
6
789
10-8
2
3
4
5
6
789
10-7
2
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.30.20.10q z (Å
-1)
C-EC1-5His 1 mM Ca2+
Lipides Ni-NTA-DLGE Expérience Ajustement
3
4
5
6
789
10-8
2
3
4
5
6
789
10-7
2
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.30.20.10q z (Å
-1)
C-EC1-5His
Dilué à 0,1 mM Ca2+
Lipides Ni-NTA-DLGE Expérience Ajustement
Dilution de la sous-phaseRéflectivité X
Conclusion
Pertes de masse et déstructuration des couches de C-cadhérines
0.42
0.40
0.38
0.36
0.34
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
200150100500Distance (Å)
[Ca2+
]=1 mM initial
Puis [Ca2+
]=0.1 mM
Profils de densité électronique
Perte de masse après dilution30% de fragments en complexes trans-15%
6,4 mg/m27,5 mg/m2
![Page 33: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/33.jpg)
Conclusion sur la C-cadhérine Conclusion sur la C-cadhérine
• Cadhérines immobilisées sensibles au calcium
• Cadhérines inter-digitées dans la monocouche
• Dissociation de complexes trans de C-cadhérines
Mais …Les fragments possèdent tous une étiquette histidine
5
1
5
1 5
15
15
1
5
1
EGTA 75 mM
a) b) c)
NiCl2 75 mM
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1 5
15
15
1
5
1
EGTA 75 mM
a) b) c)NiCl2 75 mM
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
[Ca2+] = 1 mM [Ca2+] = 0,1 mM
![Page 34: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/34.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Localisation des interactions entre cadhérine le long de la protéine ?
Interactions établies en solution entre fragments identiques de VE-cadhérine
(S. Bibert et al. 2002)
Trois mélanges de fragmentsVE-EC1-4 et de fragments courts
Rapport 1:100 (EC1-4:court) pour favoriser la formation de complexes mixtes en solution
![Page 35: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/35.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 seul
His6
10-10
10-9
10-8
10-7
Réf
lect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His 5 mM Ca2+
Lipides Ni-NTA-DLGE
Expérience Ajustement
![Page 36: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/36.jpg)
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
De
nsi
té é
lect
ron
iqu
e (
e.Å
-3)
300250200150100500Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His
eau
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Épaisseur totale ~ 21 nmHexamères en surface ?
Fragment 1-4 seul
~19 nm~23,3 nm
His6
![Page 37: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/37.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 1-3
10-10
10-9
10-8
10-7
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His + VE-EC1-3Lipides Ni-NTA-DLGE
Expérience AjustementHis6
![Page 38: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/38.jpg)
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30D
en
sité
éle
ctro
niq
ue
(e
.Å-3
)300250200150100500
Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3
eau
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 1-3
Profil de densité électronique similaireau cas du fragment 1-4 seul
His6
![Page 39: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/39.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 2- 4
810
-9
2
4
6
810
-8
2
4
6
810
-7
2
Réf
lect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His + fragmentsLipides Ni-NTA-DLGE
Lipides VE-EC2-4His6
![Page 40: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/40.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 2- 4
• Profil similaire à celui des lipides• Pas d'interaction lipide-cadhérine
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
De
nsi
té é
lect
ron
iqu
e (
e.Å
-3)
6040200Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC2-4
Fragment 1-4 +fragment 1-3
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
300250200150100500Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3
eau
His6
![Page 41: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/41.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 3-4
810
-9
2
4
6
810
-8
2
4
6
810
-7
2
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His + fragmentsLipides Ni-NTA-DLGE
Lipides VE-EC3-4His6
![Page 42: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/42.jpg)
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 3-4
• Profil similaire à celui des lipides• Pas d'interaction lipide-cadhérine
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0D
en
sité
éle
ctro
niq
ue
(e
.Å-3
)
6040200Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC3-4
Fragment 1-4 +fragment 2-4
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
De
nsi
té é
lect
ron
iqu
e (
e.Å
-3)
6040200Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC2-4
Fragment 1-4 +fragment 1-3
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
300250200150100500Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3
eau
His6
![Page 43: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/43.jpg)
Modèles d’interaction entre cadhérines
• Ancrage de protéines aux lipides dans le cas du mélange EC1-4/EC1-3
• Pas d’ancrage de protéines aux lipides dans le cas des mélanges EC1-4/EC2-4 et EC1-4/EC3-4
Conclusion sur la VE-cadhérine Conclusion sur la VE-cadhérine
Entre fragments de longueurs différentes
Importance du domaine EC4La formation de complexes bloque l’étiquette histidine
Dans l’hexamère
?
![Page 44: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/44.jpg)
Conclusion sur la VE-cadhérine Conclusion sur la VE-cadhérine
Modèles d’interaction entre cadhérines
En plusieurs étapes ?
Formation de complexes cis puis de complexes trans
Mélange de complexes en surface ?
![Page 45: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/45.jpg)
Sur la méthodologie développée
• Ellipsométrie
– Nécessaire prise en compte de la non-linéarité de et de avec l’adsorption (mesures à angle fixe)
– Estimation quantité de matière adsorbée en surface, Résolution 0,5 mg/m2
– Suivi de la quantité de matière adsorbée en temps réel
• Réflectivité des rayons X
– Des profils de densité électronique complexes rendent compte de changements fins dans la couche de protéines
Résolution ~ 1 nm (suivant la normale à la couche)
ConclusionsConclusions
Sur l’étude des cadhérines
• Dissociation de complexes et déstructuration de la monocouche de C-cadhérine par appauvrissement de la sous-phase en calcium
Il existe des complexes anti-parallèles totalement enchevêtrés en surface
• Importance du domaine EC4 dans les interactions entre fragments de VE-cadhérine
Hexamères en surface ?
![Page 46: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/46.jpg)
PerspectivesPerspectives
Étude des Cadhérines– Étude des interactions entre cadhérines immobilisées avec
• Un plus grand nombre de fragments courts différents
• Fragments sans étiquette histidine
– Structure de complexes cristallisés à 2 dimensions (VE-cadhérine : thèse R. Al-Kurdi)
– Questions ouvertes
• Observations de différences d’affinités en surface et en volume
• Faible action de l’agent chélatant EGTA sur le nickel des lipides ligands ?
Modélisation de la Réflectivité X– Améliorer la modélisation en tenant compte de
• Couches d’épaisseurs variables• Conservation du nombre d’électrons dans une couche
Monocouche de protéines sur Surfaces Solides– Manipulation des échantillons facilitée
– Étude par Résonance de Plasmons de Surface et Réflectivité de rayons X durs
![Page 47: Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022110304/551d9d82497959293b8bb962/html5/thumbnails/47.jpg)
PerspectivesPerspectives
Appareil de mesure de la Résonance de Plasmons de Surface