MET Biologia Attias
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11
Microscopia Eletrônica Microscopia Eletrônica em Biologiaem Biologia
MMáárcia rcia AttiasAttiasInstituto de BiofInstituto de Biofíísica UFRJsica UFRJ
[email protected]@biof.ufrj.br
22
Um pouco de histUm pouco de históóriaria
33
Amostras biolAmostras biolóógicas e o MEgicas e o MECCéélulas:lulas:
FrFráágeisgeisHidratadasHidratadasMuito espessas para o feixe de elMuito espessas para o feixe de eléétronstronsAmbiente no interior do ME: vAmbiente no interior do ME: váácuo e calorcuo e calor
44
55
Porque as cPorque as céélulas não podem lulas não podem ser observadas vivas no ser observadas vivas no MicroscMicroscóópio Eletrônico ?pio Eletrônico ?
Não pode haver Não pode haver áágua na coluna do gua na coluna do microscmicroscóópiopioAs cAs céélulas têm de ser resistentes ao lulas têm de ser resistentes ao feixefeixeAs cAs céélulas precisam apresentar lulas precisam apresentar contrastecontrasteAs cAs céélulas têm de ser cortadas em fatias lulas têm de ser cortadas em fatias finasfinas
66
FIXAFIXAÇÇÃOÃO
PreservaPreservaçção da integridade ão da integridade morfolmorfolóógica x moleculargica x molecular
77
FixaFixaçção de amostrasão de amostrasFixar Fixar éé matar a cmatar a céélula preservando sua lula preservando sua estruturaestrutura
Pode ser QuPode ser Quíímica oumica ouFFíísica: congelamentosica: congelamento
88
FixadoresFixadores ququíímicosmicos
Permanganato de PotPermanganato de Potáássio (KMnOssio (KMnO44))
99
ContrastaContrastaççãoão negativanegativa
Células
Estruturas macromoleculares
vírus
1010
FormaldeFormaldeíídodoInstInstáável, preparado a partir de vel, preparado a partir de paraformaldeparaformaldeíídodo. Não forma liga. Não forma ligaçções ões cruzadas. Degrada rapidamente em metanolcruzadas. Degrada rapidamente em metanolPreserva Preserva antigenicidadeantigenicidade da amostrada amostraPenetraPenetraçção rão ráápidapida
FixadoresFixadores ququíímicosmicos
1111
Famous first electron micrograph of an intact cell was published in The Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A Study of Tissue Culture Cells by Electron Microscopy," by Keith R. Porter, Albert Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times
OsO4 OsO4 –– tetrtetróóxidoxido de de óósmiosmio
LigaLiga--se aos se aos áácidos graxos cidos graxos insaturadosinsaturadosAge como contrastanteAge como contrastanteAge como mordenteAge como mordente
FixadoresFixadores ququíímicosmicos
1212
GlutaraldeGlutaraldeíídodo (Sabatini, 1963)(Sabatini, 1963)Forma ligaForma ligaçções cruzadas com proteões cruzadas com proteíínasnasMelhor preservaMelhor preservaçção estruturalão estruturalPenetraPenetraçção mais lenta que o ão mais lenta que o formaldeformaldeíídodo
FixadoresFixadores ququíímicosmicos
1313
1414
1515
SoluSoluçções tampãoões tampãoOs Os fixadoresfixadores são sempre dilusão sempre diluíídos em dos em solusoluçções tampão paraões tampão para
Manter o equilManter o equilííbrio osmbrio osmóótico do materialtico do materialManter o pH prManter o pH próóximo ao fisiolximo ao fisiolóógicogico
Tampões mais comuns Tampões mais comuns Fosfato de SFosfato de SóódiodioCacodilatoCacodilato de Sde Sóódiodio
1616
Perguntas mais Perguntas mais frequentesfrequentes
Que Que fixadorfixador usar? Fixar por imersão ou por perfusão?usar? Fixar por imersão ou por perfusão?Qual a concentraQual a concentraçção de Glutaraldeão de Glutaraldeíído, formaldedo, formaldeíído, do, tetrtetróóxido de xido de óósmio?smio?RecomendaRecomenda--se adicionar o ferrocianeto de potse adicionar o ferrocianeto de potáássio na pssio na póóss--fixafixaçção?ão?Sacarose, Sacarose, NaClNaCl, , áácido tânico. Qual seu papel na fixacido tânico. Qual seu papel na fixaçção?ão?Quanto tempo se deve deixar a amostra no Quanto tempo se deve deixar a amostra no fixadorfixador??Quanto tempo se deve lavar para retirar o Quanto tempo se deve lavar para retirar o fixadorfixador??A que temperatura deve ser a fixaA que temperatura deve ser a fixaçção?ão?Que tamanho deve ter a amostra?Que tamanho deve ter a amostra?Como selecionar o tampão?Como selecionar o tampão?
1717
FixaFixaçção Quão Quíímica por mica por imersãoimersão
ÉÉ a mais utilizada. O protocolo padrão a mais utilizada. O protocolo padrão compreende as seguintes etapas:compreende as seguintes etapas:
1.1. fixafixaçção primão primááriaria2.2. lavagemlavagem3.3. ppóóss--fixafixaçção (ou fixaão (ou fixaçção secundão secundáária)ria)4.4. lavagemlavagem5.5. desidratadesidrataççãoão6.6. infiltrainfiltraçção em resinaão em resina7.7. polimerizapolimerizaçção da resinaão da resina
1818
?
Passo a passo da fixaPasso a passo da fixaççãoão
1919
Amostras precisam ser bem Amostras precisam ser bem pequenaspequenas
2020
DIFUSÃODIFUSÃO
Palavra chave:Palavra chave:
2121
ProteProteçção contra vapores e soluão contra vapores e soluççõesões
2222
PPóóss--FixaFixaççãoão
2323
DESIDRATADESIDRATAÇÇÃOÃO
2424
DesidrataDesidrataççãoão
A amostra A amostra éé passada por passada por concentraconcentraçções crescentes de ões crescentes de
etanol ou acetonaetanol ou acetona
2525
InfiltraInfiltraçção em resinaão em resina
Em seguida, o fluido de transiEm seguida, o fluido de transiçção serão seráásubstitusubstituíído por uma resina ldo por uma resina lííquida.quida.Este processo Este processo éé feito gradualmente ao feito gradualmente ao longo de 24 horas.longo de 24 horas.
Resina no estado líquido
2626
Tipos de resinaTipos de resinaEPOXIEPOXI
HidrofHidrofóóbicasbicasPolPolíímeros de trama meros de trama mais fechadamais fechadaPolimerizaPolimerizaçção a 60ão a 60ooCC
METACRILATOSMETACRILATOSHidrofHidrofíílicaslicasPolPolíímeros de trama meros de trama mais abertamais abertaPolimerizaPolimerizaçção a baixa ão a baixa temperatura sob U.V.temperatura sob U.V.
2727
• Quando as amostras estiverem completamente infiltradas na resina elas serão distribuídas em moldes e levadas à estufa...
2828
Na estufa a resina se solidificarNa estufa a resina se solidificaráá..Os blocos contendo as amostras podem Os blocos contendo as amostras podem ser retirados e ser retirados e desenformadosdesenformados..
48 horas60oC
2929
Em seguida, os blocos são preparados Em seguida, os blocos são preparados para serem cortados em fatias para serem cortados em fatias ultrafinas.ultrafinas.
Número de identificação amostra
3030
UltramicrotomiaUltramicrotomia
As amostras precisam ser cortadas em seções ultrafinas para que ofeixe de elétrons possa atravessá-las. Isto é feito num ultramicrótomo
3131
O bloco é preso no braço do instrumento. A cada oscilação do braço, há um pequeno avanço. Ao passar pelo gume de diamante da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho d´água
diamante
bloco
espelho d´água
braço
3232
3333
3434
Os cortes flutuam sobre um Os cortes flutuam sobre um espelho espelho dd´́ááguagua
Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)
3535
Os cortes são recolhidos em Os cortes são recolhidos em telas de cobretelas de cobre
Cada tela tem 3 mm de diâmetro !
3636
A grade é então inserida no microscópio eletrônico de transmissão
3737
3838
19651965
3939
ConsideraConsideraçções sobre fixaões sobre fixaçção ão ququíímicamica
De acordo com os De acordo com os fixadoresfixadores e solue soluçções ões utilizados utilizados éé posspossíível identificar vel identificar seletivamente espseletivamente espéécies moleculares ou cies moleculares ou proteproteíínas, havendo metodologias nas, havendo metodologias especespecííficas para a localizaficas para a localizaçção ou realce de ão ou realce de vváários componentes celulares.rios componentes celulares.
4040
PrincPrincíípios da Fixapios da Fixaçção a frioão a frio
Congelamento Congelamento ““instantâneoinstantâneo”” do momento do momento celularcelularEvita: sofrimento, difusão de solutos, Evita: sofrimento, difusão de solutos, deformadeformaçção osmão osmóótica, alteratica, alteraçção ão bioqubioquíímicamicaProblemas: velocidade de fixaProblemas: velocidade de fixaçção em ão em funfunçção da espessura da amostraão da espessura da amostra
4141
CriofraturaCriofraturaMMéétodos de congelamentotodos de congelamento
4242
4343
4444
MMéétodos de congelamentotodos de congelamento
PlungePlunge FreezingFreezing
4545
MMéétodos de congelamentotodos de congelamento
Congelamento por Congelamento por Alta pressão (Alta pressão (HighHighpressurepressure freezingfreezing))
4646
CrioCrio--SubstituiSubstituiççãoão((freezefreeze substitutionsubstitution))
4747
CrioCrio--eletronmicroscopiaeletronmicroscopia
4848
4949