messelhaeusser Nachweis Clostridium spp. Garmisch · Bayerisches Landesamt für Gesundheit und...
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Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit
Nachweis und Differenzierung potentiell humanpathogener Clostridium spp. in
unterschiedlichen Matrizes
U. Messelhäußer, R. Zucker, P. Kämpf, H. Schreiner, U. Pudich, H. Diepolder, C. Höller, U. Busch
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Humanpathogene Clostridium spp.
Lebensmittel
C. perfringens (Typ A und selten Typ C u. D)Botulinum-Toxin produzierende Clostridium spp. (Typ A, B, E und F)(C. difficile)
Wundinfektionen
C. botulinum (Typ A, B, E und F)C. perfringens (Typ A)u. a. C. tetani, Clostridium septicum u. C. chauvei
Krankenhausassoziierte Erkrankungen
C. difficileC. perfringens (Typ A)
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Clostridium perfringens
gram-positive, sporenbildende anaerobe bzw. aerotolerant wachsende Stäbchenbakterien
Einteilung in fünf Toxintypen (Typ A bis E)
ubiquitäre Verbreitung in der Umwelt
lebensmittelassoziierte Toxi-Infektionen in der Mehrzahl durch C. perfringensTyp A-Stämme mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung (CpE)
Freisetzung des Enterotoxins im Darmlumen durch die Sporulation der aufgenommenen vegetativen Zellen
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Enterotoxämie bei Kälbern
cpa, iap, ipb, (cpe)cpa, iap
xxE
Enterotoxämie bei Lämmern, Schafen, Kälbern und Ziegen
Gastroenteritiscpa, etx, (cpe)xxD
Nekrotisierende Enteritis bei Ferkeln, Lämmern,
Kälbern, FohlenEnterotoxämie bei
Schafen
Nekrotische Enteritis (Darmbrand)
cpa, cpb1, (cpe)cpa, cbp2, (cpe)cpa, cpb1, cpb2,
(cpe)
xxC
Dysenterie bei Lämmern,
HämorrhagischeEnteritis bei Kälbern und Fohlen, Enterotoxämie
bei Schafen
cpa, cpb1, etx, (cpe)xxxB
Durchfall (Fohlen, Ferkel usw.)
Nekrotisierende Enteritis (Geflügel)
Gangrän bei Wundinfektionen
Gastroenteritis(lebensmittelbedingt,antibiotoikaassoziiert)
cpa
cpa, cpecpa, cpb2, (cpe)
xA
ιεβα
Veterinärmedizi-nisch bedeutsame
Erkrankungen
Humanmedizi-nisch bedeutsame
Erkrankungen
GenotypHaupttoxineToxintypen
Petit et al., 1999
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Angewandtes Nachweisverfahren
Probenmaterial
9 x TPGY-Bouillon
Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 37° C für 24 h
real-time-PCR nach DNA-Extraktion aus der Anreicherungsbouillon
Ausstrich aus der Anreicherungsbouillon auf Eigelb-
Lactose-Agar und Blutagar
Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 37° C für 24 h
real-time-PCR von verdächtigen Kolonien
Keimzahlbestimmung(Spiralplattenverfahren auf
Eigelb-Lactose-Agar)
real-time-PCR von verdächtigen Kolonien
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C. perfringens in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs
Blattsalate (u. a. Rucola, Feldsalat), n = 49
Nachweis von C. perfringens in 31 von 49 Proben (63 %):
Trockenpilze u. Gewürze, n = 108
Nachweis von C. perfringens in 35 von 108 Proben (32 %):
25
15
ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb2
27
41 3
ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb2cpa/iap
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C. perfringens in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs
Tee und Teeerzeugnisse, n = 57
Nachweis von C. perfringens in 30 von 57 Proben (53 %):
17
1
8
3 1
ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb2cpa/iapcpa/etx
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C. perfringens in Lebensmitteln tierischen Ursprungs
Hackfleisch, n = 24
Nachweis von C. perfringens in 20 von 24 Proben (83 %):
8
6
6
ausschließlich cpa
cpa/cpe
cpa/cpb2
Kesselkonserven (Direktvermarktung), n = 13
Nachweis von C. perfringens in 1 von 13 Proben (8 %)
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C. perfringens in Proben mit Erkrankungshintergrund (01/2007-08/2009)
12
948
In keiner Probe lag die detektierte Keimzahl über 103 KbE/g.
73
1 1
ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb1cpa/etx
In insgesamt 12 von 960 auf C. pefringens untersuchten Proben wurde der Erreger nachgewiesen
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Beispiel für einen lebensmittelbedingten Ausbruch (C. perfringens)
Erkrankung mehrerer Kinder in einem Kinderhort ca. 8 h nach dem Verzehr von Hühnerfrikassee (Reste vom Vortag) an Durchfall
ausschließlich qualitativer Nachweis von C. perfringens mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung in Resten des Mittagessen
qualitativer Nachweis von C. perfringens mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung in den Stuhlproben der mehrerer Kinder
vier Wochen später bestätigen die Untersuchungen des humanmedizinischen Referenzlabors für Anaerobier den Verdacht: Die humanmedizinischen Isolate und die Isolate aus den Lebensmitteln sind identisch
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Clostridium botulinum
gram-positive, sporenbildende strikt anaerob wachsende Stäbchenbakterien
ubiquitäre Verbreitung der Sporen in der Umwelt
derzeitig Einteilung in die Toxintypen A bis G:
Toxintypen A, B, E und F rufen lebensmittelassoziierte Intoxikationen / Toxi-Infektionen hervorübrige Toxintypen führen zu Erkrankungen bei unterschiedlichen Tierarten
zwei Erkrankungsmöglichkeiten (im Zusammenhang mit der Aufnahme von Lebensmitteln):
Aufnahme des Toxins („lebensmittelassoziierter Botulismus“)Aufnahme der C. botulinum-Sporen und Toxinbildung im Darm („infektiöser Botulismus“, vor allem bei Säuglingen von Bedeutung)
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Nachweismethode
Probenmaterial
9 x TPGY-Bouillon
Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 30° C bzw. 37° C für 48 h
real-time-PCR nach DNA-Extraktion aus der Anreicherungsbouillon
Ausstrich aus der Anreicherungsbouillon auf Eigelb-Lactose-Agar und
Blutagar
Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 30° C bzw. 37° C für bis zu 48 h
real-time-PCR von verdächtigen Kolonien
in Zusammenhang mit einem humanen Erkrankungsfall Direktextraktion aus dem
Lebensmittel
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Nachweis von C. botulinum-Stämmen –Beispiel Proben im Rahmen von lebensmittelbedingten
Erkrankungsfällen (2007-2009)
gesamtC. botulinum
2007
2008
2009
20
3
27
3
17
10
5
10
15
20
25
30
200720082009
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Probenmaterial, aus dem die Stämme isoliert wurden
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Beispiel für einen lebensmittelbedingten Ausbruch (C. botulinum)
Erkrankung eines Familienvaters nach Verzehr von Leberwurst (Kesselkon-serve) mit neurologischen Ausfallserscheinungen (Intensivstation mit Beatmungspflicht)
Nachweis von C. botulinum Typ B Sporen und vegetative Zellen in zwei geöffneten Dosen
Beurteilung der Probe unter Berücksichtigung des Erkrankungsfalles (epidemiologischer Zusammenhang) als „gesundheitsschädlich“ und damit „nicht sicher“ gem. Art. 14 Abs. 1 i. V. m. Abs. 2a der VO (EG) Nr. 178/2002
Maus-Bioassay aus dem Patientenmaterial positiv, auf den Toxinnachweis aus dem Lebensmittel wurde verzichtet
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Untersuchung von Proben im Rahmen des amtlichen Probenplans
58
3
43
0
Honig Kesselkonserven
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Schlussbemerkungen
bei den beiden wichtigsten humanpathogenen Clostridium spp., im Lebensmittelbereich, C. perfringens und C. botulinum, ist eine ausschließlich kulturell-mikrobiologische Untersuchung nicht aussagekräftig
häufig können die in der Literatur angegebenen Infektionsdosen auch im Rahmen von lebensmittelbedingten Erkrankungsfällen in den Verdachts-proben nicht nachgewiesen werden
eine zuverlässige Risikobewertung für einzelne Produkte bzw. Produkt-gruppen ist nur beim Vorliegen belastbarer Daten über Vorkommen, Kontaminationsquellen und –wege möglich
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Herzlichen Dank an….
…die Labore für
Lebensmittelmikrobiologie
LM 3.1 u. LM 3.3
und…
…Frau Zucker für eine stets
konstruktive Mitarbeit und die
vielen investierten Arbeitsstunden