1

Membranski kanali i crpke

________________________________________________________________________Prof.dr.sc. Ljubica Glavaš-Obrovac

Permeabilnost (propusnost) stanične membrane ovisna je o:

v Crpkama iv Kanalima

v Crpke koriste izvore energije kao što je ATPili svjetlost za termodinamički težak prijenosiona ili molekula.

v Sposobne su preoblikovati jedan oblik slobodneenergije u drugi.

v Primjer su aktivnog transporta.

v ATP-aze, P-tip ATPaza i ATP vezujućekasetne, hidrolizom ATP pomažu prijenos ionakroz membranu.

v Fosforilacija i defosforilacija predstavnica P tipa ATPaza crpki: Ca2+ -ATPaze i Na+-K+-ATPaze, povezane su s promjenama u orijentaciji i afinitetu njihovih ion-veznihmjesta.

v Kao primjer drugačijeg mehanizma aktivnogtransporta koji koristi gradijent iona za aktivnitransport drugih može poslužiti Na-Caizmjenjivač. Ova crpka ima važnu ulogu u izbacivanju Ca2+ iz stanice.

Kanali omogućavaju ionima brz prolaz kroz staničnu membranu

Primjer su pasivnog transporta ili olakšane difuzije.

Receptor za acetilkolin je kanal koji posreduje u prijenosu živčanog signala kroz sinapse (funkcionalni spojevi između neurona).Ovisan je o ligandu i otvara se kao odgovor na vezanje acetilkolina.

Natrij i kalij kanali, koji posreduju preko razlike potencijala u aksonima membrana živaca, najčešće se otvaraju depolarizacijom membrana, a rijetko vezanjem alosteričkog efektora. Rad tih kanala ovisan je o naponu. Vrlo su zanimljivi jer razlikuju vrlo slične ione poput K+ i Na+.

Transport molekula kroz membrane može biti aktivan i pasivan

Dva čimbenika određuju na koji način će molekula proći kroz membranu:

1) Permeabilnost molekule u lipidnom dvosloju2) Dostupnosti izvora energije

Lipofilne molekule prolaze kroz membranu jer su topljive u lipidima. Neke molekule prolaze kroz membranu jednostavnom difuzijom na osnovi gradijenta gustoće i drugog zakona termodinamike. U tom slučaju entropija povećava sposobnost prolaza kroz membranu.

Mnoge molekule trebaju proteine-nosače za prolaz kroz membranu

n Natrijevi ioni prolaze specifičnim kanalima kroz membranu procesom zvanim olakšana difuzija

n Prolaz natrijevih iona može se zvati i pasivni transport jer se energija potrebna za prijenos iona dobiva na osnovi gradijenta iona.

n Kanali, slično proteinima, pokazuju specifičnost za supstrat

2

Slobodna energija uskladištena u gradijentu koncentracije može se izmjeriti

Određivanje energije potrebne za stvaranje gradijenta koncentracije za nenabijenu otopljenu molekulu:ΔG = RT ln(c2/c1) = 2.303RT log10 (c2/c1)

c1 – koncentracija molekule na jednoj strani; c2- koncentracija molekule na drugoj strani

Za ione promjena slobodne energije može se prikazati kao: ΔG = RT ln(c2/c1)+ZFΔV = 2.303RT log10 (c2/c1) + ZFΔV

Z je električki naboj transportirane vrste,ΔV je potencijal kroz membranu, izražen u voltimaF je jedinica za razliku potencijala (Faraday) i iznosi 23.1 kcalV-1mol-1, odnosno 96.5 kJV-1mol-1

Kada je ΔG pozitivna transportni procesi su aktivni

Proteini koriste hidrolizu ATP za prijenos iona kroz membranu

Na+K+-ovisna ATP-azav U životinjskim stanicama c(Na+) je niska, a c(K+) visoka za razliku od izvanstaničnog prostora gdje su koncentracije tih iona obrnute.v Gradijent koncentracije održava se pomoću membranske Na+K+-ovisne ATP-aze.v Enzim se u različitim koncentracijama nalazi u membrani svih stanica.v Hidrolizom ATP dobiva se energija za aktivni transport Na+ iz stanice i ulazak K+ u stanicu stvarajući pritom gradijent.v Po molekuli ATP izlazi 3 Na+, a ulazi 2 K+. Pri tome se enzim prvo fosforilira, a zatim defosforilira.

P-tip ATP-aza Ca2+-ATP-aza

v enzim koji prenosi Ca2+ iz citoplazme u sarkoplazmatski retilukum (SR) mišićnih stanica

v Čini 80% proteina SR i ima važnu ulogu u kontrakcijama mišića

v SR Ca2+ATP-aza je polipeptid (110 kDa s transmembranskom domenom koja se sastoji od 10 α-uzvojnica

Tri citoplazmatske domene imaju različite funkcije:N – veže ATP; P-prihvaća fosforil skupinu na Asp 351; A-pokreće N-domenu.Odnosi između domena značajno se mijenjaju hidrolizom ATP

Želučana H+-K+ATPaza

vEnzim odgovoran za ubacivanje dovoljno protona u želudac radi snižavanja pH (blizu 1.0)

Mehanizam djelovanja P-tipa ATP-aza

1 i 2 – vezanje Ca2+ i ATP i fosforilacija ATP-aze; 3- preokretanje veznog mjesta i 4-oslobađanje Ca2+ na unutrašnjoj strani membrane. 5- Hidroliza fosfoaspartata i ponovno preokretanje (korak 5) vraćaenzim u početno stanje.

3

P-tip ATP-aza evolucijski je konzerviran i posjeduje velik raspon uloga u metabolizmu

Uz prijenos Na, K, Ca i H iona ta obitelj proteina sudjeluje u prijenosu fosfolipida s aminokiselinom kao glavnom skupinom.

Enzimi flipaze potpomažu u izgradnji membranske asimetrije prijenosom lipida kao što je fosfatidil-serin s vanjskog u unutrašnji sloj membranskog dvosloja.

Digitalis specifično inhibira Na+K+ crpku zaustavljanjem njene defosforilacije

Kardiotonični steroidi- digitoksigenin i ouabain inhibiraju defosforilaciju E2-P oblika ATP-aze kada se primjenjuju sa vanjske strane stanične membrane.

Digitalis je smjesa kardiotoničnih steroida dobivenih iz naprstka (D. purpurea. Povećava kontrakcije srčanog mišića što ga čini lijekom izbora pri kongestivnom zatajenju rada srca. Djeluje tako da inhibira Na+-K+ATP-azu.

ABC transporteriMDR protein (multidrug resistence protein ili P-glikoprotein - Nađeno je da taj 170 kDa velik membranski protein djeluje kao ATP-ovisna pumpa i izbacuje velik broj molekula lijeka izvan stanice. Sastoji se od 2 transmembranske domene i 2 ATP-vezujuće domene nazvane ATP-vezujuće kasete (ABC). MDRP je odgovoran za činjenicu da smanjenjem osjetljivosti tumorskih stanica na jedan lijek one postaju neosjetljive i na druge različite molekule-kemoterpaeutike.

CFTR – transmembranski regulator cistične fibroze – po građi je homologan protein MDR proteinu. Kodira ga mutirani gen u oboljelih od cistične fibroze. Djeluje kao ATP-regulirani kloridni kanal plazmine membrane epitelnih stanica.

ABC transporteriv ABC su članovi P-petlja (P-loop) nadobitelji NTPazav Neki ABC proteini , posebno u prokariota, su proteini građeni od više jedinica tako da su domena koja prolazi kroz membranu i ABC domene nalaze na različitim polipeptidnim lancima.

v Histidin permeaza iz S. Typhimurium prenosi histidin iz u bakteriju. Građena je od 2 različita proteinska lanca s domenom koja prolazi kroz membranu (HisQ i HisM) i homodimernog proteina (HisP) s ABC domenom. Topljivi histidin-vezujući protein (HisJ) veže histidin nakon što uđe u stanicu.

Sekundarni transporteri ili kotransporterikoriste jedan gradijent koncentracije da bi imali energiju za stvaranje drugog mehanizmom obratne zamjene

Sekundarne transportere dijelimo na:- antiportere- simportere

Antiporteri – izmjena tvari u suprotnim smjerovima; Natrij-kalcij izmjenjivač djeluje kao antiporter tako da koristi elektrokemijski gradijent Na+ za izbacivanje Ca2+ iz stanice.Pomoću Na+-K+ ATPaze 3 Na+ ulaze u stanicu i izlazi 1 Ca2+.Kako je kalcij vitalni glasnik za stanicu izuzetno je važna fina regulacija njegove koncentracije u stanici.

Simporteri – koriste tok jedne molekule za transport druge molekule u istom smjeru.

Glukoza se ubacuje u stanicu pomoću simportera uz istovremeni ulazak Na+. Ulazak Na+ daje 2.2 kcal/mol slobodne energije pri uobičajenim uvjetima: vanjska konc. Na+ = 143 mM, a unutarnja konc. Na+ = 14mM.

Ovaj dotok slobodne energije je dovoljan za stvaranje 66x gradijenta koncentracije za nenabijene molekule poput glukoze.

4

Sekundarni transporteri su drevni molekularni strojevi, zajednički bakterijama, arheama i eukariotima

-150 od 4000 proteina E. Coli su sek. transporteri

Laktoza permeaza , simporter iz E. Coli, ubacuje laktozu kroz zid bakterije koristeći gradijent protona. Sadrži proton-vezujuće i laktoza-vezujuće mjesto.Preokretanjem permeaze oslobađa se prvo proton, a potom laktoza.

N+-K+-ATPaza pretvara slobodnu energiju prijenosa fosforila u slobodnu energiju gradijenta Na+ iona.

Gradijent Na+ iona koristi se za ubacivanje molekula u stanicu djelovanjem sekundarnog transportera kakav je Na+-glukoza simporter.

Ionski kanali su pasivni transportni sustavi

v Ionski kanali su visoko sofisticirani molekularni strojevi koji odgovaraju na kemijske i fizikalne promjene okoliša.

v Visoko su selektivni za pojedine ione (prim. Neki dozvoljavaju prolaz K+, ali ne i Na+ kroz membranu. Drugi prenose katione, a zaustavljaju transport aniona)

Ionski kanali

v Ionski kanali postoje u otvorenom (ioni mogu prolaziti) i zatvorenom (ne mogu poduprijeti transport iona) stanju

v Prijelazi iz otvorenog u zatvoreno stanje (i obratno) regulirani su vezanjem specifične molekule -liganda (ligand-ovisni) ili električnim potencijalom kroz membranu (napon-ovisni).

v Otvoreno stanje kanala često spontano prelazi u inaktivno (zatvoreno) stanje. Djeluju kao svojevrsni “timer”-i i tako određuju trajanje protoka iona.

“Patch-clamp” tehnike za mjerenje aktivnosti kanala

Protok iona kroz kanal i prijelaz između otvorenog i zatvorenog stanja kanala može se mjeriti u mikro-sekundama.

Proteini ionskih kanala građeni su iz jednostavnih jedinicaAcetilkolin receptorski kanal- ligand-ovisni receptor

Neurotransmiteri: male difuzibilne molekule poput acetilkolina koje prolaskom kroz sinapse prenose živčane impulse.

Presinaptička membrana sinapse odvojena je od postsinaptičke membrane sinaptičkom pukotinom(razmakom od 50 nm).Završetak presinaptičkog aksona ispunjen je sa sinaptičkim vezikulama koje sadrže oko 104 acetilkolinskih molekula.

5

Dolazak živčanog podražaja dovodi do istovremenog pražnjenja sadržaja 300 vezikula, a time i povećane koncentracije acetilkolina u pukotini od 10 nM do 500 μM za manje od 1ms.

Vezanjem acetilkolina na postsinaptičku membranu značajno se mijenja njena ionska permeabilnost.Provodljivost Na+ i K+ jako naraste unutar 0,1 ms što dovodi do velike ulazne struje Na+ i male izlazne K+. Ulazna struja Na+ depolarizira postsinaptičku membranu.Acetilkolin otvara jednostavnu vrstu kationskog kanala koji je gotovo jednako propustan i za K+ i Na+.

Aktivnost acetilkolinskog receptora može se mjeriti “patch-clamp” tehnikom:

Snimka pokazuje promjene u provodljivosti acetilkolinskog receptora u prisustvu acetilkolina. Kanal neprestano prelazi iz otvorenog u zatvpreno stanje i obrnuto.

Shematski prikaz zatvorenog oblika acetilkolinskog receptorskog kanala

Acetilkolinski receptor je pentamer 4 vrste podjedinica koje prolaze kroz membranu (α2, β, γ i δ) i spojene su u oblik prstena koji tvori poru kroz membranu.

Vezanje acetilkolina na ekstracelularnu domenu dovodi do strukturnih promjena koje potiču rotaciju α uzvojnice i na taj način otvaraju poru.

Veliki hidrofobni aminokiselinski ostaci –L (ILe, Leu, Phe) zatvaraju poru. Dolaskom acetilkolina i uslijed rotacije α uzvojnice mali aminokiselinski ostaci – S (Ser, Thr, Gly) zauzimaju mjesta velikih (L) i tako čine poru propusnom.

Napon-ovisni kanali

Živčani impuls je električni signal proizveden protokom iona krozplazminu membranu neurona i osnovno je sredstvo u komunikaciji uživčanom sustavu.

Unutrašnjost neurona sadrži visoke konc. K+ i nisku konc. Na+.Ionski gradijent stvara se pomoću ATP-aza. U stanju mirovanja membranski potencijal je -60 mV.

Natrijevi kanaliŽivčani impuls stvara se pri depolarizaciji membranskog potencijala sa -60 na -40 mV.

Depolarizacijom membrane otvara se Na+ kanal. Ulaskom natrija povećava se membranski potencijal koji unutar 1ms postaje pozitivan (+30 mV) prije nego se vrati na staru vrijednost. Na+ kanali se tada zatvaraju, a otvaraju se K+

kanali

6

Natrijev kanalje jednolančani 260 kd protein s 4 ponavljajuće jedinice (I-IV).Svaka homologna jedinica sadrži 5 hidrofobnih segmenata (S1,S2, S3, S5 i S6) i 1 pozitivno nabijen segment – S4 koji djeluje kao naponski senzor u kanalu. Petlja između S5 i S6 Visoko je konzerviran.

Tetrodotoksin , izoliran iz ribe puhalice, veže se za natrijev kanal i u konc. od 10 ng letalan je za čovjeka.

Ionska selektivnost natrijevih kanalaDjelomično ovisi o steričkim čimbenicima; Na+ i Li+, zajedno s vodom ulaze u kanal kao i hidroksilamin i hidrazin. K+ s molekulom vode je prevelik i ne ulazi u kanal:

Postoje strukturne sličnosti između pojedinih regija natrijevih, kalcijevih i kalijevih kanala koji pokazuju četverostruku simetriju:

Kalijevi kanali

Kalijevi kanali izgrađeni su od 4 identične podjedinice. Od kojih svaka sadrži 2 transmembranske α-uzvojnice. Poru konusnog oblika tvore 4 podjedinice (sredina slike). S unutrašnje strane pora ima promjer od 10 A. Pora je ispunjena vodom.

Prolaz K+ kroz kanal

Kalijev ion prolazi u vodi udaljenost od 22 A kroz membranu. Pora se zatim sužava sa 10 A na 3 A i kalij stupa u reakciju s karbonilnim skupinama aminokiselinskih ostatka pore (crveno).

Interakcije kalijevih iona sa karbonilnim skupinama u suženom dijelu pore omogućavaju visoku selektivnost

kanala

7

Visoka selektivnost postignuta je i smanjenjem dijametra pore koja ne propusta ione veće od 1.5 A

Energetska osnova visoke selektivnosti kalijevih kanala

Dehidratacijom K+ u interakcijama s karbonilnim kisikom omogućena je selektivnost kanala. Taj kisik ne stupa u rekacije s Na+ jer je premali i ostaje hidratiziran i kao takav ne prolazi kroz poru.

Građa kalijevog kanala omogućava vrlo brz transport iona

Suženi dio kanala ima dva energetski identična vezna mjesta. Vezanjem drugog K+ stvara elektrostatsko odbijanje koje tjera prvi K+ izvan kanala.

Brzo

Inaktivacija kalijevog kanala

Pokusima rađenim na divljem i mutiranom shaker proteinu (kalijev kanal) nađeno je da je amino-kraj proteina odgovoran za brzu inaktivaciju kanala (1 ms) nakom otvaranja.

Inaktivacija mutiranog kanala može se ponovno uspostaviti dodatkom peptida koji sadrži prvih 20 aminokiselinskih ostataka prirodnog lanca u konc. 100 μM.

Inaktivacijska domena (crveno) povezana je s kanalom savitljivim lancem.Kad je kanal zatvoren ionizirana domena nalazi se u citosolu. Depolarizacijom se otvara kanal i stvara negativno nabijeno vezno mjesto za pozitivno ioniziranu domenu. Ulaskom domene u vezno mjesto inaktivira se kanal.

Depolarizacija Inaktivacija

Otvoreno Zatvoreno Neaktivno

Izvana UnutraPukotinski prolazi (Gap junctions) omogućavaju ionima i malim molekulama putovanje između stanica i izuzetno su važni za komunikaciju među stanicama

Kanali među stanicama ili pukotinski prolazi su nakupljeni u plazminoj membrani. Vrlo su usko pakirani u heksonalnom nizu (A).

Pukotinski prolazi premošćuju razmak među stanicama. Dugi su oko 35 A.

Male hidrofilne molekule (šećeri. Aminokiseline i nukleotidi) i anorganski ioni prolaze kroz te prolaze.

8

Kanali među stanicama građeni su od 12 molekula koneksina (30-40 kd transmembranskog proteina)

Svaka molekula koneksina ima 4 transmembranske uzvojnice.

Šest koneksinkih molekula su heksagonalno usmjerene tvoreću polukanal ili konekson.

Dva koneksona stvaraju funkcionalan kanal među stanicama.

Kanali između stanica razlikuju se od drugih membranskih kanala po:

1) Prolaze kroz dvije stanične membrane2) Povezuju citosol i citosol3) Kanale napravljene od koneksona sintetiziraju različite

stanice

Jednom stvoren kanal između stanica nastoje biti otvoreni u vremenu od 1 s do 1 min.

Visoke konc. kalcija i nizak pH zatvaraju kanale između stanica. Na taj način se normalne stanice štite od traumatiziranih i umirućih susjeda.

Ovi kanali su također kontrolirani membranskim potencijalom i hormonski induciranom fosforilacijom.