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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA TALITA MACEDO DOS SANTOS MELHORIA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DE FILMES E REVESTIMENTOS COMESTÍVEIS DE ZEÍNA FORTALEZA 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TALITA MACEDO DOS SANTOS
MELHORIA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DE FILMES E REVESTIMENTOS
COMESTÍVEIS DE ZEÍNA
FORTALEZA
2016
TALITA MACEDO DOS SANTOS
MELHORIA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DE FILMES E REVESTIMENTOS
COMESTÍVEIS DE ZEÍNA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Química, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do Título de Doutor em
Engenharia Química.
Orientadora: Profª. Dra. Henriette Monteiro
Cordeiro de Azeredo.
Coorientador: Prof. Dr. Men de sá Moreira de
Souza Filho
FORTALEZA
2016
TALITA MACEDO DOS SANTOS
MELHORIA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DE FILMES E REVESTIMENTOS
COMESTÍVEIS DE ZEÍNA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Química, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do Título de Doutor em
Engenharia Química.
Aprovada em: _____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof.ª Drª. Henriette Monteiro Cordeiro de Azeredo (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - UFC
_____________________________________________________
Prof. Dr. Men de sá Moreira de Souza Filho (Coorientador)
Embrapa Agroindústria Tropical
_____________________________________________________
Prof.ª Drª. Morsyleide de Freitas Rosa
Universidade Federal do Ceará - UFC
_____________________________________________________
Dr. Ebenézer de Oliveira Silva
Embrapa Agroindústria Tropical
_____________________________________________________
Prof.ª Drª. Maria Raquel Alcântara de Miranda
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________________
Dr. Carlos Alberto Cáceres
Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira – UNILAB
Dedico ao meu esposo Maurílio pela
companhia, parceria, apoio e compreensão,
e à minha mãe, Nesita, pelo apoio em todos
os momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Sou infinitamente grata pela grande oportunidade que me foi dada. Este trabalho é
fruto da colaboração de muitas pessoas maravilhosas, com as quais aprendi muito.
Agradeço a Deus pela força e companhia em todos os momentos.
Ao meu esposo Maurílio pelo amor, cuidado, parceria, força, apoio, compreensão
e alegrias sempre. Um exemplo de pessoa determinada. Sou muito feliz em tê-lo do meu lado.
À minha mãe, pela força sempre, por ser sempre a maior incentivadora de tudo de
bom que eu já fiz até hoje, priorizando sempre nossa educação (minha e dos meus irmãos)
mesmo nos momentos bem difíceis, e pela grande amiga que é.
Aos meus irmãos Samuel e Luisa, ao meu padrasto Ismael e às minhas cunhadas
Danielle e Mirella pela amizade, apoio e compreensão. Aos meus sogros Murilo e Socorro pelo
apoio e pelas maravilhosas caronas pela manhã.
À Dra. Henriette pela maravilhosa orientação. Pelo grande exemplo de eficiência e
profissionalismo, pela compreensão, pelos conselhos e ensinamentos e por acreditar sempre no
meu trabalho, até mais do que eu mesma, me motivando sempre a fazer o melhor.
Ao querido Dr. Men pelo apoio, disponibilidade e motivação sempre, que foram
muito importantes durante o trabalho. À Dra. Morsyleide por todo apoio e solicitude.
Ao Dr. Ebenézer pela parceria e por me ensinar bastante. Sua colaboração foi muito
importante no trabalho.
Às doutoras Roselayne, Selene e Socorro pela boa recepção e suporte. A todo o
Laboratório de Embalagens pelo suporte na realização dos experimentos. Aos queridos Delane,
Luanas, Williara, Willian, Andressa, Emanuela, Rafaela, Aíris, Dalila, Gabrielle, Kelvi, Sarah,
Camila, Ruan, Marílias, Nadya, Rogênio, Arcelina pela amizade, descontração e apoio.
Ao laboratório de Tecnologia da Biomassa pelo maravilhoso suporte, em especial
Ana Cassales, Lilian e Natália pela disponibilidade. Ao André pela ajuda nos testes mecânicos,
Nádia e Milena pela ajuda nos revestimentos, Yana, Hélder, Elígenes, Hálisson, Vitória e todos
que colaboraram, sempre prestativos.
Ao laboratório de Pós-Colheita pela boa recepção e pela colaboração, em especial
a Márcia por todo o apoio e pelos ensinamentos. À Karen, Laiza, Aline e Lorena pelo apoio.
À professora Dra. Raquel pela oportunidade de aprender sobre enzimas
antioxidantes, pela parceria e disponibilidade. A todos do laboratório de Frutos do departamento
de Bioquímica da UFC que tive a felicidade de conhecer no fim do doutorado pelo apoio, em
especial à Mônica e ao Jadilson pela grande ajuda e parceria.
À Dra. Fátima pelo apoio e ensinamentos e ao laboratório de Microbiologia pelo
suporte nos testes microbiológicos, em especial a Bruna e Carol.
À Dra. Celli pela parceria nas análises de microscopia, pelo apoio e boa vontade.
Aos laboratórios de Produtos Naturais e Análise de Alimentos, em especial a
Tigressa e Ídila pelo suporte.
Ao Ryan pela ajuda e dedicação nas análises de FTIR e também na discussão dos
resultados, e também ao Wanderson pelo apoio.
Ao Dr. Carlos Cáceres pelo apoio e ensinamentos.
Ao Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano) do CNPEM em Campinas
pela parceria e suporte, em especial à Juliana pelas análises de XPS e ao Carlos pelas análises
de AFM.
À Embrapa Agroindústria Tropical pela disponibilização de espaço e
conhecimentos através de tantos profissionais maravilhosos. Aos queridos Deborah e Manoel,
meus primeiros orientadores, por me acolherem nos meus primeiros passos e à minha prima
Luciana pelo incentivo para o primeiro estágio na Embrapa, que me abriu as portas.
À UFC por todos os conhecimentos e pelas oportunidades, desde a graduação até o
doutorado. Aos professores, companheiros de disciplinas e funcionários dos departamentos de
Engenharia de Alimentos e de Engenharia Química.
Ao CNPq pelo suporte financeiro na pesquisa e à Funcap pela bolsa concedida
Às amigas Alaídes e Ana Cristina pela torcida e apoio.
Ao meu coral feminino por ser fonte de renovação. A toda minha família e minha
querida igreja pela torcida, meus avós, todos os tios e primos, especialmente minha vozinha
Gerarda, que cuidou muito de mim quando eu precisei, representando bem meu pai (in
memorian). Com certeza ele estaria bem feliz...
Muito obrigada a todos!
RESUMO
A produção de materiais biodegradáveis tem sido cada vez mais estudada e incentivada, devido
à maior conscientização quanto aos riscos ambientais causados pelo extenso descarte de
plásticos oriundos de petróleo, com destaque para os usados em embalagens de alimentos, já
que estes possuem curta vida útil. A zeína, proteína obtida do glúten do milho, destaca-se por
ter menor hidrofilicidade que outras proteínas, o que implica em maior resistência à umidade.
Este trabalho tem o objetivo geral de estudar diferentes modificações e a combinação de
diferentes tecnologias a partir da matriz polimérica de zeína visando obter filmes com potencial
de utilização para embalagem ou revestimento de alimentos, contribuindo para o aumento de
sua vida útil. Para os testes preliminares foram testados os solventes etanol (de 70 a 95%) com
e sem ácido acético 5% e os plastificantes glicerol e ácido oleico (1:0, 2:1, 1:1, 1:2 e 0:1, no
total de 20%), e foram avaliadas propriedades físicas (solubilidade, PVA, ângulo de contato,
propriedades mecânicas) e morfológicas (MO, MEV). O etanol 80% sem ácido acético foi
escolhido como solvente, e a proporção 2:1 (13,3% e 6,7% da massa de zeína, respectivamente)
de glicerol e ácido oleico foi definida para os plastificantes. Em estudo de reticulação com ácido
tânico não-oxidado ou oxidado, foram variados a concentração de reticulante (de 0 a 8%) e o
pH da dispersão (de 4 a 9) e analisadas propriedades físicas, ópticas (cor, opacidade), químicas
(FTIR) e térmicas (TGA, DSC). Os resultados mostraram que maiores quantidades de ácido
tânico e valores de pH resultaram em filmes com melhores propriedades de forma geral,
notadamente menor solubilidade em água e melhores propriedades mecânicas. O ácido tânico
oxidado proporcionou melhoria mais expressiva nas propriedades de resistência à tração,
permeabilidade a vapor de água e solubilidade em água. O uso de 4% de ácido tânico e pH 9
foi escolhido como melhor tratamento para reticulação. Em estudo do tratamento com UV-
ozônio (UVO) para posterior funcionalização com nisina, foram avaliados filmes após
tratamento com UVO em diferentes tempos e após imersão em nisina (FTIR, XPS, MEV, AFM
e teste do halo de inibição). Mostrou-se que o tratamento com UVO é efetivo para a formação
de cargas negativas na superfície do filme, com aumento de hidrofilicidade, mantendo as
propriedades mecânicas e estruturais. Foi verificado pela técnica de XPS que a nisina foi
adsorvida na superfície dos filmes, especialmente após tratamento prévio de UVO por 120 s,
indicando que a combinação entre UVO e imersão em nisina é viável para funcionalização de
filmes de zeína com nisina; porém, são necessários mais estudos para verificar a atividade
antimicrobiana desses filmes após a adsorção de nisina na superfície. Em estudo de
revestimento de goiabas, frutos revestidos com zeína (Z) e zeína reticulada com ácido tânico
(ZR) foram submetidos a análise de sobrevivência, análises físicas (perda de massa, cor,
firmeza), taxa de respiração (CO2) e produção de etileno, pH, acidez total titulável, sólidos
solúveis totais, vitamina C, clorofila, carotenoides, teor de peroxido de hidrogênio, peroxidação
lipídica, e enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Os revestimentos se
mostraram efetivos em retardar o amadurecimento de goiabas, com retardo da mudança de cor
dos frutos, diminuição de taxa respiratória e produção de etileno, manutenção da firmeza, de
sólidos solúveis, clorofila e teor de H2O2, com efeito mais expressivo do revestimento ZR. Os
resultados indicam que os revestimentos de zeína avaliados possibilitaram aumento de vida útil
dos frutos, especialmente o revestimento ZR.
Palavras-chave: zeína; reticulação; filmes biodegradáveis; revestimento; frutas tropicais.
ABSTRACT
The production of biodegradable materials has been increasingly studied and encouraged, due
to the increased awareness about environmental risks caused by the extensive disposal of
petroleum-derived plastics, especially those used in food packaging. Zein, a protein obtained
from corn gluten, is characterized by a lower hydrophilicity than other proteins, which implies
a higher resistance to humidity. The general objective of this work was to study different
modifications and a combination of different technologies on a zein matrix in order to obtain
films with potential of use for food packaging or coating, contributing to increase of food shelf
life. For preliminary tests, the solvents ethanol (from 70 to 95%) with and without acetic acid
5% and the plasticizers glycerol and oleic acid (1:0, 2:1, 1:1, 1:2 and 0:1, total of 20%) were
tested, and physical (solubility, WVP, contact angle, mechanical properties) and morphological
properties (OM, SEM) were evaluated. Ethanol 80% without acetic acid was chosen as the
solvent, and a ratio of 2:1 (13.3% and 6.7% of zein mass, respectively) of glycerol and oleic
acid was defined for the plasticizers. In the crosslinking study with non-oxidized or oxidized
tannic acid, crosslinker concentration (from 0 to 8%) and dispersion pH (from 4 to 9) were
varied and film properties were analyzed. The results showed that higher amounts of tannic acid
and pH values resulted in films with better general properties, notably lower water solubility
and better mechanical properties. Oxidized tannic acid provided a more expressive
improvement in tensile strength, water vapor permeability and water solubility. 4% tannic acid
and pH 9 were chosen as the best conditions for crosslinking. In the study of the treatment with
UV-ozone (UVO) for functionalization with nisin, films were evaluated after UVO treatment
at different times and then after immersion in nisin (FTIR, XPS, MEV, AFM and inhibition
zone test). It was shown that UVO treatment is effective for the formation of negative charges
on the film surface, with increased hydrophilicity, maintaining mechanical and structural
properties. It was verified by the XPS technique that nisin was adsorbed on the surface of the
films, especially after previous treatment of UVO for 120 s, indicating that the combination
between UVO and immersion in nisin is viable for functionalization of zein films with nisin.
However, further studies are needed to verify the antimicrobial activity of these films after
surface adsorption of nisin. In the guava coating study, fruits coated with zein (Z) and zein
crosslinked with tannic acid (CZ) were submitted to survival analysis, physical analyzes (mass
loss, color, firmness), respiration rate (CO2) and ethylene production, pH, total titratable acidity,
total soluble solids, vitamin C, chlorophyll, carotenoids, hydrogen peroxide content, lipid
peroxidation and superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) enzymes. The coatings
showed to be effective in delaying the ripening of guavas, with delay of fruit color change,
decrease of respiratory rate and ethylene production, maintenance of firmness, soluble solids,
chlorophyll and H2O2 content, with more expressive effect of the crosslinked coating. The
results indicated that the zein coatings increased the shelf life of guavas, especially the ZR
coating.
Key-words: zein; crosslinking; biodegradable film; coating; tropical fruit.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura da unidade monomérica de zeína e estrutura computacional da
zeína. ....................................................................................................... 18
Figura 2 – Caminhos para modificar as características de filmes e revestimentos
comestíveis. ............................................................................................. 22
Figura 3 – Estrutura molecular do ácido tânico (C76H52O46). .............................. 23
Figura 4 – Estrutura primária de nisina A, mostrando a distribuição de aminoácidos
nas porções lado hidrofílica e hidrofóbica da molécula. ......................... 28
Figura 5 – Diferenças entre as taxas respiratórias de frutas climatéricas e não–
climatéricas durante o seu amadurecimento. .......................................... 33
Figura 6 – Aparência visual de filmes de zeína dos tratamentos: T70, T80, T90,
T95, T70a, T80a, T90a, T95a, respectivamente. .................................... 51
Figura 7 – Efeito da concentração de etanol e de ácido acético sobre a solubilidade
em água e permeabilidade a vapor de água de filmes de zeína. ............. 52
Figura 8 – Termograma de zeína (pó) e termogramas de filmes de zeína, sem (T80)
e com (T80a) ácido acético, obtidos por DSC. ....................................... 53
Figura 9 – Micrografias de filmes de zeína obtidas por microscopia óptica. ....... 54
Figura 10 – Efeito dos plastificantes ácido oleico e glicerol sobre a solubilidade em
água e hidrofilicidade de filmes de zeína. ............................................... 54
Figura 11 – Micrografias de superfície obtidas por MEV de filmes de zeína e
plastificantes ác. oléico/glicerol. ............................................................. 55
Figura 12 – Espectros de absorção no UV–Visível de AT (solução de ácido tânico
0,4% em água) e ATox (solução de ácido tânico 0,4% em H2O2 0,2%). 56
Figura 13 – Curvas de contorno representando regressões para as propriedades dos
filmes contendo ATn. .............................................................................. 59
Figura 14 – Curvas de contorno representando regressões para as propriedades dos
filmes contendo ATo. .............................................................................. 59
Figura 15 – Espectros de FTIR de filmes produzidos em diferentes valores de pH
com diferentes concentrações de ATn ou ATo. ...................................... 63
Figura 16 – Imagens de MEV de filmes produzidos em diferentes valores de pH com
diferentes concentrações de ATn ou ATo (magnificação de 500 x). ...... 65
Figura 17 – Curvas de TGA e da primeira derivada (DTG) para a zeína em pó e para
o ácido tânico em pó, respectivamente. .................................................. 66
Figura 18 – Curvas de TGA para filmes de zeína. ................................................. 66
Figura 19 – Curvas de DSC para filmes de zeína. .................................................. 68
Figura 20 – Propriedades físicas de filmes de zeína submetidos a diferentes tempos
de exposição em UVO. ........................................................................... 70
Figura 21 – Espectros de FTIR de filmes tratados com diferentes tempos de UVO
com e sem nisina. .................................................................................... 71
Figura 22 – Espectros de XPS de alta resolução do carbono 1s de filmes de zeína
tratados usando tempos de exposição a UVO de 0, 60 e 120s.* ............. 74
Figura 23 – Imagens de MEV de filmes tratados com UVO e/ou nisina. .............. 77
Figura 24 – Imagens de Microscopia de Força Atômica de filmes de zeína tratados
com UVO e imersão em solução de nisina. ............................................ 78
Figura 25 – Atividade antimicrobiana de filmes de zeína controle (1) e expostos à
solução de nisina 10000 UI/mL (2, 3, 4 e 5) contra (a) L. monocytogenes
e (b) S. aureus em placas com ágar Mueller–Hinton, e (c) S. cereviseae em
placas com ágar Batata Dextrose. ........................................................... 80
Figura 26 – Efeito de revestimentos de zeína sobre a atividade respiratória (CO2) e
produção de etileno (C2H4) de goiabas armazenadas a 23°C. ................ 83
Figura 27 – Aparência de goiabas (C, Z, e ZR, respectivamente) revestidas com
soluções de zeína até 12 dias de armazenamento. .................................. 86
Figura 28 – Efeito de revestimentos de zeína sobre a perda de massa de goiabas
armazenadas a 23°C. ............................................................................... 87
Figura 29 – Efeito de revestimentos de zeína sobre os parâmetros de cor L*, a* e b*
de goiabas armazenadas a 23°C. ............................................................. 88
Figura 30 – Efeito de revestimentos de zeína sobre a firmeza de goiabas
armazenadas a 23°C. ............................................................................... 90
Figura 31 – Efeito de revestimentos de zeína sobre parâmetros do metabolismo
antioxidante enzimático de goiabas armazenadas a 23°C. ...................... 94
Figura 32 – Atividade antimicrobiana de soluções filmogênicas de zeína Z, ZR,
ZN1, ZRN1, ZN2, ZRN2 (60µL) em placas com ágar BHI e PDA
(levedura). (a) Listeria monocytogenes; (b) Escherichia coli; (c)
Saccharomyces cerevisiae. Concentrações de nisina (m/m de zeína): ZN1,
ZRN1– 7%; ZN2, ZRN2 – 14%. .......................................................... 120
Figura 33 – Atividade antimicrobiana de soluções filmogênicas de zeína ZN1,
ZN(ac), ZRN1 e ZRN (ac) (60µL) em placas com ágar BHI. (a) Listeria
monocytogenes; (b) Escherichia coli. ................................................... 121
Figura 34 – Goiabas revestidas com revestimento ZRN. ..................................... 121
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Solventes usados para filmes de zeína.......................................................... 37
Tabela 2 – Plastificantes usados para filmes de zeína. ................................................... 37
Tabela 3 – Escala de notas de acordo com a cor da casca para goiabas. ....................... 46
Tabela 4 – Efeito da concentração de etanol e de ácido acético sobre as propriedades
mecânicas de filmes de zeína. ......................................................................... 53
Tabela 5 – Condições e respostas experimentais ........................................................... 57
Tabela 6 – Coeficientes de regressão para propriedades dos filmes com ácido tânico não
modificado ....................................................................................................... 58
Tabela 7 – Coeficientes de regressão para propriedades dos filmes com ácido tânico
oxidado ............................................................................................................ 58
Tabela 8 – Médias e testes–t pareados para as propriedades dos filmes com ácido tânico
não–modificado (ATn) e oxidado (ATo). ....................................................... 63
Tabela 9 – Temperaturas de degradação de filmes de zeína reticulados com ácido tânico
em diferentes pHs ............................................................................................ 67
Tabela 10 – Temperaturas de transição vítrea de filmes de zeína obtidas por DSC. ....... 68
Tabela 11 – Composição elementar da superfície de filmes de zeína com ácido tânico
submetidos a diferentes tempos de exposição em UVO com e sem nisina a partir
de espectros de varredura de XPS. .................................................................. 72
Tabela 12 – Composição do carbono 1s de filmes de zeína tratados com diferentes tempos
de exposição a UVO. * .................................................................................... 74
Tabela 13 – Dados de sobrevivência (média e intervalo de confiança) de goiabas revestidas
e não revestidas armazenadas a 23°C. ............................................................. 81
Tabela 14 – Médias globais e testes de Dunnett para as propriedades das goiabas controle
(C), revestidas com zeína (Z) e revestidas com zeína reticulada (ZR) ao longo
de 12 dias de estocagem a 23°C, UR 88%. ..................................................... 84
Tabela 15 – Parâmetros físico–químicos das goiabas revestidas e não revestidas
armazenadas a 23°C. ....................................................................................... 91
Tabela 16 – Diâmetros de zonas de inibição (mm) para soluções filmogênicas de zeína
contra bactérias L. monocytogenes e E. coli. ................................................. 120
Tabela 17 – Diâmetros de zonas de inibição (mm) e pH para soluções filmogênicas de
zeína contra bactérias L. monocytogenes e E. coli. ....................................... 121
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 14
Objetivo geral e objetivos específicos .......................................................................... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 18
2.1 Zeína: disponibilidade, estrutura e aplicações ........................................................... 18
2.2 Filmes de zeína e propriedades .................................................................................... 19
2.3 Modificações químicas e físicas em filmes .................................................................. 21
2.3.1 Reticulação com ácido tânico ........................................................................................ 22
2.3.2 Modificação da superfície com ozônio e UV ................................................................. 25
2.4 Adição de antimicrobianos – nisina ............................................................................. 27
2.5 Revestimento de frutos ................................................................................................. 29
2.6 Goiaba: características e aumento de vida útil .......................................................... 31
2.6.1 Fisiologia Pós-Colheita de Goiabas .............................................................................. 31
2.6.2 Aumento de vida útil de goiabas .................................................................................... 34
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 36
3.1 Materiais ........................................................................................................................ 36
3.2 Etapa 1 – Estudos preliminares: influência dos solventes etanol e ácido acético e dos
plastificantes glicerol e ácido oleico sobre propriedades físicas de filmes de zeína 36
3.2.1 Composição e preparação dos filmes ............................................................................ 36
3.2.2 Análises ........................................................................................................................... 37
3.3 Etapa 2 - Filmes de zeína reticulados com ácido tânico não-oxidado ou oxidado .. 39
3.3.1 Delineamento experimental ........................................................................................... 39
3.3.2 Preparação dos filmes com ácido tânico não-modificado (ATn) ................................. 39
3.3.3 Preparação dos filmes com ácido tânico oxidado (ATo) .............................................. 40
3.3.4 Análise espectrofotométrica ........................................................................................... 40
3.3.5 Análises dos filmes após reticulação ............................................................................. 40
3.4 Etapa 3 - Efeito da funcionalização com UV/ozônio e antimicrobiano catiônico
(nisina) sobre filmes de zeína reticulados com ácido tânico ...................................... 42
3.4.1 Obtenção dos filmes e análises físicas - tratamento com UVO .................................... 42
3.4.2 Tratamento dos filmes oxidados com nisina ................................................................. 42
3.4.3 Caracterização química e morfológica dos filmes tratados com UVO e nisina........... 43
3.4.4 Propriedades antimicrobianas pelo teste do halo de inibição ...................................... 43
3.5 Etapa 4 - Revestimentos de zeína na preservação de goiabas ................................... 44
3.5.1 Preparação das dispersões filmogênicas ....................................................................... 44
3.5.2 Aplicação dos revestimentos em goiabas ....................................................................... 45
3.5.3 Análises ........................................................................................................................... 45
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 51
4.1 Etapa 1 - Estudos preliminares: influência dos solventes etanol e ácido acético e dos
plastificantes glicerol e ácido oleico sobre propriedades físicas de filmes de zeína 51
4.1.1 Estudo dos solventes ....................................................................................................... 51
4.1.2 Estudo dos plastificantes ................................................................................................ 54
4.2 Etapa 2 - Filmes de zeína reticulados com ácido tânico não-oxidado ou oxidado .. 56
4.2.1 Espectros de absorção .................................................................................................... 56
4.2.2 Solubilidade em água e permeabilidade a vapor de água ............................................ 60
4.2.3 Propriedades Mecânicas ................................................................................................ 61
4.2.4 Propriedades Ópticas ..................................................................................................... 62
4.2.5 FTIR e comparação entre filmes com ácido tânico não-oxidado e oxidado ............... 62
4.2.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .............................................................. 64
4.2.7 Propriedades Térmicas ................................................................................................... 65
4.3 Etapa 3 - Efeito da funcionalização com UV/ozônio e antimicrobiano catiônico
(nisina) sobre filmes de zeína reticulados com ácido tânico ...................................... 69
4.3.1 Efeito do UV/Ozônio sobre propriedades físicas de filmes de zeína ............................ 69
4.3.2 FTIR de filmes tratados com UVO e nisina .................................................................. 70
4.3.3 Espectroscopia de Fotoelétrons de Raios-X (XPS – X-Ray Photoelectron Spectroscopy)
72
4.3.4 Microscopia Eletrônica de Varredura ........................................................................... 76
4.3.5 Microscopia de Força Atômica (AFM) ......................................................................... 77
4.3.6 Atividade antimicrobiana - Método de difusão em ágar ............................................... 79
4.4 Etapa 4 – Revestimentos de zeína na preservação de goiabas .................................. 80
4.4.1 Análise de sobrevivência ................................................................................................ 80
4.4.2 Atividade respiratória e taxa de produção de etileno .................................................... 82
4.4.3 Parâmetros físicos .......................................................................................................... 85
4.4.4 Parâmetros Químicos e Físico-Químicos ...................................................................... 90
4.4.5 Metabolismo antioxidante enzimático ........................................................................... 93
CONCLUSÕES .............................................................................................................. 97
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 98
CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 118
APÊNDICE A – Avaliação da atividade antimicrobiana de revestimentos de zeína
com nisina pelo método de difusão em ágar ............................................................. 119
14
1. INTRODUÇÃO
É urgente encontrar soluções para as questões ambientais ligadas à grande
quantidade de lixo não biodegradável e à utilização de fontes não renováveis para produção de
plásticos convencionais. Alternativas como a reciclagem não têm sido suficientes, pois menos
de 5% de todos os plásticos têm sido reciclados, acarretando em acúmulo no ambiente
(ESPITIA et al., 2014). Por isso, torna-se relevante a utilização de materiais biodegradáveis,
especialmente em embalagens de alimentos, já que estas, de forma geral, não requerem grande
vida útil.
Os filmes biodegradáveis podem ser obtidos a partir de polímeros de fonte sintética
ou renovável, em que se destacam os de origem agrícola (GUILBERT; GONTARD, 2005,
WIHODO; MORARU, 2013). A aplicação de biopolímeros de fonte agrícola pode ser feita na
forma de filme, que é formado de forma independente e depois aplicado, ou como revestimento,
que é formado diretamente na superfície do alimento. Pesquisas sobre embalagens comestíveis
vêm avançando, utilizando componentes comestíveis, como proteínas, polissacarídeos, lipídeos
e outros derivados de diversas fontes renováveis (JANJARASSKUL; KROCHTA, 2010).
As proteínas apresentam diversas vantagens na obtenção de filmes biodegradáveis,
pois possuem estrutura específica que confere uma maior gama de propriedades funcionais,
especialmente elevado potencial de interações intermoleculares, apresentando uma larga
variedade de interações e reações químicas possíveis (HERNANDEZ-IZQUIERDO;
KROCHTA, 2008). Por outro lado, os materiais obtidos de proteínas, como os da maioria das
outras macromoléculas de origem biológica, têm pobres propriedades mecânicas e de barreira
quando comparados aos polímeros convencionais. A zeína do milho, proteína obtida a partir do
glúten do milho (AKBARI; GHOMASHCHI; MOGHADAM, 2007) requer o estudo de novos
usos devido à sua grande disponibilidade graças ao crescimento da produção mundial de amido
de milho e indústria do bioetanol (BISWAS et al., 2009), sendo o material principal desse
trabalho.
A zeína é anfifílica e insolúvel em água e etanol absoluto devido à baixa quantidade
de aminoácidos polares e alta quantidade de aminoácidos não-polares (NONTHANUM; LEE;
PADUA, 2013), então, os filmes obtidos são menos hidrofílicos comparados a outros filmes de
proteínas, o que confere boa barreira ao vapor de água (DANGARAN et al., 2009), importante
para utilização de filmes como embalagens de alimentos. Alguns estudos realizados
comprovam essa potencialidade da zeína (MEHYAR et al., 2014; YUN et al., 2015).
15
Alguns fatores importantes para a utilização de zeína como matriz são a escolha do
solvente e plastificante mais adequados, pois estes podem afetar suas propriedades, inclusive
sua resistência a água (YONG et al., 2015; KIM; XU, 2008). Alguns estudos reportam o uso
dos solventes etanol e ácido acético (SHI; KOKINI; HUANG, 2009) e plastificantes glicerol e
ácido oleico (XU; CHAI; ZHANG, 2012) em filmes de zeína, mas ainda é necessária a
investigação com foco em propriedades de interesse para aplicação como embalagem de
alimentos.
Apesar de sua excelente propriedade de formar filmes e boa propriedade de barreira
a gases de filmes de zeína, sua clássica fragilidade e problemas de flexibilidade são uma grande
limitação para seu uso em filmes e revestimentos (ARCAN; YEMENICIOĞLU, 2011). Entre
as possíveis modificações de filmes de biopolímeros para obter melhores propriedades de
interesse, diminuindo a restrição do uso desses materiais, está a reticulação, processo de
formação de ligações cruzadas (crosslinking), formando redes tridimensionais que aumentam a
rigidez e resistência à água (JIANG; REDDY; YANG, 2010). Agentes reticulantes naturais e
de baixa toxicidade, como o ácido tânico, vêm ganhando destaque por seu apelo mercadológico
(pelo fato de serem naturais) e por se mostrarem efetivos na reticulação de proteínas (HAGER;
VALLONS; ARENDT, 2012). Diversas interações podem estar envolvidas, incluindo ligações
covalentes e não-covalentes (AEWSIRI et al., 2010), as quais podem ser obtidas por diferentes
caminhos, como a oxidação do ácido fenólico sob condições alcalinas ou através de peróxido
de hidrogênio como agente oxidante (ligação covalente) e interações não-covalentes como
pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas. O pH é um importante fator na elaboração de
filmes de proteínas, que pode influenciar no tipo de interação com o agente reticulante
(SHUTAVA et al., 2005), por isso, torna-se importante esclarecer a relação entre o pH e a
reação de reticulação entre ácido tânico e proteínas.
A incorporação de propriedades antimicrobianas em filmes e revestimentos também
tem sido muito pesquisada, uma vez que concentra a ação do agente antimicrobiano sobre a
superfície do alimento, que é geralmente onde existe maior contaminação. A nisina, peptídeo
antimicrobiano catiônico, tem se mostrado efetiva em inibir o crescimento microbiano quando
incorporada a filmes biopoliméricos (SIVAROOBAN et al., 2008; LIN; WANG; WENG,
2011). A incorporação de nisina tem sido feita geralmente por simples mistura à dispersão
polimérica. O uso de peptídeos antimicrobianos adsorvidos sobre superfícies é uma das
possíveis abordagens inovadoras de incorporação desses compostos (KARAM et al., 2013),
pois possibilita a ação do antimicrobiano na superfície do filme em contato com o alimento.
Porém, para que haja adsorção da nisina na superfície, é necessário que haja afinidade desta
16
com a superfície do material, então, o tratamento com UV e ozônio se torna interessante por
produzir grupos funcionais reativos pela oxidação na superfície (SHI; KOKINI; HUANG,
2009), potencializando a adsorção de nisina na superfície de filmes de zeína. A adsorção de
antimicrobianos na superfície de filmes biodegradáveis pode ser uma tecnologia promissora
para uso em alimentos, proporcionando aumento de vida útil.
Dentre as diversas aplicações possíveis de filmes e revestimentos de zeína em
alimentos, pode ser destacado o revestimento de frutas tropicais. Goiabas são frutos com
apreciadas características sensoriais e nutricionais, porém apresentam alta taxa de respiração e
rápida senescência, levando a uma curta vida útil pós-colheita (FORATO et al., 2015), por isso,
a goiaba se mostra um excelente modelo biológico para estudar a efetividade dos revestimentos
comestíveis de zeína, além do fato de que este fruto pode ser consumido com a casca. Torna-se
interessante o estudo da aplicação de revestimentos de zeína em goiabas com o objetivo de
aumento de vida útil e manutenção de qualidade, pois o uso de revestimentos em frutos pode
propiciar diminuição da taxa respiratória, prolongamento do período de armazenamento e
retenção da firmeza (FAN et al., 2009).
Baseando-se nesse contexto, para o desenvolvimento da tese, este trabalho foi
dividido em quatro etapas. A primeira etapa apresenta estudos preliminares para a escolha dos
solventes e plastificantes a serem utilizados nos filmes de zeína. A segunda etapa consiste no
estudo da reticulação de filmes de zeína com ácido tânico (oxidado ou não) em diferentes pHs.
A terceira etapa apresenta a investigação do tratamento dos filmes com UV e ozônio para
funcionalização com nisina, a fim de propor nova metodologia de incorporação desse
antimicrobiano. A quarta etapa consiste no estudo da utilização de revestimentos de zeína
reticulada ou não com ácido tânico no revestimento de goiabas.
Objetivo geral e objetivos específicos
Este trabalho de tese tem o objetivo geral de estudar diferentes modificações e a
combinação de tecnologias a partir da matriz polimérica de zeína, visando obter materiais com
melhor potencial de utilização para filme ou revestimento de alimentos.
Os objetivos específicos da tese são:
• Definir a melhor combinação de solventes e plastificantes para obter filmes
homogêneos de zeína;
• Melhorar as propriedades mecânicas, de barreira e resistência à umidade de filmes
de zeína por meio da reticulação com ácido tânico;
17
• Determinar o efeito da oxidação com UVO e da incorporação de nisina nas
propriedades físicas de filmes de zeína e determinar o desempenho antimicrobiano.;
• Aumentar a vida útil de goiabas por meio do uso de revestimentos de zeína.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Zeína: disponibilidade, estrutura e aplicações
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de milho (Zea mays L.), totalizando
84,7 milhões de toneladas na safra 2014/2015 (CONAB, 2016). Zeína é o nome dado à fração
prolamina das proteínas do milho, produzida comercialmente a partir de glúten de milho, o qual
é um coproduto obtido da produção de amido de milho (GHANBARZADEH; OROMIEHI,
2008). Esta proteína é a principal proteína de reserva do milho, representando cerca de metade
das proteínas do endosperma do milho (BISWAS et al., 2005). É o maior subproduto da
indústria de moagem úmida e de biocombustível (PADUA; WANG, 2002; ZHANG; LUO;
WANG, 2011) com aumento considerável de disponibilidade, a ponto de ser requerido o
desenvolvimento de novos usos para essa proteína (BISWAS et al., 2009).
A zeína é classificada como prolamina devido às suas características de solubilidade
(LUO; WANG, 2014; SHUKLA; CHERYAN, 2001), pois é insolúvel em água pura ou etanol
puro e é solubilizada comumente em soluções etanol-água e também acetona-água
(NONTHANUM; LEE; PADUA 2013; SOUSA et al., 2013). A estrutura da zeína é insolúvel
em água pura devido à sua sequência de aminoácidos, em que mais de 50% são não-polares,
incluindo leucina (20%), prolina (9%), alanina (14%), fenilalanina, isoleucina e valina (LUO;
WANG, 2014; SOUSA et al., 2013). Sua natureza anfifílica vem de seus resíduos hidrofílicos
e hidrofóbicos distribuídos na estrutura da proteína (SOUSA et al., 2013).
A estrutura do monômero da proteína de zeína reportada por Matsushima et al.
(1997) apresenta 10 segmentos de hélice sucessivos, dobrados um sobre o outro em um arranjo
antiparalelo, estabilizados por ligações de hidrogênio (Figura 1). Este modelo explica a natureza
anfifílica da zeína, com a parte superior hidrofílica e a parte inferior com superfície exterior
hidrofóbica (PALIWAL; PALAKURTHI, 2014).
Figura 1 – Estrutura da unidade monomérica de zeína e estrutura computacional da zeína.
Fonte: (a) Matsushima et al., 1997; (b) Wang et al., 2013. Figuras adaptadas por Paliwal e Palakurthi (2014).
19
Comercialmente, a zeína está disponível nas formas amarela e branca, em que a
amarela contém uma alta concentração de pigmentos de xantofila (8-9%) como luteína,
zeaxantina e β-criptoxantina (PODARALLA; PERUMAL, 2012; SHUKLA; CHERYAN,
2001). A zeína branca, com pureza maior que 96%, é obtida da descoloração da proteína
amarela e possui quantidade desprezível de xantofilas (KALE; ZHU; CHERYAN, 2007). As
xantofilas são responsáveis por algumas propriedades indesejadas da zeína amarela, pois a
presença de xantofila ligada à zeína afeta fortemente a sua solubilidade, já que a xantofila é
lipossolúvel (PALIWAL; PALAKURTHI, 2014).
A zeína é um dos poucos biopolímeros hidrofóbicos insolúveis em água que
possuem aprovação para uso oral pela FDA (Food and Drug Administration) (PATEL;
VELIKOV, 2014). A falta de aminoácidos essenciais triptofano e lisina e sua deficiência de
aminoácidos ácidos e básicos torna limitado o uso da zeína para consumo humano, porém
proporciona sua ampla exploração nos campos da ciência de alimentos, farmacêutica e
biomedicina (SHUKLA; CHERYAN, 2001; LUO; WANG, 2014). Esta proteína pode ser
facilmente convertida em diferentes formatos e estruturas como filmes, fibras, micro/nano-
partículas e géis, podendo ser aplicada em medicamentos, revestimentos e filmes
biodegradáveis (PALIWAL; PALAKURTHI, 2014; SHUKLA; CHERYAN, 2001). Exibe
várias propriedades como tenacidade, flexibilidade, compressão, brilho, resistência ao ataque
microbiano (SHUKLA; CHERYAN, 2001) e atividade antioxidante (KONG; XIONG, 2006),
além de suas propriedades de maior hidrofobicidade em relação a outras proteínas, que a tornam
interessante como material para embalagem de alimentos, como filmes biodegradáveis e/ou
comestíveis.
2.2 Filmes de zeína e propriedades
Filmes e revestimentos comestíveis podem ser definidos como camadas finas de
materiais que podem ser utilizadas como embalagens na superfície de alimentos. A diferença
principal entre os dois tipos é que os filmes são pré-formados separadamente do produto e
aplicados somente depois de secos, enquanto os revestimentos são formados diretamente sobre
a superfície do alimento, o que pode ser efetuado, por exemplo, por imersão ou aspersão.
Ambos possuem diversas funções como materiais para embalagens de alimentos, sendo usados
para proteger o produto do ambiente externo, retardar a deterioração, aumentar a vida útil e
manter a qualidade de produtos alimentícios (ZHANG; MITTAL, 2010). Atuam como barreira
para controlar a transferência de umidade, gases e componentes de sabor, e podem também
20
ajudar na manutenção da integridade mecânica e melhorar as características de manipulação
dos alimentos (LIANG et al., 2015). Além disso, podem ser veículos de ingredientes funcionais,
como antimicrobianos e antioxidantes, que aumentam a segurança e estabilidade dos alimentos
(ARCAN; YEMENICIOĞLU, 2011; LIANG; LUDESCHER, 2011). É óbvio que, para que os
biopolímeros exerçam sua função esperada de conter o alimento e protegê-lo, mantendo sua
qualidade, é importante controlar e modificar suas propriedades mecânicas e de barreira, as
quais dependem da estrutura do material polimérico (SIRACUSA et al., 2008).
A zeína possui excelente propriedade de formar filmes e revestimentos, tendo sido
sugerida como revestimento para frutas frescas e secas, doces e nozes (BAI et al., 2003;
SHUKLA; CHERYAN, 2001). Os filmes de zeína se destacam por sua resistência ao ataque
microbiano e hidrofobicidade comparados a outros filmes de biopolímeros. Apresentam boa
barreira a gases (ARCAN; YEMENICIOĞLU, 2011) e, como proteínas solúveis em álcool,
formam filmes com baixa permeabilidade ao vapor de água (PVA), se comparada à maioria das
proteínas de origem agrícola, devido à sua inerente hidrofobicidade (MORADI et al., 2016;
WAN et al., 2016). As propriedades dos filmes de zeína, como resistência mecânica e
habilidade de barreira, dependem largamente da interação entre as proteínas, plastificantes e
outros grupos funcionais (WANG; RAKOTONIRAINY; PADUA, 2003).
A arquitetura do polímero tem um papel importante sobre as propriedades
mecânicas, por isso é importante a forma como os filmes são elaborados, assim como a presença
de plastificantes e agentes reticulantes, dentre outros fatores. Dentre as propriedades mecânicas,
as principais geralmente avaliadas são resistência à tração, elongação ou alongamento na
ruptura e módulo de elasticidade, determinadas através de ensaios de tração do material de
embalagem biopolimérica a ser aplicado no alimento (SIRACUSA et al., 2008).
Muitos estudos vêm sendo feitos na tentativa de melhorar as propriedades
mecânicas e de barreira de filmes de zeína ou para verificar o efeito da adição de componentes
em suas propriedades: estudo de diferentes solventes (CHEN; YE; LIU, 2014; SHI; KOKINI;
HUANG, 2009), adição de diferentes plastificantes (GHANBARZADEH et al., 2007; XU;
CHAI; ZHANG, 2012), adição de ácidos fenólicos e/ou carboxílicos como reticulantes e/ou
plastificantes (ARCAN; YEMENICIOĞLU, 2011), modificação química (SESSA et al., 2013),
blendas com outras proteínas (GU; WANG; ZHOU, 2013) e com ceras (ARCAN;
YEMENICIOĞLU, 2013), formação de nanocompósitos (ZHANG; WANG, 2012),
funcionalização da superfície (BISWAS et al., 2009), uso de irradiação (SOLIMAN; FURUTA,
2009) e UV/ozônio (SHI, KOKINI; HUANG, 2009). Além disso, existe um grande interesse
na adição de propriedades importantes aos filmes de zeína para a manutenção da qualidade dos
21
alimentos, como a incorporação de antimicrobianos e antioxidantes (GÜÇBILMEZ,
YEMENICIOFLU; ARSLANOFLU, 2007). Apesar da grande quantidade de estudos e
informações já obtidas, existe ainda muito a ser estudado sobre o efeito da combinação de
diversas modificações ou tecnologias na melhoria das propriedades de filmes de zeína.
2.3 Modificações químicas e físicas em filmes
Uma importante forma de melhorar o desempenho de filmes biodegradáveis é
através de modificação química e/ou física. A modificação pode ter um efeito positivo sobre as
propriedades mecânicas e de permeabilidade ao vapor de água de materiais (EMMAMBUX et
al., 2004), mas pode ser também uma ferramenta para aprimorar a compatibilidade entre dois
polímeros (PEELMAN et al., 2013).
Filmes são, essencialmente, redes de polímeros interagindo intensamente após
secagem do solvente; portanto, os materiais de formação de filme devem formar uma estrutura
de gel rearranjada espacialmente com todos os agentes de formação de filme incorporados, que
incluem biopolímeros, plastificantes, solventes e outros aditivos (HAN; GENNADIOS, 2005).
O principal mecanismo de formação de filmes de proteína envolve sua desnaturação iniciada
por calor, solventes ou mudança de pH, seguidos pela associação da cadeia de peptídeos através
de novas interações intermoleculares (JANJARASSKUL; KROCHTA, 2010). As modificações
químicas e/ou físicas servem para auxiliar o processo de incorporação de todos os componentes
do filme e rearranjo adequado de sua estrutura. Os processos de modificação química incluem
modificação química das cadeias de peptídeos e reticulação, enquanto modificações físicas ou
métodos físicos incluem uso de radiação, formação de compósitos, adição de partículas ou
formação de emulsões, dentre outros, as quais podem acarretar ou não modificações químicas.
A Figura 2 mostra potenciais abordagens químicas e físicas para a modificação de mecanismos
de formação de filme por alteração dos materiais que formam os filmes, variação das condições
de processamento e aplicação de tratamento nos filmes formados (após a secagem) (HAN;
GENNADIOS, 2005).
22
Figura 2 - Caminhos para modificar as características de filmes e revestimentos comestíveis.
Fonte: Adaptada de Han e Gennadios (2005). * indica a adição de ingredientes química ou fisicamente ativos, os
quais podem aumentar ou interferir nos mecanismos de formação de filme; ** inclui algum reticulador químico,
substituição química de cadeias laterais para criar interações hidrofóbicas ou eletrostáticas, e outros mecanismos
causados por modificações químicas.
2.3.1 Reticulação com ácido tânico
A reticulação de polímeros é o processo de interligação de cadeias poliméricas por
ligações covalentes ou não covalentes, caracterizando a de formação de ligações cruzadas
(crosslinking), formando redes tridimensionais que tornam a estrutura mais rígida, mais
resistente à umidade. A reticulação é especialmente útil para materiais de biopolímeros, como
os derivados de proteínas ou polissacarídeos (AZEREDO; WALDRON, 2016), sendo um
importante passo para melhorar sua estabilidade, resistência mecânica, coesão e propriedades
de barreira à água (MATHEW; ABRAHAM, 2008). Alguns artigos têm descrito reações de
reticulação de zeína com diversos agentes, como ácido cítrico (JIANG; REDDY; YANG,
2010), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS)
(KIM et al., 2004), glutaraldeído (SESSA et al., 2007) e glioxal (WOODS; SELLING, 2008),
resultando em filmes com melhor resistência à umidade, e geralmente com melhores
propriedades mecânicas; porém, a maioria deles é sintética, e alguns têm sido reportados como
citotóxicos (RIVERO et al., 2010). Outros, usados para reações enzimáticas como a
transglutaminase, são caros (CARVALHO; GROSSO, 2004). Por isso, alternativas naturais e
de baixa toxicidade vêm sendo estudadas, como genipina, ácido cítrico, ferrúlico e tânico
23
(CAO; FU; HE, 2007; KHAN et al., 2016; REDDY; LI; YANG, 2009). Além disso, compostos
fenólicos com maior peso molecular possuem maior afinidade de ligação a proteínas (OZDAL
et al., 2013), que pode estar relacionada à maior capacidade de reticulação de cadeias peptídicas
em mais de um ponto (MULAUDZI et al., 2012).
O ácido tânico (AT), um éster gálico de D-glicose, é um tanino hidrolisável com
alto peso molecular devido aos seus múltiplos grupos fenólicos (HAGER; VALLONS;
ARENDT, 2012), reconhecido por sua capacidade antioxidante, pois seus grupos fenólicos
podem interagir com macromoléculas biológicas (AELENEI et al., 2009). Este é um ingrediente
de grau alimentício e um bom candidato para utilização em materiais biodegradáveis devido à
sua presença natural em muitas plantas e sua grande disponibilidade a preços relativamente
baixos (HAGER; VALLONS; ARENDT, 2012). Como mostra a Figura 3, a estrutura
representativa do ácido tânico consiste de um núcleo central de glicose ligado por pontes éster
a cadeias de poligaloil-éster.
Figura 3 - Estrutura molecular do ácido tânico (C76H52O46).
Fonte: Yi et al (2011).
O principal caminho químico postulado para reticulação covalente envolve a
oxidação de porções difenol de ácidos fenólicos sob condições alcalinas, produzindo
intermediários quinonas que reagem com nucleófilos (principalmente grupos amina ou
sulfidrila de proteínas) para formar ligações C-N ou C-S (OU et al., 2005; STRAUSS;
GIBSON, 2004). A hidroquinona regenerada pode ser reoxidada e se ligar a outra cadeia de
proteína, formando uma ligação cruzada. Alternativamente, duas quinonas, cada uma ligada a
uma cadeia de proteína, podem dimerizar para produzir uma ligação cruzada (STRAUSS;
GIBSON, 2004). Diferentes interações não-covalentes podem ocorrer, como pontes de
24
hidrogênio entre grupos hidroxila do ácido fenólico e grupos carbonila da proteína, e interações
hidrofóbicas entre anéis aromáticos do ácido fenólico e cadeias da parte hidrofóbica da proteína
(AEWSIRI et al., 2010). Baxter et al. (1997) propuseram que proteínas ricas em prolina (como
a zeína) podem interagir com pentagaloil-glucose do ácido tânico por interações hidrofóbicas
com o anel pirrolidina da prolina. Dentre os agentes oxidantes que podem ser usados para oxidar
fenólicos está o peróxido de hidrogênio (SHARMA; MISHRA; KUMAR, 2016), já utilizado
em ácido ferúlico em filmes (OU et al., 2005; MATHEW; ABRAHAM, 2008).
O ácido tânico já foi estudado em alguns filmes de proteína. Hager; Vallons e
Arendt (2012) estudaram o efeito do AT e ácido gálico em propriedades mecânicas e de barreira
de filmes de glúten do trigo em pH 4 e observaram que os filmes com AT se tornaram mais
rígidos e resistentes, porém menos flexíveis, além de apresentarem menor solubilidade; o ácido
gálico agiu somente como plastificante, promovendo aumento da elongação. Byaruhanga et al.
(2006) estudaram o efeito do AT em filmes de kafirina, proteína semelhante à zeína,
comprovando a ligação do composto fenólico à proteína. Emmambux; Stading e Taylor (2004)
estudaram o efeito do AT em propriedades mecânicas e de barreira de filmes de kafirina, e
obtiveram aumento de resistência à tração e diminuição de elongação, absorção de água e
permeabilidade a oxigênio. Zhang et al. (2010) utilizaram AT como reticulante em gelatina com
pH 8, e observaram melhoria das propriedades mecânicas. Prodpran; Benjakul e Phatcharat
(2012) compararam AT, ácido cafeico, ácido ferúlico e catequina em filmes de proteína
miofibrilar de peixe e verificaram que o AT apresentou maior eficiência na reticulação com
maior resistência mecânica. De forma geral, dentre os trabalhos que compararam outros
compostos fenólicos com o AT, este se destacou por apresentar maior eficiência na reticulação,
comprovada pelo aumento mais expressivo de resistência à tração.
O pH é uma condição de processamento do filme que pode afetar suas propriedades,
especialmente mecânicas e de barreira (MASAMBA et al., 2016). O efeito do pH tem sido
atribuído principalmente ao seu impacto sobre a carga da proteína e sobre seu grau de
desnaturação e agregação (POPOVIC et al., 2011). Esse efeito é ainda mais importante nas
reações de reticulação de proteínas, pois podem determinar o grau e o tipo de interação formado
com o agente reticulante, pois a ligação de proteínas a taninos é dependente do pH (SHUTAVA
et al., 2005). Diversos trabalhos que utilizam ácido tânico como reticulante de proteínas em
diferentes pHs, como os citados acima, mostram diferenças que podem ser relacionadas aos
diferentes pHs utilizados e diferentes concentrações.
25
2.3.2 Modificação da superfície com ozônio e UV
A superfície de um material é importante para definir suas propriedades e
aplicações, sendo o primeiro ponto de contato com outros sistemas; então, suas características
determinam as possibilidades de aplicação e interação com outros meios (KESSLER, 2010). É
importante a realização de funcionalização da superfície para conferir funções específicas e
desejáveis aos biomateriais disponíveis (ZHOU et al., 2016). A modificação de superfície pode
ser usada para modular as propriedades de superfície de substratos, tais como a adesão, a
molhabilidade, biocompatibilidade, e a de anti-incrustação (ZHOU et al., 2016).
Atualmente, é crescente a demanda por novas tecnologias na modificação de
proteínas (MIRMOGHTADAIE; ALIABADI; HOSSEINI, 2016). Alguns métodos físicos de
modificação vêm sendo estudados na preparação de filmes biodegradáveis e/ou modificação de
suas superfícies, como irradiação-γ (CIESLA; SALMIERI; LACROIX, 2006), ultrassom
(RODRIGUEZ-TURIENZO; COBOS; DÍAZ, 2012), tratamento de plasma (SLEPICKA et al.,
2013), descarga de corona (PETROV et al., 2016), radiação nuclear (BHATTACHARYA,
2000) e radiação ultravioleta (BELMONTE et al., 2016; SHI; KOKINI; HUANG, 2009), os
quais podem ser usados na modificação de filmes à base de proteínas.
Entre os tratamentos físicos, a radiação ultravioleta (UV) tem sido estudada devido
à sua radiação eletromagnética que é absorvida por duplas ligações e anéis aromáticos,
causando a formação de radicais livres em aminoácidos, e por sua capacidade de levar à
formação de ligações covalentes intermoleculares (GENNADIOS et al., 1998). A luz UV é
considerada uma fonte de excitação simples, seca e econômica (BELMONTE 2016), e tem
mostrado em muitos casos resultados similares a tratamentos de plasma (KESSLER et al, 2013).
Rhim et al. (1999) estudaram efeito da radiação UV na resistência à tração, cor e
permeabilidade a vapor de água de filmes de zeína e de outras proteínas, e encontraram
diferenças muito pequenas, não-significativas em geral, comparando com o filme controle,
porém não foram avaliadas propriedades de superfície. Díaz, Candia e Cobos (2016) avaliaram
o efeito do UV na dispersão filmogênica e no filme pronto, e verificaram que só houve diferença
significativa nas propriedades avaliadas (mecânicas, de barreira, solubilidade, cor, estrutura
química e morfologia) quando o UV foi aplicado na dispersão filmogênica, mas, também não
foram avaliadas propriedades de superfície do filme, como ângulo de contato. Belmonte et al.
(2016) estudaram a modificação da superfície de polipropileno (PP) e de poli(álcool vinílico)
com UV a vácuo seguida de exposição a oxigênio, e, analisando propriedades de superfície,
verificaram a formação de novas funções químicas na superfície dos polímeros, com mudança
26
de hidrofilicidade da superfície e permanência da modificação por longo período de tempo,
além de excelente mecanismo de enxertia de estireno nos filmes de PP. Os autores ressaltaram
a facilidade de utilização do processo como um pré-tratamento e de aplicação em escala
industrial, sem necessidade de grandes investimentos econômicos.
A molécula de ozônio é um poderoso agente oxidante, que encontra aplicações em
diferentes campos, incluindo tratamento de resíduos, aplicações médicas e no processamento
de alimentos (SEGAT et al., 2014), sendo interessante o estudo de sua utilização na modificação
de superfícies poliméricas. Segat et al. (2014) estudaram o uso de ozônio em isolado de proteína
do soro e encontraram que este apresenta efeito de modificação de propriedades funcionais
dessa proteína como na formação de espuma, além de pequenas mudanças de solubilidade.
A combinação entre luz UV e ozônio (tratamento UVO) tem sido reconhecida como
um método efetivo para modificação química de superfícies de polímeros (MacMANUS et al.,
1999). Este envolve um processo de oxidação fotossensibilizado, em que as moléculas do
material tratado são excitadas e/ou dissociadas pela absorção de radiação UV de curto
comprimento de onda e oxigênio atômico (ÖZÇAM; EFIMENKO; GENZER, 2014), e assim
como a utilização de plasma, gera superfícies hidrofílicas (LANCASTER; SHUMAKER-
PARRY, 2016). Técnicas de plasma podem ser substituídas com sucesso pelo tratamento UVO,
o qual representa um tipo de modificação física mais branda e com resultados de alterações
superficiais semelhantes (ÖZÇAM; EFIMENKO; GENZER, 2014) e ainda, nunca requer
sistemas caros de vácuo (OKADA et al., 2016). Outras vantagens enumeradas por MacManus
et al. (1999): é aplicado a objetos tridimensionais e a materiais termicamente sensíveis que
poderiam ser danificados por tratamentos com chama ou corona e não requer agentes químicos
a não ser gás comprimido e ozônio, o qual é inativado rapidamente, sem produzir resíduos
poluentes como subprodutos; portanto, consideram o tratamento UVO como uma técnica
alternativa promissora de modificação de superfície de polímeros.
Shi; Kokini e Huang (2009) utilizaram tratamento UVO para modificar a superfície
de filmes de zeína, que resultou em oxidação de grupos metila da superfície dos filmes a grupos
aniônicos carbonila (COO-), abrindo assim oportunidades para funcionalizar zeína com
compostos catiônicos, e mostrando que essa técnica é viável para modificação da superfície de
materiais comestíveis. Os autores utilizaram especialmente a técnica de espectroscopia de
fotoelétrons excitados por raios-X (XPS, do inglês, X-ray photoelectron spectroscopy) para
obter essas respostas.
A técnica de XPS tem se tornado bem estabelecida para estudar a natureza de muitos
tipos de superfícies (GAIANI et al., 2011) e tem sido utilizada para investigar a composição da
27
superfície de diversos materiais, como plásticos (BELMONTE et al., 2016; KARAM et al.,
2013) e materiais biológicos (NAWAZ et al., 2016; SHI; KOKINI; HUANG, 2009; ZHAO et
al., 2015). A análise de XPS confere a composição relativa atômica elementar de
aproximadamente 5-10 nm de camada de superfície (RENSMO; SIEGBAHN, 2015). A
composição elementar relativa (carbono, oxigênio e nitrogênio) é utilizada para identificar
componentes como proteínas, lipídeos e polissacarídeos (NAWAZ et al., 2016). Em adição, os
picos de C1s, N1s e O1s obtidos de “Survey Scans” de XPS podem ser decompostos em
energias de ligação específicas em vários sub-picos e associados a funções químicas bem
identificadas, por exemplo, C-C(H), C-O, C-N, C=O, O-C=O, que são típicas de componentes
específicos, como lipídeos, derivados de açúcar e aminoácidos (ROUXHET; GENET, 2011).
A aplicação de XPS a biopolímeros se mostra muito viável e versátil, com ampla escala de
aplicabilidade, podendo ser utilizada para analisar filmes de zeína (SHI; KOKINI; HUANG,
2009) e também na verificação de compostos proteicos de interesse na superfície, como
antimicrobianos (KARAM et al., 2013; KELLY et al., 2015).
2.4 Adição de antimicrobianos – nisina
Nas duas últimas décadas a tecnologia de embalagens de alimentos vem
continuamente evoluindo em resposta aos desafios crescentes na sociedade moderna
(SALGADO et al., 2015), que incluem alimentos mais seguros e saudáveis, maior vida útil,
conveniência, mercados globais, legislação, autenticidade, resíduos alimentícios e conceitos
ambientais (NUR HANANI; ROOS; KERRY, 2014). Nesse contexto, as embalagens ativas
vêm se destacando, pois estão entre as tecnologias mais dinâmicas para preservar alimentos
(SALGADO et al., 2015). Estas embalagens interagem positivamente com o alimento e/ou o
ambiente para estender a vida útil do alimento ou para melhorar suas propriedades de segurança
ou sensoriais, enquanto mantém sua qualidade, baseando sua atividade em propriedades
intrínsecas do polímero ou em propriedades de aditivos específicos que são incorporados aos
sistemas de embalagem (MELLINAS et al., 2015), como os antimicrobianos.
Os agentes antimicrobianos incorporados aos filmes de embalagens de alimentos
criam um sistema de embalagem ativa que mantém sua atividade durante a estocagem do
alimento (NGUYEN; GIDLEY; DYKES, 2008). O uso de embalagens ativas incorporando
antimicrobianos é uma das tecnologias mais promissoras, já que o uso desse método pode
melhorar a segurança dos alimentos pela inibição de bactérias patogênicas ou controlando a
biota remanescente no alimento com a utilização de quantidades mínimas de compostos ativos;
28
estas embalagens têm como alvo a superfície do alimento, onde as mudanças microbiológicas
ocorrem primeiramente e mais intensivamente (APPENDINI; HOTCHKISS, 2002).
Bacteriocinas são compostos de ocorrência natural com uma larga faixa de
atividade antimicrobiana e natureza proteica, o que implica em degradação no trato intestinal
de humanos e animais (CLEVELAND et al., 2001). A nisina (Figura 4) está entre os
antimicrobianos mais estudados atualmente. Esta é um peptídeo catiônico anfifílico de peso
molecular de 3354,09 g/mol e com 34 aminoácidos pertencente à classe I das bacteriocinas,
produzidas por certas cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis (DELVES-BROUGHTON,
1996; YONG et al., 2015). Seu peptídeo ribossomicamente sintetizado possui um espectro
relativamente largo de atividade antibacteriana contra bactérias Gram positivas patógenas e
deteriorantes (IMRAN et al., 2014). A ação contra bactérias Gram-positivas ocorre por um
processo multi-etapas que desestabiliza a camada de fosfolipídeos da célula e cria poros na
membrana (TAI et al., 2008). A nisina (E234) é reconhecida como um aditivo de alimentos
pelo Food and Drug Administration (FDA) devido à sua não toxicidade (HAGIWARA et al.,
2010). De acordo com Imran et al (2014), a modelagem da difusão da nisina da embalagem
para modelar o sistema alimentar é necessária para julgar a capacidade e eficiência da
embalagem como carreadora de antimicrobianos.
Figura 4 - Estrutura primária de nisina A, mostrando a distribuição de aminoácidos nas porções
lado hidrofílica e hidrofóbica da molécula.
Fonte: Gross; Morell (1971) adaptada por Karam et al. (2013).
A integridade estrutural da nisina precisa ser mantida para que esta tenha atividade
antimicrobiana (YONG et al., 2015). A adição de nisina a superfícies alimentícias pode levar a
alguma perda de sua atividade, porque ela pode migrar até o centro do alimento, o que pode
resultar em uma diluição associada e esgotamento dos seus efeitos (QUINTAVALLA; VICINI,
29
2002). E ainda, agentes antimicrobianos como a nisina podem ser inativados por alguns
componentes presentes nos alimentos (ROSE et al., 1999).
Revestimentos de zeína com nisina mostraram resultados promissores no controle
de Listeria monocytogenes em produtos cárneos prontos para comer (JANES; KOOSHESH;
JOHNSON, 2002). Dawson et al. (2003) estudaram a manutenção de atividade da nisina em
filmes de zeína e glúten de trigo preparados por casting ou prensados, e observaram que, entre
os filmes estudados, os filmes de zeína preparados por casting foram os que melhor retiveram
a atividade da nisina, com melhor resultado. LIN; WANG e WENG (2011) aplicaram
revestimentos de zeína com nisina em produtos de peixe e obtiveram redução significativa de
carga microbiana na superfície dos produtos, além de manutenção de parâmetros de qualidade
devido ao uso dos revestimentos.
A nisina tem sido adicionada geralmente aos biopolímeros por simples mistura na
dispersão polimérica. Um novo método possível de incorporação da nisina aos filmes é através
de funcionalização da superfície, a qual pode ser feita por contato direto da nisina (em solução)
com a superfície ou por meio de um método em duas etapas: o tratamento da superfície do
polímero de forma a produzir grupos funcionais reativos, seguido pela reação desses grupos
funcionais com um composto de interesse (KUGEL et al., 2011), a nisina. Bower, McGuire e
Daeschel (1995a) relataram maior atividade da nisina em superfícies de hidrofobicidade mais
baixa e suportam a hipótese de que a nisina adsorvida em superfícies hidrófilas fica mais
livremente disponível para penetrar o microrganismo susceptível e iniciar a sua atuação dentro
da membrana bacteriana. Karam et al. (2013) estudaram a incorporação de nisina em filme de
polietileno e em polietileno com superfície modificada por grafting (enxertia) com ácido
acrílico (e pré-tratamento com plasma) e conseguiram confirmar a adsorção por XPS e
manutenção da atividade antibacteriana da nisina após adsorção. Não foram encontrados
trabalhos com adsorção de nisina na superfície de filmes biopoliméricos.
2.5 Revestimento de frutos
Nas últimas décadas, tem sido crescente a demanda por frutas e hortaliças frescas,
forçando a indústria de alimentos a desenvolver métodos novos e melhores para manter a
qualidade dos alimentos e estender sua vida útil (CERQUEIRA et al., 2009a). Grandes perdas
(de 20 a 80%) de frutas frescas ocorrem desde a colheita até o consumo final, e as frutas com
vida útil curta sofrem grande desvantagem em relação à cadeia de distribuição (CERQUEIRA
30
et al., 2009b). A aplicação de revestimentos comestíveis em frutos é uma alternativa viável e
reconhecida para prolongar sua vida útil.
Revestimentos comestíveis são finas camadas de material comestível (suspensões
ou emulsões) formadas como uma cobertura na superfície de produtos alimentícios. A remoção
da camada de revestimento pode ser possível; contudo, espera-se que este seja considerado
parte do produto final (HAN; GENNADIOS, 2005). O uso de revestimentos na superfície dos
alimentos, de forma geral, não tem o objetivo de substituir as embalagens utilizadas, mas
reduzir seus requerimentos de proteção, podendo simplificar a estrutura geral da embalagem
externa (KROCHTA; DE MULDER-JOHNSTON, 1997); sua utilização como embalagem
primária (que está em contato direto com o alimento) torna possível a redução de quantidade
de embalagem secundária (em geral de material sintético).
A eficiência das embalagens comestíveis depende da natureza de seus
componentes, da composição e da estrutura do filme; suas funções variam de acordo com esses
fatores, por isso a escolha de uma embalagem comestível é função da natureza do produto a ser
acondicionado. Por exemplo, revestimentos à base de proteínas (assim como de
polissacarídeos) apresentam boa propriedade de barreira a oxigênio, até comparável com a de
embalagens sintéticas, o que é desejável quando se quer baixar a taxa de respiração para retardar
o amadurecimento de frutas.
Sabe-se que o revestimento de frutas reduz a taxa de respiração pela formação de
uma atmosfera modificada (ALI et al., 2011), que é gerada pela criação de uma barreira
semipermeável a O2, CO2, umidade e movimento dos solutos, diminuindo assim a respiração,
perda de água e taxas de reação de oxidação (MARTÍNEZ-ROMERO et al., 2006) e
promovendo, consequentemente, melhoria de integridade mecânica, redução de alterações
sensoriais e do crescimento microbiano. O uso de revestimentos comestíveis é de grande
relevância para possibilitar maior disponibilidade da fruta in natura ao consumidor, já que
preserva características nutricionais e sensoriais do fruto, devido à manutenção de propriedades
físico-químicas (SALGADO et al., 2015).
Existem algumas pesquisas do uso de revestimentos de zeína aplicados em frutos
para aumento de vida útil. Gol e Rao (2014) encontraram bons resultados na manutenção da
qualidade de mangas utilizando revestimentos de zeína. Zapata et al. (2008) aplicaram
revestimentos de alginato e zeína em tomate e verificaram que estes foram efetivos para
qualidade e para retardar o amadurecimento, sendo que o revestimento de zeína retardou ainda
mais o pico de taxa de respiração e de etileno. Outro estudo com tomates mostrou que
revestimentos de zeína com óleos essenciais (de canela e de mostarda) foram efetivos na
31
inativação de Salmonella inoculada na superfície, além de manutenção de qualidade (YUN et
al., 2015). Scramin et al. (2011) encontraram que revestimentos de zeína e ácido oleico foram
efetivos na redução de perda de massa de peras em temperatura ambiente. Colzato et al. (2011)
observaram que a aplicação de revestimentos de zeína reduziu consideravelmente as taxas de
oxidação de macadâmias, melhorando assim sua qualidade e estabilidade. Scramin et al. (2007)
observaram redução da perda de massa de maçãs em decorrência da aplicação de revestimentos
de zeína. De acordo com Mehyar et al. (2014), revestimentos de zeína, associados ou não à cera
de carnaúba, foram efetivos em retardar a maturação e na prevenção do crescimento de fungos
em tâmaras. Baraiya, Rao e Thakkar (2015) avaliaram o efeito da zeína adicionada de
antioxidantes em jambolão e obtiveram aumento da sua vida útil em até 10 dias a 10°C.
2.6 Goiaba: características e aumento de vida útil
A goiabeira (Psidium guajava L.) é uma importante fruteira das regiões tropicais e
subtropicais do mundo (SINGH; PAL, 2008a), considerada a espécie cultivada mais valiosa da
família Myrtaceae. Sua fruta é conhecida popularmente como “fruta dos homens pobres” ou
maçã dos trópicos (NAKASONE; PAULL, 1998) e é uma cultura resistente, tolerando altas
temperaturas e seca (FORATO et al., 2015). Apresenta possibilidade de produção o ano todo
(PEREIRA, 1995).
A goiaba é uma fruta doce, bastante apreciada, nativa da América do Sul e Central
(FORATO et al., 2015), comercialmente importante em diversos países e popular devido à sua
disponibilidade durante todo o ano, rico valor nutricional e medicinal, preço acessível e boa
aceitação pelo consumidor (NIMISHA et al., 2013). Esta fruta é rica em vitaminas A e C e com
sementes ricas em ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 e ômega-6 e fibras dietéticas, além
de conter minerais, potássio e magnésio. Ainda, apresenta carotenoides e antocianinas, as
maiores classes de pigmentos antioxidantes, tornando-a com alto valor antioxidante entre os
alimentos vegetais (NIMISHA et al., 2013). Seu consumo na forma in natura garante o
aproveitamento de suas propriedades nutricionais, mas é limitado, principalmente, por seu curto
tempo de vida útil, pois a goiaba exibe alta taxa de respiração e rápido amadurecimento que
leva ao seu perecimento durante o armazenamento (HONG et al., 2012).
2.6.1 Fisiologia Pós-Colheita de Goiabas
O desenvolvimento dos frutos é dividido em quatro fases em função dos processos
fisiológicos, desde a formação até a morte do fruto: formação, crescimento, maturação e
32
senescência (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Dessas fases, a maturação é a mais importante
em relação à fisiologia pós-colheita, pois é quando os frutos se tornam mais atrativos e
apropriados para o consumo em função da cor, firmeza, aumento de odores específicos e
doçura, dentre outros (CHITARRA; CHITARRA, 2005). A respiração é o principal processo
fisiológico envolvido na fisiologia pós-colheita de frutas e hortaliças (CALBO; MORETTI;
HENZ, 2007), e também a biossíntese de etileno.
A respiração de um fruto é o processo em que ocorre uma série de reações
oxidativas dos compostos orgânicos, principalmente carboidratos e ácidos orgânicos,
transformados em CO2 e água, com produção de energia química, a qual é utilizada pela célula
para realização de processos metabólicos que originarão as características típicas do fruto
quando maduro (CORRÊA; PINTO; ONO, 2007). Este processo é de vital importância no
amadurecimento dos frutos, pois várias reações ligadas à respiração são responsáveis pela
síntese de diversos compostos, como pigmentos e fitohormônios (PURVIS, 1997).
Os frutos podem apresentar padrões diferentes de taxa respiratória. Alguns frutos
sofrem aumento na taxa de respiração durante a fase de amadurecimento, ao final do
desenvolvimento, sendo chamados frutos climatéricos (CALBO; MORETTI; HENZ, 2007).
Um aspecto importante que se observa nesses frutos em relação aos não-climatéricos é um pico
da taxa de produção de etileno nessa mesma fase da maturação (Figura 5). Quanto mais alta a
taxa respiratória, mais rapidamente os frutos chegarão à senescência; então, é importante
diminuir essa taxa, especialmente em frutos climatéricos, para possibilitar maior período de
conservação e manutenção da qualidade e maior período de comercialização. A respiração
intensa pode trazer mudança negativa de cor, odor e sabor indesejáveis, além de diminuição do
valor nutricional, resultando em deterioração do produto (GALUS; KADZINSKA, 2015).
A goiaba é considerada, em geral, uma fruta climatérica (BASHIR; ABU-GOUKH,
2003; FORATO et al., 2015; SINGH; PAL, 2008a), apesar de algumas referências indicarem a
goiaba como fruta não climatérica (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Esta fruta é, portanto,
altamente perecível e sofre rápida maturação pós-colheita em poucos dias em temperatura
ambiente (FORATO et al., 2015; SINGH; PAL, 2008a).
De acordo com Giovannoni (2001), o etileno é necessário para coordenar e
controlar o amadurecimento. Este fitorregulador presente nos espaços intercelulares, em um
determinado estádio da maturação, liga-se ao seu receptor na célula e desencadeia uma série de
eventos que culminam com o amadurecimento e senescência do fruto (LELIÈVRE et al., 1997).
Apesar de outros hormônios estarem envolvidos no amadurecimento, a sinalização através do
etileno continua a ser a via mais bem definida que media as alterações fenotípicas que ocorrem
33
durante o amadurecimento (BARRY; GIOVANNONI, 2007). Os processos que envolvem a
biossíntese e ação do etileno são complexos e dependem de várias condições exógenas e
endógenas do vegetal (CAVALINI, 2004). Lelièvre et al. (1997) explicam que o etileno pode
promover diferentes respostas em função do estágio de desenvolvimento, das condições
ambientais ou da variedade. O etileno é biologicamente ativo em quantidades muito pequenas
(traços), e seus efeitos são de extrema importância na agricultura (ABELES et al., 1992).
Figura 5 - Diferenças entre as taxas respiratórias de frutas climatéricas e não-climatéricas
durante o seu amadurecimento.
Fonte: FRUTAS CLIMATÉRICAS E NÃO CLIMATÉRICAS. Disponível em: <http://frutasbioquimica
2015.blogspot.com.br/2015/11/frutas-climatericas-e-nao-climatericas_3. html>.
De forma resumida, o etileno é sintetizado a partir da metionina como precursor em
três passos: (1) conversão da metionina em S-adenosil-L-metionina (SAM) catalisada pela
enzima SAM sintetase, (2) formação de ácido 1-aminociclopropano -1-carboxílico (ACC) a
partir do SAM com atividade da ACC sintase (ACS), e (3) conversão de ACC a etileno,
catalisada pela enzima ACC oxidase (ACO) (BARRY; GIOVANNONI, 2007). McMurchie et
al. (1972) propuseram dois sistemas distintos de biossíntese de etileno ainda aceitos atualmente
(LI et al., 2016), nomeados sistema 1 e sistema 2. O Sistema 1, caracterizado por baixa produção
de etileno e autoinibição, corresponde à liberação de etileno em frutos não climatéricos e ao
período pré-climatérico dos frutos climatéricos. Já o Sistema 2 confere massiva produção de
etileno e uma resposta autocatalítica encontrada na fase de amadurecimento dos frutos
climatéricos, então, este tem sido sugerido como a maior diferença entre frutos climatéricos e
não climatéricos (MCMURCHIE et al., 1972; LELIEVRE et al., 1997).
A taxa respiratória das goiabas depende de vários fatores como espécie e
temperatura de armazenamento. Abu-Goukh e Bashir (2003) estudaram a taxa respiratória de
34
goiabas vermelhas a 22°C e 90–95% UR, e observaram padrão típico climatérico com pico em
torno de 7 dias de armazenamento. Bassetto et al. (2005) verificaram a taxa respiratória de
goiabas armazenadas a 25°C e observaram que a taxa foi crescente até o quinto dia, último dia
de avaliação. Cerqueira et al. (2009b) avaliaram goiabas ‘Kumagai’ a 22°C e encontraram
pequeno pico climatérico no 5° dia, e pico de etileno taxa e respiratória crescente a partir do 7°
dia. Velho et al. (2011) avaliaram goiabas serranas e encontraram pico climatérico no quinto
dia de armazenamento a 23°C e taxa crescente de produção de etileno, com valor máximo após
10 dias a 23°C. Singh e Pal (2009) avaliaram goiabas dos cultivares ‘Lucknow-49’ e ‘Allahabad
Safeda’ e encontraram pico climatérico no quarto dia de armazenamento de goiabas a 27°C e
produção máxima de etileno após quatro dias a 27°C. Bron et al. (2005) avaliaram goiabas
‘Paluma’ em diferentes temperaturas e encontraram pico de produção de etileno no quarto dia
a 31°C e pequeno crescimento no sétimo dia a 21°C. Liu et al. (2012) obtiveram curva crescente
de etileno de goiabas ‘Li-Tzy Bar’ avaliando até o oitavo dia de armazenamento a 20°C.
Em todos os estudos aqui citados, a taxa máxima respiratória coincidiu com a taxa
máxima de produção de etileno, ou com o início do crescimento da taxa de etileno (o ponto
anterior à maior taxa mais alta), confirmando que o etileno está diretamente relacionado com a
taxa respiratória de goiabas. Verifica-se também que a taxa de produção de etileno, assim como
a taxa respiratória das goiabas, depende de diversos fatores como condições de armazenamento,
especialmente a temperatura, fase de maturação em que foi feita a colheita, além de variedade,
cultivar e fatores genéticos. Vishwasrao e Ananthanarayan (2016) estudaram o efeito de
revestimentos de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) em goiabas variedade ‘Lalit’ e
verificaram que esses revestimentos foram efetivos em reduzir o teor de etileno em relação ao
controle somente até três dias de armazenamento.
2.6.2 Aumento de vida útil de goiabas
Apesar das vantagens econômicas e de saúde, há diversos problemas que impactam
a produtividade e a qualidade das goiabas, como doenças e variações causadas por fatores
ambientais, porém, além do aumento de produtividade e resistência a pragas, é necessário
investimento na manutenção da qualidade dos frutos (NIMISHA et al., 2013). A curta vida pós-
colheita da goiaba e sua susceptibilidade a danos por frio e doenças limitam sua comercialização
potencial (SINGH; PAL, 2008a). O comércio no varejo de goiaba no Brasil é geralmente
realizado sem refrigeração e, portanto, a preservação de fruta em temperatura ambiente é
35
altamente desejável; o aumento do período de vida útil poderia ajudar no transporte de longa
distância e melhorar a sua comercialização (BASSETTO et al., 2005).
Vários métodos para conservação pós-colheita foram avaliados em goiabas frescas,
incluindo o uso de radiação ionizante para impedir a proliferação de microrganismos (SILVA
et al., 2011; SINGH; PAL, 2009); tratamento por imersão em solução concentrada de cloreto
de cálcio (WERNER et al., 2009) ou cloreto de cálcio associado com o ácido giberélico (LIMA
et al., 2003); resfriamento por ar forçado (SIQUEIRA et al., 2014); exposição a 1-
metilciclopropeno (BASSETTO et al., 2005; SINGH; PAL, 2008b) e embalagens plásticas
(SINGH; PAL, 2008a; TEIXEIRA et al., 2016) ou atmosfera modificada (GRIGIO et al., 2011;
SAHOO et al., 2015).
Além disso, diversos revestimentos comestíveis para o aumento de vida útil de
goiabas in natura vêm sendo testados, como a cera de carnaúba (JACOMINO et al., 2003;
RIBEIRO et al., 2005); hidroxipropilcelulose (MCGUIRRE; HALLMAN, 1995); amido e
quitosana (AQUINO; BLANK; SANTANA, 2015; HONG et al., 2012; SOARES et al., 2011),
cera de candelila (SALINAS-HERNÁNDEZ; ULIN-MONTEJO; SAUCEDO-VELOZ, 2010),
de proteínas lácteas (CERQUEIRA et al., 2011); gelatina, triacetina e ácido láurico
(FAKHOURI; BATISTA; GROSSO, 2003); de goma-xantana com nanopartículas lipídicas
(ZAMBRANO-ZARAGOZA et al., 2013) e de goma de cajueiro e carboximetilcelulose
(FORATO et al., 2015). Contudo, não foram encontrados trabalhos com uso de zeína e proteínas
reticuladas no revestimento de goiabas.
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
Para preparar os filmes das etapas 1, de estudos preliminares do solvente e dos
plastificantes, 2, da reticulação com ácido tânico, e 3, da modificação com UVO e nisina, e as
dispersões filmogênicas da etapa 4 foi utilizada zeína do milho obtida da Sigma-Aldrich, etanol
(95% ou 99,5%) obtido da Synth diluído com água destilada para preparar o solvente e os
plastificantes glicerol (P.A.) da Dinâmica e ácido oléico (P.A.) da Synth.
Na etapa 1 foi utilizado ácido acético da Synth no estudo de solventes. Nas etapas
seguintes, 2, 3 e 4, foi utilizado ácido tânico da Sigma-Aldrich. Na etapa 2, peróxido de
hidrogênio da Vetec foi utilizado para oxidação do ácido tânico. Na etapa 3 foi utilizada como
antimicrobiano catiônico nisina comercial produzida pela DuPont® (marca comercial
Nisaplin®), pureza 2,5%, gentilmente cedida pela empresa MasterSense.
Na etapa 4, as goiabas in natura foram compradas em mercado local (CEASA,
Ceará) e adquiridas de um mesmo lote (as goiabas tinham sido colhidas no mesmo dia). Estas
foram escolhidas de acordo com a coloração, entre verde-escuro e verde-claro, e ausência de
defeitos e doenças visíveis, acondicionadas em caixas plásticas forradas com espuma para evitar
danos mecânicos e transportadas imediatamente para o laboratório de Fisiologia e Tecnologia
Pós-Colheita da Embrapa Agroindústria Tropical, onde foram higienizadas e armazenadas.
3.2 Etapa 1 – Estudos preliminares: influência dos solventes etanol e ácido acético e dos
plastificantes glicerol e ácido oleico sobre propriedades físicas de filmes de zeína
3.2.1 Composição e preparação dos filmes
Na preparação dos filmes do estudo dos solventes foram adicionados 15 g de zeína
a 100 mL de solução de etanol (EtOH) 70, 80, 90 e 95% (v/v), sem e com ácido acético (AcOH)
5% (v/v). Glicerol 20% (m/m de zeína) foi utilizado como plastificante. A composição de cada
solvente está descrita na Tabela 1. O glicerol foi adicionado às dispersões, as quais foram
homogeneizadas em UltraTurrax T-25 (IKA, Staufen, Alemanha) a 10000 rpm por 10 minutos
e aquecidas sob agitação magnética a 72±5°C por 60 min. Os filmes foram obtidos por casting
(espalhamento) de 35 mL da solução formada sobre placas de vidro cobertas por filmes de
Mylar, nivelados com barra de 1 mm de espessura e foram secos em estufa com circulação de
ar (35°C, overnight).
37
Tabela 1 - Solventes usados para filmes de zeína.
Tratamento Concentração de solventes (v/v)
EtOH Água AcOH
T70 70% 30% -
T80 80% 20% -
T90 90% 10% -
T95 95% 5% -
T70a 70% 25% 5%
T80a 80% 15% 5%
T90a 90% 5% 5%
T95a 95% - 5%
No estudo dos plastificantes, as dispersões filmogênicas foram obtidas em
condições semelhantes ao estudo dos solventes, com algumas modificações. Foram adicionados
15 g de zeína a 100 mL de solução etanol 80% (v/v) e aquecidas a 72±5°C por 10 min, sob
agitação. Foram utilizados os plastificantes glicerol e ácido oleico. A mistura foi adicionada a
diferentes concentrações de plastificantes, totalizando 20% da massa de zeína (3 g), cujas
concentrações estão descritas na Tabela 2, e homogeneizada em UltraTurrax T-25 (IKA) a
10000 rpm por 10 minutos. Os filmes foram obtidos por casting nas mesmas condições do
estudo dos solventes.
Tabela 2 - Plastificantes usados para filmes de zeína.
Tratamentos Plastificantes
(20% da massa de zeína) Ácido oleico Glicerol
T1 (1:0) 100% -
T2 (2:1) 66,7% 33,3%
T3 (1:1) 50% 50%
T4 (1:2) 33,3% 66,7%
T5 (0:1) - 100%
3.2.2 Análises
A solubilidade em água dos filmes foi definida como a quantidade de matéria seca
solubilizada após 24 horas de imersão em água, e medida de acordo com Pena-Serna e Lopes-
Filho (2013). Os filmes foram cortados em discos de 2 cm de diâmetro e secos em estufa a
105°C por 24 h, pesados (peso inicial, pi) e imersos em 50 mL de água destilada a 26± 2°C por
24 h sob agitação em shaker orbital (MA-410, Marconi, Brazil) a 76 rpm. Após a imersão, os
discos foram retirados e secos (peso final, pf) nas mesmas condições citadas anteriormente, de
forma a determinar o peso de matéria seca que não foi solubilizado em água. Três replicatas de
38
cada amostra foram testadas e a solubilidade em água foi calculada de acordo com a Equação
(1).
𝑆𝑜𝑙𝑢𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑚 á𝑔𝑢𝑎 = 𝑝𝑖−𝑝𝑓
𝑝𝑖×100 (1)
Os ângulos de contato foram medidos de acordo com a ASTM D5946-01 (ASTM,
2001) para avaliar hidrofilicidade da superfície dos filmes. Gotas de água deionizada foram
depositadas na superfície dos filmes previamente condicionados com uma seringa acoplada ao
sistema de medida de ângulo de contato. As imagens foram capturadas com uma câmera Nikon
imediatamente após a formação da gota (0 s), em 30, 60 e 90 s. O ângulo obtido sobre a
superfície do filme foi medido com o programa ImageJ. Todas as medidas foram obtidas a
23±2°C. As análises foram feitas com no mínimo cinco replicatas.
No estudo dos solventes, foram avaliados permeabilidade a vapor de água,
propriedades mecânicas, térmicas e microscopia óptica. A determinação de permeabilidade a
vapor de água (PVA), com seis replicatas, foi baseada no método E96-00 (ASTM, 2000) a 25°C
e 55% RH, usando sílica gel como material dessecante. Foram feitas 8 medidas dentro de um
período de 24 h. A PVA foi calculada de acordo com a Equação (2).
𝑃𝑉𝐴 = 𝑝
𝑡
𝑥
𝐴𝑃0(𝑅𝐻1−𝑅𝐻2) (2)
Em que p/t é mudança em massa (fluxo, g/h), x é a espessura do filme (mm), A é a
área da superfície do filme exposta ao permeante (m2), P0 é a pressão de vapor da água pura
(kPa) e (RH1 – RH2) é o gradiente de umidade relativa usado no experimento. A 25°C, P0 é
3,159 kPa.
As propriedades mecânicas – resistência a tração (RT), elongação na ruptura (ER)
e módulo elástico (ME) – foram avaliadas. Antes da caracterização mecânica dos filmes, as
amostras foram condicionadas por no mínimo 24 horas a 25°C em dessecadores contendo
solução saturada de nitrato de cálcio tetrahidratado, de forma a manter a umidade relativa
constante em torno de 50%. No mínimo cinco amostras foram medidas, de acordo com a norma
ASTM D882-01 (ASTM, 2001), em uma Máquina de Testes Universal Emic DL-3000 com
uma célula de carga de 100 N, separação de garras inicial de 100 mm e velocidade de 1 mm/min.
O valor de RT foi determinado dividindo a tensão máxima pela área da seção transversal da
espécie. O valor de ER foi calculado como a porcentagem de aumento de extensão da amostra.
O valor de ME foi determinado a partir da inclinação da região linear de deformação elástica
da curva de tensão-deformação.
O Calorímetro Exploratório Diferencial (DSC, do inglês, Differential Scanning
Calorimeter) (modelo Q20, TA Instruments) foi aplicado para determinar a temperatura de
39
transição vítrea (Tg) das amostras sob atmosfera de nitrogênio. Amostras (4 mg) foram
submetidas a dois ciclos com taxa de 10°C/min. O primeiro ciclo foi realizado entre 20°C e
150°C de forma a apagar a história térmica do material, e o segundo ciclo entre 20 e 180°C. As
temperaturas de transição de vítrea foram obtidas do termograma obtido do segundo ciclo,
determinado pelo ponto médio entre o início e fim de temperaturas de mudanças graduais do
fluxo de calor observadas durante a corrida.
A microscopia óptica foi realizada para determinar a homogeneidade dos filmes,
que foram cortados em pedaços quadrados de 1 cm2. As amostras foram analisadas com um
microscópio óptico Olympus BX 60, equipado com um sistema de captura de imagem
Oplympus DP 71, usando uma magnificação de 40X.
No estudo dos plastificantes, além de solubilidade em água e hidrofilicidade por
ângulo de contato, a morfologia dos filmes foi investigada por Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV). As amostras foram montadas em stubs de alumínio usando fita adesiva dupla
face revestida de carbono, cobertas com platina e examinadas em microscópio eletrônico de
varredura Zeiss DSM940A, o qual foi ajustado para uma voltagem de aceleração de 15 kV.
3.3 Etapa 2 - Filmes de zeína reticulados com ácido tânico não-oxidado ou oxidado
3.3.1 Delineamento experimental
Os filmes foram preparados de acordo com um delineamento composto central,
com duas variáveis independentes: concentração de ácido tânico, de 0 a 8% em relação à massa
de zeína, e pH das soluções filmogênicas, de 4 a 9. Cada corrida foi conduzida para ácido tânico
não-modificado (ATn) e ácido tânico oxidado (ATo), como mostra a Tabela 5.
3.3.2 Preparação dos filmes com ácido tânico não-modificado (ATn)
Para cada filme, 10 g de zeína foram adicionados a 100 mL de solução etanol 80%
(v/v), e a dispersão foi agitada magneticamente a 72°C por 10 minutos. Glicerol e ácido oleico
foram adicionados como plastificantes na promoção de 2:1 de acordo com testes da etapa 1
(20% e 10% em relação à massa de zeína, respectivamente), porém, houve um aumento no total
de plastificantes de 20% para de 30% devido ao aumento esperado de rigidez com a reticulação.
A dispersão foi homogeneizada em UltraTurrax T-25 (Ika-Werke) a 10000 rpm por 10 minutos.
AT foi então adicionado sob agitação, o pH foi ajustado e a dispersão foi agitada com agitador
magnético a 60°C por 30 minutos para promover a reticulação.
40
As soluções filmogênicas foram espalhadas sobre Mylar® fixado sobre placas de
vidro (0,3 x 0,3 m), niveladas com barra para obter espessura final de 0,08 mm e secas em estufa
com circulação de ar (35°C, 180 min). Amostras secas foram cortadas e destacadas da
superfície. Antes da caracterização dos filmes, as amostras foram condicionadas por no mínimo
por 24 horas a 25°C em dessecadores contendo solução saturada de nitrato de cálcio
tetrahidratado, de forma a manter a umidade relativa constante em torno de 48%, o que tornou
o teor de umidade de todos os filmes uniforme (em torno de 7%).
3.3.3 Preparação dos filmes com ácido tânico oxidado (ATo)
0,4g de AT foram adicionados a 20 mL de solução de peróxido de hidrogênio 0,2%
(p/v). Esta dispersão de AT foi mantida sob agitação por 30 minutos a 60°C para promover
oxidação do AT. Nesse intervalo, zeína (10g) foi solubilizada em etanol absoluto (80 mL) sob
agitação a 72°C por 10 min, e junto com os plastificantes (nas mesmas quantidades descritas
em 2.3) foi homogeneizada em UltraTurrax T-25 a 10000 rpm por 10 minutos. As dispersões
de AT e zeína foram então misturadas sob agitação, o pH foi ajustado, e a dispersão filmogênica
resultante foi agitada com agitador magnético a 60°C por 30 min. A formação do filme foi então
conduzida como descrito em 3.3.2.
3.3.4 Análise espectrofotométrica
Foi realizada análise de espectroscopia no UV-Visível para verificação qualitativa
da oxidação do ácido tânico com H2O2. Para isso, foi utilizado espectrofotômetro UV-Vis (Cary
60, Agilent) na faixa de comprimento de onda de 300 a 600 nm, e foram avaliadas soluções:
ácido tânico 0,4% em água, com agitação até sua a total dissolução, e ácido tânico 0,4% em
solução H2O2 0,2%, com agitação por 30 min a 60°C para promover a oxidação.
3.3.5 Análises dos filmes após reticulação
As determinações de solubilidade em água, permeabilidade a vapor de água (PVA),
propriedades mecânicas, obtenção das imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV)
dos filmes e análise de DSC foram realizadas segundo descrito na Etapa 1 (ítem 3.2.3).
A determinação de opacidade dos filmes foi de acordo com método descrito por
Irissin-Mangata et al. (2001). Amostras de filmes foram cortadas em retângulos de 1 x 5 cm e
colocadas no interior de célula de espectrofotômetro Varian Cary 50 UV−vis,
41
perpendicularmente à luz. Foi realizada varredura de 400 a 800 nm, e a opacidade foi definida
como a área sob a curva da absorbância versus comprimento de onda (estimada por integração
trapezoidal) e expressa como unidade de absorbância x nanômetro (comprimento de onda)
/milímetros (espessura do filme) (A.nm.mm-1).
Foram medidos os parâmetros de cor luminosidade (L*, variando de 0 a 100,
representando preto e branco, respectivamente), cromaticidade do verde ao vermelho (a*,
valores negativos indicando verde e valores positivos indicando magenta) e do azul ao amarelo
(b*, valores negativos indicando azul e valores positivos indicando amarelo). As medidas de
cor foram realizadas com colorímetro Konica-Minolta CR-400, padronizado com um padrão de
referência (L* = 95.62, a* = −0.22 e b* = 2.45). As medidas foram feitas a partir da média de
seis pontos de cada filme, com aproximadamente 0,08 mm de espessura, colocados em cima da
referência. Diferenças de luminosidade (ΔL) foram consideradas como as diferenças entre os
valores da amostra (filme) e da referência. Diferenças de cor (ΔE) foram medidas pela
magnitude do vetor resultante dos três componentes de cor: diferença de luminosidade (ΔL),
diferença de cromaticidade do verde ao vermelho (Δa), diferença de cromaticidade do azul ao
amarelo (Δb), seguindo a Equação (1):
ΔE = √ΔL2 + Δa2 + Δb2 (1)
As análises estatísticas para os resultados correspondentes a solubilidade em água,
PVA, propriedades mecânicas, opacidade e cor foram feitas usando o software Minitab® versão
15. As regressões para representar as respostas foram obtidas e avaliadas em termos de seus
coeficientes de determinação (valor R2) e a significância de seus valores F. Testes t pareados
foram realizados para comparar propriedades dos filmes obtidos com AT não-modificado e
oxidado.
Os espectros de espectrofotometria de infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR) foram obtidos para estudar a estrutura dos componentes dos filmes e eventuais
interações entre os mesmos, em um espectrofotômetro a Varian 660-IR equipado com acessório
de reflectância total atenuada (ATR), com número de onda de 4000 a 650 cm-1 com uma
resolução de 4 cm-1 sobre 25 varreduras.
Além da calorimetria exploratória diferencial (DSC), foi feita análise
termogravimétrica (TGA, do inglês Thermogravimetric analysis). Esta foi realizada utilizando
um analisador termogravimétrico (Mettler Toledo, modelo TGA/SDTA 851), com medidas
realizadas sob atmosfera de nitrogênio com fluxo de gás de 50 mL/min, aquecidas na faixa de
temperatura de 25ºC a 500ºC a uma taxa de aquecimento de 10ºC/min em porta-amostra de
alumina.
42
3.4 Etapa 3 - Efeito da funcionalização com UV/ozônio e antimicrobiano catiônico
(nisina) sobre filmes de zeína reticulados com ácido tânico
3.4.1 Obtenção dos filmes e análises físicas - tratamento com UVO
Os filmes de zeína foram preparados segundo metodologia descrita na etapa 2 (ítem
3.3.2. O reticulante ácido tânico foi adicionado (4% em relação à massa de zeína) sob agitação,
o pH foi ajustado para 9 e a incorporação feita segundo ítem 3.3.2, concentração escolhida de
acordo com a etapa 2.
A oxidação da superfície dos filmes foi realizada em cabine UV/ozônio (UV Ozone
Cleaner – ProCleaner™ Plus) variando o tempo de exposição dos filmes em 0 (controle), 30,
60, 90, 120 e 150 s; os tempos foram escolhidos com base na metodologia e resultados de Shi;
Kokini e Huang (2009) para filmes de zeína. Filmes de 10 x 10 cm foram colocados dentro da
cabine e o UVO foi ligado pelo tempo determinado, e logo em seguida os filmes foram
armazenados em dessecador com umidade em torno de 53% (±5%).
Foram avaliados permeabilidade a vapor de água (PVA), propriedades mecânicas,
solubilidade em água e ângulo de contato de todos os filmes oxidados de 0 a 150 s, realizados
segundo descrito na Etapa 1 (ítem 3.2.3). O ângulo de contato foi feito com imagens capturadas
imediatamente após a formação da gota e ângulos medidos com o programa DGD.
3.4.2 Tratamento dos filmes oxidados com nisina
A preparação e purificação da solução de nisina foi realizada segundo Nguyen,
Gidley e Dykes (2008). Foi preparada solução base de nisina 50000 UI/ml dissolvendo 2,5 g de
nisina em 50 ml de HCl 0,01 M. A purificação da solução para remoção de proteínas do soro
de leite insolúveis presentes na composição da nisina utilizada (Nisaplin®) foi realizada por
centrifugação da suspensão a 3000 g por 15 min e o sobrenadante foi filtrado e guardado como
solução de estoque a aproximadamente 5°C. Esta solução foi diluída com HCl 0,01 M para
obter solução de nisina 10000 UI/ml, que foi usada como solução de trabalho para
funcionalização dos filmes.
A funcionalização foi feita por imersão dos filmes (5x5 cm de tamanho) em placas
de Petri (10 cm de diâmetro) com 35 ml de solução nisina 10000 UI/ml, mantida por 16 horas
a aproximadamente 5°C. Em seguida foi feita imersão rápida em água destilada para remover
nisina não adsorvida. Após esse processo, os filmes foram secos em estufa a 35°C por
aproximadamente 1 hora.
43
3.4.3 Caracterização química e morfológica dos filmes tratados com UVO e nisina
Os espectros de espectrofotometria de infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR) foram obtidos para estudar a estrutura química dos filmes em espectrofotômetro Perkin
Elmer modelo FT-IR/NIR FRONTIER. Foi feita a sobreposição de 4 varreduras, utilizando com
acessório de reflectância total atenuada (ATR) modelo Miracle acoplado com cristal ZnSe, no
comprimento de onda de 4000 a 550 cm-1 com uma resolução de 4 cm-1.
A análise química da superfície foi feita através da técnica de XPS (espectroscopia
de fotoelétrons excitados por raios X, X-ray Photoelectron Spectroscopy) realizada no
laboratório LNNano (Laboratório Nacional de Nanotecnologia) do CNPEM (Centro Nacional
de Pesquisa em Energia e Materiais) em Campinas/SP. Foi utilizado instrumento de XPS K-
Alpha (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) com irradiação de raio-X A1K em ultravácuo
correspondente à pressão de cerca de 10-8 mbar com compensação de carga durante as
medições. Espectros XPS de varredura (survey) e de alta resolução foram obtidos entre as
energias de 200 e 50 eV e resoluções de 1,0 e 0,1 eV, respectivamente. Os espectros de XPS
obtidos foram calculados a partir de 10 varreduras. A análise dos dados foi realizada utilizando
o software Thermo Avantage (versão 5.921).
As imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da superfície dos filmes
foram obtidas usando microscópio Vega3 Tescan. As amostras foram montadas em stubs de
alumínio usando fita adesiva dupla face revestida de carbono, cobertas com platina e
examinados usando voltagem de aceleração de 15 kV.
Imagens de AFM (Microscopia de Força Atômica, Atomic Force Microscopy)
foram obtidas no laboratório LNNano do CNPEM utilizando o microscópio modelo NX-10
PARK (SYSTEMS) no modo contato intermitente (tapping mode). As amostras foram
escaneadas com sonda de silício NCHR (NanoWorld), frequência de ressonância nominal:
320kHz, constante de força: 42N/m. O software de tratamento de imagens foi o Guyddion.
3.4.4 Propriedades antimicrobianas pelo teste do halo de inibição
As propriedades antimicrobianas dos filmes (1 – controle sem UVO e sem nisina,
2 – controle sem UVO com nisina, 3 – filme UVO 60s com nisina, 4 – filme UVO 120s com
nisina, 5 – filme UVO 150s com nisina) foram avaliadas através do teste de inibição em ágar.
O cultivo das bactérias avaliadas S. aureus e L. monocytogenes foi realizado em caldo infuso
de cérebro e coração (BHI) (Becton Dickinson, USA), enquanto que levedura S. cereviseae foi
cultivada em caldo batata dextrose (Becton Dickinson, USA). Após o crescimento, as cepas de
44
bactérias e levedura foram adicionadas de 20% de glicerol (v/v) e armazenadas sob
congelamento (-20°C e -80°C) e refrigeração (4°C a 6°C).
Suspensões de células com aproximadamente 1 a 2 x 106 UFC/ml de S. aureus, L.
monocytogenes e S. cereviseae foram espalhadas na superfície de placas de Petri de ágar
Mueller-Hinton para S. aureus, caldo infuso de cérebro e coração (BHI) para L. monocytogenes
e ágar Batata Dextrose para a levedura. Filmes em disco com 1,5 cm de diâmetro dos
tratamentos avaliados foram colocados em placas previamente inoculadas. As placas foram
incubadas a 35 °C/24 h e 25 °C/48-72 h, para bactérias e levedura, respectivamente. A atividade
inibitória foi observada pela inibição de crescimento microbiano sob o disco dos filmes (na área
de contato) e quando houve formação de halo (inibição em torno do filme), este foi quantificado
pela medida do diâmetro total.
3.5 Etapa 4 - Revestimentos de zeína na preservação de goiabas
3.5.1 Preparação das dispersões filmogênicas
Foram avaliadas 2 formulações de revestimentos nas goiabas: revestimento de zeína
(Z), e zeína reticulada com ácido tânico (ZR), os quais foram comparados com o controle (C),
que consistiu em goiabas sem revestimento. A dispersão filmogênica de zeína (Z) foi preparada
segundo metodologia descrita na etapa 2 (ítem 3.3.2.), sem adição de ácido tânico (AT), assim
como a dispersão de zeína reticulada com AT (ZR), com adição de ácido tânico 4% em relação
à massa de zeína e pH 9, concentração escolhida de acordo com a etapa 2.
Não foi possível testar a metodologia da etapa 3 para verificar o efeito da nisina em
goiabas porque esta metodologia só pode ser testada em forma de filme, já que a nisina é
adicionada no filme pronto (ítem 3.3.3) e a metodologia de revestimento por imersão é mais
adequada para goiabas; além disso, a cabine UVO oxida filmes com tamanho máximo de 10
cm de lado, então o tamanho dos filmes torna inviável a aplicação nesse fruto. Então, foram
feitos testes de halo de inibição (dispostos no Apêndice A) para verificar a possibilidade de uso
da nisina na dispersão filmogênica para uso como revestimento, e a partir deles, foi escolhido
o tratamento com nisina. Os testes preliminares com o tratamento escolhido de zeína reticulada
com ácido tânico e nisina (ZRN) mostraram que o revestimento com nisina tornou os frutos
com aparência inaceitável, e por isso não foi dada continuidade na investigação desse
revestimento em goiabas (mais detalhes no Apêndice A).
45
3.5.2 Aplicação dos revestimentos em goiabas
Antes da aplicação dos revestimentos nas goiabas, foi realizado processo de
higienização dos frutos, que consistiu em lavagem das frutas com solução de detergente neutro
(2 ml/L), enxágue com água corrente, sanitização com solução 100 ppm de hipoclorito de sódio
(Adheclor®, registro Anvisa n° 317740032, validade 05/2018) por 5 min, e em seguida 5 ppm
de hipoclorito de sódio por 5 min, para retirar excesso de sanitizante da superfície dos frutos, e
secagem em temperatura ambiente.
As goiabas foram divididas aleatoriamente em 3 grupos, descritos a seguir, e
pesadas, para obter massa inicial: grupo com goiabas não-revestidas, denominado controle (C);
grupo de goiabas revestidas com revestimento de zeína (Z), e grupo de goiabas com
revestimento de zeína reticulada (ZR). Um volume total de 600 mL de cada solução para
revestimento foi utilizado, e cada goiaba foi imersa em solução por 1,5 min. Em seguida, os
frutos foram colocados em bandejas de isopor e armazenados em câmara a 23±2 °C, com
umidade relativa de 88±5%.
3.5.3 Análises
Após o processo de revestimento, as goiabas foram submetidas às seguintes
análises, cujas metodologias serão apresentadas a seguir: sobrevivência; físicas (perda de
massa, cor, firmeza); taxas de produção de CO2 e de de etileno; químicas e fisico-químicas (pH,
acidez total titulável, sólidos solúveis totais, vitamina C, clorofila e carotenoides) e do
metabolismo antioxidante enzimático (peróxido de hidrogênio, peroxidação lipídica, catalase e
SOD).
3.5.3.1 Análise de sobrevivência
Para avaliar o tempo de sobrevivência das goiabas, foram utilizadas 24 repetições
de 1 fruto para cada tratamento. As frutas foram avaliadas visualmente e foram atribuídas notas
para cada uma (Tabela 3), de acordo com a cor da casca do fruto (CAVALINI et al., 2006). As
notas foram atribuídas a cada fruto todos os dias até que o fruto fosse descartado por presença
de podridão ou fungos ou danos profundos em mais de 10% do fruto, que é a porcentagem
mínima aceita para classificação segundo a CEAGESP (2016). A avaliação foi realizada pela
comparação do tempo em dias para a fruta chegar à cor amarela, ou seja, tempo até atingir a
nota 5, e do tempo em dias para a fruta ser descartada.
46
Tabela 3 – Escala de notas de acordo com a cor da casca para goiabas.
Nota Cor do fruto
1 verde-escuro
2 verde-claro
3 verde-amarelado
4 amarelo esverdeado
5 amarelo
3.5.3.2 Análises físicas
Para as análises de perda de massa e cor, foram utilizados os mesmos frutos do
início ao fim do ensaio. A análise física de perda de massa foi realizada diariamente por
pesagem dos frutos em uma balança semianalítica. Foram utilizados 12 repetições de 1 fruto
para cada tratamento e os resultados foram expressos em porcentagem. A percentagem de perda
de massa (PM) dos frutos calculada por meio da fórmula:
𝑃𝑒𝑟𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 = 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙−𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙×100
A medição da cor do fruto foi realizada diariamente, diretamente sobre a casca
utilizando um colorímetro Konica Minolta modelo CR-410. A cor foi expressa como L*
(luminosidade/brilho), a* (do verde ao vermelho) e b* (do amarelo ao azul), utilizando o
sistema CIE-L*a*b*. Foram analisados 12 frutos para cada tratamento e foram feitas três
medições em pontos distintos em cada fruto, na região equatorial.
A firmeza dos frutos foi medida utilizando texturômetro Stable Micro System,
modelo TA-XT2i. Foi utilizada probe de 6 mm de diâmetro penetrando profundidade de 15
mm, e velocidade de 1mm/s, usando célula de carga de 50 N. Foram utilizados para cada
replicata 5 frutos, testados em ambos os lados na região equatorial (duas medições). Os valores
de firmeza foram expressos em Newton (N).
3.5.3.3 Atividade respiratória e produção de etileno
Para avaliação da concentração de CO2 e etileno, as goiabas foram pesadas e
colocadas em frascos de polipropileno (3 repetições de 4 frutas por frasco, para cada tratamento)
hermeticamente fechados, com capacidade de 2600 mL, e septo de silicone nas tampas. Os
frascos foram fechados por 60 minutos e após esse período foram coletadas amostras de gás
utilizando seringas de 22 mL. As amostras de ar foram colocadas em frascos de vidro de 22 mL
47
(dos quais foi retirado previamente todo o ar com auxílio de bomba de vácuo) e armazenadas
em geladeira.
Para análise da concentração de CO2, alíquotas de 250µL foram injetadas em
cromatógrafo a gás Varian 450-GC, equipado com coluna Select permanent gases/CO2
(CP7429) e detector de condutividade térmica (TCD). As temperaturas da coluna e do detector
foram, respectivamente, 60°C e 120°C. O gás de arraste foi o nitrogênio (N), na vazão de 15
ml/min. O software Galaxie Chromatography Data System foi utilizado para registrar e integrar
os picos cromatográficos. Os picos de CO2 das amostras foram comparados aos picos obtidos
pela aplicação de um padrão de concentração 5% mol.mol-1. Os resultados foram expressos em
mg CO2.kg-1.h-1.
Na avaliação da produção de etileno foi utilizado cromatógrafo (Shimadzu GC-
2010), com coluna RTX-5 e detector de ionização de chama (FID). Foram injetadas alíquotas
de 1 mL de cada amostra. As temperaturas da coluna e do detector foram 30°C e 250°C,
respectivamente. O gás de arraste foi o nitrogênio (N), na vazão de 30 ml.min-1. Padrão externo
de etileno (10 ppm mol.mol-1) foi usado como referência para quantificação das amostras. Os
resultados foram expressos em µgC2H4.kg-1.h-1.
3.5.3.4 Análises físico-químicas
Para a avaliação das variáveis físico-químicas, foram utilizadas 3 repetições de 3
frutos, totalizando 9 frutos para cada tratamento e para cada dia de análise (0, 6 e 12). As
análises foram feitas em triplicata para cada repetição. Os frutos foram processados em uma
centrífuga de frutas domésticas para a obtenção da polpa. As metodologias empregadas nas
análises de acidez total titulável, pH, sólidos solúveis totais (ºBrix) e vitamina C foram
realizadas de acordo com as Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008).
O pH foi obtido por leitura direta na polpa em pHmetro de bancada (modelo 3510,
Jenway). A acidez total titulável foi determinada por titulação com NaOH 0,1 N e os resultados
expressos em percentagem de ácido cítrico. A porcentagem de sólidos solúveis totais (SST) foi
obtida da polpa através de refratômetro digital (modelo Q167D145, Quimis), com compensação
automática de temperatura e os resultados expressos em graus Brix. Os teores de vitamina C
(mg de ácido ascórbico por 100 gramas) na polpa foram determinados por titulometria com
solução de DCFI (2,6-diclorofenol-indofenol), conhecido como reagente de Tillmans. As
avaliações dos teores de clorofila e carotenóides foram feitas segundo Lichtenthaler (1987).
48
3.5.3.5 Metabolismo antioxidante enzimático
As análises do metabolismo antioxidante enzimático foram realizadas no Laboratório
de Bioquímica e Fisiologia Pós-Colheita de Frutos (Departamento de Bioquímica – UFC). O
conteúdo de peróxido de hidrogênio (H2O2) das amostras foi determinado de acordo com
Velikova et al. (2000). Amostras (1 g) foram maceradas em 5 mL de ácido tricloroacético
(TCA) 0,1% (w/v) por 5 min a 4 ºC e após centrifugadas a 3000 x g, durante 10 min a 4 ºC.
Foram adicionados a 50 µL do sobrenadante, 50 µL de tampão fosfato de potássio 10 mM (pH
7,0) e 100 µL de KI a 1 M. A mistura foi protegida da luz e deixado reagir durante 1 h. O teor
de peróxido de hidrogênio do sobrenadante foi determinado por comparação da sua absorbância
a 390 nm contra uma curva de calibração padrão, variando de 1 a 90 µmol de H2O2 mL-1. Os
resultados foram expressos como µmol g-1.
A peroxidação lipídica foi avaliada através da produção de metabólitos, usando
protocolo desenvolvido por Zhu et al. (2008) com base na formação do malonialdeído (MDA),
produto secundário da oxidação de ácidos graxos poliinsaturados, que ao reagir com o ácido
tiobarbitúrico (TBA) pode ser lido por espectrofotometria. Amostras (1 g) foram
homogeneizadas em 5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 0,1% (w/v) (Vetec, Brasil) por 5 min
a 4 ºC e centrifugado a 3000 x g a 4 ºC durante 10 min. O sobrenadante (250 µL) foi recolhido
e adicionado a 1000 µL de TBA 0,5% (v/v) (JT Baker, Reino Unido) em TCA 20% (w/v), sendo
incubado a 95 ºC durante 30 min. Após incubação, os tubos foram imediatamente resfriados em
banho de gelo e centrifugados a 3000 x g durante 10 min. A absorbância do sobrenadante foi
mensurada a 532nm e 600nm gerando absorbâncias específica e não específica,
respectivamente. As espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) foram calculados
utilizando o coeficiente de extinção molar (155 mM-1 cm-1), e expressos como nmol de MDA
g-1.
O extrato para enzimas foi preparado seguindo protocolo modificado de Yang et al.
(2009). Amostras (4 g) foram maceradas durante 2 min em 4 mL de solução tampão gelada (pH
8,0), contendo 0,05 M de Tris-HCl e 0,1 mM de EDTA, seguido por centrifugação a 12000 x g
durante 15 min a 4 ºC. O sobrenadante obtido constituiu o extrato enzimático para a
determinação da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase
(CAT). A concentração de proteína em todos os extratos enzimáticos foi determinada pelo
método de Bradford (1976), utilizando albumina bovina sérica (Sigma-Aldrich, Co.) como
padrão. A cada 10 µL de amostra, diluída ou não, 100 µL do reagente de Bradford foram
adicionados. A mistura foi então deixada em repouso por 15 min, e em seguida absorbância
49
determinada a 595 nm em leitor de microplacas UV/VIS (Synergyx Mx, Biotek, EUA). A
concentração de proteínas solúveis nas amostras analisadas foi determinada a partir de uma
curva padrão obtida como uso de soluções de concentrações conhecidas de albumina sérica
bovina (BSA). Os resultados foram expressos em mg g-1 proteína (P).
A atividade da superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) foi determinada com base
na reação da riboflavina com o oxigênio molecular (O2), que na presença de luz reage com o
nitro azul de tetrazólio (NBT) (Sigma), resultando na formação de formazana, um produto
colorido monitorado espectrofotometricamente (GIANNOPOLITIS; RIES, 1977). A marcha
analítica constituiu de: 95 µL de tampão fosfato de potássio 0,05 M com EDTA 0,1 mM (pH
7,8), 80 µL de extrato, 25 µL de NBT 750 µM e 50 µL de riboflavina uM, obedecendo esta
ordem. A mistura reacional foi transferida para uma câmara com luz fluorescente de 30 W,
onde permaneceu por 15 min. A absorbância foi medida após 15 min a 560 nm e uma unidade
de atividade da enzima (UA) foi definida como a quantidade de enzima necessária para causar
uma redução de 50% na taxa de fotoredução do NBT (BEAUCHAMP; FRIDOVICH, 1971).
Os resultados foram expressos como UA mg-1 P.
A atividade da catalase (CAT, EC 1.11.1.6) foi medida de acordo com Beers e Sizer
(1952). A diminuição do teor de H2O2 foi monitorizada e quantificada utilizando o coeficiente
de extinção molar (36 mM-1 cm-1). O meio reacional foi composto de 230 µL de tampão fosfato
de potássio 0,1 M com EDTA 0,1 mM (pH 7), 10 µL de H2O2 a 0,5 M e 10 µL de extrato. A
leitura foi realizada a cada minuto, a 240 nm em intervalo de 20 min com auxílio de um leitor
de microplaca (Synergyx Mx, Biotek, EUA). Os resultados foram expressos em µmol de H2O2
mg-1 min-1 P.
3.5.3.6 Análise estatística
Foram utilizadas no mínimo 3 repetições de 3 frutos para cada tratamento e período
de análise, com número de repetições variando de acordo com a análise. Foi realizada análise
de variância (ANOVA) para verificar a variabilidade dos dados e significância dos coeficientes
de regressão, utilizando o programa R.
Os fatores e níveis avaliados podem ser divididos de acordo com o esquema abaixo
para facilitar a compreensão:
1. Tipo de revestimento, com três níveis:
- C (controle): sem revestimento, Z: revestimento de zeína, ZR: revestimento de
zeína reticulada.
2. Dias de armazenamento (número de níveis variando de acordo com a análise):
50
- Parâmetros físicos de perda de massa e de cor (L*, a* e b*): dias 0, 1, 2, 3, 4, 6,
7, 8, 9, 10, 11 e 12, totalizando 12 níveis. Para essas análises foi realizada análise de regressão
polinomial, na qual foram consideradas equações até o 3° grau. Para a adequação do modelo
foi adotado como critério coeficiente de determinação (R2) acima de 0,70. Foi verificado para
validação do modelo as pressuposições de normalidade e homocedasticidade dos dados
exigidas para regressão.
- Parâmetros de firmeza, CO2 e etileno, peróxido de hidrogênio, peroxidação
lipídica, CAT e SOD: dias 0, 1, 3, 6, 8, 10 e 12, totalizando 7 níveis. Neste caso, apresentaram-
se as médias, desvio padrão e foi feita comparação pelo Teste de Tukey a 5% de significância,
pois os modelos de regressão apresentaram coeficiente de determinação (R2) abaixo de 0,70.
- Parâmetros físico-químicos (pH, acidez total titulável, sólidos solúveis totais,
vitamina C, clorofila e carotenoides): dias 0, 6 e 12, totalizando 3 níveis. As médias desses
parâmetros foram comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de significância.
- Foi feita Tabela com todos os parâmetros avaliados com as médias globais e Teste
de Dunnett (p < 0,05) para comparação dos frutos revestidos Z e ZR com o controle.
51
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Etapa 1 - Estudos preliminares: influência dos solventes etanol e ácido acético e dos
plastificantes glicerol e ácido oleico sobre propriedades físicas de filmes de zeína
4.1.1 Estudo dos solventes
Os filmes de zeína obtidos se apresentaram com superfície lisa, flexível e sem poros
visíveis, com exceção dos filmes feitos com 90 e 95% de etanol, que se mostraram heterogêneos
e muito quebradiços; por isso, as propriedades mecânicas desses tratamentos não puderam ser
avaliadas. Provavelmente, a zeína não se solubilizou totalmente nessas concentrações devido
às partes polares da sua estrutura anfifílica, que exigem um mínimo de água em solução,
formando aglomerados de zeína que tornam o filme quebradiço. A aparência dos filmes pode
ser vista na Figura 6.
Figura 6 - Aparência visual de filmes de zeína dos tratamentos: T70, T80, T90, T95, T70a,
T80a, T90a, T95a, respectivamente.
A solubilidade em água dos filmes pode ser observada na Figura 7. Verifica-se que
houve aumento de solubilidade nos filmes com AcOH e que os valores de solubilidade nos
filmes sem AcOH foram próximos entre si e mais baixos, com exceção em 90%, indicando que
os filmes sem AcOH foram mais resistentes a água. Provavelmente, nos tratamentos T70a e
T80a o ácido acético presente (somente 5%) não foi suficiente para que ocorresse protonação
dos grupos COOH de zeína, que diminuiria a hidrofilicidade da superfície dos filmes (SHI;
KOKINI; HUANG, 2009). Os valores de permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos filmes
foram entre 0,626 e 1,005 g.mm.kPa-1.h-1.m-2. De forma geral, as mudanças de solvente não
interferiram na PVA, com valores similares para os filmes com e sem AcOH, com exceção dos
52
filmes com AcOH em 70% de etanol. A tendência de diminuição de PVA em T70a pode ter
ocorrido devido ao melhor desdobramento da zeína em presença de ácido acético descrito por
LI et al. (2012), que pode ser responsável pela diminuição de espaços livres para a passagem
de vapor de água. A PVA dos filmes obtida foi menor que a obtida por Soliman e Furuta (2009)
com solvente 88% de etanol, e maior do que a do filme de zeína dissolvido em 80% de etanol
de Gu et al. (2013); provavelmente, as diferentes condições de processamento do filme
(temperatura e pH) podem ter favorecido a menor ou maior PVA encontrada pelos autores. De
acordo com Shi et al. (2009), filmes de zeína preparados com etanol são mais hidrofílicos
devido à sua alta porcentagem de grupos funcionais polares na superfície comparados aos
filmes com AcOH, porém, os resultados de solubilidade e PVA mostram que a substituição de
5% de água do solvente por 5% de ácido acético não é suficiente para provocar redução de
afinidade por água esperada. Os filmes de zeína mostram menor PVA que outras proteínas
como gelatina, com PVA em torno de 2 g.mm.kPa-1.h-1.m-2 (SANTOS et al., 2014) e proteína
do soro de leite, com PVA em torno de 5 g.mm.kPa-1.h-1.m-2 (JANJARASSKUL et al., 2014).
Figura 7 - Efeito da concentração de etanol e de ácido acético sobre a solubilidade em água e
permeabilidade a vapor de água de filmes de zeína.
Os resultados das propriedades mecânicas estão apresentados na Tabela 4. A
resistência à tração (RT) e a elongação na ruptura (ER) em geral foram similares, com exceção
da RT de T70, que foi maior em comparação com T80. Não houve diferença considerável entre
os filmes com e sem AcOH, com exceção do pequeno aumento de módulo de T80a. O módulo
elástico diminuiu com o aumento do teor de etanol a 80%, com menor valor em T80, mostrando
pequena diminuição de rigidez, o que é desejado para filmes de zeína, pois eles são muito
quebradiços. Os resultados encontrados foram próximos aos encontrados por Gu et al. (2013) e
por Ghanbarzadeh e Oromiehi (2008) para filmes de zeína.
53
Tabela 4 - Efeito da concentração de etanol e de ácido acético sobre as propriedades mecânicas
de filmes de zeína. Resistência à Tração Elongação na Ruptura Módulo Elástico
EtOH sem AcOH com AcOH sem AcOH com AcOH sem AcOH com AcOH
70% 30,27 ± 1,80 30,15 ± 3,01 1,39 ± 0,20 1,36 ± 0,23 24,76 ± 2,30 22,97 ± 2,76
80% 20,62 ± 5,83 25,37 ± 5,03 1,15 ± 0,12 1,21 ± 0,36 18,88 ± 2,02 22,67 ± 1,06
Os termogramas de DSC estão expostos na Figura 8. A temperatura de transição
vítrea (Tg) de zeína é 170°C e a Tg de filmes plastificados de zeína é na faixa de 70°C, similar
aos valores encontrados por Gu et al. (2013) e Chen; Ye e Liu (2014). A Tg é diminuída em
filmes de zeína devido aos efeitos de plastificação dos solventes e do glicerol. O filme T80
apresentou Tg menor que T80a, o que significa que as cadeias de proteína possuem maior
mobilidade sem ácido acético. Possivelmente, também por causa do menor teor de água em
T80a que pode ter ocasionado menor teor de umidade após a secagem, pois esta atua também
como plastificante em filmes de zeína. Os resultados concordam com o resultado de módulo
elástico de menor rigidez do filme sem AcOH a 80% de etanol comparado com o T80a.
Figura 8 - Termograma de zeína (pó) e termogramas de filmes de zeína, sem (T80) e com
(T80a) ácido acético, obtidos por DSC.
As imagens de microscopia óptica de filmes de zeína com 80% de etanol com e sem
AcOH estão apresentadas na Figura 9. A presença de glicerol causou a formação de filme
heterogêneo com aglomerados amarelos porque este não ficou totalmente distribuído na matriz.
A fraca interação entre glicerol e zeína fez com que o excesso de glicerol fosse excluído da
matriz (PENA-SERNA; LOPES-FILHO et al, 2013). O filme T80 apresentou pequenos
aglomerados de zeína de cor escura, bem espalhados na matriz. Em T80a, os aglomerados
54
escuros (zeína) formaram uma rede menos espalhada na matriz do filme, indicando que os
filmes com AcOH são menos homogêneos.
Figura 9 - Micrografias de filmes de zeína obtidas por microscopia óptica.
(a) sem ácido acético (T80); (b) com ácido acético (T80a). As setas indicam aglomerados de glicerol. Aumento de
40x.
4.1.2 Estudo dos plastificantes
Solubilidade em água e ângulo de contato são relacionados à
hidrofilicidade/hidrofobicidade dos filmes, de forma que, quanto maior o ângulo de contato e
quanto menor a solubilidade em água, menor a hidrofilicidade (PENA-SERNA; LOPES-
FILHO, 2013). Observa-se na Figura 10 que a solubilidade dos filmes com ácido oleico é bem
baixa (em torno de 10%) e aumenta com o aumento de glicerol, sendo o aumento mais
perceptível a partir do tratamento 3 (1:1). Este aumento é esperado, já que o glicerol tem
natureza polar, que permite maior interação com a água e menor interação com zeína.
Figura 10 - Efeito dos plastificantes ácido oleico e glicerol sobre a solubilidade em água e
hidrofilicidade de filmes de zeína.
T1 (1:0) T2 (2:1) T3 (1:1) T4 (1:2) T5 (0:1)0
5
10
15
20
25
So
lub
ilid
ad
e (
%)
55
Na Figura 10 também podem ser observados os ângulos de contato formados por
gotas de água na superfície dos filmes em 0 (assim que a gota entra em contato), 30, 60 e 90s.
Verifica-se que o ângulo diminui com o aumento de glicerol (de T1 para T5), confirmando que
a hidrofilicidade dos filmes aumenta com o aumento de concentração de glicerol como
plastificante. Além disso, pode-se observar que os filmes com mais ácido oleico (T1, T2 e T3)
apresentam estabilidade maior, enquanto os filmes T4 e T5 tendem a absorver mais água com
o tempo. Pode-se destacar que o tratamento 3 (1:1), apesar de apresentar alta solubilidade,
apresenta hidrofilicidade de superfície semelhante à de T1 e T2, e boa estabilidade com o
tempo, indicando que houve um efeito positivo de combinação dos dois plastificantes nessa
concentração.
A Figura 11 mostra as micrografias de superfície obtidas por Microscopia
Eletrônica de Varredura. Podem ser observadas marcas de partes quebradiças do filme, mais
perceptíveis em T2, que diminuem com o aumento de glicerol, e perfurações ou orifícios e
depressões, os quais podem ser formados durante a evaporação do etanol na etapa de secagem
do filme, e tendem a desaparecer com o aumento de glicerol (T5) (XU; CHAI; ZHANG, 2012;
PENA-SERNA; LOPES-FILHO, 2013).
Figura 11 - Micrografias de superfície obtidas por MEV de filmes de zeína e plastificantes ác.
oléico/glicerol.
T1(1:0), 2: T2(2:1), 3: T3(1:1); 4: T4(1:2) e 5: T5 (0:1). Aumento de 1000 x.
56
A adição de glicerol cria espaços entre as cadeias de proteína, diminuindo as forças
intermoleculares e permitindo uma melhor mobilidade das mesmas (TIHMINLIOGLU; ATIK;
ÖZEN, 2010) e, portanto, melhor difusão do etanol através do filme. Segundo Pena-Serna e
Lopes-Filho (2013), o ácido oleico forma agregados na matriz. O filme T4 apresentou boa
homogeneidade, mostrando ser possível a utilização dos dois plastificantes em conjunto em
filmes de zeína. Mesmo com os melhores resultados nas micrografias obtidas para filmes com
glicerol, observam-se nesses filmes pontos brancos (T5) que podem ser aglomerações de zeína,
também por causa da interação fraca entre esta proteína e glicerol.
4.2 Etapa 2 - Filmes de zeína reticulados com ácido tânico não-oxidado ou oxidado
4.2.1 Espectros de absorção
A Figura 12 mostra os espectros de absorção no UV-Vis de duas soluções, uma com
AT e a outra com ATox. Observa-se que houve mudanças de absorção da solução com ATox
para maiores comprimentos de onda (mudança batocrômica) e para maiores absorbâncias
(mudança hipercrômica). A absorção máxima do espectro da solução com AT em 374 nm
passou por mudanças batocrômica e hipercrômica, comprovando que ocorreu oxidação do AT
utilizando H2O2 como oxidante nas condições utilizadas. O comportamento dos espectros
encontrado foi semelhante ao encontrado por Janosevic et al (2012) na oxidação de AT com
persulfato de amônia.
Figura 12 - Espectros de absorção no UV-Visível de AT (solução de ácido tânico 0,4% em
água) e ATox (solução de ácido tânico 0,4% em H2O2 0,2%).
57
A Tabela 5 apresenta as respostas experimentais para as propriedades dos filmes.
Os modelos para os filmes obtidos de ácido tânico não modificado (ATn) e oxidado (ATo) são
representados por equações de regressão e parâmetros estatísticos nas Tabelas 6 e 7,
respectivamente, e pelas curvas de contorno nas Figuras 12 (ATn) e 13 (ATo). Algumas
regressões não foram significativas (p<0,05), mas foram utilizadas para indicar tendências
gerais das propriedades. Além disso, a maioria dos modelos não significativos apresentaram
alguns termos de regressão significativos que devem ser mencionados.
Tabela 5 - Condições e respostas experimentais
Corrida AT pH SA PVA RT ER ME OP ΔL ΔE
1(n) 1,2 4,73
79,53 1,102 6,54 0,68 10,67 3461,7 2,28 14,79
1(o) 62,68 1,070 7,82 1,16 11,37 3393,5 4,78 20,04
2(n) 6,8 4,73
53,22 0,925 8,65 0,65 14,54 4321,5 4,99 25,67
2(o) 50,57 0,845 11,56 0,90 14,83 4943,1 4,86 17,34
3(n) 1,2 8,27
59,21 0,917 7,97 1,82 10,45 3583,8 8,91 32,61
3(o) 54,61 0,812 8,52 1,86 12,45 3320,9 12,25 44,81
4(n) 6,8 8,27
43,73 0,887 12,29 1,16 14,66 4503,9 16,73 36,96
4(o) 42,88 0,725 12,88 1,08 16,27 4490,6 18,33 49,71
5 0 6,5 80,65 1,041 5,58 2,16 10,02 3038,5 2,14 11,54
6(n) 8 6,5
55,42 0,782 11,17 0,80 15,71 3965,9 5,88 30,25
6(o) 42,38 0,782 13,97 0,81 17,24 3806,7 5,38 22,21
7(n) 4 4
78,31 0,939 7,86 0,76 11,21 3549,4 4,53 26,26
7(o) 60,89 0,910 6,16 0,68 9,40 4954,8 4,45 23,93
8(n) 4 9
51,47 0,742 10,47 1,37 10,77 3832,3 16,81 47,51
8(o) 42,69 0,746 12,67 0,50 16,44 4016,1 13,82 40,45
9(n) 4 6,5
58,74 0,881 7,43 0,71 11,44 3768,6 6,84 35,19
9(o) 57,72 0,767 9,32 0,84 11,11 3631,9 7,00 27,24
10(n) 4 6,5
60,96 0,993 6,26 0,67 10,77 3267,2 3,57 20,93
10(o) 59,44 0,806 8,19 0,72 10,15 3495,3 4,49 22,58
11(n) 4 6,5
61,52 0,956 6,29 0,65 10,89 3585,9 3,85 22,22
11(o) 57,47 0,769 8,16 0,77 12,09 3030,2 5,05 23,43 (n) e (o) se referem a corridas feitas com ácido tânico não-modificado e oxidado, respectivamente. AT se refere
ao teor de ácido tânico (não-modificado ou oxidado, em massa% de zeína). SA: solubilidade em água (massa%);
PVA: permeabilidade ao vapor de água (g.mm.kPa-1.h-1.m-2); RT: resistência à tração (MPa); ER: elongação na
ruptura (%); ME: módulo elástico (MPa); OP: opacidade (A.nm.mm-1); ΔL: diferença de luminosidade entre a
amostra e a referência branca; ΔE: diferença de cor entre a amostra e a referência branca.
58
Tabela 6 - Coeficientes de regressão para propriedades dos filmes com ácido tânico não
modificado
Termo PVA SA RT ER ME OP ΔL ΔE
Constante 0,943 60,41 6,66 0,68 11,03 3540,61 4,75 26,11
AT -0,072 -9,68 1,79 -0,33 2,01 386,42 1,97 5,21
pH -0,063 -8,47 1,09 0,31 -0,09 88,07 4,47 7,40
AT2 0,005 1,93 0,88 0,35 1,08 73,59 -0,15 -2,95
pH2 -0,031 0,36 1,27 0,15 0,14 167,94 3,18 5,04
AT,pH 0,037 2,71 0,55 -0,16 0,09 15,09 1,27 -1,63
R2(%) 78,39 91,30 97,07 87,64 97,15 76,64 95,72 86,59
F 3,63 10,50 33,16 7,09 34,08 3,28 22,35 6,46
P 0,09 0,01 <0,01 0,02 <0,01 0,11 <0,01 0,03 PVA: permeabilidade ao vapor de água; SA: solubilidade em água; RT: resistência à tração; ER: elongação na
ruptura; ME: módulo elástico; OP: opacidade; ΔL: diferença de luminosidade; ΔE: diferença de cor. Termos da
regressão e valores F em negrito são significantes (p < 0,05).
Tabela 7 - Coeficientes de regressão para propriedades dos filmes com ácido tânico oxidado
Termo PVA SA RT ER ME OP ΔL ΔE
Constante 0,781 58,21 8,56 0,78 11,11 3335,82 5,52 24,42
AT -0,085 -9,75 2,50 -0,37 2,19 475,70 1,34 2,16
pH -0,076 -5,19 1,40 0,08 1,56 -231,57 4,27 10,06
AT2 0,064 0,66 0,76 0,41 1,37 39,15 0,02 -1,66
pH2 0,022 -4,21 0,58 -0,04 1,02 570,57 2,71 6,00
AT,pH 0,034 0,10 0,15 -0,13 0,09 -94,96 1,50 1,90
R2(%) 96,98 87,21 87,61 86,57 87,32 87,06 85,23 78,14
F 32,16 6,82 7,07 6,45 6,89 6,73 5,77 3,58
P <0,01 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,04 0,09 PVA: permeabilidade ao vapor de água; SA: solubilidade em água; RT: resistência à tração; ER: elongação na
ruptura; ME: módulo elástico; OP: opacidade; ΔL: diferença de luminosidade; ΔE: diferença de cor. Termos da
regressão e valores F em negrito são significantes (p < 0,05).
59
Figura 13 - Curvas de contorno representando regressões para as propriedades dos filmes
contendo ATn.
Figura 14 - Curvas de contorno representando regressões para as propriedades dos filmes
contendo ATo.
60
4.2.2 Solubilidade em água e permeabilidade a vapor de água
A zeína por si só é capaz de produzir filmes razoavelmente resistentes à água devido
à sua relativa hidrofobicidade, como previamente demonstrado (CHO, LEE; RHEE, 2010).
Nesse estudo, o filme de zeína não modificado (corrida 5 na Tabela 5) apresentou solubilidade
em água de 80% após 24 horas de imersão, o que é comparável com valores reportados para
filmes de gelatina (PÉREZ-MATEOS, MONTERO; GÓMEZ-GUILLÉN, 2009; DENAVI et
al., 2009). A solubilidade em água dos filmes de zeína foi diminuída pelo aumento da
concentração de AT (Tabelas 6 e 7), corroborando Hager et al. (2012) e Peña et al. (2010) para
filmes de kafirina e gelatina, respectivamente. Este efeito suporta a ocorrência de interações
entre zeína e AT não-oxidado ou oxidado, desde que sugere diminuição da disponibilidade da
proteína por interação com a água (HAGER et al., 2012). O aumento de pH também diminuiu
significativamente a solubilidade em água para ambos ATn e ATo (Tabelas 6 e 7). A presença
de ATn ou ATo em quantidades em torno de 7% a pH 8 produziu valores de solubilidade em
água menores que 50% (Figuras 13 e 14), melhorando a aplicabilidade dos filmes sob condições
úmidas. Apesar de proteínas serem mais solúveis em pHs alcalinos (acima do ponto isoelétrico)
por causa do excesso de cargas de mesmo sinal, produzindo repulsão entre as moléculas e,
consequentemente, contribuindo para sua maior solubililidade (PELEGRINE; GASPARETTO,
2005), o desdobramento das proteínas devido ao aumento da repulsão eletrostática promove o
aumento de grupos funcionais disponíveis para reticulação induzida pelos compostos fenólicos
entre as moléculas de proteína (NUTHONG et al., 2009a). Por isso, o aumento do pH
provavelmente favoreceu a reticulação, diminuindo consequentemente a solubilidade dos
filmes.
Para ATn e ATo, os modelos de permeabilidade a vapor de água (PVA)
apresentaram termos significativos e negativos tanto para o teor de AT como para o pH (Tabelas
6 e 7), indicando uma tendência de diminuição com o aumento de AT em maiores valores de
pH, embora o modelo de PVA para ATn não tenha sido significativo (Tabela 6). Esses
resultados corroboram com os de solubilidade, indicando que maiores pHs e maior teor de AT
diminuem a afinidade dos filmes com a água. Provavelmente, o favorecimento da formação de
ligações cruzadas entre AT e proteína pelo aumento do pH colabora para a diminuição da
passagem de vapor de água devido à diminuição de espaços na estrutura da matriz. Nuthong et
al. (2009a) não conseguiram diminuição de PVA com o uso de AT em filme proteico de plasma
de porco, provavelmente por causa da baixa concentração utilizada (abaixo de 4%).
Emmambux, Stading e Taylor (2004) não obtiveram redução significativa de PVA com o uso
61
de AT como reticulante em filmes de kafirina sem modificação de pH, o que confirma que o
pH alcalino favoreceu a reticulação de zeína com AT, como explicado na análise de
solubilidade.
4.2.3 Propriedades Mecânicas
O aumento do teor de AT (ambos ATn e ATo) resultou em aumento de resistência
à tração e módulo elástico. A adição de 8% de AT resultou em aumentos na resistência à tração
de mais de 30% para filmes com ATn e quase 70% para filmes com ATo. Os aumentos no
módulo foram ainda mais evidentes para ambos os tipos de filmes (quase 70% para ATn e mais
de 80% para ATo). A elongação dos filmes, por outro lado, que foi muito pobre no filme não
modificado (em torno de 1%), foi ainda menor com AT. Estes resultados corroboram alguns
estudos (CAO; FU; HE, 2007; EMMAMBUX et al., 2004; HAGER et al., 2012 e PRODPRAN
et al., 2012, para filmes de gelatina, kafirina, glúten e proteína miofibrilar, respectivamente), e
são relacionados à restrição de mobilidade das cadeias resultante da reticulação, tornando os
filmes mais rígidos (HAGER et al., 2012). Nenhuma evidência foi encontrada de que o ácido
tânico apresente efeito plastificante em maiores concentrações, como reportado por Zhang et al
(2010) sobre filmes de gelatina.
Houve tendência de incremento da resistência à tração dos filmes com AT (ambos
ATn e ATo) e módulo dos filmes com ATo (Tabelas 6 e 7) com o aumento dos valores de pH,
resultados corroborados por Cao et al. (2007), que reportaram que a resistência à tração máxima
dos filmes de gelatina modificados com AT ocorreu em pH 9. Pode ser evidenciado pelas curvas
de contorno (Figuras 13 e 14) que houve aumento de resistência e módulo com o uso de AT
mesmo em valores baixos de pH. Porém, esses incrementos só são possíveis com maior teor de
AT (em geral a partir de 7%), o que indica que o uso de pHs alcalinos torna a reticulação com
AT mais eficiente, possibilitando a utilização de menor concentração. O AT em condições de
pH alcalino é exposto à oxidação a quinona (YI et al., 2011), então, mesmo nos filmes com AT
não modificado este pode ter sido oxidado em soluções com pH alcalino, favorecendo a
reticulação e aumento de resistência mecânica. A elongação dos filmes com ATn também foi
favorecida por maiores valores de pH, especialmente em baixo teor de ATn (Tabela 6, Figura
13), o que foi inesperado, mas pode estar relacionado à diminuição de interações eletrostáticas
acima do ponto isoelétrico da zeína (6,8, de acordo com CABRA et al., 2005).
62
4.2.4 Propriedades Ópticas
As propriedades ópticas também foram influenciadas pelas propriedades de
processamento. Maiores valores de pH resultaram em maiores valores de ΔL e ΔE (para os
filmes com ATn e ATo), significando que o aumento do pH contribui para mudanças em
luminosidade e cor, mas não mudanças de opacidade. Uma possível explicação para o aumento
de opacidade e intensidade de cor dos filmes em maior pH (durante a reação de reticulação em
pH básico ocorre escurecimento da solução de zeína), é a possível oxidação de pigmentos de
cor naturais como xantofilas e outros carotenoides presentes na zeína (SHUKLA; CHERYAN,
2001), pois algumas xantofilas são instáveis em meio alcalino (MELÉNDEZ-MARTÍNEZ;
VICÁRIO; HEREDIA, 2004). Maiores quantidades de AT também contribuem para mudanças
na cor do filme (para ATn) e perda de transparência (para ambos filmes com ATn e ATo),
corroborando com outros estudos que reportaram mudanças de cor e perda de transparência por
filmes de proteína reticulados com ácido tânico (HAGER et al., 2012, para glúten; NUTHONG
et al., 2009b, para proteína de plasma de porco; PEÑA et al., 2010, para gelatina; PRODPRAN
et al., 2012, para proteína miofibrilar do peixe).
4.2.5 FTIR e comparação entre filmes com ácido tânico não-oxidado e oxidado
A Figura 15 apresenta os espectros de FTIR de alguns filmes, apresentando algumas
bandas derivadas da estrutura da zeína, como amida A em 3288 cm-1, amida I em 1647 cm-1,
amida II em 1538 cm-1, e amida III em torno de 1242 cm-1 (BARTH, 2007). A banda amida A
foi ampliada na presença de AT, especialmente ATo em pH 9. Este aumento de banda foi
reportado também por outros autores (HE et al., 2011; MADHAN et al., 2005) como resultado
das interações de colágeno com procianidina e catequina, respectivamente. A banda amida III
se deslocou levemente para maiores frequências. Essas mudanças são relacionadas
provavelmente à formação de pontes de hidrogênio entre o componente fenólico e a matriz da
proteína (HE et al., 2011; MADHAN et al., 2005; ARCAN; YEMENICIOĞLU, 2013). A banda
em 1044 cm-1, relacionada ao estiramento C-O, foi aumentada em intensidade em presença de
AT, também indicando interação da zeína com o ácido fenólico (AEWSIRI et al., 2010;
AEWSIRI et al., 2013). A banda em 1450 cm-1, descrita como estiramento simétrico de grupos
COO- (YANG et al., 2010), foi mais evidente no espectro de filmes produzidos em pH 9
(tratamento 8 para ATn e ATo). A banda em 1406 cm-1 (estiramento C–N) se tornou mais
intensa em pH 9, possivelmente indicando uma quantidade maior de pontes amida devido a
63
interações zeína-AT (XING et al., 2014). Contudo, não foram encontradas evidências nos
espectros de FTIR para suportar a ocorrência de reticulação covalente.
Figura 15 - Espectros de FTIR de filmes produzidos em diferentes valores de pH com
diferentes concentrações de ATn ou ATo.
Tabela 8 - Médias e testes-t pareados para as propriedades dos filmes com ácido tânico não-
modificado (ATn) e oxidado (ATo).
Propriedades ATn Ato
Valor T p Média DP Média DP
PVA 0,924 0,104 0,843 0,117 3,59 0,005
SA 62,07 12,27 55,63 11,22 3,26 0,009
RT 8,23 2,21 9,53 2,82 -3,17 0,010
ER 1,040 0,530 1,044 0,516 -0,05 0,963
ME 11,92 2,01 12,85 2,85 -1,60 0,142
OP 3716 431 3829 696 -0,72 0,490
ΔL 6,96 5,23 7,50 5,02 -1,08 0,305
ΔE 27,63 10,37 27,57 12,06 0,02 0,981
DP: desvios padrão. SA: solubilidade em água (m%); PVA: permeabilidade a vapor de água (g.mm.kPa-1.h-1.m-2);
RT: resistência a tração (MPa); ER: elongação na ruptura (%); ME: modulo elástico (MPa); OP: opacidade
(A.nm.mm-1); ΔL: diferença de luminosidade entre a amostra e a referência branca; ΔE: diferença de cor entre a
amostra e a referência branca.
64
O espectro dos filmes com ATn e ATo foram similares, como também observado
por Aewsiri et al. (2010) para filmes de gelatina com ATn e ATo. Por outro lado, os resultados
dos testes t pareados (Tabela 8) sugerem que a interação de zeína com ATo foi provavelmente
mais forte que a interação com ATn, já que os filmes com ATo tiveram maior resistência média
à tração e menores valores de permeabilidade a vapor de água e solubilidade em água.
4.2.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A Figura 16 apresenta as imagens de MEV de alguns filmes que representam pontos
extremos do estudo com ATn e ATo. Todos os filmes apresentaram estruturas heterogêneas,
que também foram observadas por outros autores em filmes de zeína (PENA-SERNA; LOPES-
FILHO, 2013; LIANG et al., 2015), e podem ser associados à agregação de glóbulos de zeína
devido à exposição de superfícies hidrofílicas de zeína em presença de uma alta concentração
de etanol (KIM; XU, 2008). A ligação de glicerol nas regiões hidrofílicas sobre a superfície de
agregados de zeína possivelmente pode facilitar essa agregação pelo aumento da viscosidade
(PENA-SERNA; LOPES-FILHO, 2013). Ainda, a agregação de ácido oleico, que já tinha sido
observada anteriormente por outros autores utilizando etanol 80%, mesma concentração do
presente estudo (PENA-SERNA; LOPES-FILHO, 2013), também contribui para a
heterogeneidade dos filmes. Comparando os filmes em pH 6,5 com e sem AT, observa-se que
a presença de orifícios foi diminuída especialmente com a presença de ATo, indicando que este
favorece a continuidade do filme nesse pH em comparação com ATn. Esses resultados
condizem com os resultados para T6 (8% AT, pH 6,5, Tabela 5) de menor solubilidade e
pequeno aumento de RT e ME dos filmes com ATo em relação aos filmes com ATn.
Na comparação dos filmes com 4% de AT em pH 4 e pH 9, observamos que em pH
4 ocorre uma quantidade bem maior de perfurações ou orifícios ao longo do filme com pH 4
em relação ao de pH 9, o que explica que o filme em pH 4 seja mais quebradiço e corrobora
com os resultados das outras análises (Tabela 5), comprovando que o uso de pH 4 não favorece
a reticulação de zeína com AT. Os filmes com pH 9 são mais rugosos, provavelmente por causa
do maior pH favorecendo a oxidação do ácido tânico. Também foi reportado que o aumento da
rugosidade nos filmes de proteína foi promovido pela presença de ácido ferúlico oxidado
(ARABESTANI et al., 2016).
Comparando os filmes com ATn e ATo em pH 6,5 e especialmente em pH 9, os
filmes com ATo parecem mais ásperos, o que pode estar associado à agregação de proteínas
induzida pelas quinonas derivadas da oxidação do AT (NUTHONG et al., 2009b). Os filmes
65
produzidos com 4% de ATo em diferentes pHs (4 e 9) também são notavelmente diferentes,
sendo o último mais áspero, provavelmente porque o pH alcalino favorece a oxidação de AT.
A presença de poros nos filmes, mesmo sendo estes superficiais (não passam de um lado para
o outro do filme) favorece uma maior PVA, devido às diminuições localizadas (nos poros) de
espessura, o que pode explicar o aumento de permeabilidade em pH 4 e a diminuição não ter
sido tão expressiva em relação à diminuição de PVA em pH 9. A diferença de cor nas
micrografias dos filmes com AT indica que os componentes do filme, matriz e plastificantes,
se agregam de forma diferente em presença de AT e em diferentes pHs, provavelmente por
causa da diferença da carga da zeína em pHs acima ou abaixo de seu ponto isoelétrico, alterando
sua forma de interação com o ácido tânico.
Figura 16 - Imagens de MEV de filmes produzidos em diferentes valores de pH com diferentes
concentrações de ATn ou ATo (magnificação de 500 x).
4.2.7 Propriedades Térmicas
As degradações térmicas da zeína na sua forma nativa (pó), do ácido tânico em pó,
e de filmes de zeína são apresentadas nas Figuras 17 e 18, respectivamente, através das curvas
de termogravimetria (TGA) e da primeira derivada de cada curva (DTG, do inglês derivative
thermogravimetry); a Tabela 9 resume algumas informações das temperaturas de degradação.
66
Figura 17 - Curvas de TGA e da primeira derivada (DTG) para a zeína em pó e para o ácido
tânico em pó, respectivamente.
Figura 18 - Curvas de TGA para filmes de zeína.
Primeira linha: T5 (0% AT, pH 6,5), T6 (8% AT, pH 6,5), T7 (4% AT, pH 4), T8 (4% AT, pH 9) e curvas da
primeira derivada (DTG), respectivamente. Segunda linha: T5 (0% AT, pH 6,5), T6ox (8% AT, pH 6,5), T7ox
(4% AT, pH 4), T8ox (4% AT, pH 9) e curvas da primeira derivada (DTG), respectivamente.
Observamos na Figura 17 que a degradação da zeína e do ácido tânico ocorrem em
maior intensidade entre 250 e 350 °C. Ocorre pequena perda de massa em torno de 100 °C,
relacionada à evaporação de água e de compostos voláteis (NEO et al., 2013; XIA et al., 2015).
A temperatura que dá a maior razão de perda de massa no termograma de DTG é considerada
a temperatura de degradação (Td) do composto (YOKSAN; JIRAWUTTHIWONGCHAI;
ARPO, 2010). A curva de DTG da zeína revelou Td em 307,6°C (valor próximo ao encontrado
por Magoshi et al., 1992, de 320°C) e a curva do ácido tânico apresenta inflexão em 275 e
67
306,6°C, mostrando que o ácido tânico apresenta degradação inicial um pouco maior que a
zeína. Porém, após a Td, o AT mantém uma taxa de perda de massa menor que a zeína,
demonstrando possuir maior estabilidade térmica.
Pode ser visto na Figura 18 e na Tabela 9 que os filmes de zeína apresentaram
comportamento térmico similar ao da zeína pura, porém com valores menores de Td, por causa
do efeito dos solventes e plastificantes. Observa-se deslocamento das curvas de DTG dos picos
dos filmes de zeína com AT para menores temperaturas em relação ao filme de zeína (T5), o
que mostra que filmes de zeína reticulados apresentam início de degradação com maior perda
de massa inicial (T80%), além de menor Td (Tabela 9), especialmente dos tratamentos T7, T7ox,
T8 e T8ox, devido à presença de AT. O aumento inicial do evento de perda de água nos filmes
com AT ocorre porque o ácido tânico possui muitos grupos hidroxila que podem interagir com
água, e a reticulação aumenta o número de pontes de hidrogênio (SIONKOWSKA et al., 2015);
esse fato explica a menor estabilidade inicial.
Tabela 9 - Temperaturas de degradação de filmes de zeína reticulados com ácido tânico em
diferentes pHs
Amostras Temperatura (°C)
T80% Td T20%
Zeína pura 294,3 307,6 457,1
AT puro 265,8 306,6 *acima de 500
T5 (0% AT, pH 6,5) 262,1 308,7 401,3
T6 (8% AT, pH 6,5) 260,0 302,8 482,3
T7 (4% AT, pH 4) 240,3 286,3 408,9
T8 (4% AT, pH 9) 255,3 286,8 471,3
T6ox (8% AT, pH 6,5) 253,5 306,8 450,3
T7ox (4% AT, pH 4) 247,5 310,4 397,3
T8ox (4% AT, pH 9) 235,5 277,5 421,8
T80%: resta 80% da massa inicial; T20%: resta 20% da massa inicial. *O AT se manteve com 29% da sua massa
inicial a 500°C, que foi a temperatura máxima utilizada.
Porém, observa-se que os tratamentos T6, T6ox, T8 e T8ox apresentaram maiores
temperaturas T20%, indicando que o AT aumentou a estabilidade térmica dos filmes,
provavelmente devido à eficiência da formação de ligações cruzadas nessas condições. Esse
resultado corrobora com o encontrado por Auriemma et al. (2015) em que o AT mostra efeito
positivo na estabilidade térmica de PHB, prolongando o processo de degradação térmica a
tempos maiores. T7 e T7ox apresentaram menores temperaturas, confirmando que o uso de pH
4 não favorece a reticulação de filmes de zeína com AT. De forma geral, verifica-se que filmes
com ATo mostraram maior Td (T6ox e T7ox), porém menor T20%, o que sugere que a oxidação
68
do AT não foi eficiente para melhorar a estabilidade térmica da zeína em comparação com o
AT não-oxidado. Comprova-se que o uso de AT pode ser vantajoso por conferir maior
estabilidade térmica (XIA et al, 2015).
Os termogramas de DSC para filmes de zeína com AT oxidado ou não em diferentes
pHs estão expostos na Figura 18 e os valores de temperatura de transição vítrea (Tg) na Tabela
10, em que Tg é a temperatura média entre o início e o fim da mudança na linha de base.
Figura 19 - Curvas de DSC para filmes de zeína.
T5 (0% AT, pH 6,5), T6 (8% AT, pH 6,5), T7 (4% AT, pH 4), T8 (4% AT, pH 9) e T9 (4% AT, pH 6,5), com AT
não-oxidado e oxidado, respectivamente. Termogramas do segundo ciclo.
Tabela 10 - Temperaturas de transição vítrea de filmes de zeína obtidas por DSC.
Amostras Temperatura de transição vítrea (°C)
Sem AT AT não-oxidado AT oxidado (ox)
Zeína pura 170,0 - -
T5 (pH 6,5) 79,6 - -
T6 (8% AT, pH 6,5) - 89,2 82,3
T7 (4% AT, pH 4) - 86,0 82,9
T8 (4% AT, pH 9) - 100,9 102,2
T9 (4% AT, pH 6,5) - 88,7 87,9
A Tg de zeína é 170 °C e a de filmes de zeína é na faixa de 80°C, valor similar ao
encontrado por Gu et al., 2013 e Chen; Ye e Liu (2014). Esta é diminuída em filmes de zeína
devido aos efeitos de plastificação dos solventes e do glicerol. Os filmes analisados
apresentaram transição vítrea na faixa entre 75 e 120°C. Verifica-se que houve um
deslocamento da faixa de Tg dos filmes com ATn e ATo para maiores temperaturas em relação
ao filme sem AT (T5) e Tg maior do que a encontrada por Gu et al. (2013), que foi de 70°C.
Esse pequeno aumento de Tg, principalmente de T8 e T8ox, se deve provavelmente ao aumento
de resistência mecânica e de rigidez dos filmes de zeína reticulados. Comparando os filmes com
69
ATn em relação aos filmes com ATo, pode ser observado que não houve mudanças expressivas
na Tg dos filmes. O aumento de Tg, especialmente com o uso de AT em pH 9, confirma que
houve interação positiva entre AT e a matriz de zeína, com diminuição de mobilidade
molecular, corroborando com os resultados de aumento de resistência à tração e de módulo
elástico. Emmambux; Stading e Taylor (2004) e Weng e Qiu (2014) também encontraram
incremento dos valores de Tg com o uso de AT devido à interação deste com a matriz.
4.3 Etapa 3 - Efeito da funcionalização com UV/ozônio e antimicrobiano catiônico
(nisina) sobre filmes de zeína reticulados com ácido tânico
4.3.1 Efeito do UV/Ozônio sobre propriedades físicas de filmes de zeína
A Figura 20 mostra os resultados das análises de solubilidade, PVA, propriedades
mecânicas e ângulo de contato dos filmes expostos a UVO entre 0 e 150s. É possível observar
que houve aumento considerável de solubilidade em água (de quase 30%), com valor máximo
no filme tratado com 120s de UVO, e aumento da PVA dos filmes com o aumento do tempo de
exposição à UVO. Esses resultados indicam que houve aumento de hidrofilicidade da superfície
com o tratamento UVO. Embora tenha ocorrido aumento de PVA, esse aumento não foi
expressivo (de 0,9 para 1,1 g.mm.kPa-1.h-1.m-2), indicando que a permeabilidade não foi afetada
expressivamente. No caso da solubilidade, o contato do filme com superfície mais hidrofílica
direto com a água pode facilitar a penetração (ou difusão) de água na estrutura, aumentando a
solubilidade.
O aumento de hidrofilicidade da superfície dos filmes pode ser comprovado com a
análise de ângulo de contato, pela diminuição do ângulo com o aumento do tempo de UVO.
Esta diminuição do ângulo indica maior afinidade da água com a superfície do filme devido à
formação de cargas negativas na superfície (compostos COO-), resultado semelhante ao
encontrado por Shi; Kokini e Huang (2009) na oxidação da superfície de filmes de zeína.
Verifica-se que esta diminuição se estabiliza a partir de 120s, indicando que este tempo é
suficiente para a oxidação da superfície. Por isso, o tempo de 120s foi escolhido como tempo
ideal de tratamento para ser estudada a adsorção com nisina, além de caracterização química e
morfológica para comparação. Shi; Kokini e Huang (2009) avaliaram os tempos de exposição
a UVO de 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180s e verificaram que o ângulo de contato também se
estabiliza a partir de 120s.
70
As propriedades mecânicas de resistência à tração, elongação na ruptura e módulo
elástico não foram modificadas de forma expressiva pelo tratamento UVO, o que sugere que
esta modificação tem caráter superficial, não afetando a estrutura mais interna da matriz do
filme, ou seja, que a alteração não resultou em modificação das propriedades mecânicas. Essa
característica de manutenção das características mecânicas é importante para que a utilização
do tratamento UVO seja viável.
Figura 20 - Propriedades físicas de filmes de zeína submetidos a diferentes tempos de
exposição em UVO.
4.3.2 FTIR de filmes tratados com UVO e nisina
Os espectros obtidos por FTIR dos filmes oxidados por UVO nos tempos de 0, 60
e 120s, sem nisina e com nisina estão apresentados na Figura 21. Podem ser observadas bandas
características de proteínas em todos os espectros, especialmente da zeína, como amida A em
3288 cm-1, amida I em 1647 cm-1, amida II em 1538 cm-1, e amida III em torno de 1239 cm-1
(BARTH, 2007, WANG et al., 2013). De forma geral, os espectros dos filmes com e sem nisina
se mostraram semelhantes entre si, apresentando as mesmas bandas de absorção.
71
Analisando os espectros dos filmes sem nisina, foi percebido que, com o aumento
do tempo de exposição ao UVO, não houve o aparecimento de uma banda referente ao
estiramento assimétrico da carbonila do grupo carboxilato (-COO-) que se encontra entre 1650-
1550 cm-1, como esperado pela formação dessas cargas devido ao tratamento UVO. Mesmo
sendo demonstrado que a banda da Amida I, referente ao estiramento da carbonila da ligação
peptídica (-CONH-), se encontra dentro dessa faixa, não houve um aumento da intensidade
desta banda quando a banda da Amida II, referente à deformação angular da ligação N-H da
ligação peptídica, foi utilizada como padrão interno (ou referência).
Figura 21 - Espectros de FTIR de filmes tratados com diferentes tempos de UVO com e sem
nisina.
Pode ser percebido na Figura 21 dos filmes com nisina, que estes espectros são
semelhantes com os espectros dos filmes sem a presença da nisina. Como a zeína e nisina são
proteína e peptídeo, respectivamente, é difícil determinar as bandas especificas de cada
componente, visto que as bandas destas duas macromoléculas são parecidas (BERNELA et al.,
2014; WANG et al., 2013).
O fato de estes espectros serem semelhantes pode ter sido pela forma de tratamento
do filme e o método realizado para as análises do FTIR, podendo ser levados em conta que: os
filmes foram expostos sob UVO por no máximo de 2 min, o que proporciona a oxidação
somente da superfície, e não de toda a matriz do filme, como mostrado pela manutenção das
propriedades mecânicas; deve ser observado que a análise de FTIR por ATR requer altas
pressões, o que faz com que a radiação de infravermelho penetre mais o interior do filme do
que a superfície. Isso explicaria porque não foi possível observar processos oxidativos nos
72
espectros de FTIR. A análise de XPS pode auxiliar na confirmação da modificação pelo
tratamento UVO e na verificação da presença de nisina na superfície.
4.3.3 Espectroscopia de Fotoelétrons de Raios-X (XPS – X-Ray Photoelectron
Spectroscopy)
4.3.3.1 Modificação da superfície com UV e Ozônio (UVO)
A técnica de XPS foi utilizada para investigar modificação da superfície de filmes
de zeína expostos a UV e ozônio (UVO) e imersos em nisina, através da verificação da
composição elementar e de grupos funcionais presentes na superfície. Os resultados da
composição de filmes expostos a diferentes tempos de tratamento com UVO estão resumidos
na Tabela 11.
Tabela 11 - Composição elementar da superfície de filmes de zeína com ácido tânico
submetidos a diferentes tempos de exposição em UVO com e sem nisina a partir de espectros
de varredura de XPS.
Tempo
de
UVO
Composição elementar
C (%) O (%) N (%) S
(%)
O/C N/C S/C
0 85,20±0,31a 10,16±0,25a 0,93±0,09a - 0,1192 0,0109 -
60 83,44±0,54a 11,05±0,26a 1,91±0,08b - 0,1324 0,0229 -
120 80,99±0,58b 12,56±0,18b 2,60±0,43b - 0,1551 0,0321 -
0s +
Nis 76,31±0,14c 15,17±0,40c 6,89±0,19c 0,53 0,1988 0,0903 0,0069
60s +
Nis 77,01±1,56c 15,49±0,46c 6,88±0,44c 0,46 0,2011 0,0893 0,0060
120s +
Nis 75,63±0,30c 15,18±0,12c 7,92±0,16d 0,59 0,2007 0,1047 0,0078
Médias seguidas de mesma letra minúscula na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Os resultados mostram que as superfícies de todos os filmes de zeína são compostas
principalmente de carbono (C), nitrogênio (N) e oxigênio (O), assim como a maioria das
proteínas (KARAM et al., 2013; KAYACI; UYAR, 2012; SHI et al., 2009). Foram encontrados
nas superfícies teores de C superiores e teores de N inferiores aos encontrados por Shi et al.
(2009), provavelmente devido à possível presença de ácido tânico (C76H52O46) e plastificantes
glicerol (C3H8O3) e ácido oleico (C18H34O2) na superfície, compostos que não apresentam o
elemento N. Pode ser observado que durante o tratamento UVO, o teor de C diminuiu, enquanto
o teor de O aumentou significativamente com o aumento do tempo de exposição a UVO (120
73
s), resultado semelhante ao encontrado por Shi et al. (2009) para filmes de zeína tratados com
UVO. Para esclarecer melhor o mecanismo de aumento do teor de oxigênio, espectros de XPS
de alta resolução foram realizados do carbono 1s de filmes de zeína, como mostra a Figura 22.
Na Figura 22 podem ser observados três componentes em todos os espectros de alta
resolução do carbono 1s: Pico C1s A, localizado em torno de 284,8 eV, com energia de ligação
característica de carbonos alifáticos (C–H e/ou C–C); Pico C1s B, em torno de 285,9 eV, do
carbono C-OH; e Pico C1s C, em 288 eV, correspondente ao carbono relacionado a COOH.
Esses três picos foram similares aos encontrados por Shi; Kokini e Huang (2009) em filmes de
zeína e por Kayaci e Uyar (2012) na superfície de fibras de zeína. A área de cada pico, que
corresponde à composição de cada pico de carbono relevante, foi calculada por ajuste para uma
função gaussiana e estão resumidos na Tabela 12. Os resultados de alta resolução de C1s
indicam que o tratamento com UVO promoveu o aumento do pico C que representa –COO de
6,59% em 0s para 8,85% em 120s, enquanto a composição do pico A (–C–H, –C–C), diminuiu
de 87,25 em 0s para 82,90% em 120s, comprovando que o aumento do teor de oxigênio se deve
principalmente à formação de –COOH na superfície de filmes de zeína, resultado semelhante
ao encontrado por Shi et al. (2009). Os resultados de XPS comprovam que a utilização de
tratamento UVO na superfície de filmes de zeína reticulados com ácido tânico promove a
oxidação dos grupos funcionais da superfície, com formação de –COO-, formando filme com
cargas negativas que podem favorecer a ligação de compostos catiônicos de interesse na
superfície. Shi et al. (2009) retificam que a modificação no filme é somente superficial, o que
também pode ser reforçado pela análise de FTIR, que não mostra mudanças relevantes nos
compostos funcionais dos filmes de zeína, mas indica também oxidação da superfície por UVO.
O método de utilização de UVO mostrou ser eficiente na oxidação da superfície de
filmes de zeína reticulados com ácido tânico, possibilitando facilitar a ligação de compostos de
interesse na superfície que tenham afinidade com cargas negativas para aplicação em alimentos,
como compostos antimicrobianos catiônicos.
74
Figura 22 - Espectros de XPS de alta resolução do carbono 1s de filmes de zeína tratados
usando tempos de exposição a UVO de 0, 60 e 120s.*
*Os picos são obtidos a partir de deconvolução de três funções Gaussianas.
Tabela 12 - Composição do carbono 1s de filmes de zeína tratados com diferentes tempos de
exposição a UVO. *
Tempo de
UVO (s)
Composição e energia de ligação de sinais de C 1s
C–C, C–H –C–OH –COOH
0 87,25% (284,8 eV) 6,16% (285,9 eV) 6,59% (288,0 eV)
60 83,33% (284,8 eV) 8,45% (285,9 eV) 8,22% (288,0 eV)
120 82,90% (284,8 eV) 8,24% (286,2 eV) 8,85% (288,0 eV)
*Os resultados foram ajustados de espectros de carbono 1s de XPS de alta resolução usando três funções
Gaussianas.
4.3.3.2 Interação da nisina na superfície de filmes de zeína
Os resultados da composição dos filmes imersos em solução de nisina (Nis) para
verificar se houve adsorção de nisina na superfície de filmes de zeína tratados ou não com UVO
estão dispostos na Tabela 11. A melhor forma de verificar se a nisina se ligou ou não aos filmes
75
é pela comparação do teor de nitrogênio, já que a nisina (C143H230N42O37S7) é um peptídeo, e,
portanto, contém teor considerável desse elemento químico, enquanto os outros compostos que
fazem parte da amostra, como o reticulante ácido tânico e os plastificantes, não contém esse
elemento. Comparando os teores de N dos filmes sem nisina e com nisina (Tabela 11), observa-
se que houve aumento significativo em todos os filmes com nisina, de 0,93% a 2,60% para
6,88% a 7,92%, indicando que houve adsorção de nisina na superfície de filmes de zeína.
A adsorção de nisina mesmo sem a oxidação da superfície nos filmes não tratados
com UVO (0s UVO + Nis), pode ser explicada pela estrutura anfifílica da zeína (WANG et al.,
2004), que contém resíduos de aminoácidos hidrofílicos em sua estrutura, apesar de possuir
mais aminoácidos hidrofóbicos não-polares que hidrofílicos (NONTHANUM; LEE; PADUA,
2013; PALIWAL; PALAKURTHI, 2014). A imersão dos filmes em solução de nisina
solubilizada em solução de ácido clorídrico diluído (HCl 0,01 M) pode ter facilitado a exposição
dos resíduos hidrofílicos presentes na zeína, facilitando a interação entre a nisina e os filmes. A
adsorção de nisina a superfícies hidrofílicas por interações eletrostáticas foi previamente citada
(BOWER et al., 1995b), entretanto, partes não-polares na nisina podem ter se ligado à zeína
por interações hidrofóbicas, o que corrobora com à ligação de nisina a filmes de polietileno,
mesmo sem modificação (KARAM et al., 2013), pois a nisina possui caráter anfifílico, com um
conjunto volumoso de resíduos hidrofóbicos na extremidade N-terminal e resíduos hidrofílicos
na extremidade C-terminal (VAN DE VEN et al., 1991).
Comparando os tratamentos com UVO e nisina, verifica-se que houve aumento do
teor de nitrogênio de 6,89% significativo no filme com 0s +Nis para 7,92% no filme com 120s
+ Nis, e também aumento na proporção N/C, indicando que houve aumento do teor de nisina
adsorvido na superfície do filme. Esse aumento de nisina adsorvida também pode ser indicado
pelo pequeno aumento do teor de enxofre, presente na molécula de nisina, e da proporção S/C
no tratamento 120s. Verifica-se que o tratamento com 60s de UVO não promove o aumento da
proporção N/C e S/C, sendo o tratamento com 120s mais adequado para aumentar a quantidade
de nisina adsorvida na superfície. Provavelmente, a quantidade de cargas negativas criadas pelo
tratamento UVO presentes no filme 60s não foram suficientes para aumentar a atração
eletrostática com as cargas positivas da nisina. Karam et al. (2013) também obtiveram adsorção
de nisina em filmes de polietileno (hidrofóbicos), otimizada após tratamento da superfície dos
filmes para torná-los hidrofílicos (plasma).
76
4.3.4 Microscopia Eletrônica de Varredura
A Figura 23 apresenta as imagens de MEV de filmes que representam os principais
pontos do estudo com UVO e nisina. Todos os filmes apresentaram alguns poros superficiais,
em maior ou menor quantidade, assim como obtido na etapa 2, do estudo da reticulação da zeína
com AT, os quais foram relacionados com a evaporação do etanol durante a secagem do filme,
e pequenos aglomerados (pontos brancos) que podem ser atribuídos à zeína não-solubilizada
(PENA-SERNA; LOPES-FILHO, 2013). A presença de poros superficiais também foi
observada por Gu et al. (2013) em filmes de zeína. O filme tratado com 120s UVO apresentou
estrutura semelhante à do filme não-tratado com UVO.
Comparando os filmes com e sem Nis, pode ser vista maior presença de orifícios
nos filmes que foram imersos em solução de nisina, assim como o aumento de linhas que
indicam pequenas fraturas na superfície. Este aumento de falhas pode ser atribuído à exposição
dos filmes em solução composta em grande parte por água (HCl 0,01 M), já que a zeína se
solubiliza em parte em água, com solubilidade maior que 55%, que se potencializa ainda mais
após o tratamento com UVO por 120s, como mostrado na Figura 20. Apesar de ser verificado
este aumento de falhas superficiais, pode ser observado que estrutura do filme foi mantida, sem
comprometimento da integridade do filme após a adsorção com nisina. Ao comparar os filmes
com 0s UVO + Nis e 120 UVO + Nis pode ser visto que estes são semelhantes, embora o filme
120s UVO apresente mais pontos brancos, que podem ser atribuídos à presença de pequenos
aglomerados de nisina na superfície, como encontrado por Imran et al. (2014) em filmes de
hidroxipropilmetil-celulose (HPMC) e quitosana com nisina.
77
Figura 23 - Imagens de MEV de filmes tratados com UVO e/ou nisina.
4.3.5 Microscopia de Força Atômica (AFM)
A técnica de AFM tem se tornado uma técnica fundamental no campo da ciência da
superfície e ciência biomédica (STYLIANOU; ALEXANDRATOU, 2014); é uma ferramenta
muito poderosa e sua maior vantagem sobre a microscopia óptica convencional e eletrônica é
sua habilidade de oferecer resolução molecular/submolecular sem tratamento especial
(MORRIS; KIRBY, 2008). As imagens topográficas dos filmes obtidas por AFM podem ser
observadas na Figura 24. Pode ser observado que o filme sem nenhum tratamento (0s UVO)
apresentou matriz contínua e superfície com topografia não uniforme e com presença de linhas
formadas provavelmente no processo de secagem, assim como o filme 120s UVO. Essas linhas
podem ser comparadas com as linhas vistas na análise de MEV do filme 0s UVO, e podem ser
também atribuídas ao processo de obtenção por casting. É possível que os aglomerados ou
regiões mais volumosas presentes (cor branca) ocorram devido à presença de glicerol (LIANG
et al., 2015) ou aglomerados de zeína, que podem estar na superfície do filme, como mostram
as imagens de MEV (Figuras 11, 16 e 23). De acordo com Liang et al. (2015), as ligações de
78
glicerol a pontos hidrofílicos sobre a superfície de agregados de zeína podem facilitar a sua
agregação pelo aumento de viscosidade na superfície.
Figura 24 - Imagens de Microscopia de Força Atômica de filmes de zeína tratados com UVO
e imersão em solução de nisina.
O filme tratado com 120s UVO apresenta superfície mais rugosa que o 0s UVO,
resultado consistente com os encontrados anteriormente por outros autores, que obtiveram
superfície dos filmes mais rugosa em filmes de zeína mais hidrofílicos (GEZER et al. 2015;
SHI et al., 2009; WANG et al, 2004). De acordo com Shi et al. (2009), a rugosidade depende
do resultante de cargas da superfície, pois as moléculas de zeína podem se alinhar
perpendicularmente para obter maior estabilidade, resultando em maior rugosidade da
superfície, o que ocorre com superfície mais polar, ou mais hidrofílica. A altura do relevo do
filme 120s UVO teve uma pequena diminuição em relação a 0s UVO, a qual pode ser atribuída
somente ao acaso da região analisada, devido ao maior preenchimento das reentrâncias na parte
escolhida para análise, que diminui o valor entre os máximos e mínimos de altura. De forma
geral, o tratamento com UVO por 120s não muda a estrutura dos filmes de zeína.
Os filmes 0s e 120s UVO funcionalizados com nisina apresentaram superfície mais
lisa que os filmes sem nisina, embora possa ser notada a presença de poros, a qual também é
observada em filmes de zeína por Biswas et al. (2009) pela técnica de AFM. Estes poros ou
falhas observados na superfície de filmes funcionalizados com nisina podem ter ocorrido devido
à solubilização de parte da matriz de zeína na solução de nisina, o que pode explicar também a
79
superfície mais lisa em comparação com os filmes sem Nis, e os pequenos relevos brancos
presentes no filme com Nis podem ser devido a aglomerados de zeína ou de nisina na superfície,
assim como explicado na análise de MEV.
4.3.6 Atividade antimicrobiana - Método de difusão em ágar
A nisina possui um amplo espectro especialmente para bactérias gram-positivas
(IMRAN et al., 2014), então os microrganismos Staphylococcus aureus e Listeria
monocytogenes foram escolhidos para testar sua eficácia, além da levedura Saccharomyces
cerevisiae para avaliar tendência de inibição de fungos. Os resultados de atividade
antimicrobiana pelo teste estão dispostos na Figura 25. Pode ser observado que não houve
formação de halo para S. aureus e L. monocytogenes, porém, houve inibição de crescimento
microbiano sob a superfície de todos os filmes, mesmo o filme 1 (sem Nis), indicando que a
inibição pode ou não ser associada à presença de nisina na superfície dos filmes. É possível que
presença do AT em todos os filmes tenha contribuído para o efeito de inibição no contato nos
filmes avaliados, como relatado por Ünalan et al. (2013), que mostram atividade antimicrobiana
de compostos fenólicos. O mesmo comportamento foi observado nos filmes para S. cereviseae.
Ou seja, o teste realizado não mostra se houve efeito antimicrobiano atribuído à funcionalização
dos filmes com nisina, já que a inibição na região de contato com o filme ocorreu também para
os filmes sem nisina, provavelmente por efeito do ácido tânico presente em todos filmes.
O estudo de Karam et al. (2013) mostrou que os filmes de polietileno com adsorção
de nisina na superfície estudados também não apresentaram formação de halo para Listeria
innocua, porém houve inibição sob a superfície e em torno do filme somente nos filmes com
nisina, o que indica que a adsorção de nisina na superfície proporcionou filmes com atividade
antimicrobiana. Provavelmente, a adsorção de nisina na superfície dos filmes de zeína não
permite que haja dessorção no meio. Esta dessorção depende muito do tipo de interação da
nisina com a matriz e da matriz utilizada, como mostrado por Imran et al. (2014), em que o
filme de poliácido láctico (PLA) apresentou inibição somente sob os filmes devido à sua
natureza hidrofóbica e à sua alta capacidade de retenção de nisina, ao contrário do observado
pelos autores em filmes de quitosana e HPMC, em que houve formação de halo de inibição.
80
Figura 25 - Atividade antimicrobiana de filmes de zeína controle (1) e expostos à solução de
nisina 10000 UI/mL (2, 3, 4 e 5) contra (a) L. monocytogenes e (b) S. aureus em placas com
ágar Mueller-Hinton, e (c) S. cereviseae em placas com ágar Batata Dextrose.
1 – controle (0s UVO e sem Nis), 2 – 0s UVO com Nis, 3 – UVO 60s com Nis, 4 – UVO 120s com Nis, 5 – UVO
150s com Nis
4.4 Etapa 4 – Revestimentos de zeína na preservação de goiabas
4.4.1 Análise de sobrevivência
Estudos de análise de sobrevivência são utilizados quando se tem interesse em saber
o intervalo de tempo até a ocorrência de determinado evento (TEIXEIRA, FAERSTEIN,
LATORRE, 2002), porém levando-se em conta que pode haver censura, ou seja, quando ocorre
interrupção de forma que não é possível observar o evento. Por exemplo, na análise de um
agente que promova o amarelecimento da casca de frutos, em que foram observados os tempos
para o desenvolvimento da cor amarela até 15 dias, pode-se dizer que os frutos que não
chegaram à cor amarela até 15 dias foram censurados. Como o interesse principal desse trabalho
é verificar o efeito de aumento de vida útil com o uso de revestimentos de zeína em goiabas, a
análise de sobrevivência é uma importante ferramenta. A Tabela 13 mostra os resultados de
tempo em que ocorrem dois eventos que foram observados durante o armazenamento: o tempo
em que as frutas atingiram o estádio de cor amarela, e o tempo em que as frutas foram
81
descartadas devido à presença de danos, fungos ou podridão em proporção acima do aceitável,
pela aparência.
Tabela 13 - Dados de sobrevivência (média e intervalo de confiança) de goiabas revestidas e
não revestidas armazenadas a 23°C.
Tratamento
Evento observado (dias)
Amadurecimento total
(cor amarela)
Descarte por presença de
danos, fungos ou podridão
Média + IC Média + IC Δ (%)
Controle 6,64 ± 1,01 9,46 ± 0,90 a -
Z -* 13,04 ± 1,02 b 37,9
ZR -* 12,46 ± 0,79 b 31,7 Z: revestimento de zeína, ZR: revestimento de zeína reticulada com AT; Δ: variação (% a mais) em relação ao
controle. Médias seguidas de mesma letra minúscula na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05). * indica que a observação foi interrompida antes de ocorrer o evento (os tratamentos Z e ZR não
chegaram à cor amarela).
Os resultados da Tabela 13 mostram que o uso de revestimentos Z e ZR foram
eficientes em aumentar o tempo até as goiabas chegarem à cor amarela e também o tempo até
o descarte dos frutos. Pode ser visto que o aumento de tempo até o descarte dos frutos foi
significativo para Z e ZR, com aumento de 37,9% de Z em relação a C, e de 31,7% de ZR em
relação a C. Isso significa que o uso de revestimentos de zeína implica em aumento importante
da vida útil de goiabas vermelhas, de pelo menos 4 dias, ou seja, um terço a mais de vida útil
para consumo. Os tratamentos Z e ZR não diferiram significativamente entre si, porém somente
os estudos de suas propriedades físicas e químicas serão capazes de esclarecer se os
revestimentos são similares quanto aos atributos de qualidade dos frutos e se proporcionam
manutenção da qualidade em relação aos frutos sem revestimento, o que será apresentado nos
tópicos posteriores.
A mudança de cor é um indicador natural de maturação (FORATO et al., 2015).
Em relação ao evento de amadurecimento, deve-se destacar que todos os frutos revestidos Z e
ZR foram descartados antes que se completasse o evento (antes de chegarem a cor amarela -
nota 5), por presença de podridão ou fungos, tendo sido descartados com cor verde-amarelada
(nota 3), verde-clara (nota 2), ou cor amarelo-esverdeada (nota 4). Entre os frutos com
revestimento Z, 50% deles foram descartados com nota 3, 8,3% com nota 4, e o restante se
manteve entre 1 e 2 até o descarte. Já entre os frutos com revestimento ZR, 45,8% foram
descartados com nota 3, 12,5% com nota 4 e o restante foi descartado ainda com notas 1 e 2.
Então, a partir dos dados obtidos, pode-se deduzir que os frutos revestidos demoram
mais de 12 dias para chegarem à cor amarela. Esse resultado é interessante, pois, o estádio 2
(cor verde-clara) corresponde à maturidade fisiológica, o estádio 3 (cor verde-amarelada), que
82
é o início de desenvolvimento da cor amarela, precisa ser comercializado rapidamente, pois
apresenta curto período de vida útil, o estádio 4 (cor amarelo-esverdeada) precisa ser
comercializado o mais breve possível e o estádio 5 (cor amarela) é normalmente destinado à
indústria (CAVALINI et al., 2006). Isso significa que o uso de revestimento é vantajoso, pois
mantém a fruta por mais tempo em estádio de maturação conveniente para a comercialização,
com aumento de até seis dias em relação ao controle. Porém, os revestimentos não foram
eficientes para impedir o desenvolvimento de danos físicos como a presença de manchas
escuras e na maioria dos casos de censura a presença de patógenos, especialmente fungos, a
partir de 12 dias de armazenamento. De acordo com Barkai-Golan (2001), as doenças pós-
colheita podem ser divididas em dois tipos: as típicas, causadas por patógenos que infectam os
frutos após a colheita, geralmente através de ferimentos; e as quiescentes, causadas por
patógenos que infectam o fruto antes da colheita, mesmo sem ferimentos, permanecendo
latentes até a maturação. Os principais patógenos que causam podridões pós-colheita em
goiaba, como Colletotrichum gloeosporioides, C. acutatum, Guignardia psidii e Fusicoccum
sp., pertencem à categoria de doenças quiescentes, embora patógenos pós-colheita comuns,
como os dos gêneros Rhizopus e Pestalotia, também ocorram (Barkai-Golan, 2001; Amaral et
al., 2006). Isto quer dizer que é possível que os frutos utilizados no estudo pudessem estar
infectados antes da colheita, não sendo possível o efeito dos revestimentos nesse caso em
proteger o fruto contra danos e contaminação.
Outras análises são necessárias para esclarecer se os revestimentos impedem
somente a mudança de cor da casca, ou se também retardam as mudanças bioquímicas que
caracterizam o amadurecimento, que podem ser observadas pela diminuição de firmeza,
aumento de sólidos solúveis totais, dentre outros atributos. Também é importante avaliar se os
revestimentos provocam condições de estresse ou impedem o desenvolvimento completo do
fruto, o que será apresentado mais a frente nos resultados do metabolismo oxidativo enzimático.
4.4.2 Atividade respiratória e taxa de produção de etileno
A goiaba é um fruto considerado climatérico com elevada atividade respiratória e
alta taxa de produção de etileno, o que leva a um rápido processo de senescência em temperatura
ambiente. A Figura 26 mostra a atividade respiratória e taxa de produção de etileno dos frutos
revestidos com Z e ZR em comparação com o controle. Foram obtidas médias entre 47,7 e
150,9 mg.kg-1.h-1 de CO2, ou entre 30 e 100 mL.kg-1.h-1 (dados não mostrados na Figura 26),
próximas aos valores encontrados por Mattiuz (2002) para goiabas ‘Paluma’ (23,6 °C, 66%UR)
83
até 6 dias de armazenamento, entre 60 e 180 mg.kg-1.h-1, e dos valores encontrados por Azzolini
et al. (2005) para goiabas ‘Pedro Sato’ (23°C, 85% UR), entre 30 e 90 mL.kg-1.h-1. As médias
obtidas de taxa de produção de etileno foram entre 4 e 20 µg.kg-1.h-1, ou entre 0,3 e 5,2 µL.kg-
1.h-1, comparáveis às obtidas por Cavalini (2008), entre 0 e 6 µL.kg-1.h-1, e Azzolini et al. (2005)
e Abreu et al. (2012), entre 0 e 5 µL.kg-1.h-1 em goiabas ‘Pedro Sato’ a 23°C. Pode ser observado
que não houve pico climatérico de CO2 definido em nenhum dos tratamentos analisados. A taxa
respiratória foi significativamente menor para os frutos revestidos Z e ZR em relação ao
controle, enquanto para o etileno, somente ZR foi significativamente menor (Tabela 14).
Figura 26 - Efeito de revestimentos de zeína sobre a atividade respiratória (CO2) e produção
de etileno (C2H4) de goiabas armazenadas a 23°C.
Tratamentos com letra minúscula diferente no mesmo dia diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). Tempos
de armazenamento sem nenhuma letra indicam que não houve diferença significativa entre os três tratamentos.
Apesar de as goiabas controle mostrarem ter completado o processo de
amadurecimento durante o armazenamento através de profundas mudanças em alguns atributos
como cor da casca e firmeza, como os frutos climatéricos, estas não apresentaram pico típico
climatérico de atividade respiratória e nem de produção de etileno, com pequena tendência de
aumento na taxa respiratória até o oitavo dia, decréscimo no 10° dia, e posterior aumento no
12° dia de armazenamento. A senescência do controle a partir do 10° dia é comprovada pelos
parâmetros de cor (totalmente amarela), perda de firmeza e de acidez e diminuição significativa
de sólidos solúveis totais (apresentados mais a frente na Tabela 15), e mesmo assim, houve
aumento crescente de produção de etileno durante esse período, o que condiz com os resultados
de produção de CO2, de que essas goiabas não apresentam padrão climatérico perfeito. Esse
comportamento também foi encontrado em outros trabalhos (ABREU et al., 2012; AZZOLINI
et al., 2005). Segundo Azzolini et al. (2005), a diminuição da taxa respiratória durante o pós-
climatérico representa a perda da habilidade homeostática da mitocôndria, com predominância
84
da senescência durante esse período; sendo assim, goiabas ‘Pedro Sato’ mostram habilidade de
manter a capacidade de homeostase da célula, o que leva a um aumento na respiração e na
síntese de etileno na senescência, que foi observado no 12° dia de armazenamento
principalmente nos frutos controle.
Tabela 14 - Médias globais e testes de Dunnett para as propriedades das goiabas controle (C),
revestidas com zeína (Z) e revestidas com zeína reticulada (ZR) ao longo de 12 dias de
estocagem a 23°C, UR 88%.
Propriedades C Z ZR
Média + DP Média + DP Média + DP
TR (CO2) 117,33 ± 33,67 91,50 ± 38,91 85,15 ± 41,98
Etileno 10,18 ± 6,83 8,17 ± 4,31 5,70 ± 2,56
PM 3,13 ± 1,50 2,53 ± 1,24 2,39 ± 1,18
L* 62,73 ± 6,67 55,77 ± 4,67 52,76 ± 3,73
a* -7,11 ± 7,36 -10,76 ± 4,25 -12,89 ± 2,56
b* 42,47 ± 5,67 36,80 ± 4,22 35,02 ± 3,95
Firmeza 21,25 ± 16,63 34,42 ± 17,23 42,33 ± 15,79
ATT 0,87 ± 0,10 0,95 ± 0,09 0,88 ± 0,10
pH 4,27 ± 0,27 4,13 ± 0,09 4,13 ± 0,11
SST 7,39 ± 1,38 8,94 ± 0,56 8,96 ± 0,71
Vitamina C 38,05 ± 7,54 40,96 ± 6,61 39,66 ± 6,44
Clorofila 0,62 ± 0,54 1,11 ± 0,12 1,26 ± 0,18
Carotenoides 0,32 ± 0,07 0,26 ± 0,07 0,31 ± 0,04
H2O2 0,0429 ± 0,03 0,0369 ± 0,02 0,0276 ± 0,02
Peroxidação
lipídica 31,56 ± 5,69 33,80 ± 6,50 38,42 ± 4,01
SOD 61,06 ± 25,40 55,25 ± 15,23 40,26 ± 11,30
CAT 331,1 ± 103,7 360,6 ± 142,3 239,9 ± 63,50
DP: desvios padrão. PM: perda de massa (m%); Firmeza (N); TR: taxa respiratória (mg.kg-1.h-1 de CO2); Etileno
(µg.kg-1.h-1); ATT: Acidez total titulável (ácido cítrico, g/100g); SST: Sólidos Solúveis Totais (°Brix); Vitamina
C (mg/100g); Clorofila (mg/100g); Carotenoides (mg/100g), H2O2 (µmol.H2O2g-1), Peroxidação lipídica (MDA
nmol. g-1, atividade da superóxido dismutase (SOD) (UA.mg-1.P) e catalase (µmol.H2O2mg-1min-1P) Controle:
goiabas não revestidas, Z: goiabas revestidas com revestimento de zeína, ZR: goiabas revestidas com revestimento
de zeína reticulada com ácido tânico. Médias em negrito diferem do controle pelo teste de Dunnett (p<0,05).
A taxa respiratória, expressa em produção de CO2, foi significativamente menor até
o 8° dia de armazenamento nas goiabas revestidas (Figura 26), confirmando o efeito de redução
da taxa respiratória devido ao uso de revestimentos de zeína; porém, a partir do décimo dia os
frutos revestidos não diferiram do controle, indicando tendência de aumento. Em geral, a
atividade respiratória está diretamente relacionada com a velocidade das reações metabólicas
que ocorrem no vegetal, o que explica o aumento de vida útil das goiabas revestidas.
85
Revestimentos comestíveis podem retardar o amadurecimento de frutas e hortaliças pela
modificação de suas atmosferas internas através de permeabilidade seletiva a gases
metabólicos, diminuindo o consumo de O2 e/ou aumentando a produção de CO2, assim como
inibição da biossíntese e ação do etileno (SÁNCHEZ-GONZÁLEZ et al., 2011).
Verifica-se que a produção de etileno foi significativamente menor para os frutos
revestidos a partir do 8° dia para ZR e 10° dia para Z (Figura 26), corroborando com os
resultados anteriores de atividade respiratória e manutenção da cor e firmeza para os frutos
revestidos. O atraso no aumento da produção de etileno em Z e ZR comparados com o controle
sugere que o revestimento comestível exerce uma barreira a trocas gasosas, retardando a
senescência (ALI et al., 2010; VISHWASRAO; ANANTHANARAYAN, 2016). O tratamento
Z apresentou tendência de aumento no oitavo dia, assim como os frutos controle, enquanto o
tratamento ZR manteve taxa significativamente menor, com tendência de aumento após o
décimo dia, o que também condiz com os parâmetros físicos de Z e ZR, em que ZR mantém a
firmeza e os parâmetros de cor mais do que Z. Provavelmente, a taxa respiratória foi bem menor
nas frutas revestidas devido à menor produção ou liberação de etileno, já que este hormônio
acelera a deterioração e a senescência dos tecidos vegetais, aumentando a permeabilidade das
membranas e reduzindo a biossíntese de fosfolipídios (WATADA; ABE; YAMAUCHI, 1990).
Vishwasrao e Ananthanarayan (2016) estudaram o efeito de revestimentos de
hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) em goiabas variedade ‘Lalit’ e verificaram que estes foram
efetivos em reduzir o teor de etileno somente até três dias de armazenamento, com aumento
significativo nos frutos revestidos em relação ao controle no sexto dia, indicando que os
revestimentos de zeína são bem mais eficientes em retardar o amadurecimento de goiabas.
4.4.3 Parâmetros físicos
A aparência das goiabas é de extrema importância na escolha e aceitação do
consumidor. A Figura 27 mostra a aparência de goiabas revestidas, comparando com o controle,
desde o dia em que os frutos foram comprados e revestidos, dia 0, até 12 dias de
armazenamento. As goiabas revestidas com zeína e zeína reticulada apresentaram boa aparência
após a secagem do solvente, com aspecto brilhoso assim como os frutos controle. Pode ser
observado que após 6 dias, a goiaba sem revestimento já se encontra sem brilho e no estádio
máximo de maturação, com coloração amarela, enquanto as frutas revestidas se encontram com
cor verde amarelada a verde escuro e ainda brilhosas, o que indica que os revestimentos de
zeína são eficientes para retardar o amadurecimento de goiabas. Estes resultados condizem com
86
os da análise de sobrevivência (Tabela 13), em que os frutos controle se tornam totalmente
amarelos entre o sexto e o sétimo dia, enquanto os revestidos Z e ZR não ficam totalmente
amarelos até o 12° dia. Após 12 dias, observa-se que a goiaba não revestida apresenta cor da
casca amarela-avermelhada, indicando que está sobremadura, enquanto as frutas revestidas
continuam ainda com cor amarelo-esverdeada (Z) e verde-amarelada (ZR), indicando estarem
em estádio menor de maturação. Porém, a determinação da fase de maturação com base apenas
na aparência dos frutos é falha, porque é uma medida subjetiva que está sujeita a muitas
variações e, consequentemente, a grande margem de erros. Podem ser observadas pequenas
manchas escuras nos frutos revestidos a partir de 9 dias de armazenamento, que se enquadram
como danos leves (CEAGESP, 2016), o que sugere que os revestimentos não são eficientes
para impedir o surgimento de pequenos danos a partir de 9 dias de armazenamento, como
mostrado na análise de sobrevivência, porém esses danos não comprometem a integridade do
produto até 12 dias.
Figura 27 - Aparência de goiabas (C, Z, e ZR, respectivamente) revestidas com soluções de
zeína até 12 dias de armazenamento.
C: controle, Z: goiabas com revestimento de zeína, ZR: goiabas com revestimento de zeína reticulada com AT. Os
números indicam o tempo de armazenamento em dias.
87
A Figura 28 mostra a perda de massa das goiabas com o tempo de armazenamento.
Verifica-se que houve perda de massa com média de até 5,6% após 12 dias, crescente com o
tempo, o que é esperado em armazenamento em temperatura ambiente (FORATO et al., 2015).
Os valores de perda de massa próximos a 6% foram semelhantes aos encontrados por Bassetto
et al. (2005) para goiabas (Pedro Sato) em temperatura ambiente. A perda de massa pode ser
atribuída à respiração e outros processos metabólicos relacionados à senescência durante a
estocagem (WATADA; QI, 1999); envolve transferência de água das células para a atmosfera,
e representa uma forma de avaliar a eficiência do revestimento na preservação de qualidade
(PÉREZ-GAGO; GONZÁLEZ-AGUILAR; OLIVAS, 2010). Verifica-se que houve pequena
redução de perda de massa dos frutos revestidos após 12 dias em relação ao controle (de 5,63%
em C para 4,36% em Z e 4,13% em ZR), significativa a partir da comparação das médias globais
(Tabela 14), que pode ser relacionada com a diminuição da taxa respiratória e de etileno (Figura
26).
Figura 28 - Efeito de revestimentos de zeína sobre a perda de massa de goiabas armazenadas
a 23°C.
C: controle, Z: goiabas com revestimento de zeína, ZR: goiabas com revestimento de zeína reticulada com AT.
As linhas representam modelos de regressão (C: y = 0,1104 + 0,8301Dia - 0,0864Dia2 + 0,0046Dia3, R2=0,9961;
Z: y = 0,0166 + 0,6366Dia - 0,0509Dia2 + 0,0023Dia3, R2=0,9988; ZR: y = 0,0308 + 0,5654Dia - 0,0392Dia2 +
0,0017Dia3, R2=0,9983).
A Figura 29 mostra os resultados dos parâmetros de cor L*, a* e b*, referentes à
luminosidade, cor variando do verde ao vermelho e do azul ao amarelo, respectivamente.
Verifica-se que as frutas controle apresentam uma variação bem maior com o tempo de
estocagem, enquanto as goiabas revestidas mantiveram sua cor quase que constante ao longo
do tempo, com médias globais de L* significativamente menores que o controle (Tabela 14). O
gráfico com os valores de L* indica aumento de luminosidade com o tempo, de 52 para 67,5
88
no controle após 12 dias, e valores quase constantes nos frutos revestidos, de 52 para 59,8 para
Z e 54,9 para ZR após 12 dias. A tendência de aumento de L* é positiva, já que a diminuição
dos valores L* durante o tempo de armazenamento pode refletir o desenvolvimento do
escurecimento dos tecidos (SÁNCHEZ-GONZÁLEZ et al., 2011).
Figura 29 - Efeito de revestimentos de zeína sobre os parâmetros de cor L*, a* e b* de goiabas
armazenadas a 23°C.
C: goiabas não revestidas, Z: goiabas revestidas com revestimento de zeína, ZR: goiabas revestidas com
revestimento de zeína reticulada com ácido tânico. As linhas representam modelos de regressão.
L* (C: y = 51,4115 + 2,1635Dia + 0,0668Dia2 - 0,0116Dia3, R2 = 0,9879; Z: y = 51,8202 - 0,1119Dia + 0,2112Dia2
- 0,0127Dia3, R2=0,9488; ZR: y =51,5688 - 0,5680Dia + 0,1736Dia2 - 0,0087Dia3, R2=0,9225);
a* (C: y = -16,6651 + 0,7169Dia + 0,2622Dia2 - 0,0160Dia3, R2=0,9979; Z: y = -16,6411 + 1,9869Dia - 0,2097Dia2
+ 0,0102Dia3, R2=0,9975; ZR: y = -16,3730 + 1,6989Dia - 0,2612Dia2 + 0,0133Dia3, R2=0,9414);
b* (C: y =32,9935 + 2,2791Dia - 0,0954Dia2, R2=0,9935; b*Z: y = 33,2379 - 0,3301Dia + 0,1942Dia2 -
0,0104Dia3, R2=0,9756; b*ZR: y = 33,1034 - 0,8003Dia + 0,2073Dia2 - 0,0094Dia3, R2=0,9700).
Valores mais baixos de ‘a*’ representam que a cor da fruta está mais esverdeada, o
que é devido à dominância de pigmentos de clorofila, enquanto valores positivos de ‘b*’
mostram que a cor está mudando para amarelo (SAHOO et al., 2015). Os revestimentos Z e ZR
foram significativamente efetivos na manutenção da cor verde, representada por valores mais
negativos do parâmetro a* e menores valores de b* (Tabela 14). Enquanto as goiabas controle
tiveram aumento de a* de -16,6 para 2,1 após 12 dias, as goiabas com Z mostraram a* de -5,6,
e ZR valor de a* de -11. Em relação a b*, observa-se aumento mais expressivo nos frutos C, de
89
33,3 para 46,7, enquanto Z e ZR tiveram aumento de 33,3 para 39,2 e 36,9, respectivamente,
após 12 dias, confirmando também que os frutos revestidos amadureceram mais lentamente que
o controle. Aquino et al (2015) também encontraram manutenção de a* e b* com o uso de
revestimentos de quitosana e amido de mandioca, porém os revestimentos de zeína
demonstraram manutenção mais expressiva da cor das goiabas durante o armazenamento.
Azzolini; Jacomino e Spoto, (2004) e Cavalini et al. (2006) consideram que a cor da casca é o
melhor índice para determinar o estádio de maturação de goiabas ‘Pedro Sato’. De forma geral,
os revestimentos Z e ZR se mostraram eficientes na manutenção de cor das goiabas em
temperatura ambiente em relação ao controle, mostrando que estes atuaram retardando o
amadurecimento.
A Figura 30 mostra os resultados de firmeza com o tempo de armazenamento. Os
frutos controle apresentaram média inicial de 59,3 N, com queda para 12,8 N no sexto dia, se
estabilizando até o final do tempo de análise, resultado similar ao de Azzolini et al. (2005) em
condições semelhantes de análise de goiabas ‘Pedro Sato’. Observa-se que houve efeito positivo
dos revestimentos, significativamente maiores que C, pela Tabela 14, em que ZR mostrou
firmeza quase igual à inicial até o 12° dia de armazenamento (médias entre 35 e 44 N entre o
1° e 12° dia), enquanto o tratamento Z apresentou firmeza de 51,3 N no primeiro dia com
diminuição para 25,5 N no sexto dia, com média significativamente menor que ZR a partir do
10° dia. Esses resultados concordam com os de manutenção da cor verde (Figura 29),
especialmente pelo frutos ZR, que mostram que esses frutos não amadureceram. A maior
eficiência do tratamento ZR se deve provavelmente à formação de redes cruzadas pelo ácido
tânico, que diminui os espaços livres na estrutura da matriz proteica, diminuindo assim a
permeabilidade do revestimento, a taxa respiratória e perda de umidade, o que contribui para
manutenção da firmeza dos frutos. Com a produção de etileno, há um aumento de atividade
enzimática nos componentes das células dos tecidos, causando amaciamento (FORATO et al.,
2015).
O revestimento ZR mostra ser vantajoso em comparação com os aplicados por
Aquino et al. (2015), de quitosana e amido de mandioca, e Forato et al (2015), de goma de
cajueiro e carboximetilcelulose, que não foram eficientes na manutenção da firmeza após 10
dias de armazenamento em temperatura ambiente. Alterações na resposta mecânica das frutas
são atribuídas a mudanças na estrutura celular dos tecidos durante o amadurecimento e
senescência, em que as forças de união das células através da lamela média são grandemente
enfraquecidas (CHIRALT et al., 2001).
90
Figura 30 - Efeito de revestimentos de zeína sobre a firmeza de goiabas armazenadas a 23°C.
Tratamentos com letra minúscula diferente no mesmo dia diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). Tempos
de armazenamento sem nenhuma letra indicam que não houve diferença significativa entre os três tratamentos.
4.4.4 Parâmetros Químicos e Físico-Químicos
Os resultados dos parâmetros físico-químicos pH, acidez total titulável (ATT),
sólidos solúveis totais (SST), vitamina C, clorofila e carotenoides para os frutos controle e
revestidos (Z e ZR) podem ser vistos na Tabela 15. O aumento de atividade respiratória
desencadeia o aumento da produção de ácido cítrico, via ciclo dos ácidos tricarboxílicos, sendo
consumido posteriormente como substrato respiratório (BRODY, 1996; MATTIUZ, 2002);
sendo assim, o teor de ácidos orgânicos tende a diminuir com o processo de maturação e o teor
de ATT pode ser um indicativo do estádio de maturação do fruto. Os teores de ATT foram
próximos entre si variando de 0,80 a 1,03 g/100g, com valores próximos aos encontrados por
Cavalini (2008) em goiabas ‘Pedro Sato’ a 23°C e 85%UR (entre 0,7 e 1,0 g/100g). De acordo
com a Tabela 14, não houve diferença significativa de acidez entre as médias globais dos
tratamentos Z e ZR em relação ao controle. Não foi possível observar diferenças significativas
nos dias de armazenamento analisados entre os tratamentos C e Z, porém observa-se que a
acidez para ZR foi significativamente menor que o controle em 6 dias de armazenamento
(Tabela 15). Essa manutenção do teor de ATT (não desenvolvimento de maior acidez) condiz
com a menor taxa respiratória dos frutos ZR no sexto dia (Figura 26). Basseto et al. (2005)
encontraram valores próximos de acidez em goiabas ‘Pedro sato’ estocadas a 25°C, em torno
de 0,7 g/100g.
91
Tabela 15 - Parâmetros físico-químicos das goiabas revestidas e não revestidas armazenadas a
23°C.
Dias de armazenamento
0 6 12
Acidez total titulável (ácido cítrico, g/100g)
Controle 0,87 ± 0,07 0,93 ± 0,07 a 0,82 ± 0,14
Z 0,87 ± 0,07 1,03 ± 0,10 ab 0,94 ± 0,04
ZR 0,87 ± 0,07 0,80 ± 0,03 b 0,98 ± 0,10
pH
Controle 4,04 ± 0,10 4,16 ± 0,09 4,62 ± 0,08 a
Z 4,04 ± 0,10 4,21 ± 0,06 4,15 ± 0,01 b
ZR 4,04 ± 0,10 4,10 ± 0,04 4,24 ± 0,04 b
Sólidos Solúveis Totais (°Brix)
Controle 8,63 ± 0,29 7,43 ± 0,31 a 5,40 ± 0,57 a
Z 8,63 ± 0,29 9,23 ± 0,90 b 8,97 ± 0,31 b
ZR 8,63 ± 0,29 9,20 ± 0,26 b 9,07 ± 1,27 b
Vitamina C (mg/100g)
Controle 43,90 ± 7,55 31,73 ± 4,09 a 38,52 ± 6,47
Z 43,90 ± 7,55 44,05 ± 2,25 b 34,95 ± 5,80
ZR 43,90 ± 7,55 41,49 ± 2,92 ab 33,60 ± 4,17
Clorofila (mg/100g)
Controle 1,19 ± 0,15 0,14 ± 0,01 a 0,26 ± 0,05 a
Z 1,19 ± 0,15 1,11 ± 0,03 b 1,01 ± 0,09 ab
ZR 1,19 ± 0,15 1,29 ± 0,04 c 1,33 ± 0,33 b
Carotenóides (mg/100g)
Controle 0,30 ± 0,02 0,27 ± 0,04 0,42 ± 0,04
Z 0,30 ± 0,02 0,16 ± 0,01 0,30 ± 0,01
ZR 0,30 ± 0,02 0,32 ± 0,09 0,32 ± 0,04
Controle: goiabas não revestidas, Z: goiabas revestidas com revestimento de zeína, ZR: goiabas revestidas com
revestimento de zeína reticulada com ácido tânico. Médias seguidas de mesma letra minúscula na mesma coluna
e mesma letra maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Os valores de pH também foram próximos entre si e as médias globais de Z e ZR
não diferiram estatisticamente em relação ao controle (Tabela 14). As médias obtidas de pH
(Tabela 15) mostram que houve aumento de pH do controle e ZR no 12° dia em comparação
com o dia 0, o que é esperado, devido à utilização dos ácidos orgânicos, como resultado do
amadurecimento (ZAMBRANO-ZARAGOZA et al., 2013). Os resultados de pH se mostraram
similares em 6 dias de armazenamento, porém houve aumento significativo do pH do controle,
de 4,15 a 4,24 nos frutos reticulados para 4,62, confirmando diminuição de acidez mais
proeminente nas goiabas controle, relacionada à maior atividade respiratória. Aquino et al.
(2015) encontraram maior valor de ATT das goiabas revestidas com quitosana em relação às
não-revestidas no final do armazenamento, o que pode indicar o efeito dos revestimentos em
retardar o amadurecimento.
92
Observa-se que o teor de SST, com médias entre 5,40 e 9,23 °Brix, apresentou
diminuição no dia 12 em relação ao dia 0 somente para o controle, enquanto os frutos revestidos
tiveram médias similares nos 3 dias avaliados. Cavalini (2008) também encontrou diminuição
do teor de SST após o sétimo dia de armazenamento de goiabas ‘Pedro Sato’ (23°C, 85%UR).
As médias de SST de Z e ZR foram significativamente maiores que o controle no sexto e 12°
dias (Tabela 15) e as médias globais de Z e ZR também foram significativamente maiores em
relação ao controle (Tabela 14). Possivelmente, o aumento de SST nas frutas controle ocorreu
antes do sexto dia de armazenamento, e a diminuição de SST após esse dia corresponde ao
período da senescência dessas goiabas. O teor de açúcar (representado por SST) mais baixo nos
frutos controle pode ser explicado pela taxa de respiração mais elevada exibida por esses frutos,
com consumo de açúcares (ESPINOZA-ZAMORA et al., 2010). Essa maior taxa de respiração
foi observada comparando os frutos controle com os frutos revestidos (Tabela 14). O teor de
SST de Z e ZR se manteve semelhante ao de goiabas revestidas com amido de mandioca
estudado por Soares et al. (2011) após 12 dias de armazenamento em temperatura ambiente. A
manutenção dos valores de SST nos frutos revestidos Z e ZR indica manutenção da qualidade
desses frutos até o final do período avaliado. Aquino et al. (2015) encontraram diminuição de
SST de goiabas revestidas com quitosana a 25°C de 11°Brix no primeiro dia de armazenamento
para 8°Brix após 10 dias, sugerindo que os revestimentos de zeína foram mais eficientes na
manutenção dos açúcares (9° Brix no 12° dia).
Os teores de vitamina C (ácido ascórbico) obtidos apresentaram médias entre 43,9
e 31,7 mg/100g, menores que as obtidas por Cavalini et al. (2006) para goiabas ‘Paluma’, entre
62,8 e 72,0 mg/100g após colheita no estádio de maturação 1 (fruto verde-escuro) e 2 (fruto
verde-claro), e similares às obtidas por Azzolini; Jacomino e Bron (2004) para goiabas ‘Pedro
Sato’ após colheita nos mesmos estádios, entre 30,4 e 44,5 mg/100g. Não houve diferença
significativa na comparação das médias globais de Z e ZR em relação ao controle (Tabela 14).
Observa-se que a média de Z no sexto dia foi significativamente maior do que o controle,
indicando que esse revestimento pode ajudar a manter os níveis iniciais desse nutriente, mas Z
e ZR foram similares às frutas controle no 12° dia (Tabela 15). A senescência dos frutos, assim
como danos mecânicos e podridão, promovem a desorganização da parede celular, propiciando
a oxidação do ácido ascórbico. Vishwasrao e Ananthanarayan (2016) encontraram valores
semelhantes de vitamina C entre goiabas ‘Lalit’ revestidas com HPMC e sem revestimento no
6° dia de armazenamento (24°C).
A clorofila é o pigmento responsável pela cor verde das frutas; esta é degradada
com o amadurecimento, enquanto há síntese ou revelação de outros pigmentos como beta-
93
caroteno, licopeno, xantofila, antocianina, dependendo do vegetal (CHITARRA; CHITARRA,
2005). Foram obtidas médias de teor de clorofila entre 0,14 e 1,33 mg/100g, com diminuição
com o tempo de armazenamento nos frutos controle a partir do sexto dia. Os revestimentos
favoreceram a manutenção dos valores iniciais de clorofila até o final do armazenamento,
especialmente o tratamento ZR, o qual mostrou média significativamente maior no 12° dia.
Esses resultados condizem com os dos parâmetros de cor a* e b*, em que ZR manteve a cor
verde dos frutos, diferindo significativamente do controle (Tabela 14). Vishwasrao e
Ananthanarayan (2016) também mantiveram maior teor de clorofila na casca de goiabas
revestidas com HPMC após 6 dias de armazenamento.
Durante o processo de amadurecimento, a clorofila se degrada expondo os
carotenoides, que são os principais pigmentos responsáveis pelo tom de cor amarela (FORATO
et al., 2015). Essa classe de pigmentos se encontra em frutas e vegetais amarelos, sendo
mascarados pela clorofila até que o tecido envelheça; então, a intensificação de cor amarela da
casca se deve em parte ao aumento que ocorre no amadurecimento do fruto, e em parte devido
à perda de clorofila. Os carotenoides são importantes na proteção dos sistemas biológicos,
exercendo função antioxidante em fases lipídicas pelo bloqueio dos radicais livres que
danificam as membranas lipoproteicas (SHAMI; MOREIRA, 2004). Verifica-se que o teor de
carotenoides foi significativamente igual entre os tratamentos (Tabelas 14 e 15). Watada; Abe
e Yamauchi (1990) mencionam que a perda do pigmento verde, com exposição do vermelho,
em vegetais está relacionada com a exposição do produto ao etileno, o que condiz com os
resultados de menor produção de etileno do tratamento ZR relacionados ao maior teor de
clorofila.
4.4.5 Metabolismo antioxidante enzimático
As atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), o teor de
peróxido de hidrogênio (H2O2) e o grau de peroxidação lipídica da membrana celular estão
relacionados ao estresse oxidativo, o qual é definido como um desbalanço entre a produção e a
neutralização de espécies reativas como as espécies reativas de oxigênio (EROs) (CARVALHO
et al, 2016). Os resultados desses parâmetros podem ser vistos na Figura 31 e na Tabela 14. As
médias globais de H2O2 dos frutos revestidos não apresentaram diferença significativa em
relação ao controle (Tabela 14). De acordo com a Figura 31, de forma geral, os valores de H2O2
foram similares entre Z e o controle, com exceção do 8° dia, em que ocorre um pico de produção
de H2O2 nos frutos controle. Esse aumento coincide com o período em que estes estão no início
94
do estádio de senescência e os frutos revestidos ainda estão verdes (pelos resultados de cor e
firmeza), e provavelmente está associado ao início de processos de degradação, e ao aumento
da atividade da enzima SOD no sexto dia, a qual tem como produto esse metabólito. Os frutos
revestidos com ZR apresentaram tendência de menor teor de H2O2 em relação ao controle a
partir de 8 dias de armazenamento; possivelmente, a redução do estresse oxidativo ocorre pela
menor taxa respiratória desse tratamento, com menor produção de EROs, assim como foi obtido
por Carvalho et al. (2016) com revestimentos de quitosana com trans-cinamaldeído em melão.
O maior teor de H2O2 para no ZR no primeiro dia de armazenamento pode ser associado a
estresse devido à modificação da atmosfera interna do fruto. O aumento de H2O2 de Z e ZR no
12° dia indica início da senescência desses frutos.
Figura 31 - Efeito de revestimentos de zeína sobre parâmetros do metabolismo antioxidante
enzimático de goiabas armazenadas a 23°C.
Tratamentos com letra minúscula diferente no mesmo dia diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). Tempos
de armazenamento sem nenhuma letra indicam que não houve diferença significativa entre os três tratamentos.
95
O processo de peroxidação lipídica (PL) representa uma cascata de reações
iniciadas pelos radicais livres como as EROs, que se inicia com uma reação entre um radical
livre e um ácido graxo insaturado, propagada por radicais peróxidos formando hidroperóxidos
lipídicos e aldeídos, como malonialdeído (MDA) (CARVALHO et al., 2016), causando danos
biológicos na membrana. O aumento do grau de peroxidação lipídica (PL) pode ser esperado
no fim do amadurecimento ou quando a fruta é exposta a condições de estresse (VICENTE et
al., 2006). A PL foi supreendentemente maior para os frutos revestidos, de forma geral, com
exceção do 8° dia de armazenamento, em que houve aumento de PL nos frutos controle, com
média global de PL de ZR significativamente maior que o controle (Tabela 14), indicando
estresse devido à modificação da atmosfera interna, com desequilíbrio oxidativo.
O aumento de MDA nos frutos revestidos indica aumento de estresse no início do
armazenamento, ou seja, desbalanço entre os sistemas oxidativos/antioxidativos por efeito do
revestimento, que pode ser relacionado com as atividades enzimáticas semelhantes ou menores
que o controle, tanto da SOD quanto da CAT, para os frutos revestidos, contribuído para um
maior efeito dos sistemas oxidativos. Uma possível explicação para o aumento de MDA nos
frutos revestidos pode ser a alta concentração de CO2 dentro das células, a qual pode causar
danos oxidativos e consequente acumulação de H2O2, o que pode levar a modificações na
membrana das células (LARRIGAUDIERE et al., 2001), porém isso não condiz com o menor
teor de H2O2 nos frutos revestidos, com exceção no primeiro dia de armazenamento. É possível
que o estresse no início do armazenamento pelo uso de revestimentos, especialmente ZR (já
que este impede mais a difusão de gases devido às ligações cruzadas, como mostrado na etapa
2), tenha sido controlado pela atividade antioxidante não-enzimática, representada por
compostos antioxidantes presentes nas goiabas e preservados pelos revestimentos, como ácido
ascórbico e clorofila (Tabela 15), levando a uma diminuição do teor de H2O2. Um composto
que diferencia os revestimentos Z e ZR é o ácido tânico utilizado como reticulante, um fenólico
com comprovada ação antioxidante, e que pode ter colaborado para as menores taxas de H2O2
e manutenção de clorofila nos frutos revestidos com ZR.
As enzimas antioxidantes, junto com antioxidantes não-enzimáticos, estão na linha
de defesa contra o excedente de EROs. A SOD é responsável pela dismutação do radical
superóxido O2• para O2 e H2O2 (espécie menos reativa), que pode ser eliminado por catalase e
diferentes peroxidases; SOD é considerada, portanto, a primeira linha de defesa antioxidante
enzimática (CARVALHO et al., 2016). A Tabela 14 mostra que a atividade da SOD de ZR foi
significativamente menor que a do controle. Os valores da SOD apresentaram maior atividade
no controle no 1° e no 6° dias de armazenamento, enquanto Z e ZR só tiveram aumento no final
96
do armazenamento (Figura 31), o que confirma que houve alteração do metabolismo
antioxidante enzimático pelos frutos revestidos pela diminuição da taxa respiratória,
especialmente de ZR (Tabela 14). O aumento da SOD acompanhado de diminuição de atividade
da catalase para os frutos controle no 12° dia confirma estádio avançado de senescência, com
acúmulo de H2O2.
A enzima catalase converte H2O2 em H2O e O2 e é considerada uma das mais ativas
enzimas antioxidantes nos vegetais (BREUSEGEM et al., 2001). Pode ser visto que ocorreu um
pico de atividade da CAT no 6° dia para os frutos controle, que condiz com o período de
amadurecimento, seguido de diminuição da atividade, que pode ser relacionada ao aumento de
H2O2 e de peroxidação lipídica no 8° dia que indicam o início da senescência dos frutos. De
acordo com Mondal et al. (2009), o amadurecimento da goiaba acompanha um aumento
progressivo de estresse oxidativo que induz a um sistema antioxidante, mas este sistema não se
prolonga até os estádios mais avançados de maturação refletindo na disfunção celular e
consequente morte do fruto. A atividade da CAT do controle foi, de forma geral, similar a Z e
ZR de acordo com as médias globais (Tabela 14), porém pode ser observada menor atividade
da CAT em ZR do sexto ao décimo dias de armazenamento (Figura 31) que pode ser relacionada
com os menores níveis de H2O2 para esse tratamento, e também com a menor atividade da SOD,
já que seu produto é o substrato da CAT. Os resultados de menor atividade enzimática
antioxidante para os frutos revestidos corroboram com outros trabalhos de revestimento de
frutos, como quitosana em melão (CARVALHO et al., 2016) e goma arábica em mangas
(KHALIC et al., 2016).
97
5. CONCLUSÕES
Os filmes de zeína reticulados com AT não-oxidado ou oxidado foram produzidos
com sucesso. Maiores quantidades de AT e valores de pH resultaram em filmes com melhores
propriedades de forma geral, notadamente menor solubilidade em água e melhores propriedades
mecânicas. Embora os espectros de FTIR não apresentem nenhuma evidência de reticulação
covalente, o AT oxidado resultou em filmes com melhor resistência mecânica (em torno de
20% melhor) e melhor barreira a vapor de água quando comparado ao não-oxidado, o que
sugere que reticulação mais forte (covalente) pode ter ocorrido quando o AT oxidado foi
utilizado. Os filmes de zeína reticulados apresentam potencial para serem utilizados como
embalagem de alimentos e em aplicações de revestimento.
O tratamento dos filmes de zeína com UVO proporcionou a modificação por
formação de cargas negativas na superfície com sucesso, proporcionando aumento de
hidrofilicidade da superfície, como e mantendo as propriedades mecânicas e integridade
estrutural dos filmes. A nisina se ligou à superfície, e o tratamento com UVO por 120 s
propiciou o aumento significativo na quantidade de nisina adsorvida, mostrando que pode ser
utilizado como tratamento preliminar para aumentar a eficiência da adsorção de compostos
catiônicos de interesse na superfície, sem comprometimento das propriedades mecânicas do
material. O teste microbiológico foi inconclusivo, então outros estudos com outras
metodologias não abordadas, como testes feitos diretamente no alimento ou testes in vitro, são
necessários para comprovar a eficiência da atividade antimicrobiana da nisina e garantir
propriedades físicas dos filmes adequadas após a adsorção e durante a utilização em alimentos.
A aplicação de revestimentos de zeína e zeína reticulada em goiabas se mostrou eficiente em
retardar o amadurecimento, com aumento da vida útil, com efeito mais expressivo do
revestimento de zeína reticulada. Foram observadas mudanças no metabolismo antioxidante
pelo uso dos revestimentos, com diminuição da atividade enzimática da SOD e CAT e menor
teor de peróxido de hidrogênio. Os resultados indicam que os revestimentos de zeína avaliados
agem positivamente como um agente conservante, aumentando a vida útil dos frutos pela
diminuição da taxa respiratória, e que o revestimento de zeína reticulada com ácido tânico
apresenta maior eficiência na manutenção de qualidade e aumento de vida útil que o
revestimento de zeína, possivelmente pela maior barreira a gases devido às ligações cruzadas
na matriz proteica em presença de ácido tânico. Os frutos revestidos com zeína apresentam
características aceitáveis até 12 dias de armazenamento em temperatura em torno de 23°C.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
De forma geral, este trabalho de tese teve seus objetivos atingidos, abordando uma
ampla área de conhecimentos que incluíram, tanto a parte de modificações químicas pela
técnica de reticulação, quanto a modificação da superfície por uso de técnicas físicas, como o
tratamento UVO. Foi possível a melhoria das propriedades físicas do filme de zeína e a adsorção
do composto antimicrobiano nisina na superfície, o que indica que filmes de zeína apresentam
grande potencial de utilização como embalagem de alimentos.
A aplicação de revestimentos de zeína em goiabas apresentou ótimos resultados,
retardando o amadurecimento e possibilitando o aumento de vida útil. As goiabas mostraram
ser um modelo adequado para verificar a eficiência de revestimentos pela sua curta vida útil.
Esses revestimentos podem ser utilizados em outros frutos ou outros alimentos, como produtos
cárneos para avaliar a eficiência dos filmes com nisina. Ainda há muito o que ser estudado e
aprofundado para possibilitar o uso das tecnologias utilizadas nesse trabalho de forma mais
efetiva, especialmente na obtenção de filmes antimicrobianos de zeína com adsorção de nisina,
e no aumento de vida útil de goiabas e outros alimentos. Este trabalho abre caminhos para o
uso de novas tecnologias para a utilização de zeína, possibilitando a sua utilização em produtos
com maior valor agregado, e ainda para o uso dessas tecnologias em outros materiais
biodegradáveis.
119
APÊNDICE A – Avaliação da atividade antimicrobiana de revestimentos de zeína com
nisina pelo método de difusão em ágar
O efeito antimicrobiano das dispersões filmogênicas foi avaliado pelo método de
difusão em ágar de acordo com a norma de Desempenho para Testes de Sensibilidade
Antimicrobiana, recomendada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012).
O cultivo das bactérias avaliadas Listeria monocytogenes e Escherichia coli e da levedura S.
cereviseae foi feito segundo o tópico 3.3.5. Suspensões de células com aproximadamente 1 x
108 UFC/ml de E. coli, L. monocytogenes e S. cerevisiae foram espalhadas na superfície de
placas de Petri de ágar e caldo infuso de cérebro e coração (BHI) para L. monocytogenes e E.
coli e ágar Batata Dextrose para a levedura, com auxílio de um swab. Após a inoculação, o ágar
foi perfurado para obter poços de 5 mm de diâmetro, aos quais foram adicionados 60 µl das
diferentes soluções testadas. Foram testadas as seguintes dispersões: Z - zeína, ZR - zeína
reticulada, ZN1 - zeína com nisina 7% (m/m de zeína ou 7000 UI/mg), ZRN1 - zeína reticulada
com nisina 7%, ZN2 - zeína com nisina 14% (m/m de zeína ou 14000 UI/mg), ZRN2 - zeína
reticulada com nisina 14%, preparadas de acordo com o tópico 3.5.1, e a nisina adicionada por
último e agitada em agitador magnético. As placas foram incubadas a 35 °C/24 h e 25 °C/48-
72h, para bactérias e levedura, respectivamente. A atividade inibitória foi observada pela
inibição de crescimento microbiano ao redor dos poços e quando houve formação de halo
(inibição em torno do filme), este foi quantificado pela medida do diâmetro total.
Para verificar se a diminuição de pH melhora a atividade da nisina, foi testada a
substituição de 17% do solvente (etanol 80%) por ácido acético, o qual também é utilizado
como solvente para zeína. Foi realizado o mesmo procedimento anterior, com os mesmos
microrganismos, todos com 7% de nisina. Foram testadas as soluções: ZN1 - zeína com nisina,
ZN(ac) – zeína com nisina e substituição de 5 mL de ácido acético em 30 mL de solução
etanol/água 80%, ZNR1 - zeína reticulada com nisina e ZRN(ac) – zeína reticulada com nisina
e substituição de 5 mL de ácido acético em 30 mL de solução etanol/água 80%.
Os resultados de atividade antimicrobiana estão dispostos nas Figuras 32 e 33. Pode
ser observado na Figura 32 que houve formação de halo para L. monocytogenes e E. coli
somente para as soluções reticuladas com ácido tânico (ZR, ZRN1 e ZRN2), indicando que o
ácido tânico pode estar atuando como um antimicrobiano nas soluções de zeína. Ao contrário
do esperado, a presença de nisina não favoreceu a atividade antimicrobiana, o que pode ser
observado nos halos de ZN1 E ZN2. O aumento da concentração de nisina, além de não ter
efeito, ainda diminuiu o halo (Tabela 16), comparando ZRN1 (16 e 15,5 mm) com ZRN2 (10,5
120
e 11 mm). Não houve atividade antimicrobiana para S. cereviseae, pois não houve inibição de
crescimento para nenhuma das soluções testadas, apesar de ser possível ter ocorrido inibição na
região de contato.
Figura 32 - Atividade antimicrobiana de soluções filmogênicas de zeína Z, ZR, ZN1, ZRN1,
ZN2, ZRN2 (60µL) em placas com ágar BHI e PDA (levedura). (a) Listeria monocytogenes;
(b) Escherichia coli; (c) Saccharomyces cerevisiae. Concentrações de nisina (m/m de zeína):
ZN1, ZRN1- 7%; ZN2, ZRN2 - 14%.
Tabela 16 - Diâmetros de zonas de inibição (mm) para soluções filmogênicas de zeína contra
bactérias L. monocytogenes e E. coli.
Solução Listeria
monocytogenes Escherichia coli
Z 7,0 ± 0,0 8,0 ± 0,0
ZR 16,5 ± 0,5 15,5 ± 0,5
ZN1 6,0 ± 0,0 6,5 ± 0,5
ZRN1 16,0 ± 1,0 15,5 ± 0,5
ZN2 6,0 ± 0,0 6,5 ± 0,5
ZRN2 10,5 ± 0,5 11 ± 0,0 Soluções: Z- solução de zeína, ZR – solução de zeína reticulada, ZN1 – solução de zeína com nisina 7% (m/m de
zeína ou 7000 UI/mg), ZRN1 – solução de zeína reticulada com nisina 7%, ZN2 – solução de zeína com nisina
14% (m/m de zeína ou 14000 UI/mg), ZRN2 – solução de zeína reticulada com nisina 14%.
A Figura 33 mostra que a nisina em pH ácido foi efetiva, apresentando efeito
antimicrobiano para L. monocytogenes e E. coli, mesmo sem a presença de ácido tânico em
solução, pois houve formação de halo para ZN(ac) (sem reticulação), como mostra a Tabela 17,
assim como para ZRN(ac). Provavelmente, isso se deve à diminuição do pH de solução pelo
uso de ácido acético, que favorece a atividade de nisina, já que esta apresenta maior solubilidade
em pH ácido (SALMASO et al., 2004). Então, foi mostrado que a nisina só tem efetividade em
pH ácido e foi escolhido o tratamento ZRN (ac) para teste como revestimento de goiabas.
a
Z
ZN1
ZR
ZRN1
ZRN2
ZN2
b
Z
ZN1
ZR
ZRN1
ZRN2
ZN2
c
Z
ZN1
ZR
ZRN1
ZRN2
ZN2
121
Figura 33 - Atividade antimicrobiana de soluções filmogênicas de zeína ZN1, ZN(ac), ZRN1
e ZRN (ac) (60µL) em placas com ágar BHI. (a) Listeria monocytogenes; (b) Escherichia coli.
Tabela 17 - Diâmetros de zonas de inibição (mm) e pH para soluções filmogênicas de zeína
contra bactérias L. monocytogenes e E. coli.
Solução pH da solução Listeria
monocytogenes Escherichia coli
ZN1 5,1 7,0 ± 1,0 6,5 ± 1,5
ZN(ac) 3,1 24,0 ± 0,0 15,0 ± 0,0
ZRN1 8,3 10,5 ± 0,5 10,5 ± 0,5
ZRN(ac) 4,0 25 ± 0,0 25,0 ± 0,0 Soluções: ZN1 – solução de zeína com nisina 7% (m/m de zeína ou 7000 UI/mg), ZN(ac) – solução de zeína com
nisina 7% em ácido acético, ZRN1 – solução de zeína reticulada com nisina 7%, ZRN2 – solução de zeína
reticulada com nisina 7% em ácido acético.
Teste preliminar da solução de nisina em goiabas
Com relação ao tratamento ZRN (ac), foi observado durante testes preliminares na
superfície de goiabas que este provocou um dano na casca caracterizado por manchas escuras
que tornou a aparência destas inaceitável (Figura 34), e por isso esse tratamento não foi utilizado
no estudo do revestimento de goiabas. Possivelmente, a composição do solvente utilizado para
as dispersões com nisina, com diminuição do pH para que esta pudesse ter atividade
antimicrobiana, provocou injúrias na superfície do fruto. Por isso, o revestimento ZRN foi
considerado inadequado para utilização em goiabas, e não foi dada continuidade nas análises
posteriores com esse tratamento.
Figura 34 - Goiabas revestidas com revestimento ZRN.
a b a
ZN(ac)
ZRN1
ZN1
ZRN(ac)
ZN(ac)
ZRN1
ZN1
ZRN(ac)
