1

Slika iz: Lin et al., (1998) Science 279.

Encimi, ki delujejo na agregiranih substratih (npr. lipidnih membranah).

medfazna encimatika

klasična encimatika

membranska površina

2

•  Dostopajo do substrata na fazni meji med vodnim in lipidnim okoljem

•  Evolucija v smeri produktivne interakcije s površino agregatov

⇒  učinkovita vezava substrata v aktivno mesto

•  Encimi lipidnega metabolizma:

- PI-3-kinaze, gliceridne lipaze, bakterijska sfingomielinaza, fosfolipaze A1 in A2,

PI-fosfolipaza C

•  Sekretorne PLA2 – paradigma medfazne encimatike

•  Sekretorne fosfolipaze A2 (sPLA2)

•  Substrati – značilnosti fosfolipidnih agregatov

•  Zakaj je medfazna kinetika zapletena?

•  Kako jo uporabljamo v praksi?

3

PLA2

POPC

•  Cepijo sredinsko (sn-2) estrsko vez v molekulah glicerofosfolipidov

4

•  13-18 kDa

•  5-8 -S-S- mostičkov

•  Asp/His/H2O katalitska ‘triada’

•  Ca2+-vezavna zanka

Ca2+-vezavna zanka

aktivno mesto

5

Pogoji za encimsko delovanje sPLA2: 1.  Vezava na membransko površino (Kd)

2.  Vezava Ca2+ in substrata v aktivno mesto (KCa in KS*)

3.  Kataliza hidrolitske reakcije (kcat*)

4.  Sproščanje produktov reakcije

5.  Ponovna kataliza ali zapustitev površine

E* + S* E*S E* + P* KS* kcat*

Kd

E

Berg et al. (2001) Chem. Rev. 101.

membranska površina

Ca2+

6

F124

N119 R118

V31 F24

L19

T20

L2

L3

K69

R72

T70 S67

H48

Interakcije z membrano: –  centralni obroč hidrofobnih

in aromatskih ostankov –  polarni, bazični, kisli

ostanki na robovih

Petan et al., (2005) Biochemistry, 44.

Ca2+-vezavna zanka

Kalcij je nujen za vezavo fosfolipidne molekule v aktivno mesto in katalitsko reakcijo, ni pa potreben za vezavo sPLA2 na membransko površino.

7

Pan et al., 2001, Biochemistry, 40.

MJ33 - inhibitor, analog prehodnega intermediata

Verheij et al., 1980, Biochemistry 19, 743-750.

8

•  “Specifičnost” ali afiniteta za vezavo na membrano

•  fizikalno-kemijske lastnosti celotne membranske površine in zgradba IBS-a

•  večina sPLA2 se zelo dobro veže na negativno nabite (PG, PS, PM), a veliko slabše na zwitterionske (elektronevtralne) membranske površine (PC, PE)

•  Substratna specifičnost aktivnega mesta

•  struktura fosfolipidne molekule in njeno prileganje v aktivno mesto •  večina sPLA2 nima izražene specifičnosti do posameznih fosfolipidov

9

•  Bistvo razumevanja medfazne kinetike se skriva v poznavanju narave agregiranih substratov

•  Že najbolj enostavni eksperimentalni modeli za sPLA2 (npr. suspenzija fosfatidilholinskih liposomov v vodi) so zelo kompleksni za kinetsko analizo

•  Amfipatske molekule => specifična organizacija/agregacija molekul v vodnem okolju

•  Na strukturo agregatov vplivajo: –  Dolžina in (ne)nasičenost verig CH –  Struktura polarne glave –  Metoda disperzije –  Koncentracija soli –  Temperatura –  Prisotnost drugih amfipatskih molekul

10

< 4 CH2-skupin < 10 CH2-skupin

•  SUV, LUV, GUV – ”Small/Large/Giant unilamellar vesicles” (unilamelarni vezikli)

•  MLV – multilamelarni vezikli

> 10 CH2-skupin

11

16:0-18:1 PG

16:0-18:1 PC

16:0-18:1 PS

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoserin

(−)

(+/−)

(−)

12

•  MLV potiskamo skozi polikarbonatne filtre z izbranim premerom por (0,015 do 12 µm, tipično 100 nm)

LipoFast Extruder, Avestin, Canada

13

100 nm vezikli (LUV); sestava: 50% POPG/POPC; pripravljeni z ekstruzijo

Petan et al., (2007) Biochemistry, 46.

fuzija 100 nm veziklov 50% POPG/POPC, 5 min po dodatku fuzogene kačje sPLA2

Petan et al., (2007) Biochemistry, 46.

14

15

Omejitev dostopnosti substrata na 2D: 1.  Encim se mora vezati na površino v odvisnosti od dostopne

vezavne površine, ki jo določa:

- celotna koncentracija substrata

- število, velikost, vrsta (struktura) in dinamika agregatov

2.  Aktivnost je odvisna od površinske koncentracije substrata

3.  Specifična struktura (fizikalno-kemijske lastnosti) agregata vpliva na vse aspekte medfazne kinetike

Primer delovanja sPLA2 na veziklih PC - “time scrambling in hopping mode”

t1=0 t3>0

=> v danem trenutku vsaka molekula encima “vidi” drugačno okolje!

t2=0 t1>0

16

•  Tudi S in P se lahko izmenjujejo med agregati

Počasna izmenjava molekul: fosfolipidi v veziklih ~ nekaj ur, dni

kataliza sPLA2~ nekaj ms

Hitra izmenjava molekul: detergent v micelah ~ nekaj ms

fosfolipidi v mešanih micelah ~ sekunde

MERITVE ODRAŽAJO HITROST KATALITSKE

REAKCIJE

MERITVE ODRAŽAJO HITROST PREHAJANJA S IN P

Hitrosti prehajanja E, S in P med agregati vplivajo na makroskopsko stanje sistema, ki ga eksperimentalno zasledujemo:

17

•  Substrat se lahko nahaja v konformaciji, ki pospeši ali inhibira vezavo

•  Sosednje molekule lahko sterično ovirajo vezavo E* in S*

•  Fazne razlike/prehodi in lateralne domene, substratov, produktov, inhibitorjev…

•  Poškodbe površine

•  Kopičenje produktov vpliva na strukturo, afiniteto vezave, aktivnost

•  Dinamika izmenjave S, P in E

•  Procesivnost katalitske reakcije

•  Zasedenost vezavnih mest (“crowding”)

=> možne so številne kinetske poti

E* + S* E*S E* + P* KS* k*cat

Kd

E E + S ES E + P

K’s Ksd Kd

kcat KS

18

•  Vsaka molekula encima mora videti enako! •  Povprečje mikroskopskih dogodkov = makroskopsko stanje

sistema

1.  “Scooting”– drseča/procesivna kataliza, ni izmenjave E, S ali P med agregati

2. “Quasi-scooting”– zelo hitra izmenjava E, S, P med agregati (hitrejša od katalitske reakcije)

1 2 3

4 n

n >> 1000 “scooting mode”

E* izvaja procesivno katalizo do popolne hidrolize zunanje plasti vezikla

19

Ni izmenjave E, S ali P med vezikli (V)

[V] / [E] > 6,6 => največ ena molekula E je vezana na vsakem V, ki vsebuje E

V povprečju se bodo vsi vezikli, ki vsebujejo E,

obnašali enako s časom

20

⇒  merjenje nastajanja produkta v časovni enoti bo vsota produktov, ki nastajajo na vsakem veziklu, ki vsebuje encim.

⇒  lahko povežemo mikroskopske dogodke na posameznem veziklu z makroskopskim obnašanjem sistema

•  pH-stat metoda

•  vezikli DMPM (SUV) –  Kd ~ 0.1 pM –  vezava E*V je res

ireverzibilna!

=> hidrolizira se le del veziklov

DTPM – nehidrolizabilni dietrski fosfolipidi

DMPM

21

•  [E] / [V] > 5 => razgradi se le 60% vseh PL molekul, t.j. vsi PL na zunanji strani vseh veziklov

•  Ni sproščanja vsebine veziklov

•  Reakcija se ustavi, ko ni več PL na zunanji strani E-vsebujočih veziklov

(dokaz: “navidezna aktivacija sPLA2” s polikationskim peptidom polimiksinom B (PxB))

PxB omogoča prehajanje DMPG med vezikli, ne pa tudi DMPA

•  Začetno hitrost v0 in konstanto prvega reda ki dobimo z nelinearno regresijo iz krivulje Pt/Pmax (t)

•  Ns – število molekul S v zunanjem sloju veziklov dobimo iz: Pmax = [E]celotnaNs

•  kcat*, KM*, KP* so še vedno neznanke!

Pt kit = Pmax – ln 1 – ( ) +

Nski

v0 – 1 ( ) Pt

Pmax ( )

kcat* Nski =

KM*(1 + 1/KP*)

22

KCa* KP*

KS*

Ca2+ Kd

•  Disociacijska konstanta Kd (M) je sorazmerna s celotno koncentracijo substrata (oz. z vezavno površino):

–  Kd za vezavo sPLA2 na anionske vezikle DMPM < 10-12 M => ireverzibilna vezava

=> Kd ne vpliva na analizo “scooting”

–  Kd za sPLA2 na nevtralne vezikle PC < 0.01 – 20 mM

=> “scooting” analiza ni mogoča

23

•  2D konstante ravnotežij za vezavo ligandov:

E* + L* E*L (L = S, P, I)

konstante KS*, KP*, KI* (molski odstotek)

–  Določimo jih lahko s spreminjanjem površinskega odstotka liganda (XL*):

XL* = KL* => [E*] = [E*L]

Ko je molski odstotek liganda enak KL* velja, da polovica molekul encima vsebuje vezan ligand.

•  Nevtralni razredčevalec (NR) = 2D inertno topilo –  ne veže se v aktivno mesto, a je podoben substratu! –  tvori vezavno površino za encim –  npr. za ppPLA2: 2-heksadecil-glicero-3-PC

•  Idealen NR omogoča spreminjanje XL od 0 do 1 in s tem določanje KCa*, KS*, KP*, KI* –  metoda temelji na tem, da se E*L bolj počasi inaktivira (alkilacija

His-48 s p-BPB) kot E*

24

•  KM* – površinska Michelisova konstanta odraža molski odstotek

substrata v površini, pri katerem velja [E*] = [E*S]+[E*P] Določimo jo preko odvisnosti v0 od XS (z uporabo NR):

•  kcat* – površinsko pretvorbeno število določimo iz v0 in KM* pri nasičenju encima s substratom: XS=1; E* ~ 0

kcat* v0 =

1 + KM*

kcat* Xs v0 =

Xs + KM* pri Xs < 1

•  Kd = kd / ka~ 10-13 M

kd < 0.00002 s-1

k-3

k3>> k2

35 s-1

1350 s-1

k-2

400 s-1

Vezava sPLA2 na vezikle DMPM je ireverzibilna!

Najpočasnejša stopnja reakcije (tista, ki določa njeno hitrost) je

katalitska stopnja (kcat = k2).

25

“Scooting” analiza je le eksperimentalni “trik”, ki omogoča

kinetsko analizo sPLA2 le pod posebnimi pogoji.

26

Beers et al. (2002) JBC 277.

antibakterijsko delovanje sPLA2 iz skupine IIA

•  Afiniteta za vezavo na membrane – Kd

•  Vpliv Kd na encimsko aktivnost – metoda FABP

•  Vpliv Kd na afiniteto vezave Ca2+ – appKCa

27

•  Težavno pri visokih afinitetah (PM, PG)

•  Produkti vplivajo na Kd

•  nehidrolizabilni fosfolipidi

•  odsotnost Ca2+

•  encimsko neaktivne mutante

• Tehnike temeljijo na: •  fizično ločevanje E in E*

•  spremembe spektralnih lastnosti (Trp, FRET)

•  kinetska ali ravnotežna analiza s SPR

nehidrolizabilni dietrski fosfolipidi

Kd S

ni hidrolize

Ca2+

28

Bezzine et al., (2002) J. Biol. Chem. 277.

hGIIA sPLA2 se ne more vezati na zunanjo plast

plazemske membrane (< 5% anionskih PL)!

*

Kd = 0.23 mM (20% PS/PC)

Bezzine et al., (2002) J. Biol. Chem. 277.

Kd = 0.0026 mM (20% PS/PC)

afiniteta vezave je višja ~100x!

hGIIA-V3W lahko deluje na zunanji strani

celične membrane!

29

•  Začetna hitrost hidrolize (v0)

•  Prednost metode: substrat so lahko poljubni

glicerofosfolipidi s poljubnimi strukturami agregatov

•  Zelo občutljiva metoda (0,01-5 pmol sPLA2)

11-dansyl-undecanoic acid - DAUDA FABP

MK

LUV

PLA2

30

kačje sPLA2 *sesalske sPLA2

specifične encimske aktivnosti (µmol / min x mg)

POPG

POPS

POPC

vezikli

* skupine I, II, V, X in XII;

Singer in sod. (2002), JBC 277, 50. Petan et al., (2005) Biochemistry, 44.

350 - 2100 0,1 - 1000

430 - 2000

0,3 - 100

0,022 - 55

0,03 - 30

AtxA

•  mutant AtxA(V31W)

31

Petan et al., (2005) Biochemistry, 44.

32

•  Meritve v0 v odvisnosti od [Ca2+] z metodo FABP

•  Vezikli poljubne sestave

•  Določimo navidezno KCa (appKCa)

vmax [Ca2+] v0 =

[Ca2+] + appKCa

Ca2+

S

Ca2+

Kd sPLA2

KCa

KS*

appKCa = f (Kd, KCa, [V])

33

Petan et al., (2005) Biochemistry, 44.

appKCa = 25 ± 4 µM vmax [Ca2+] v0 =

[Ca2+] + appKCa

Petan et al., (2005) Biochemistry, 44.

Ko je sPLA2 močno vezana na membrano, potrebuje nižje koncentracije kalcija za doseganje maksimalne hitrosti hidrolize.

34