MEDDELELSE NR. 857 - Ærlig og professionel … med SpermVision Fra hver blev cirka 10 ml sæd...

MEDDELELSE NR. 857

2. DECEMBER 2009

AF: Anja Kibsgaard Olesen og Claus Hansen

Produktionen af sæddoser skal være så skånsom som muligt for sæden. I den proces er det vigtigt at være

opmærksom på:

● kvaliteten af fortynder

● materialer som sæden kommer i kontakt med

● hygiejne

● temperaturen på fortynderen, når sæden fortyndes.

Formålet med denne afprøvning var at klarlægge effekten af temperaturen i for- og slutfortynder på sædens

bevægelighed målt med computer assisted sperm analysis (CASA) på 3. dagen efter sædopsamling.

Afprøvningen var opdelt i to delundersøgelser. Hver delundersøgelse omfattede sæd fra i alt 20 orner. Sæden

blev for- og slutfortyndet med EDTA-ornesædsfortynder med forskellige temperaturer. Normal procedure for KS-

stationer er for-fortynding med 30 grader varm fortynder og slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Dette

blev sammenlignet med for- og slutfortynding med 20 eller 30 grader varm fortynder.

Der sås positiv effekt på sædens bevægelighed med fortynding af sæd med 20 grader varm fortynder ved både

for- og slutfortynding af sæden i forhold til de andre anvendte temperaturer.

Baggrund Produktionen af sæddoser skal være så skånsom som muligt for sæden. I den proces er det vigtigt at være

opmærksom på kvaliteten af fortynder og de materialer som sæden kommer i kontakt med samt hygiejnen, men

også temperaturen på fortynderen når sæden fortyndes.

Der var positiv effekt på sædens bevægelighed, når sæden blev både for – og slutfortyndet med 20 grader varm fortynder.

© VIDENCENTER FOR SVINEPRODUKTION 2009TEKSTEN MÅ MED KILDEANGIVELSE FRIT ANVENDES

en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 1

Selve fortyndingsprocessen af sæden sker i dag i to trin – en for-fortynding og slutfortynding. DanAvls KS-

stationer anvender til for-fortyndingen 30 grader varm EDTA-ornesædsfortynder [1]. Normal praksis for KS-

stationerne er anvendelse af 20 grader varm fortynder ved slut-fortyndingen. Normalt slut-fortyndes sæden inden

for cirka en time efter for-fortynding. Det tidsrum er tilstrækkeligt til, at for-fortyndet sæd til tider nedkøles til cirka

22 grader inden slutfortyndingen.

Hvis der anvendes materialer eller procedurer i produktionen af sæddoser, som er skadelige for sædcellerne,

kan sædcellerne miste evnen til at befrugte. I laboratoriet kan det ikke lade sig gøre at måle om enkelte

sædceller har mistet evnen til at befrugte, men der findes flere metoder til at undersøge om sæden kunne have

reduceret frugtbarhed. Disse metoder omfatter som eksempel måling af om sædcellerne er levende [2] eller

sædcellernes svømmehastighed [3], [4]. Nyere studier hos Videncenter for Svineproduktion har tillige vist, at

måling af sædcellernes bevægelighed på 3. dagen målt med computer assisted sperm analysis (CASA)har

sammenhæng til kuldstørrelsen (data ikke publiceret).

Formålet var at undersøge effekten af temperaturen i for- og slutfortynder på sædens bevægelighed målt med

computer assisted sperm analysis (CASA) på 3. dagen efter sædopsamling.

Materiale og metode Afprøvningen omfattede to separate delundersøgelser (tabel 1). Hver delundersøgelse omfattede sæd fra 10

forskellige orner fra henholdsvis Landrace og Yorkshire. Sæden blev opsamlet, behandlet i overensstemmelse

med reglerne for avl drift og smittebeskyttelse for KS-stationer [1]. Al sæden var desuden godkendt i henhold til

førnævnte regler for KS-stationerne. Temperaturen i sæden blev kontrolleret med IR-termometer +/- 0,5 graders

nøjagtighed umiddelbart efter sædopsamling, ved for-fortynding samt slutfortynding.

Delundersøgelse 1 Efter sædopsamling blev råsæden omhældt til en 2 liter polyethylen (PE) dunk. Sædens motilitet blev bestemt i

henhold standardmetode for DanAvls KS-stationer [1]. Sædkoncentrationen blev bestemt med NucleoCounter

SP100, ved udtagelse af 50µl sæd, som blev fortyndet med 10,00 ml S100 Reagens og analyseret i instrumentet.

Efterfølgende blev sæden fortyndet i PE dunken med 30 grader varm fortynder til en koncentration på 80 mio.

motile sædceller pr. ml (for-fortynding).

Fra PE dunken med for-fortyndet sæd blev produceret en sæddose til hver af grupper 1 og 2. Dunken med for-

fortyndet sæd blev efterfølgende hensat ved cirka 20 grader indtil temperaturen i sæden havde nået cirka 22

grader. Efterfølgende blev en dose til gruppe 3 produceret.

Sæddoserne blev produceret ved at tilsætte 56 ml fortynder til en sædpose, hvorefter 25 ml for-fortyndet sæd blev

tilsat. Sædposen blev straks herefter lukket og lagt til opbevaring ved 17 grader og efter tre dage analyseret med

SpermVision CASA System.

Delundersøgelse 2 Efter sædopsamling blev råsæden omhældt til en 2 liter polyethylen (PE) dunk. Sædens motilitet blev bestemt i

henhold standardmetode for DanAvls KS-stationer [1]. Sædkoncentrationen blev bestemt med NucleoCounter

SP100, ved udtagelse af 50µl sæd, som blev fortyndet med 10,00 ml S100 Reagens og analyseret i instrumentet.


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 2

Herefter blev 20 ml råsæd fordelt til hver af tre forskellige 2 liters PE dunke. Sæden i hver dunk blev henholdsvis

for-fotyndet og slutfortyndet i henhold til forsøgsdesign som beskrevet i tabel 1. Slutfortyndet sæd blev fyldt på

sæddoser som beskrevet under delundersøgelse 1. Sæddoserne blev opbevaret ved 17 grader og analyseret

med SpermVision CASA System på 3. dagen efter sædopsamling.

Analyse med SpermVision

Fra hver blev cirka 10 ml sæd omhældt til 10 ml NUNC-rør til varme-reaktivering af sæden. Ved varmereaktivering

blev sæden opbevaret i 38 grader varmt vandbad i 50±5 minutter.

Efter varmereaktivering blev udtaget 2,3 µl sæd som blev overført til 20 µm dybt Leja-4 tællekammer. Sædens

bevægelighed blev analyseret straks med SpermVision CASA System i henhold til standardmetode som

beskrevet ved en tidligere afprøvning [5]. Sæd fra alle NUNC rør blev analyseret to gange. For hver sædcelle blev

registreret gennemsnitlig drejning af sædcellehovedet (AOC) samt gennemsnitlig svømmehastighed (VCL). Hver

analyse omfatter måling af cirka 600-1.000 sædceller.

Tabel 1. Oversigt over forsøgsdesign for delundersøgelse 1 og delundersøgelse 2

Statistik

Delundersøgelse 1

Gruppe Temperatur på fortynder ved for-fortynding

Behandling af sæden mellem for- og slutfortynding

Temperatur på fortynder ved slutfortynding

1 (Kontrol)

30 °C Slutfortynding straks 20 °C

2 30 °C Slutfortynding straks 30 °C

3 30 °C Nedkøling til 22 grader 20 °C

Delundersøgelse 2

Gruppe Temperatur på fortynder ved for-fortynding

Behandling af sæden mellem for- og slutfortynding

Temperatur på fortynder ved slutfortynding

1a (kontrol)

30 °C Slutfortynding straks 20 °C

2a 20 °C Slutfortynding straks 20 °C

3a 30 °C Nedkøling til 22 grader 20 °C


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 3

Sædceller blev karakteriseret som bevægelige ved AOC>5. For bevægelige sædceller blev der for hver analyse

beregnet sædens bevægelighed og karakterisering af sædcellernes bevægelsesmønster (se tabel 2 og figur 1).

Tabel 2. Definition af afhængige variable i den statistiske analyse

AOC Average Orientation Change angiver gennemsnitlig drejning af sædcellens hoved.

Sædcellernes bevægelighed

Alle sædceller med AOC > 5 grader er bevægelige. Kun bevægelige sædceller er medtaget i analyser af sædcellernes hastighed og bevægelsesmønster.

VCL Velocity Curved Line angiver sædcellens direkte svømmehastighed i analysen (figur 1). VCL for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse.

R-VCL Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne.

VSL Velocity Straigh Line angiver hastigheden for sædcellens bevægelse fra startpunktet til slutpunktet i analysen (figur 1). VSL for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse.

R-VSL Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne.

VAP Velocity Average Path angiver sædcellens gennemsnitlige svømmehastighed som udglattet linie (figur 1). VAP for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse.

R-VAP Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne.

LIN Linearity angiver forholdet mellem VSL og VCL og udtrykker om sædcellen har en lige bevægelse eller svømmer i ring.

STR Straightness angiver forholdet mellem VSL og VAP og udtrykker om sædcellen har en lige fremadrettet bevægelse.


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 4

Figur 1. Skematisk oversigt over definitioner af hastighedsmålinger for sædcellens bevægelsedescriptiondescription

Data blev analyseret med mixed model analysis i SAS version 9.13. Analysen kan beskrives ved følgende model:

Yi jk= μ + Ai+ Bj+ wk + ei jk

Y er den afhængige variabel. ”μ” angiver det generelle gennemsnit for henholdsvis sædens bevægelighed, VCL og R-VCL, Ai henviser til, om prøven er kontrol- eller forsøgsgruppe, Bj angiver om prøven er fra en Landrace eller

Yorkshire orne, wk angiver tilfældig variation mellem sædopsamlinger fra de forskellige orner og ei j er

residualvariationen (antages normalt fordelt).

Temperaturen af sæd og fortynder er beregnet som gennemsnit med standardafvigelse for alle

sædopsamlingerne inden for hver af grupperne.

Resultater og diskussion Gennemsnit for temperaturen på sæd og fortynder i fortyndingsprocessen svarede til det forventede (tabel 3).

Temperaturen i sæden var godt 30 grader umiddelbart efter sædopsamling.

Tabel 3. Oversigt over temperatur i sæd og fortynder ved fortyndingen af sæden.


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 5

Sæden i gruppe 1 og 2 i begge delundersøgelser blev for- og slutfortyndet straks. Temperaturen i den for-

fortyndede sæd umiddelbart inden slutfortyndingen er derfor ikke målt. Sæden i gruppe 1 og 2 i begge

delundersøgelser blev slutfortyndet inden for cirka 5 minutter efter sæden var leveret til laboratoriet.

Der sås i undersøgelsen ingen forskelle mellem grupperne ved måling af VSL, R-VSL, VAP, R-VAP, STR eller

LIN. Estimater for disse parametre er ikke vist.

Delundersøgelse 1

Gruppe Ved for-fortynding – temperatur i - Ved slutfortynding –

temperatur i -

- Sæden Fortynder For-fortyndet sæd Fortynder

1 (kontrol) 33,8 ± 1,9 ºC 29,9 ± 0,4

ºC - 20,1 ± 0,4 ºC

2 33,8 ± 1,9 ºC 29,9 ± 0,4 ºC - 29,9 ± 0,4

ºC

3 33,8 ± 1,9 ºC 29,9 ± 0,4 ºC 22,2 ± 1,3 ºC 20,1 ± 0,4

ºC

Delundersøgelse 2

Gruppe Ved for-fortynding – temperatur i - Ved slutfortynding–

temperatur i -

- Sæden Fortynder For-fortyndet sæd Fortynder

1 (kontrol) 33,5 ± 1,5 ºC 30,0 ± 0,7

ºC - 19,5 ± 0,5 ºC

2 33,5 ± 1,5 ºC 19,5 ± 0,5 ºC - 19,5 ± 0,5

ºC

3 33,5 ± 1,5 ºC 30,0 ± 0,7 ºC 22,3 ± 0,3 ºC 19,7 ± 0,3

ºC


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 6

Der var forskel i svømmehastigheden for sædcellerne fra henholdsvis Landrace og Yorkshire orner, hvilket kan

være et udtryk for raceforskelle (tabel 4). Derimod er andelen af bevægelige sædceller for orneracerne ikke

forskellig, hvilket kan være et udtryk for, at kun et lille antal orner indgik i undersøgelsen. Enkelte orner med lavt

antal bevægelige sædceller kan forskubbe resultaterne meget.

Resultaterne fra delundersøgelse 1 viste negativ effekt ved slutfortynding med 30 grader varm fortynder (tabel 4) i

forhold til slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Der var derimod ingen forskel om sæden blev slutfortyndet

straks med 20 grader varm fortynder, eller om den for-fortyndede sæd blev kølet inden slutfortynding med 20

grader varm fortynder. Effekten sås både ved et fald i andelen af bevægelige sædceller og svømmehastigheden

for de bevægelige sædceller (VCL). Behandlingen medførte ikke, at populationen af sædceller i en prøve blev

mere uens i svømmehastigheden, idet R-VCL ikke blev påvirket af behandlingen.

Tabel 4. Oversigt over resultater for analyse af andelen af bevægelige sædceller, median for sædcellernes

svømmehastighed (VCL) samt range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne for VCL (R-VCL).


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 7

Forskelligt bogstav i hævet skrift indikerer statistisk sikker forskel (p<0,05) mellem grupper eller orneracer inden

for hver af henholdsvis andelen af bevægelige sædceller, VCL og R-VCL

Resultaterne fra delundersøgelse 2 viste ligeledes ens resultater ved for-fortynding med 30 grader varm fortynder

og 20 grader varm slutfortynder, uanset om fortyndingen skete straks eller efter køling af for-fortyndet sæd. Dog

sås en øget andel af bevægelige sædceller ved for-fortynding og slutfortynding med 20 grader varm fortynder.

Sædcellernes bevægelseshastighed var den samme for alle grupper. Disse resultater er i modstrid med

tidligere undersøgelser [6], som ikke fandt forskel mellem de tre fortyndingsprocedurer som anvendt i denne

undersøgelse. Dog blev ved de tidligere undersøgelser anvendt subjektiv vurdering af sædens bevægelighed,

hvilket vil kunne have maskeret de relativt små forskelle fundet i denne undersøgelse.

Delundersøgelse 1

Gruppe Andelen af bevægelige sædceller VCL R-VCL

Gruppe 1 65,1 pct. a 112,1 µm/sek. 91,9 µm/sek.

Gruppe 2 59,2 pct. b 108,7 µm/sek. 90,6 µm/sek.

Gruppe 3 64,8 pct. a 112,4 µm/sek. 90,2 µm/sek.

Landrace orner 72,1 pct. a 121,0 µm/sek. a 96,4 µm/sek. a

Yorkshire orner 54,0 pct. b 101,1 µm/sek. b 85,4 µm/sek. b

Delundersøgelse 2

- Andelen af bevægelige sædceller VCL R-VCL

1 (kontrol) 74,3 pct. a 109,7 µm/sek. 78,3 µm/sek.

2 76,9 pct. b 109,9 µm/sek. 78,4 µm/sek.

3 74,1 pct. a 109,0 µm/sek. 78,9 µm/sek.

Landrace orner 74,6 pct. 110,6 µm/sek. 78,9 µm/sek.

Yorkshire orner 75,5 pct. 89,2 µm/sek. 78,2 µm/sek.


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 8

Samlet kan tolkes, at hurtig nedkøling af sædcellerne bevarer sædcellernes evne til at bevæge sig på 3. dagen.

Dette kan konkluderes, da andelen af bevægelige sædceller steg, sammenholdt med at ingen andre

måleparametre blev påvirket. Resultaterne indikerer således, at sædcellernes bevægelsesmønster, ikke

ændres ved den hurtige nedkøling, da behandlingen ikke påvirkede hverken LIN eller STR, som kan opfattes

som mål for sædcellernes svømmeretning.

Tidligere undersøgelser har vist, at både sædens bevægelighed, integriteten af plasmamembranen og

akrosomet kan tage skade ved køling af sæden [7], samt at faktorer som akrosom og mitokondriel aktivitet også

tager skade før bevægeligheden påvirkes [8]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare, om disse

strukturer i sædcellen tager skade af det kuldechok sædcellerne udsættes for ved for- og slutfortynding med 20

grader varm fortynder. Det kan derfor ikke endeligt konkluderes, at sædcellernes befrugtningsevne eller sædens

holdbarhed vil blive bedre, hvis der anvendes en for- og slutfortynding med 20 grader varm fortynder frem for en

for-fortynding med 30 grader varm fortynder og slutfortynding med 20 grader varm fortynder.

Konklusion Der sås positiv effekt af både for- og slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Effekten var lille og kunne

måles på andelen af bevægelige sædceller.

Referencer


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 9

Afprøvngingen var delvist finansieret af DanAvls KS-stationer

Deltagere

Laboratorietekniker Cicilie Line Jensen, Hatting-KS, Ringsted

Afprøvning: 1005

[1] Hansen, C. (2009): Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer. Manual nr. 6, Dansk Svineproduktion.

[2] Madsen, M.T., Wachmann H., Johansen, D., Christensen, P. (2002): Vitalitetsbestemmelse af ornesæd ved flowcytometri. Meddelelse nr. 564, Landsudvalget for Svin.

[3] Holt, C., Holt, W.V., Moore, H.D., Reed, H.C., Curnock, R.M. (1997): Objectively measured boar sperm motility parameters correlate with the outcomes of on-farm inseminations: results of two fertility trials. J Androl;18:312-23.

[4] Hirai, M., Boersma, A., Hoeflich, A. et al. (2001): Objectively measured sperm motility and sperm head morphometry in boars (Sus scrofa): relation to fertility and seminal plasma growth factors. J Androl;22:104-10.

[5] Hansen, C. (2008): Validering af SpermVision CASA System til måling af ornesædcellers bevægelighed. Rapport nr. 31, Dansk Svineproduktion.

[6] Vesterager, L. (1993): Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motiliteten i ornesæd. Meddelelse nr. 266, Landsudvalget for Svin.

[7] White, I.G. (1993): Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod Fertil Dev;5:639-58.

[8] Waberski, D. (2009): Personlig meddelelse. Professor i Reproduktionsmedicin hos svin og små ruminanter, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany.

© VIDENCENTER FOR SVINEPRODUKTION 2010.

TEKSTEN MÅ MED KILDEANGIVELSE FRIT ANVENDES.

OPDATERET D. 02.12.2009

Tlf: 33 73 27 00


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 10

Printet er fra vsp.lf.dk 03.01.2010

Ophavsretten tilhører Videncenter for svineproduktion. Informationerne fra denne hjemmeside må anvendes i anden

sammenhæng med kildeangivelse.

Ansvar: Informationerne på denne side er af generel karakter og søger ikke at løse individuelle eller konkrete rådgivningsbehov.

Videncenter for svineproduktion er således i intet tilfælde ansvarlig for tab, direkte såvel som indirekte, som brugere måtte lide

ved at anvende de indlagte informationer.

Artiklen findes på adressen: http://vsp.lf.dk/Publikationer/Kilder/lu_medd/2009/857.aspx

Fax: 33 11 25 45

[email protected]

en del af


en del af

[email protected]

TLF: 33 73 27 00FAX: 33 11 25 45

SIDE 11

MEDDELELSE NR. 857 - Ærlig og professionel … med SpermVision Fra hver blev cirka 10 ml sæd...

Documents

Transcript of MEDDELELSE NR. 857 - Ærlig og professionel … med SpermVision Fra hver blev cirka 10 ml sæd...