MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
Transcript of MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
1/13
ENZM AKTVTESNNENZM AKTVTESNN
LLMESLLMESveveHESAPLANMASIHESAPLANMASI
UVUV--VIS ABSORPSYONVIS ABSORPSYONSPEKTROFOTOMETRSSPEKTROFOTOMETRS
FLUORESANSFLUORESANSSPEKTROFOTOMETRSSPEKTROFOTOMETRS
RADYOAKTFRADYOAKTFYNTEMLERYNTEMLER
Enzimlerin doku ve hcrelerdeki konsantrasyonu son derecedk olduundan miktarlarn lmek ok gtr. En iyilme yntemi enzimin katalitik aktivitesinikatalitik aktivitesini lmektir.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
2/13
ENZM AKTVTESN LMEK:ENZM AKTVTESN LMEK:
Belli bir zaman aralnda enzimin katalizetkinlii sonucu oluan
DEMDEMsaptamaktr.
RNOLUUMU SUBSTRATEKSLMES
SPEKTROFOTOMETRK YNTEMLERLESPEKTROFOTOMETRK YNTEMLERLE
Enzim miktar, genelde, enzimkonsantrasyonu ile doru orantlolarak meydana gelen rn miktar
llerek saptanr.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
3/13
Balang Hz "Initial rate":Balang Hz "Initial rate":
vvoo Aktivite lm, henz reaksiyon hzndabir dmenin olmad ksa zaman
aralnda yaplr.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
4/13
Bu dnemde gvenilirgvenilir bir lm
iin: Enzim ve substrat deriimi reaksiyonun
optimum hzda gereklemesine yetecek
ekilde ayarlanmal, Scaklk kontrol altnda tutulmal,
lm yaplan karmn homojen olmassalanmal,
ok salkl kr ve kontrol lmleri
yaplmaldr.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
5/13
KR (BLANK)KR (BLANK)allan dalga boyundaki n
absorplayacak maddeyiiermeyen reaksiyon ortam
KONTROL(LER)KONTROL(LER)
Reaksiyon ortamndaki etkinliipheli olan bileenler (r.Koenzimler)
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
6/13
LEMLERLEMLER
Spektrofotometre lmden 10-15 dak ncealtrlr; alma ortamnn scakl
ayarlanr; doru ve temiz kvetler seilir. Reaksiyonu balatacak bileen hari diertm bileenler kvete (ift nl aletlerde
her iki kvete) konulur. Alet sfrlanr("Auto-Zero").
Reaksiyonu balatacak bileen eklenir veetkin bir ekilde karmas salanarak lma lr.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
7/13
Yksek Km deeri sz konusu ise aktivite lmnde substratkonsantrasyonu yksek tutulmaldr.
Olanaklar el verdii lde safsaf enzimle almakta yararvardr.
zelti eklinde saklanan enzimlerde zamanla aktivite kaybolaca unutulmamaldr. Liyofilize halde saklamak dahaelverilidir.
lmlerde kullanlan kimyasallarn saf olmas arttr. Kalitene kadar yksek olursa, hata pay o kadar azalr.
Cam eyalarn temiz olmas, deterjan art bulunmamas, safsuyun yksek kalitede olmasna zen gsterilmelidir.
Reaksiyon karmna katlacak maddelerin pH'lar elveriliolmaldr.
TEKNK OLARAK DKKATTEKNK OLARAK DKKATEDLECEK NOKTALAREDLECEK NOKTALAR
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
8/13
ENZM AKTVTESNN HESAPLANMASI:ENZM AKTVTESNN HESAPLANMASI:
Birimler ve Spesifik AktiviteBirimler ve Spesifik AktiviteAbsorpsiyon (Ekstinksiyon) KatsaysAbsorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsays
Spektrofotometrik lmn dayand BeerSpektrofotometrik lmn dayand Beer--Lambert yasasna gre Absorbans (A; ya daLambert yasasna gre Absorbans (A; ya da
Optik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapanOptik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapanmaddenin deriimi (c) ve nn katettii yol (d)maddenin deriimi (c) ve nn katettii yol (d)
ile doru orantldr:ile doru orantldr: A=A=IIPPcdcd
Buna gre:Buna gre: c =c = AAIIPPdd c =c = AAIIPP
1 cm old.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
9/13
Deriimi 1 M olan bir kromoforunDeriimi 1 M olan bir kromoforunk yolu 1 cm olan birk yolu 1 cm olan bir
spektrofotometrede ortaya koyduuspektrofotometrede ortaya koyduuabsorbansabsorbans Molar AbsorpsiyonMolar Absorpsiyon
(Ekstinksiyon) Katsays ((Ekstinksiyon) Katsays (IIPP)) olarakolaraktanmlanr.tanmlanr.
Birimi MBirimi M--11cmcm--11 'dir.'dir.(lmol(lmol--11cmcm--11 veya mmolveya mmol--11cmcm22 'ye edeerdir)'ye edeerdir)
cmcm22molmol--11 (M(M--11cmcm--11'in 1000 kat) olarak da ifade edilir'in 1000 kat) olarak da ifade edilir
A=A=IIPPcdcd
1 cm1 M
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
10/13
Bu durumda hesaplanan deriiminBu durumda hesaplanan deriimin(c'nin) birimi M (mol/l)'dr.(c'nin) birimi M (mol/l)'dr.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
11/13
Bir enzimin aktivitesini eitli biimlerde ifade etmek
mmkndr:rnein,Birim zamanda enzim tarafndan meydana getirilen
absorbans deiimi: (dA/dt)Ancak daha standart bir birim olan NTE (U;NTE (U;"International Unit", IU)"International Unit", IU) daha genikullanm alan bulur.Buna gre 1 nite Enzim, 1 dakikada 1 Qmol rnnoluumunu (veya 1 Qmol substratn dnmn)katalizleyen enzim miktardr (U= Qmol /dak)
Enzim Aktivitesinin TanmlanmasEnzim Aktivitesinin Tanmlanmas
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
12/13
rnekteki Enzimrnekteki Enzimnitesi =nitesi =
VVtt x dA/dt x 1000 x sulandrma faktrx dA/dt x 1000 x sulandrma faktr
IIPPvvss x dx d
Deneysel lmlerin niteye DntrlmesiDeneysel lmlerin niteye Dntrlmesi
VVtt = Reaksiyon karmnn toplam hacmi (ml)= Reaksiyon karmnn toplam hacmi (ml)
dA/dt = dakikada Absorbans deiimi (dakdA/dt = dakikada Absorbans deiimi (dak--11))
IIPP= Absorpsiyon katsays (cm= Absorpsiyon katsays (cm22molmol--11))
VVss = Reaksiyon ortamna katlan rnek (enzim) hacmi= Reaksiyon ortamna katlan rnek (enzim) hacmi(ml)(ml)
D = kvetteki k yolu (genellikle 1 cm)D = kvetteki k yolu (genellikle 1 cm)
1000 arpan enzimi1000 arpan enzimi QQmole evirmek iindir.mole evirmek iindir.
-
8/6/2019 MBKY-II-7.ders-enzim-II 25.05.2011
13/13
SPESFK AKTVTE = U/mg proteinSPESFK AKTVTE = U/mg protein
Saf bir enzimin spesifik aktivitesiSaf bir enzimin spesifik aktivitesisabittir ve o enzime zg bir deerdir.sabittir ve o enzime zg bir deerdir.Bu aktivite birimi, enzimin saflnBu aktivite birimi, enzimin safln
tanmlayan bir lttr.tanmlayan bir lttr.
Ham ztlerde protein deriimiHam ztlerde protein deriimi
yksektir. Dolaysyla ilgilenilen enziminyksektir. Dolaysyla ilgilenilen enziminspesifik aktivitesi DK kar. Enzimispesifik aktivitesi DK kar. EnzimiSAFLATIRDIKA spesifik aktivitesiSAFLATIRDIKA spesifik aktivitesi
YKSELR.YKSELR.