Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya A.D...
Transcript of Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya A.D...
Antioksidan Moleküllerin Farklı Yöntemler
ile Lipozomlanması
Ziba Mokhberi Oskouei1, Gökhan Biçim1,2, A. Suha Yalçın1,2
1 Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya A.D., Haydarpaşa, İstanbul
2Oksante Ar-Ge Laboratuvarı, Eyüp, İstanbul
Lipozom oluşumu ve yapısı
Lipozomlar, tek veya iç içe birçok tabakadan oluşmuş, aralarında sulu faz içeren küresel
vesiküllerdir.Lipozomlar lipit tabaka ve sulu faz olmak üzere iki bölümden oluşurlar. Lipit
tabakanın temel yapıtaşıfosfolipitlerdir. Sulu faz, tek bir tabakadan oluşan lipozomlarda içteki
bölümdür. İlk keşfedildiği yıllarda biyolojik membran özellikleri ile ilgili çalışmalarda
kullanılmış olan lipozomlar, günümüzde başta ilaç taşıyıcı sistemler olmak üzere birçok bilim
dalında farklı kullanım alanlarına sahiptir.. Lipozomlar, biyogeçimli ve biyoparçalanan
özellikteki lipit içerikleri sayesinde hücre membran yapısına benzerlik gösterir ve benzerlik
derecesi çeşitli kimyasal modifikasyonlarla artırılabilir. Bu özellikleri sayesinde, ilaç
hedeflendirme çalışmalarında ve immun sistemin modulasyonunda yaygın olarak kullanılırlar.
Lipozomların yapısı farklı özellikte birçok maddeyi üzerlerinde taşımaya uygun olduğundan
kullanım alanları giderek genişlemektedir.
Bu çalışmada, farklı antioksidan moleküllerin değişik lipozom hazırlama yöntemleri (ince
tabaka, ters faz, dondurma-çözme, aralıklı sonikasyon) ile lipozomlanması ve lipozom
yapısında aktivitelerini koruyup korumadıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Ayrıca değişik
lipozom elde etme yöntemleri karşılaştırılarak aralarından en uygun olan yöntemin
belirlenmesi hedeflenmiştir. Farklı yapısal özellikteki antioksidan moleküllerin
lipozomlanması ve karakterizasyonu ile ilgili ön denemelerden sonra, C vitamini, E vitamini
ve polifenol ekstresi içeren lipozomlarda antioksidan aktivite ölçümleri yapıldı. E vitaminli
lipozomların en yüksek Trolox eşdeğeri aktiviteye sahip olduğu bulundu. Ayrıca, E vitaminli
lipozomların santrifuj öncesi ve sonrası antioksidan aktivitesi ölçüldüğünde, ‘pellet’ kısmında
yüksek antioksidan aktivite gözlendi. Kullandığımız yöntemlerden aşamalı sonikasyon
yönteminin diğerlerinden daha kısa sürede sonuçlanması ve metanol, kloroform gibi organik
çözücüler içermemesi nedeni ile daha avantajlı ve kullanışlı olduğu sonucuna varıldı.
Işık mikroskopu ile boş
lipozom görüntüsü (40x)
Floresan mikroskop ile boş
lipozom görüntüsü (63x)
İnce tabaka yöntemiyle elde edilmiş lipozomların boyut analizi
Dondurma-çözme yöntemiyle elde edilmiş
lipozomların boyut analizi Particle Size Distribution
0.01 0.1 1 10 100 200
Particle Size (µm)
0
2
4
6
8
10
12
14
Volu
me (
%)
lipozom-5, 19 Haziran 2012 Salý 15:52:11
Particle Size Distribution
0.01 0.1 1 10 100 200
Particle Size (µm)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Volu
me (
%)
lipozom_7, 19 Haziran 2012 Salý 16:53:20
D (0.5)=12,282
HPLC yöntemi ile fenolik bileşik tayini
Çay polifenollerinin HPLC ile analizi
Antioksidan lipozomlarda CUPRAC
yöntemiyle antioksidan aktivite ölçümü
Lipozomlanmış C vitamini, lipozomlanmış E vitamini
ve lipozomlanmış polifenol Ekstresinde antioksidan
aktivite ölçümleri yapıldığında E vitaminli lipozomların
en yüksek Trolox eşdeğeri aktiviteye sahip olduğu
bulundu.
CL EL PFL
mM TR 8,63 13,57 7,36
0
2
4
6
8
10
12
14
16
CL: C vitaminli Lipozom, EL: E vitaminli Lipozom, PFL: Polifenolik Lipozom
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
PFL (A-280)
PF (A-280)
BL (A-280)
Sephadex G-25 kolon kromatografisi
Lipozomlanmış ve lipozomlanmamış
moleküllerin ayrımı Sephadex G-25 kolon
kromatografisi ile gerçekleştirildi. Ayrıca elde
edilen fraksiyonların 280 nm’deki
absorbansları ile antioksidan aktiviteleri
ölçülerek grafiklendi. Lipozomca yoğun
fraksiyonlar 4. – 6. fraksiyonlar arasındaydı.
Serbest radikaller yaşam için gerekli, ama hücrede oluşumları kontrolsüz bir davranış gösterirse oksidatif hasarlara neden olan bileşiklerdir. Oksijenli yaşamla birlikte aerobik organizmalarda oksijen kaynaklı
radikaller oluşmaya başlamıştır. Bununla eş zamanlı olarak, tüm aerobik canlılarda oksidatif hasara karşı koyan antioksidan savunma sistemleri gelişmiştir. Günümüzde antioksidanların lipitleri, proteinleri,
nükleik asitleri ve diğer hedef makromolekülleri koruyucu etkileri olduğu bilinmektedir. Serbest radikal düzeyleri ile antioksidanlar arasındaki denge bozulduğunda oksidatif stres durumu ortaya çıkar.
Farklı Lipozom Elde Etme Yöntemlerinin Karşılaştırılması
Aşamalı sonikasyon işleminin lipozom boyutlarına etkisi
A-Sonikasyon yok; B-10x sonikasyon; C- 20x sonikasyon;
D-30x sonikasyon şık mikroskopu görüntüsü (40x)
1: GA-Gallik asit 2: EGC-Epigallokateşin 3: K-Kafein 4: EC-Epikateşin 5: EGCG Epigallokateşingallat 6: ECG-Epikateşingallat 7: T-Teaflavin
Folin yöntemi ile total fenolik bileşik tayini Çaydan polifenol ekstresi elde edildikten sonra Folin yöntemiyle yapılan toplam fenolik bileşik tayini tungsten ve molibden oksitleri indirgeme kapasitesine dayanır. Reaksiyon, koyu mavi renk oluşumuyla sonlanır. 750 nm dalgaboyundaki absorbansı okunur. Çay örneklerinin Trolox cinsi fenolik bileşik içeriğinin 4.5 mM olduğu bulundu.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
A-280
mM TR
Antioksidan aktivite ölçümü CUPRAC yöntemi ile suda ve yağda çözünen moleküllerin antioksidan aktivitelerinin ölçümü bakır iyonu indirgeme kapasitesine dayanır. Reaksiyon, açık mavi renk oluşumuyla sonlanır. 450 nm dalgaboyundaki absorbansı okunur.
E vitaminli antioksidan lipozomlarda CUPRAC
yöntemiyle antioksidan aktivite ölçümü
E vitaminli lipozomlar elde edildikten sonra
lipozomların santrifüjle çöktürülmesi
sonrasında yapılan aktivite ölçümleri alt ve üst
fazlar arasında belirgin aktivite farkı olduğunu
gösterdi .
GA 0.157mM EGC 0.395mM K 0.035mM EC 0.124mM EGCG 0.133mM ECG 0.029mM T 0.122mM
Lipozom elde etme yöntemleri İnce tabaka yöntemi Ters faz buharlaştırma yöntemi Dondurma çözme yöntemi Aşamalı sonikasyon yöntemi
Antioksidan aktivite ölçümü
Lipozomlanmış polifenol ekstresi Sephadex G-25 jel
filtrasyon kromatografisi ile fraksiyonlara ayrıldıktan sonra
elde edilen fraksiyonların antioksidan aktiviteleri CUPRAC
yöntemiyle ölçüldü.Lipozomca yoğun olan fraksiyonların en yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu gözlendi.
Farklı fenolik bileşiklerin HPLC kromatogramı
D (0.5)=9,784
Kolon: 2x26 cm; Örnek hacmi: 1 ml; Elüsyon: % 0.9 NaCl; Akış hızı: 2 ml/dakika
18,8
1,89
13,4
Alt Faz
Üst Faz
Santrifüj Öncesi
mM Trolox
İnce tabaka yöntemiyle elde edilmiş
lipozomların boyut analizi