MARISTELA BARBOSA PORTELA

ESTUDO DE PROTEÍNAS FUNCIONAIS DE Candida spp. ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO VÍRUS DA

IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA

Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro

2006

Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia),

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes

da Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Doutor em Ciências

Biológicas (Microbiologia).

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2

FICHA CATOLOGRÁFICA

PORTELA, Maristela Barbosa

Estudo de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas da cavidade

bucal de crianças infectadas pelo Vírus da Imunodeficiência Humana /

Maristela Barbosa Portela. – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Microbiologia

Prof. Paulo de Góes (IMPPG), 2006.

xv, 176p.: il.

Orientadores: Rosangela Maria de Araújo Soares

Ivete Pomarico Ribeiro de Souza

Tese: Doutorado em Ciências Biológicas (concentração Microbiologia)

Referências bibliográficas: f.

1. Candida spp. 2. Fator de Virulência. 3. Protease. 4. Infecção pelo

HIV. 5. Serina protease

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) – IMPPG.

II. Título

3

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia de Protista,

Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes (IMPPG), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do

Rio de Janeiro (UFRJ), sob orientação das Professoras Rosangela Maria de

Araújo Soares e Ivete Pomarico Ribeiro de Souza.

4

“Paciência e “Paciência e “Paciência e “Paciência e perseverançaperseverançaperseverançaperseverança têtêtêtêm o efeito mm o efeito mm o efeito mm o efeito mágicoágicoágicoágico de fazer as dificuldades de fazer as dificuldades de fazer as dificuldades de fazer as dificuldades

desaparecerem e os obstáculos sumirem”.desaparecerem e os obstáculos sumirem”.desaparecerem e os obstáculos sumirem”.desaparecerem e os obstáculos sumirem”.

John Quincy Adamas

5

DEDICATÓRIADEDICATÓRIADEDICATÓRIADEDICATÓRIA

Ao meu pai Álvaro (Ao meu pai Álvaro (Ao meu pai Álvaro (Ao meu pai Álvaro (in memoriam)in memoriam)in memoriam)in memoriam)............

...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha ...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha ...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha ...dói saber que além da distância só vou lhe tocar na minha

lembrança. A sua falta é sol sem calor. Está alembrança. A sua falta é sol sem calor. Está alembrança. A sua falta é sol sem calor. Está alembrança. A sua falta é sol sem calor. Está aqui, mas já se foi. Já não qui, mas já se foi. Já não qui, mas já se foi. Já não qui, mas já se foi. Já não

fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção. fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção. fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção. fala mais, mas escuto a sua voz. Já não sente, mas sinto sua emoção.

Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a Hoje mais do que nunca, sinto a sua presença, pois sou a

continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.continuidade do seu brilho, e a minha saudade lhe traz de volta.

(autor desconhecido) (autor desconhecido) (autor desconhecido) (autor desconhecido)

6

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A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais A Deus, por sua proteção e amparo sempre nos momentos mais

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possa estar mais perto de ti.possa estar mais perto de ti.possa estar mais perto de ti.possa estar mais perto de ti.

AoAoAoAos meus pais, Álvaro (s meus pais, Álvaro (s meus pais, Álvaro (s meus pais, Álvaro (in memoriamin memoriamin memoriamin memoriam)))) e Marina, meus maiores e Marina, meus maiores e Marina, meus maiores e Marina, meus maiores

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privilégio de sua companhia. Obrigada pela abdprivilégio de sua companhia. Obrigada pela abdprivilégio de sua companhia. Obrigada pela abdprivilégio de sua companhia. Obrigada pela abdicação de tantos sonhos para icação de tantos sonhos para icação de tantos sonhos para icação de tantos sonhos para

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desses anos. Sou muito grata a você!desses anos. Sou muito grata a você!desses anos. Sou muito grata a você!desses anos. Sou muito grata a você!

À Professora Rosangela Maria de Araújo À Professora Rosangela Maria de Araújo À Professora Rosangela Maria de Araújo À Professora Rosangela Maria de Araújo

Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança Soares, minha orientadora, pelo incentivo e confiança

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transmitidos ao longo desses anos de convivência. transmitidos ao longo desses anos de convivência. transmitidos ao longo desses anos de convivência. transmitidos ao longo desses anos de convivência.

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confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se confiança e a quem poderemos recorrer quando a vida se

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e as várias oportunidades concedidas. Admiroe as várias oportunidades concedidas. Admiroe as várias oportunidades concedidas. Admiroe as várias oportunidades concedidas. Admiro----te muito!te muito!te muito!te muito!

9

As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela, As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela, As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela, As companheiras de viagem e de laboratório Lucimar e Daniela,

por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades! por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades! por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades! por toda ajuda fornecida para que eu pudesse vencer as minhas dificuldades!

Durante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos váriDurante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos váriDurante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos váriDurante esses quatro anos, é inegável a aquisição dos vários conhecimentos os conhecimentos os conhecimentos os conhecimentos

científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas científicos, mas o que me faz sentir que tudo valeu a pena foi conhecer pessoas

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As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu As amigas Glória e Apoena, por alimentarem deste o início o meu

gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...gosto pela ciência. Afinal, foi com vocês que tudo começou...

A CelinaA CelinaA CelinaA Celina, uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no , uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no , uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no , uma grande amiga, pelos conhecimentos transmitidos no

início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil! início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil! início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil! início da minha jornada como “pesquisadora”. Sem você tudo seria muito difícil!

Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar Obrigada, amiga! Foi uma pena que pessoas egoístas te forçaram a procurar

outro caminho...outro caminho...outro caminho...outro caminho...

Aos Professores do DepartameAos Professores do DepartameAos Professores do DepartameAos Professores do Departamento de Microbiologia Geral do nto de Microbiologia Geral do nto de Microbiologia Geral do nto de Microbiologia Geral do

IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por IMPPG, em especial aos Professores Celuta, Márcio, Leonardo e André por

compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a compreenderem as minhas dificuldades e estarem sempre dispostos a

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A Professora Eliana Barreto pelas considerações e revisA Professora Eliana Barreto pelas considerações e revisA Professora Eliana Barreto pelas considerações e revisA Professora Eliana Barreto pelas considerações e revisão da ão da ão da ão da

presente tese em um curto período de tempo.presente tese em um curto período de tempo.presente tese em um curto período de tempo.presente tese em um curto período de tempo.

A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”, A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”, A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”, A amiga Marta, companheira de “Prova de Conhecimentos Gerais”,

por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.por ser uma grande pessoa neste momento tão complicado de nossas vidas.

10

Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia, Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia, Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia, Aos amigos do laboratório, Lys, Glauce, Gleiser, Vanila, Cátia,

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As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico, As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico, As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico, As amigas Andréa Graciene, Áurea Simone e Luciana Pomarico,

pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.pela agradável companhia nas clínicas de Odontopediatria da UVA.

Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o Ao CNPq e FAPERJ que financiaram os meus estudos durante o

curso de Doutorado.curso de Doutorado.curso de Doutorado.curso de Doutorado.

11

RESUMO

Estudo de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas da cavidade

bucal de crianças infectadas pelo HIV

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da serina protease secretada

(SPS) por Candida spp no processo de interação com células epiteliais,

formação de biofilme, degradação de proteínas de matriz extracelular (laminina

(LAM) e fibronectina (FN)) e componentes do soro (albumina humana, bovina e

IgG). Foi comparado o perfil de proteínas de Candida albicans HIV+ e HIV-

responsável pelo reconhecimento de FN, LAM e colágeno tipo IV (COL);

avaliação do efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de aspártico

protease do HIV no crescimento, diferenciação e adesão a células epiteliais de

C. albicans; e envolvimento da atividade ecto-fosfatásica de C. albicans HIV+ e

HIV- nos processos de interação também com células epiteliais. Após o

isolamento de Candida spp. de sítios sub-gengivais, essas foram crescidas em

meio BHI por 48 horas à 37o sob agitação. In vitro, SPS foi responsável pela

hidrólise de laminina, fibronectina, IgG, albumina bovina e humana. O

tratamento de C. albicans com 1000 µM de PMSF, inibidor de serina protease,

reduziu em 80% a adesão destas leveduras a células epiteliais e modulou a

expressão de proteínas de superfície das células tratadas de forma dose-

dependente. A inibição da atividade da serina protease reduziu a adesão das

células formadoras do biofilme quando comparado ao sistema controle. C.

albicans HIV+ apresentou maior expressão de proteínas responsáveis pelo

reconhecimento à FN, LAM e COL. Apenas o Saquinavir influenciou no

crescimento de C. albicans quando crescida em meio BHI. Esta droga inibiu a

adesão a células epiteliais (p<0,05, na concentração de 150 µM) e indução de

tubo germinativo (p<0,05, na concentração de 100 µM). C. albicans HIV+

apresentaram altos índices de ecto-fosfatase quando comparadas com cepas

HIV-. Esta atividade mostrou-se envolvida no processo de interação fungo-

hospedeiro.

12

ABSTRACT

Estudo de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas da cavidade

bucal de crianças infectadas pelo HIV

This study aimed to correlate the secreted serine proteinase (SSP) by Candida

spp. with epithelial cells interaction, biofilm formation, extracellular matrix

proteins cleavage (laminin (LAM), fibronectin (FN)) and serum compounds

(bovine albumin, human albumin and IgG). Its also compared the protein profile

of C. albicans HIV+ and HIV- that binds to FN, LAM and collagen type IV

(COL); and the effect of antiretroviral drugs aspartic proteinase inhibitor on

growth, cellular differentiation and epithelial cells adhesion of C. albicans; and

the ecto-phosphatase activity of C. albicans HIV+ e HIV- in the interaction

process with epithelial cells. After Candida spp. isolation from sub-gingival sites,

the yeasts were growth in BHI medium for 48 hours at 37o with agitation. In

vitro, SSP was able to cleave LAM, FN, IgG, bovine albumin and human

albumin. The C. albicans treatment with 1000 µM of PMSF, a serine proteinase

inhibitor, decreased 80% of the adhesion index using epithelial cells and

modified the surface proteins expression of treated yeasts in a dependent drug

concentration. The serine proteinase activity inhibition decreased the biofilm

yeast adhesion when compared with control system. C. albicans HIV+

demonstrated higher protein expression that recognize FN, LAM e COL.

Saquinavir was the only drug that decreased C. albicans growth in BHI medium.

This medication inhibited the adhesion to epithelial cells (p<0,05, in a

concentration of 150 µM) and germ tube differentiation (p<0,05, in a

concentration of 100 µM). C. albicans HIV+ ecto-phosphatase present a higher

activity than the others isolates suggesting that, the expression and activity of

ecto-phosphatase in these cells may contribute to the early mechanisms

required for disease establishment.

13

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

BHI - Infusão de cérebro e coração

BSA - Soro albumina bovina

oC - Graus Celsius

Candida spp. - Espécies do gênero Candida

CDC - “Centers for Disease Control and Prevention”

CD4 - Proteína de superfície do linfócito T-auxiliar (grupo

de diferenciação do tipo 4)

COL IV - Colágeno tipo IV

Crianças HIV+ - Crianças infectadas pelo HIV

Crianças HIV- -Crianças sem evidências clínicas de

imunossupressão

Cut-off - Microconcentradores “Centricon”com membrana

de exclusão

DNA - Ácido desoxirribonucléico

E-64 -L-trans-epoxisuccinil leucilamido-(4-

guanidino)butano

ELISA - “Enzyme-linked Immunosorbent Assay”

Fc - Fragmento cristalizável

FN - Fibronectina

g - Grama

HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana

14

HSA - Soro albumina Humana

IgG - Imunoglobulina G

kDa - Kilodalton

LAM - Laminina

M - Molar

mL - Mililitro

mM - Milimolar

NaCl - Cloreto de sódio

pH - Potencial hidrogeniônico

PMSF - Fluoreto de fenilmetanosulfonil

SAP - Aspártico protease secretada

SDS - Dodecil Sulfato de Sódio

SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo

SDS

UFC - Unidades formadoras de colônia

UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro

v/v/v - Relação volume/volume/volume

w/v - Relação peso/volume

YCB - “Yeast Carbon Base”

µm - Micrômetro

µM - Micromolar

15

ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO 01-05

2. REVISTA DA LITERATURA 06-53

2.1 Síndrome da Imunodeficiência Humana em Crianças 06

2.2 Manifestações Bucais em Crianças Portadoras da Síndrome da Imunodeficiência Humana

09

2.2.1 Candidíase Bucal 12

2.2.1.1 Relação com a progressão da infecção pelo HIV e o impacto da terapia anti-retroviral

16

2.3 Candida spp. 18

2.4 Fatores de Virulência de Candida spp. 20

2.4.1 Parede Celular 22

2.4.2 Produção de Enzimas Hidrolíticas - Proteases 26

2.4.2.1 Inibidores proteolíticos 36

2.4.3 Diferenciação celular 43

2.4.4 Adesão e formação de biofilme de Candida 46

2.4.5 Ecto-fosfatases em Candida 50

3. OBJETIVOS 54

4. MATERIAIS E MÉTODOS 56-68

5. RESULTADOS 69-113

6. DISCUSSÃO 114-128

7. CONCLUSÕES 129-131

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 132-174

9. ARTIGOS EM ANEXO 175-166

16

1. Introdução1. Introdução1. Introdução1. Introdução

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) vem

aumentando de forma alarmante. De acordo com o último boletim da UNAIDS

(UNAIDS, 2005) há uma média de 40,3 milhões (36,7 – 45,3 milhões) de

pessoas vivendo com AIDS em todo o mundo. Somente no ano de 2005,

detectou-se um total de 4,9 milhões de novos casos de infecção, sendo destes

700 mil somente em crianças abaixo de 15 anos de idade. Com relação ao

número de óbitos, a AIDS foi responsável por 3,1 milhões de mortes no ano de

2005 (UNAIDS, 2005). Na América Latina o número estimado de pessoas

vivendo com o vírus HIV é de 1,8 milhões (1,4 milhões – 2,4 milhões), sendo o

Brasil o responsável por mais de um terço deste número (UNAIDS, 2005).

A AIDS tornou-se a primeira causa de morte em mulheres de 20-

40 anos nas grandes cidades das Américas, Europa Ocidental e África Sub-

Saara. Além de centenas de milhares de casos de AIDS pediátrica, mais de um

milhão de crianças não infectadas tornaram-se órfãs porque suas mães e seus

pais morreram de AIDS (LAMBERT et al., 2001). O grande ponto para a

proteção de crianças contra o vírus HIV é a tentativa de prevenção da infecção

em seus pais. A prevenção da transmissão vertical (mãe-criança) é crucial com

relação à prevenção primária. A implantação de programas educativos tem

eliminado virtualmente a transmissão do HIV de mães para seus filhos em

países industrializados. No entanto, em um alto número de países a AIDS é

ainda a responsável pelo aumento de uma parte dos óbitos de crianças abaixo

dos 5 anos de idade (UNAIDS, 2005). Os maiores obstáculos encontrados

17

nestes programas educativos incluem os inadequados serviços de atenção a

gestante (pré-natal), o não conhecimento da presença da infecção durante a

gestação, o preconceito e discriminação, e por fim a dificuldade no acesso a

profilaxia anti-retroviral durante a gravidez. Um fator agravante a ser

considerado seria ainda o alto número de mulheres que desconhecem a

possibilidade de transmissão do vírus HIV para seu filho (UNAIDS, 2005).

Muitas manifestações bucais têm figurado na literatura por sua

freqüência em crianças infectadas pelo HIV (FALOON et al., 1989; LEGGOTT,

1992; VALDEZ et al., 1994; RAMOS-GOMEZ et al., 1996; CASTRO, 1998;

RAMOS-GOMEZ et al., 2000), sendo consideradas indicativas do estado

imunológico e da progressão da infecção nestes pacientes (GREENSPAN &

GREENSPAN, 1992; SANTOS et al., 2001). As lesões bucais mais comuns

são: candidíase, estomatite herpética, eritema linear gengival, linfadenopatia

cervical, leucoplasia pilosa, hipertrofia de parótidas e gengivite

(CHIGURUPATTI et al., 1996; CASTRO, 1998; PORTELA et al., 2000).

Dessas, a candidíase bucal e a gengivite são as mais freqüentes (CASTRO,

1998). O eritema linear gengival, embora pouco freqüente, tem se mostrado

intimamente relacionado com a progressão da infecção pelo HIV (VELEGRAKI

et al., 1999; PORTELA, 2002).

Embora represente condição comum em crianças infectadas pelo

HIV (SAN MARTIN et al., 1992; VALDEZ et al., 1994; CASTRO, 1998;), as

alterações periodontais têm sido pouco descritas na literatura principalmente

quanto a sua etiologia, os microrganismos envolvidos e sua relação com a

debilidade do sistema imunológico destas crianças.

18

Tem-se especulado sobre a possível correlação entre a presença

de Candida sp. e a alteração gengival, como por exemplo o eritema linear

gengival (VELEGRAKI et al., 1999). ZAMBON et al. (1990) no intuito de

determinar os microrganismos presentes na região subgengival de pacientes

adultos infectados pelo HIV, mostraram que em 62% dos pacientes com

gengivite e periodontite foram encontradas diferentes espécies de fungos e,

sugeriram serem estes patógenos oportunistas importantes no

desenvolvimento da doença periodontal em pacientes com AIDS e com outras

doenças imunossupressoras. Em um estudo transversal, do tipo caso-controle

com 50 crianças infectadas pelo HIV e 44 crianças sem evidências clínicas de

imunossupressão, PORTELA e colaboradores (2004) demonstraram uma

freqüência de isolamento de Candida spp. maior no grupo HIV+. Este achado

esteve ainda diretamente relacionado com o grau de inflamação gengival

presente nos pacientes da amostra. Nesse mesmo estudo, observou-se que

todas as crianças com eritema linear gengival apresentaram cultura positiva

para espécies de Candida.

O aumento no número de infecções oportunistas causadas por

fungos, principalmente em indivíduos infectados pelo HIV, tem estimulado

novas pesquisas para esclarecer os fatores de virulência e as circunstâncias da

patogenicidade das várias espécies (GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1990;

MULLER, GROLL & WALSH, 1999). A virulência do microrganismo é o

resultado de uma multiplicidade de fatores que agem simultaneamente para

vencer as defesas do hospedeiro. No caso da infecção por Candida, estes

fatores podem estar correlacionados com a aderência à célula epitelial, ao

19

dimorfismo, a capacidade de crescimento como blastoporos, pseudo-hifas e

hifas, a produção de enzimas hidrolíticas (proteases, fosfolipases e

lisofosfolipases) (NAGLIK, CHALLACANBE & HUBE, 2003) e a produção de

endotoxinas de baixa e alta massa molecular, bem como a composição da

parede celular, que facilita a adesão e a penetração através do tecido infectado

(GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1990; SCHALLER et al., 2005).

A produção e a secreção de proteases por espécies de Candida

vêm sendo intensamente estudadas por ser considerada um fator importante

nas diferentes fases da interação fungo-célula hospedeiro (MacDONALD &

ODDS, 1983; GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1986). Nestes microrganismos, as

proteases são capazes de digerir proteínas do hospedeiro (MacDONALD,

1984), invadindo os tecidos através da degradação de proteínas de matriz

extracelular (MORSCHHÄUSER et al., 1997) e driblando a ação do sistema

imune, através da hidrólise de imunoglobulinas e proteínas do sistema

complemento (KAMINISHI et al., 1995; RÜCHEL, 1986). As aspártico-

proteases constituem uma família composta de várias isoenzimas, onde

algumas (SAP1-10) são produzidas pelas espécies de Candida (HUBE, 1996;

SMOLENSKI et al. 1997; HUBE, 1998; HUBE et al. 1998; SCHALLER et al.

1998; HUBE, 2000; KOELSCH et al. 2000; SCHALLER et al. 2000). No

entanto, nenhuma outra classe de protease extracelular havia sido detectada

(HUBE, 2000). COSTA (2001) e PORTELA (2002) ao avaliarem a secreção de

proteases em isolados de diferentes espécies de Candida, provenientes de

diferentes sítios da cavidade bucal de crianças infectadas pelo HIV,

20

evidenciaram a produção de serina e metalo-proteases por essas espécies,

quando cultivadas em meio BHI (infusão de cérebro e coração).

A capacidade destes microrganismos de sofrer diferenciação

celular (transição de blastoporos, pseudo-hifas, hifas e no caso de C. albicans

e C. dubliniensis, tubo germinativo) é uma característica muito importante no

estudo da patogenicidade das mesmas (CUTTER, 1991). A parede celular do

tubo germinativo apresenta certas peculiaridades que facilitam a instalação da

infecção, como a presença de antígenos de superfície específicos

(CASANOVA et al., 1991; CASANOVA et al., 1992a; CASANOVA et al., 1992b),

a indução da expressão de proteínas de superfície que promovem a interação

com o tecido ou proteínas do hospedeiro proporcionando a formação de um

biofilme patogênico (BOUALI et al., 1987; BOUCHARA et al., 1990;

CASANOVA et al., 1992) e o aumento da hidrofobicidade da parede celular

(HAZEN & HAZEN, 1988; LÓPEZ-RIBOT et al., 1991). FERNANANDO et al

(1999) ainda atribuem à presença de fosfatases de superfície (ecto-fosfatases)

como possíveis fatores a serem considerados na patogênese de Candida

parapsilosis.

Diante desta problemática, o objetivo geral do presente estudo foi

comparar a expressão de proteínas funcionais de Candida spp. isoladas de

diferentes sítios da cavidade bucal de crianças soropositivas para o HIV e de

crianças sem evidências clínicas de imunossupressão e, expandir os

conhecimentos sobre esta nova classe de protease (serina-protease) secretada

por espécies de Candida.

21

2. Revista da Literatura2. Revista da Literatura2. Revista da Literatura2. Revista da Literatura

2.1 Síndrome da Imunodeficiência Humana em Crianças

A contaminação pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)

vem aumentando de forma alarmante. De acordo com a Organização Mundial

de Saúde, mais de um milhão de crianças estariam infectadas pelo HIV em

1998 e, no ano 2000, esta seria a quinta causa de morte em crianças de todo o

mundo (MANN & TARANTOLA, 1998).

A Síndrome da Imunodeficiência Humana pode variar da

ausência de sintomas à presença de doenças em estágios mais avançados,

resultando assim na AIDS (FALOON et al., 1989).

Em 1994, o CDC (Center of Disease Control) revisou o sistema

de classificação para a infecção pelo HIV em crianças, e propôs dois critérios

da mesma: um para crianças menores de 18 meses e o outro para as maiores.

Isso porque, como os pacientes menores de 18 meses podem estar

manifestando os anticorpos maternos, eles só serão considerados infectados

se apresentarem dois resultados positivos em um ou mais testes de detecção

do HIV (cultura em célula animal; reação em cadeia da polimerase – PCR - e

detecção do antígeno viral circulante – p24) ou se preencher os critérios de

definição da AIDS determinados pelo CDC em 1987. Já no caso das crianças

acima de 18 meses, bastam dois testes ELISA positivos confirmados por outro,

como o “western blotting” ou imunofluorescência, para serem consideradas

soropositivas para o HIV.

22

O agente etiológico da AIDS é o HIV, um retrovírus cujo material

genético está sob a forma de RNA, que possui tropismo pelo antígeno de

superfície CD4 presente em linfócitos “T auxiliar” e macrófagos (FALOON et al.,

1989). A infecção pelo HIV provoca uma anormalidade na função linfocitária,

resultando em um decréscimo no número de linfócitos T, inversão da relação

linfócito “T auxiliar” e “T supressor” (TCD4/TCD8), aumento nos níveis de

imunoglobulinas e produção deficiente de interferon, o que gera defeitos

profundos no sistema imune do paciente (LANE & FAVCI, 1985; FALOON et

al., 1989).

As anormalidades presentes no sistema imunológico das crianças

infectadas pelo HIV irão levar a disfunções sistêmicas bem mais graves que

aquelas presentes em adultos HIV+ (MANN & TARANTOLA, 1998). Dentre

estas disfunções, pode-se citar a maior susceptibilidade ao desenvolvimento de

infecções de origem fúngica e bacteriana, bem como às demais condições

vistas na AIDS (FALOON et al., 1989; LANE & FAVCI, 1985).

As crianças de 0 a 12 anos infectadas pelo HIV são classificadas,

atualmente, de acordo com a condição da infecção, condição imunológica e

presença de sintomas clínicos, em concordância com a proposta oferecida pelo

CDC em 1994 (Quadros 1 e 2).

A principal fonte de transmissão do vírus para crianças é a

vertical, ou seja, da mãe para o filho e, em menor escala, devido à transfusão

de sangue ou derivados (MANN & TARANTOLA, 1998).

Experimentos que buscaram traçar o perfil das crianças

infectadas pelo HIV confirmaram que grande parte delas tinham sofrido

23

transmissão vertical. Vários autores como CHIGURUPATI et al. (1996),

CASTRO (1998) e PORTELA et al. (2000), observaram que esta via estava

presente em 85, 88 e 90,1% dos casos, respectivamente.

Quadro 1 – Classificação da AIDS Pediátrica, CDC, 1994. Fonte: Revised classification system for Human Immunodeficiency Vírus infection in children less than 13 years of age (CDC), 1994.

Categoria Clínica Categoria Imunológica

N: sintomas

ausentes

A: sintomas

leves

B: sintomas

moderados

C: sintomas

graves

1. imunossupressão

ausente (%CD4 ≥≥≥≥25)

N1 A1 B1 C1

2. imunossupressão

moderada (%CD4 15-24)

N2 A2 B2 C2

3. imunossupressão

grave (%CD4<15)

N3 A3 B3 C3

24

Quadro 2 – Características Clínicas Fonte: Revised classification system for Human I(mmunodeficiency Vírus infection in children less than 13 years of age (CDC), 1994.

Características Clínicas # Categoria N: Assintomático

Nenhum sinal ou sintoma considerado como resultado da infecção pelo HIV ou presença das condições listadas na categoria A. # Categoria A: Sintomas Leves

Presença de duas ou mais das seguintes condições abaixo e nenhuma das listadas nas categorias B e C:

Linfadenomegalia Hepatoesplenomegalia Dermatite Aumento de parótidas Infecção respiratória superior, sinusite ou otite recorrente ou persistente

# Categoria B: Sintomas Moderados Anemia, neutropenia ou plaquetopenia por mais de 50 dias Meningite, pneumonia ou sepse (um único episódio) Candidíase oral por mais de 2 meses em crianças > 6 meses Cardiomiopatia Diarréia crônica ou recorrente Hepatite Estomatite herpética (mais de 2 vezes em 1 ano) Herpes zoster (2 ou mais episódios ou mais de 1 dermátomo) Pneumonia intersticial linfóide (LIP) Nefropatia Nocardiose Febre persistente por mais de 1 mês Varicela disseminada Toxoplasmose, infecção pelo vírus herpes simples (HSV) ou

citomegalovírus (CMV) com menos de 1 mês de idade # Categoria C: Sintomas Graves

Criança com qualquer das doenças definidoras de AIDS (CDC, 1987) com exceção da LIP.

2.2 Manifestações Bucais em Crianças Portadoras da Sínd rome da

Imunodeficiência Humana

As manifestações bucais da infecção pelo HIV são comuns em

crianças soropositivas, com freqüência de aparecimento variando de 28% a

25

65% (FALOON et al., 1989; LEGGOT et al., 1992; VALDEZ et al., 1994;

FONSECA, 1996; CASTRO 1998; PORTELA et al., 2000; RAMOS-GOMEZ et

al., 2000; FLAITZ et al., 2001; SANTOS et al., 2001). Devido a esta alta

prevalência, estudos em todo o mundo têm investigado, principalmente à

freqüência do seu aparecimento, o seu alto valor prognóstico e a sua grande

relação com o uso da nova terapia múltipla anti-retroviral.

Vários autores como FALOON et al. (1989); LEGGOT et al.

(1992); VALDEZ et al. (1994); FONSECA, (1996); CHIGURUPATI et al. (1996);

CASTRO (1998); PORTELA et al. (2000); RAMOS-GOMEZ et al. (2000) e

FLAITZ et al. (2001); SANTOS et al. (2001) observaram que as manifestações

bucais mais comumente encontradas em crianças infectadas pelo HIV são as

seguintes: candidíase bucal, estomatite herpética, eritema linear gengival,

gengivite, leucoplasia pilosa e hipertrofia de parótidas.

MONIACI et al. (1993) e CASTRO et al. (1998) demonstraram

que o aparecimento de lesões como a candidíase bucal estaria mais associado

à infecção pelo HIV, especialmente em um estágio mais avançado da doença.

No estudo de CASTRO et al. (1998), 93% das 14 crianças com lesão de

candidíase agravaram seu quadro clínico, sendo que 79% dessas evoluíram

para o óbito durante os 18 meses de acompanhamento.

A utilização de uma terapia múltipla anti-retroviral em estágios

iniciais da infecção pelo HIV em crianças aumenta a expectativa de vida

(LAMBERT et al., 1996; DE MARTINO et al., 2000) e diminui a freqüência de

aparecimento das lesões bucais (CASTRO et al., 1999; RAMOS-GOMEZ et al.,

2000). Com o objetivo de verificar a influência da utilização dessa terapia no

26

decréscimo da mortalidade em uma população infantil infectada pelo HIV, DE

MARTINO et al. (2000) avaliaram prontuários médicos de 1142 crianças de 106

centros de atendimentos de AIDS pediátrica, nascidas entre os anos de 1980 e

1997. Neste estudo, as crianças foram agrupadas de acordo com o tipo de

terapia anti-retroviral utilizada, podendo-se concluir que houve aumento da

sobrevida das crianças no período de 1996 a 1998 como resultado da

introdução da terapia anti-retroviral múltipla.

Em um estudo longitudinal com um grupo de crianças

soropositivas para o HIV, CASTRO et al. (1998) observaram que havia uma

diminuição da freqüência de lesões bucais nos anos de 1993 a 1998.

Posteriormente (1999), estes mesmos autores relacionaram a redução do

aparecimento dessas lesões ao emprego de drogas anti-retrovirais (CASTRO

et al., 1999). No entanto, estudos mais recentes de PORTELA et al. (2000),

com 206 crianças infectadas pelo HIV, mostraram freqüência de 28,20% de

lesões bucais.

A distribuição das manifestações bucais relacionadas à infecção

pelo HIV em crianças, em muitos estudos, revela que a gengivite e a

candidíase são as lesões que mais acometem tais pacientes (CASTRO, 1998;

PORTELA et al., 2000; RIBEIRO, 2000). Assim, uma melhor compreensão da

patogenicidade de microrganismos oportunistas tende a permitir o

desenvolvimento de terapias eficazes para estas infecções, já que, mesmo com

o grande avanço da terapia anti-retroviral, crianças infectadas pelo HIV

continuam apresentando quadros de lesões oportunistas que, em algumas

27

situações, são resistentes ao tratamento antifúngico convencional (ABRAMS,

2000).

2.2.1 Candidíase Bucal

A candidíase bucal, lesão de origem fúngica, é uma das mais

comuns em crianças infectadas pelo HIV, podendo ser ainda a primeira

manifestação da AIDS (KATZ et al., 1993; VALDEZ et al., 1994; JANDINSKI et

al., 1994; FONSECA, 1996; CASTRO, 1998). Estudos mostraram que a

freqüência de aparecimento varia de 8,5% a 72% e que apresenta significante

valor prognóstico no desenvolvimento da AIDS em crianças (CASTRO et al.,

1998). Atualmente, devido ao grande avanço das drogas anti-retrovirais –

terapia com inibidor de proteases - está ocorrendo uma mudança do padrão

das infecções bucais oportunistas, constatando-se uma redução no seu

aparecimento (PATTON et al., 2000). Vários estudos, tanto in vitro (GRUBER

et al., 1999a; GRUBER et al., 1999b; CASSONE et al., 1999), quanto in vivo

(CASSONE et al., 1999; TAYLOR et al., 2000), têm mostrado a redução da

atividade da protease ácida (aspártico-protease) secretada por espécies de

Candida frente à utilização dos inibidores de proteases utilizados na terapia do

HIV, já que em ambos os sistemas (Candida e HIV) há a secreção de uma

mesma classe de protease.

Entretanto, em outros casos pode ocorrer o aparecimento de

quadros graves de lesões resistentes à terapia convencional antifúngica

utilizada, devido à falha na resposta do hospedeiro ao tratamento anti-retroviral,

28

levando a necessidade de terapias profiláticas com antibacterianos e

antifúngicos (ABRAMS, 2000).

A candidíase bucal pode apresentar-se clinicamente de três

formas distintas: candidíase eritematosa, candidíase pseudomembranosa e

quelite angular (REPENTIGNY, LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004).

A espécie considerada predominante na infecção fúngica da

cavidade bucal em indivíduos imunocomprometidos é a C. albicans, seguida

ainda por outras espécies, como: C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C.

lusitaniae e C. parapsilosis (SAMARANAYAKE, 1992; REPENTIGNY,

LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004). Em 1995, uma nova espécie de

Candida, com características fenotípicas semelhantes às da C. albicans, foi

descrita e denominada de C. dubliniensis (SULLIVAN et al., 1995).

Frente ao aumento do número de casos de indivíduos infectados

pelo HIV, o estudo desses microrganismos tem recebido novo significado, já

que se trata dos patógenos comensais responsáveis por uma das mais

freqüentes lesões bucais em indivíduos imunocomprometidos. Ou seja, quando

presentes em um indivíduo com aspectos de normalidade tendem a evoluir de

forma comensal, não causando alteração, mas, em situações anormais, estas

mesmas cepas assumem características de patogenicidade, pois quebram o

equilíbrio com o hospedeiro (CUTLER, 1991). O aparecimento destes

microrganismos, principalmente quando se trata da C. albicans, dá-se logo

após o nascimento, dos 2 aos 6 meses de vida, e a principal fonte de

transmissão é sua mãe (HANNULA et al., 1999).

29

Considerando o conhecimento da colonização bucal por espécies

de Candida, um fator importante na implementação de uma terapia antifúngica

para a prevenção de candidíase orofaríngea e na detecção de indivíduos com

maior propensão à rápida evolução da infecção pelo HIV, HICKS et al. (1998)

determinaram a prevalência de espécies destes fungos na saliva não

estimulada de crianças infectadas pelo HIV através da via vertical, comparando

ainda com a de crianças não infectadas, mas que foram expostas ao vírus

durante a gravidez ou o nascimento. Observaram, então, que estes

microrganismos estavam presentes em 19% dos pacientes infectados pelo HIV

e em 9% daqueles soronegativos para tal vírus. E, ainda, que esta presença foi

mais prevalente em crianças HIV+ sintomáticas com imunossupressão

moderada e grave e que estavam fazendo uso de agentes anti-retrovirais e de

nenhuma medicação antifúngica.

Corroborando esse estudo, COSTA et al. (2000), ao avaliarem a

influência da infecção pelo HIV na prevalência de Candida spp. em mucosa

bucal de crianças clinicamente saudáveis, observaram sua presença em uma

maior porcentagem quando comparada ao estudo anterior – 76% das crianças

HIV+ e 46% das saudáveis (p<0,05) o que provavelmente foi decorrente de

metodologias de coleta de saliva diferentes. No primeiro trabalho (HICKS et al.,

1998) a saliva não estimulada foi removida por meio de um aspirador a vácuo,

enquanto que COSTA et al. (2000) empregaram a fricção suave no dorso de

língua com swab estéril. Mas ambos concluíram que espécies de Candida

podem ser encontradas em mucosa normal tanto em pacientes

imunocomprometidos como em pacientes sem evidências de

30

imunossupressão, sendo, porém esta diferença estatisticamente significante

somente neste último estudo.

BROWN et al. (2000), ao estudarem 27 isolados bucais de

crianças infectadas pelo HIV, obtiveram resultado positivo para Candida em 15

amostras. Desses 15 isolados, 3 foram identificados como C. dubliniensis, um

foi positivo para C. glabrata e 12 pacientes estavam colonizados somente por

C. albicans. Neste mesmo estudo, todos os pacientes que apresentaram

isolados positivos para C. dubliniensis estavam gravemente imunodeprimidos e

com classificação C3 da doença, mas somente um desses tinha história

passada de candidíase bucal. Os autores atribuem esse fato ao avanço da

terapia anti-retroviral, já que todos faziam uso de inibidor de proteases, o qual

reduz a prevalência de candidíase bucal.

Os mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos

pertencentes à família dos azoles em cepas C. albicans isoladas de pacientes

infetados pelo HIV são multifatoriais com predominância da “overexpression”

dos genes (MDR1 e CDR) codificadores da bomba de efluxo, fato esse

detectado em 85% de todos os isolados com esta característica fenotípica de

resistência (PEREA et al. 2001). SAGEORZAN et al (1994) e BARCHIESI et

al. (1995) observaram que estas cepas não ficam confinadas aos pacientes

infectados pelo HIV e sim, apresentam potencial para serem transmitidas aos

seus cônjuges e outros membros da família, incluindo crianças (MULLER et al.,

1999).

31

2.2.1.1 Relação com a progressão da infecção pelo H IV e o impacto da

terapia anti-retroviral

A candidíase bucal pode ocorrer em qualquer momento durante o

curso da infecção pelo HIV, o que inclui a infecção primária pelo HIV, fase

crônica assintomática e a AIDS propriamente dita (PENA et al., 1991; PATTON,

2000). Durante a fase assintomática da infecção pelo vírus HIV a presença de

quadros de candidíase pseudomembranosa ou eritematosa são sinais

preditivos da progressão da imunossupressão, independentemente da

contagem de células CD4+ (NIELSEN et al., 1994). VARGAS & JOLY (2002) ao

relacionarem a freqüência e intensidade de colonização de leveduras na

cavidade oral de pacientes infectados pelo HIV com a progressão para o

estabelecimento da candidíase oral, observaram que o aumento da carga de C.

albicans ocorre antes do primeiro episódio da infecção fúngica e a intensidade

da colonização aumenta significantemente de acordo com a progressão do

quadro assintomático para o primeiro sinal clínico de candidíase. Estas

observações sugerem que as defesas normais do hospedeiro contra este fungo

possam estar sendo alteradas em um estágio muito precoce da evolução da

infecção pelo HIV, antes mesmo que ocorra uma depleção acentuada das

células CD4+ (REPENTIGNY, LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004). No

entanto, a prevalência das formas clínicas de candidíase oral aumentam

drasticamente a medida que a infecção pelo HIV avança, associado a

diminuição da contagem de células CD4+ (<200/mm3) (VARGAS & JOLY,

2002).

32

Através de um estudo analítico retrospectivo, compreendendo um

intervalo de quatro anos, SOARES e colaboradores (2002) avaliaram a

evolução da freqüência de candidíase oral em crianças brasileiras infectadas

pelo HIV, relacionando-a com o grau de imunossupressão e terapia anti-

retroviral. A análise dos 18 prontuários indicou uma correlação significante

entre a ocorrência de candidíase e imunossupressão grave (p=0,0048), dado

este que corrobora com o último estudo citado acima.

Com a introdução da terapia anti-retroviral de alto impacto em

1996 (HAART), que inclui os inibidores de proteases, tem-se observado uma

drástica redução da prevalência de candidíase bucal em pacientes infectados

pelo HIV. Durante o período de 12 meses após o início desta nova terapia anti-

retroviral a prevalência de candidíase oral reduziu de 30-56% para 1-9%, assim

como o número de casos de candidíase recorrente e a colonização

assintomática por C. albicans na cavidade oral (MARTINS, LOZANO-CHIU &

REX, 1998).

Em relação às crianças infectadas pelo HIV, quadro semelhante

tem sido observado desde a implantação do HAART. SOARES et al. (2002)

observaram que o uso de inibidores de protease em terapia tripla aumentou

durante o período de estudo (1997 a 2000) em um grupo de crianças

brasileiras atendidas em um Hospital de referência para o tratamento da

infecção na cidade do Rio de Janeiro, em concomitância com o declínio da

freqüência de candidíase bucal, sendo que, em 2000, não foi verificado na

amostra nenhum episódio da lesão.

33

Um dos fatores responsáveis pela mudança na incidência de

infecções oportunistas em pacientes soropositivos para o HIV em uso desta

terapia anti-retroviral de alto impacto está relacionado a elevação da contagem

de células CD4+, conferindo assim uma reconstituição imunológica do

hospedeiro. Concomitantemente, alguns estudos demonstram a ação direta

destas drogas sobre as aspártico-proteases secretadas por espécies de

Candida, onde tal inibição atenua a adesão de C. albicans às células do epitélio

oral (CASSONE et al., 1999).

2.3 Candida spp.

Os fungos são organismos eucariotos e podem ser unicelulares

ou multicelulares. O gênero Candida pertence à família Crytococcaceae, da

classe Ascomycetes e filo Ascomycota e é caracterizado por leveduras que

apresentam formas arredondadas ou ovais que medem aproximadamente de

2,0 a 4,0 µm (GUARRO, 1999) e reproduzem-se por brotamento ou gemulação.

Algumas espécies, como C. albicans, produzem brotos que não se separam

uns dos outros; estes brotos formam uma cadeia de células chamada de

pseudo-hifa, forma esta necessária para invadir tecidos mais profundos nos

quadros de infecção (Figura 1) (MOLERO et al., 1998). Esta transição entre os

dois fenótipos pode ser induzida in vitro em resposta a variações do ambiente

como pH e temperatura, ou determinadas substâncias como N-

acetilglucosamina ou prolina. No entanto, o mais importante critério para a

patogenicidade é a indução para a forma micelial por macrófagos e

componentes do soro. Associado a isso, o grande interesse biológico do

34

dimorfismo é a capacidade do microrganismo mudar de forma e isso estar

associado diretamente a sua patogenicidade (MOLERO et al., 1998).

GHANNOUM & ABU-ELTEEN (1990) em uma revisão da

literatura descreveram os determinantes da patogenicidade destes

microrganismos e observaram que a C. albicans e outras espécies exibem

características importantes para sua virulência, como composição de sua

parede celular com a presença de adesinas (manoproteínas), produção de

enzimas hidrolíticas (proteases, fosfolipases, hialuronidase e condroitina

sulfatase) e formação de hifas.

Figura 1 - Dimorfismo em Candida albicans. (A) Blastosporos; (B) Tubos germinativos; (C) Formação de hifas a partir do crescimento apical de tubos

germinativos; (D) Micélios; (E) Blastosporos secundários separados dos filamentos. Fonte: MOLERO et al., 1998.

35

2.4 Fatores de Virulência de Candida spp.

A patogenicidade de um microrganismo é definida como sendo a

capacidade desse para causar doença. A prevenção ou a ocorrência vai

depender da interação entre o agente causador e o hospedeiro (GHANNOUM

& ABU-ELTEEN, 1990). CASADEVALL & PIROFSKI (2001) enfatizam, ainda,

que a virulência não pode ser considerada como uma característica isolada do

microrganismo, mas sim um processo dinâmico e com fenômenos de troca que

incluem tanto o hospedeiro como os fatores microbianos.

Espécies de Candida são comensais presentes na cavidade bucal

de indivíduos clinicamente saudáveis, sendo isoladas numa frequência que

varia de 40 a 60% (ARENDORF & WALKER, 1980). Vários fatores predispõem

ao desenvolvimento da candidíase, como por exemplo, distúrbios endócrinos,

gravidez, deficiência de ferro, xerostomia e desordens imunológicas

(SAMARANAYAKE & MACFARLANE, 1982). HUBE (2000) ressalta, ainda, que

o número de pacientes predispostos a infecções causadas por microrganismos

oportunistas, como a C. albicans, vem crescendo significantemente nesta

última década e os pacientes de risco para essa infecção seriam aqueles sob

tratamento para o câncer, transplantados e portadores do HIV.

GHANNOUM & ABU-ELTEEN (1990) em uma revisão da

literatura que buscou descrever os determinantes da patogenicidade da

Candida, observaram que a C. albicans e outras espécies exibem como fatores

responsáveis pela virulência, a aderência à célula epitelial, dimorfismo,

capacidade de crescimento como blastosporos, pseudo-hifas e hifas, produção

36

de enzimas (proteases, fosfolipases) e endotoxinas de baixo e alto peso

molecular, bem como a composição da parede celular que facilita a adesão e

penetração através do tecido infectado. Concluem, ainda, que a virulência da

C. albicans resulta da ação conjunta desses fatores contra as defesas do

hospedeiro. Mais tarde, SENET (1997) corroborou as conclusões destes

autores quanto aos determinantes da patogenicidade da Candida, ressaltando

a importância de um melhor conhecimento dos mecanismos precisos

envolvidos na fisiopatologia da candidíase, para que se elaborem estratégias

de prevenção.

VERSTREPEN & KLIS (2006) enfatizam, ainda, a notável

capacidade de formação de biofilme a partir da propriedade de adesão de

alguns fungos como C. albicans. Esta característica apresenta grande

relevância médica e industrial, já que a presença de um biofilme maduro

dificulta a ação de antifúngicos e pode tornar-se um reservatório de células

com características de resistência a determinadas drogas. No âmbito industrial,

pode ocasionar problemas econômicos devido a formações de biofilmes em

instalações industriais em companhias de processamento de alimentos.

Ainda sobre os determinantes da patogenicidade de Candida,

FERNANANDO e colaboradores (1999) estudaram a presença de fosfatases

de superfície em C. parapsilosis e demonstraram a associação da atividade

fosfatásica ácida e alcalina com o índice de adesão destas cepas a células

epiteliais. Os autores observaram, ainda, que os isolados de C. parapsilosis

que exibiram maior atividade fosfatásica foram os que apresentaram maior

capacidade de adesão às células epiteliais bucais humanas. Concluíram assim

37

que fosfatases de espécies de Candida podem desempenhar um papel crucial

na potencialização da virulência deste fungo.

2.4.1 Parede Celular

A parede celular de Candida spp. é uma estrutura de grande

importância, pois mantém a morfologia característica de cada forma, levedura e

hifa, e é o primeiro local onde ocorre a interação entre o organismo e o

ambiente. Por isso, estudos relacionados à identificação e a distribuição dos

componentes da parede celular podem contribuir para o conhecimento do seu

papel na patogênese fúngica (ex.: expressão de adesinas e receptores para

proteínas do hospedeiro; atividade proteolítica extracelular; hidrofobicidade

[BORG & RUCHEL, 1988; CALDERONE & SCHELD, 1987; DOUGLAS, 1987;

HAZEN, 1989; BOUCHARA et al., 1990]) e na interação parasito-hospedeiro

(LOPEZ-RIBOT et al., 1991).

A parede celular dos fungos é formada por aproximadamente 80

a 90% de carboidratos. Três constituintes básicos formam a porção

polissacarídica da parede celular: polímeros de glucose com ligações β-1,3 e β-

1,6 (β-glucanas); polímeros de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) com ligações

β-1,4 (quitina) e polímeros de manose (manana) em associação covalente com

proteínas (glico[mano]proteínas). Além disso, a parede celular apresenta

proteínas (6 a 25%) e uma pequena porção de lipídeos (1 a 7%) (CALDERONE

& BRAUN, 1991; CHAFFIN et al. 1998; CABIB et al., 2001). Os polímeros de β-

glucanas e quitina apresentam uma função estrutural formando um rígido

esqueleto que proporciona uma forte propriedade física à célula. Quanto ao

38

ponto de vista quantitativo, as β-glucanas representam o principal constituinte,

correspondendo a 47 a 60% do peso da parede celular, enquanto que a quitina,

embora sendo minoria, 0,6 a 9% em peso, apresenta uma importante função

na reprodução do fungo por formar uma constrição entre a célula parenteral e a

célula filha durante o brotamento (MOLANO et al. 1980; CABIB et al., 2001).

A parede celular de Candida spp. apresenta grande importância

na patogenicidade desses microrganismos por proporcionar adesão aos

tecidos e a células do hospedeiro, assim como por participar ativamente da

imunomodulação da resposta imune do hospedeiro (CHAFFIN et al. 1998). A

adesão é um pré-requisito para a colonização e um passo essencial para o

estabelecimento da infecção. As espécies de Candida possuem algumas

características peculiares que favorecem essa adesão, dentre elas a presença

de adesinas em suas paredes celulares. O grande repertório de adesinas

presente nesses fungos propicia uma enorme variedade de sítios no

hospedeiro que servem de porta de entrada para a infecção (CALDERONE &

BRAUN, 1991; CALDERONE, 1993). No Quadro 3 podem ser observadas

algumas manoproteínas com função de adesinas em C. albicans e seus

respectivos ligantes. Os componentes da parede celular, incluindo glucana,

quitina e manoproteínas, possuem a capacidade de modular a resposta imune

do hospedeiro ativando ou desativando-o (CASSONE, 1989), tendo as

mananas e manoproteínas como as moduladoras de atividade mais potentes

(CASSONE, 1989).

Vários estudos na literatura têm demonstrado o potencial de

adesão de isolados de Candida spp. a células epiteliais (BIASOLI et al. 1999;

39

MURPHY & KAVANAGH, 2001). MURPHY & KAVANAGH (2001) ao tratarem

um isolado de C. albicans com manosidase observaram um substancial

decréscimo (60%) na aderência a células epiteliais, demonstrando a

importância deste componente da parede (manoproteínas) no processo de

aderência de C. albicans aos tecidos do hospedeiro.

Quadro 3 – Manoproteínas (MP) de C. albicans. Adaptado de Candida albicans adhesins: Biochemical aspects and virulence. Rev Iberoam Micol, 14,

p. 90-97, 1997. Adesinas (kD) Ligantes

MP60 iC3b, C3d

MP60 Laminina, fibrinogênio, fibronectina

MP58 Fibrinogênio

MP165 iC3b

MP70, 55, 42 C3H2O

MP130 iC3b

MP37/67 Laminina

Na parede celular destes fungos existem algumas enzimas

funcionais envolvidas na biossíntese ou remodelação da parede celular, que

acompanha o crescimento e divisão celular. O Quadro 4 demonstra de forma

resumida as enzimas hidrolíticas presentes na parede celular de espécies de

Candida e seu alvo de ação.

40

Quadro 4 – Enzimas hidrolíticas da parede celular de Candida spp. Adaptado de Cell Wall and Secreted Proteins of Candida albicans: Identification, function

and expression. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62(1), p. 130-180, 1998. Enzima Localização Comentário Referência

β-1,3-glucanase Parede celular Morfogênese da

Parede celular

CHAMBERS et al.

1993

β-1,3-glucana

transferase

Parede celular Metabolismo da

Parede celular

HERRERO et al. 1987

Quitinase Parede celular Enzima hidrolítica;

Morfogênese da

Parede celular

GOODAY et al. 1992

Transglutaminase Parede celular Covalent cross-

links?

RUIZ-HERRERA et al.

1995

Fosfolipase A Parede celular Enzima hidrolítica BARRET-BEE et al.

1985

Lisofosfolipase Parede celular Enzima hidrolítica BANNO et al. 1985

Fator hemolítico Parede celular Enzima hidrolítica BANNO et al. 1985

Metaloproteases Parede celular Enzima hidrolítica EL MOUDNI et al.

1995; EL MOUDNI et

al. 1997

Trehalase Parede celular Enzima hidrolítica MOLINA et al. 1989;

RUIZ-HERRERA &

SENTANDREU 1989

Visto a grande complexidade estrutural e funcional da parede

celular dos fungus, principalmente os causadores de infecções em humanos,

NIMRICHTER e colaboradores (2005) em uma revisão recente, demonstraram

que este conjunto de características e a biossíntese destes componentes

podem ser considerados como alvos potenciais para drogas e anticorpos

antifúngicos. Estes autores descrevem, ainda, novos aspectos de

41

determinados componentes da parede celular no envolvimento direto na

patogênese fúngica, como por exemplo: glicolipídios, melanina, proteínas de

choque térmico, histonas e antígenos de superfície (Figura 2).

Figura 2 – (A) Parede celular “clássica”; (B eC) Estrutura da parede celular apresentando os possíveis alvos (componentes da parede celular envolvidos diretamente na patogênese de

determinados fungos) para drogas e estruturas com capacidade antifúngica. Fonte: NIMRICHTER et al. (2005).

2.4.2 Produção de Enzimas Hidrolíticas - Proteases

As espécies de Candida apresentam uma grande variedade de

enzimas que facilitam o desenvolvimento da infecção, como: proteases ácidas,

fosfolipases, hialuronidase, condroitina sulfatase, metalo-protease

citoplasmática, serina-protease citoplasmática, esterase, glicomilase, fator

hemolítico e fosfatase ácida (CHAFFIN et al. 1998).

As proteases são enzimas encontradas em vários organismos,

desde vírus até humanos, catalisando um amplo espectro de reações

42

biológicas importantes, que inclui metabolismo protéico, reações imunes,

remodelação tecidual e coagulação sangüínea (McKERROW, 1989). As

proteases que degradam os terminais da cadeia polipeptídica são chamadas

de exoproteases ou, mais especificamente de amino e carboxiproteases ,

dependendo do final que é liberado da cadeia de aminoácidos do substrato

(McDONALD, 1985; BARRETT, 1986), ao passo que, as que catalisam a

clivagem de ligações peptídicas internas são denominadas endoproteases ou

proteases .

As análises in vitro das suas propriedades proporcionaram a

classificação das proteases segundo diversos critérios, com base nos

seguintes fatores: pH ótimo de atividade (ácida, neutra e alcalina), capacidade

de hidrolisar proteínas específicas (queratinase, elastase, colagenase e outras)

e similaridade com proteínas já caracterizadas, como a pepsina, tripsina,

quimiotripsina e catepsinas de mamíferos. As endoproteases podem ser

divididas em seis subclasses, que são: serina, cisteína, aspártico, metalo,

treonina e glutâmico proteases. Ao passo que as carboxiproteases foram

subdivididas em três classes, serina, metalo e cisteína carboxiproteases.

Algumas proteases não se encaixam nestas subclasses e formam a subclasse

3.4.99, de mecanismo catalítico desconhecido (BARRET, RAWLINGS &

O’BRIEN, 2001).

As proteases celulares podem apresentar funções de degradação

de proteínas e peptídeos residentes na célula, como é o caso das proteases

citossólicas e mitocôndriais; outras são sintetizadas para serem exportadas

para o espaço extracelular (proteases secretadas), como as proteases

43

lisossomais e de membrana plasmática. Ainda com relação à ação das

proteases, pode ser dividida em proteólise limitada ou ilimitada, levando em

consideração o tipo de proteólise realizada. A primeira, as proteases clivam

somente uma ou um número limitado de ligações peptídicas com o objetivo de

ativar proteínas alvo, enquanto que a outra ocorre uma degradação sem

controle e/ou completa das ligações peptídicas de uma proteína (WOLF, 1992).

A atividade proteolítica celular deve ser altamente regulada para

prevenir degradação inapropriada e incontrolada de proteínas. Portanto, a ação

de uma protease deve ser limitada por sua localização subcelular e regulada

em inúmeras etapas (BOND & BUTLER, 1987).

A classe de uma protease pode ser determinada de acordo com

os seus efeitos de inibidores sobre a atividade enzimática (BARRET, 1977),

sendo esses designados em três classes: a dos que reagem com mais de uma

classe de protease; a dos específicos para uma única classe; a dos que têm

alta especificidade por uma única protease (BEYNON & BOND, 1989).

Devido à existência de vários inibidores naturais das proteases,

vários grupos de pesquisa buscam um melhor conhecimento a respeito destas

classes de enzimas, o que é estimulado pelo seu evidente potencial como alvo

para novas terapias (HUBE, 2000). Dessa forma, o armazenamento e a

obtenção da informação devem ser otimizados e, para tal, os sistemas de

classificação e nomenclatura das enzimas devem seguir os avanços dos

estudos da química de proteínas, como o seqüenciamento de aminoácidos e a

cristalografia. Dessa forma, foi criado o sistema MEROPS

(htttp://merops.sanger.ac.uk) que agrupa as enzimas em famílias de acordo

44

com a homologia na seqüência de aminoácidos. Por sua vez, as famílias de

mesma origem ancestral são agrupadas em clãs e este tipo de informação é

determinado pela estrutura terciária das proteases (BARRET, TOLLE &

RAWLINGS, 2003).

No Quadro 5 podem ser observadas algumas classes de

proteases com seus respectivos inibidores e espectro de ação.

45

Quadro 5 – Relação das classes de proteases com respectivos inibidores e espectro de ação. Fonte: McKERROW et al., 1993

Classe de Protease Inibidores Espectro de ação

Diisopropilfluorfosfato (DFP ou DIFP);

Diisopropilfluorfosfofluorideto (DispF)

Todas

Fluoreto de fenilmetanosulfonil (PMSF) Muitas

Serina-proteases

Clorometil cetonas (N-p-tosil-L-lisina-

clorometil cetona, TLCK; L-1-

tosilamido-2-feniletil clorometil cetona,

TPCK)

Algumas

p-hidroximercuriobenzoato (pHMB); E-

64 (L-trans-epoxisuccinil leucilamido-

(4-guanidino) butano); reagentes

alcaninos ( acetato de iodo,

iodoacetamida e N-etilmaleimida

(NEM)

Todas Cisteína-proteases

PMSF; Clorometil cetonas Algumas

Aspártico-proteases Pepstatinas (pentapeptídeos acilados,

isolados de actinomicetos); compostos

diazoacetílicos (diazoacetil-L-fenil-metil

éster)

Todas

Metalo-proteases Agentes quelantes: EDTA (ácido

etileno-diamino tetracético); EGTA;

Fenantrolina

Algumas

A produção e secreção de proteases por espécies de C. albicans

foi descrita pela primeira vez em 1965 (STAIB, 1965) e desde então vem sendo

intensamente estudada por ser considerada um fator importante na

patogenicidade de espécies de Candida (MacDONALD & ODDS, 1983;

GHANNOUM & ABU-ELTEEN, 1986). Tem capacidade de digerir proteínas do

46

hospedeiro (MacDONALD, 1984), invadir os tecidos através da degradação de

imunoglobulinas e proteínas do sistema complemento (RUCHEL, 1986;

KAMINISHI et al., 1995), e proteínas da matrix extracelular (MORSCHHÄUSER

et al., 1997).

MacDONALD & ODDS (1983) verificaram a influência da

produção e secreção de proteases por espécies de C. albicans na invasão e

destruição dos tecidos de camundongos através da inoculação de espécies de

Candida produtoras de proteases e cepas mutantes que não produziam tal

enzima. Os camundongos inoculados com as espécies produtoras de protease

morreram, enquanto o mesmo não ocorreu com os aqueles onde as cepas

mutantes foram inoculadas. Os autores concluíram então que as proteases

seriam um dos fatores determinantes da virulência de C. albicans. Mais tarde,

GHANNOUM & ABU-ELTEEN (1986) corroborando tais achados, mostraram

que a produção de proteases por espécies de Candida é essencial para que

haja a invasão nos tecidos, levando a a uma ruptura na adesão entre as

células ou até na lise da membrana celular do hospedeiro.

A produção e secreção de proteases não é característica

exclusiva de C. albicans. Todas as espécies de Candida até o presente

momento estudadas, crescidas na presença de proteína com fonte de

nitrogênio, são produtoras de proteases para o meio extracelular, o que faz

com que este não seja um fator de virulência exclusivo de C. albicans (RAY &

PAYNE, 1990; CHAKRABARTI et al., 1991).

Estudos realizados por CHAKRABARTI et al (1991) identificaram

proteases produzidas por outras espécies de Candida, comparando com a C.

47

albicans, e observaram que, além dessa a C. tropicalis, C. parapsilosis e C.

glabrata são capazes de produzir e secretar aspártico-proteases. Concluíram,

também que as proteases devem ser importantes fatores na patogênese de

espécies de Candida, principalmente em sítios onde estão presentes, também,

na ausência de doença.

HUBE (2000) cita que em C. albicans não foi detectada a

presença de outra classe de protease, a não ser a aspártico-protease. No

entanto, COSTA e colaboradores (2003) descreveram pela primeira vez que C.

albicans isoladas da mucosa oral de crianças infectadas pelo HIV e de crianças

sem evidências clínicas de imunossupressão eram capazes de produzir e

secretar para o meio extracelular outras duas classes, metalo e serina

proteases, quando cultivadas em meio BHI (infusão de cérebro e coração), e

tendo a gelatina como substrato. SANTOS & SOARES (2005) demonstraram

que uma espécie de Candida não-albicans (C. guillermondii), isolada de um

indivíduo soropositivo para o HIV, era capaz de secretar uma serina protease

de 50 kDa com propriedades de hidrolisar proteínas presentes no soro humano

e componentes da matriz extracelular. Mais tarde, este mesmo grupo

demonstrou que espécies de C. albicans isoladas de urina também foram

capazes de secretar serina protease para o meio extracelular quando

cultivadas em BHI (SANTOS et al., 2006).

OLLERT et al. (1995), ao investigarem a relação entre a atividade

secretora de protease de C. albicans isoladas da mucosa orofaríngea saudável

e com lesão de 100 pacientes infectados pelo HIV e 112 indivíduos HIV-,

observaram que no grupo HIV+ a secreção foi estatisticamente maior quando

48

comparada com o grupo controle, embora a produção tenha ocorrido em todas

as cepas analisadas. A intensidade de produção da protease das espécies de

Candida isoladas dos indivíduos HIV+ mostrou-se independente da condição

sistêmica e da relação CD4/CD8 dos pacientes. De acordo com estes achados,

os autores concluíram que a deterioração do sistema imune provocada pela

infecção pelo HIV não influenciou na virulência destes microrganismos, embora

o grupo HIV apresentasse maior produção de protease. Provavelmente

ocorreria uma seleção de espécies de Candida logo após a infecção pelo HIV.

Adicionalmente, este achado corrobora como outros estudos em que

constatou-se que a imunodeficiência celular, neutropenia crônica, câncer e

outras situações em que se faz necessária a terapia imunossupressiva são

fatores que predispõem a mudança do fungo de um estágio comensal para um

patogênico (STEWART et al. 1999; HUBE, 2000). No entanto, DE BERNARDIS

et al. (1992) demonstraram que isolados de C. albicans de pacientes infectados

pelo HIV em estágios avançados apresentavam padrões proteolíticos mais

intensos do que no caso de indivíduos não infectados ou em estágios iniciais

da infecção, o que discorda dos achados de OLLERT et al. (1995).

SCHALLER et al. (1999), ao demonstrarem a localização e

expressão, in vivo, de anticorpos contra aspártico-proteases durante um

episódio de candidíase orofaríngea através de anticorpos monoclonais e

microscopia eletrônica, detectaram o sítio de contato entre a C. albicans e as

células epiteliais, sugerindo ser a protease a responsável por toda capacidade

de causar doença nesta interação fungo-hospedeiro. Concluíram, então, que a

49

inibição desta enzima deve ser considerada como uma importante alternativa

na prevenção e tratamento da candidíase.

Existem evidências claras na literatura, da interação das

proteases produzidas por Candida spp. com proteínas chaves do hospedeiro.

CALDERONI (1989) e RUCHEL et al. (1992) demonstraram que esta classe de

enzima, durante a colonização do fungo no organismo, é responsável pela

degradação das barreiras da mucosa do hospedeiro, facilitando a sua

aderência, digestão de proteínas com finalidade nutricional e quebra da

barreira imunológica através do ataque aos linfócitos e macrófagos. Esta ação

seria facilitada pela existência, em algumas destas proteínas chaves do

hospedeiro, de epítopos com propriedades de adesão que seriam reconhecidas

pelo fungo. BOUCHARA et al.(1990) demonstraram a existência de receptores

específicos nos tubos germinativos de espécies de C. albicans para laminina,

umas das mais importantes glicoproteínas constituintes da membrana basal.

Isso facilitaria a adesão deste microrganismo, contribuindo para o

estabelecimento da candidíase.

MORSCHHÄUSER et al (1997), ao investigarem se a secreção

de protease ácida (aspártico-protease) por C. albicans facilitaria a invasão

destes microrganismos para tecidos mais profundos através da degradação

metabólica de proteínas da matriz extracelular, observaram haver grande

hidrólise. Concluíram ser a enzima secretada por estes fungos fator importante

na penetração através dos tecidos mais profundos podendo, também, atingir a

circulação sanguínea. Esta atividade proteolítica é atribuída a família

multigenes SAP de C. albicans com 10 membros. Oito dessas proteases

50

(Sap1-8) são secretadas para o espaço extracelular, enquanto as Sap 9 e Sap

10 estão ligadas a membrana via âncora de GPI (SCHALLER et al., 2005).

Esses autores propõem, ainda, nesta recente revisão da literatura sobre

enzimas hidrolíticas de C. albicans, que a presença de 10 genes que codificam

diferentes sub-classes de aspártico-proteases apresentam uma variedade de

funções cruciais na patogênese das infecções por C.albicans (Figura 3).

Figura 3 – Expressão das diferentes sub-classes de aspártico-proteases por C. albicans durante o processo de infecção. Fonte: MUNRO & HUBE, 2002.

De acordo com o processo de infecção, diferentes isoenzimas

são expressas. Em um estudo in vitro utilizando um modelo de candidíase

vaginal, SCHALLER e colaboradores (2005) sugerem que diferentes Saps

possuem importância crucial na indução da resposta de citocinas durante a

infecção vaginal por C. albicans.

51

2.4.2.1 Inibidores proteolíticos

Algumas proteases celulares devem exclusivamente degradar

proteínas e peptídeos residentes na célula, incluindo proteases citossólicas e

mitocondriais; outras são sintetizadas para serem exportadas para o espaço

extracelular (proteaes secretadas), como é o caso das proteases de membrana

plasmática e parede celular. A ação das proteases pode ainda ser dividida em

duas categorias, levando-se em consideração o tipo de proteólise realizada,

isto incluiria proteólises limitadas, nas quais as proteaes clivam somente uma

ou um número limitado de ligações peptídicas com o objetivo de ativar

proteínas alvo e proteólises ilimitadas, nas quais ocorre uma degradação sem

controle e/ou completa, das ligações peptídicas de uma proteína (WOLF,

1992). Assim, a atividade proteolítica celular deve ser altamente regulada para

prevenir degradação inapropriada e incontrolada de proteínas vitais para a

célula (BOND & BUTLER, 1987). Neste contexto, os inibidores proteolíticos

assumem papéis cruciais na manutenção da integridade celular e,

conseqüentemente do hospedeiro como um todo.

Muitos inibidores proteolíticos naturais e sintéticos têm sido

identificados (BODE & HUBER, 1992; BARRETT, 1996). Inibidores naturais

desenvolvem funções importantes na regulação pós-traducional da atividade

proteolítica em microrganismos e em seus hospedeiros (LUSTIGMAN et al.,

1992). Inibidores sintéticos são usados como ferramentas importantes na

subclassificação das proteases em seus grupos principais (BARRETT, 1996).

Os efeitos de inibidores sobre a atividade enzimática podem determinar a

classe das proteases (Quadro 5).

52

Os inibidores proteolíticos têm sido considerados como

ferramentas em potencial para o tratamento de inúmeras patologias, como

câncer (DE VIZCAYA-RUIZ et al., 2000; ZHOU et al., 2002), infecções fúngicas

e parasitárias (BECKER et al., 1995; BRINDLEY et al., 1997), infecção pelo

HIV (DASH et al., 2003), Hepatite (KIM et al., 1996, LOVE et al., 1996), Herpes

(GIBSON & HALL, 1997), desordens inflamatórias, imunológicas e respiratórias

(TANAKA et al., 1995; HUGLI, 1996; FATH et al., 1998), alterações

cardiovasculares (OEHFNER et al., 1999) e disfunções neurodegenerativas

como doença de Alzheimer (HONG et al., 2002).

ABBENANTE & FAIRLIE (2005) ao realizarem uma extensa

revisão da literatura sobre os inibidores proteolíticos observaram que esses

apresentam atividades terapêuticas promissoras. No entanto, apesar do grande

número de estudos realizados nestas duas últimas décadas, ainda existe um

reduzido número de drogas disponíveis com adequada efetividade e segurança

para o uso como medicamentos em humanos.

Com relação a infecção fúngica causada por C. albicans, que

possui sua patogenicidade associada a um grupo de fatores de virulência que

inclui os genes que codificam as SAPs – aspártico-proteases secretadas

(SCHALLER et al., 2005), e mais recentemente a secreção também de serina-

protease (COSTA et al., SANTOS et al., 2006), ainda não se utiliza no

tratamento da infecção antifúngicos tendo como alvo estas enzimas. No

entanto, ABBENANTE & FAIRLIE (2005) listaram um grande número de drogas

em diferentes fases do desenvolvimento clínico para o tratamento de várias

53

desordens, exceto a candidíase, tento como alvo a inibição de serina (Figura 4)

e aspártico- proteases (Figura 5).

Uma das principais causas para o aumento de infecções

oportunistas, dentre elas a candidíase, foi o grande aumento do número de

indivíduos infectados pelo HIV (REPENTIGNY, LEWANDOWSKI &

JOLICOEUR, 2004). Com o intuito de impedir a evolução da AIDS, as drogas

uitlizadas agem impedindo e/ou desorganizando o processo de replicação do

vírus HIV. Em 1996, um novo esquema anti-retroviral foi introduzido – HAART,

onde havia a associação de medicamentos com diferentes alvos, incluindo a

inibição da protease viral (MARTINS, LOZANO-CHIU & REX, 1998). A enzima

aspártico-protease tem ação na clivagem das poliproteínas gag e gag-pol, que

são precursoras das proteínas funcionais (p17, p24, p7, p6, p2, p1, proteases,

transcriptase reversa e integrase), responsáveis então pela maturação do vírus

HIV (CAVERT et al., 1997; SEPKOWITZ, 1998). Com a inibição dessa enzima

através deste novo esquema anti-retroviral foi observado um aumento do

número de células T CD4+ e uma diminuição da incidência de infecções

oportunistas, como a candidíase (SOARES et al., 2002).

Vários estudos na literatura vêm atribuindo a redução da infecção

por Candida em pacientes infectados pelo HIV ao efeito indireto (melhora da

condição imunológica do hospedeiro), como também a um efeito direto sobre

as aspártico-proteases secretadas por estes fungos (BORG-VON ZEPELIN et

al., 1999; KORTING et al., 1999; CASSONE et al., 1999; GRUBER et al., 1999;

BERKTIÉ et al., 2001) exercendo desta forma um efeito protetor contra o

estabelecimento da infecção fúngica (Figura 6). Por isso, os inibidores de

54

aspártico protease do HIV estão sendo alvo de pesquisas para o tratamento

alternativo para infecções fúngicas, devido a crescente resistência dos fungos

aos quimioterápicos existentes (PALMEIRA, 2006).

Figura 6 – (A) Adesão, degradação do tecido do hospedeiro e penetração proporcionada pela secreção de diferentes Saps; (B) Efeito protetor gerado

pela presença dos inibidores da aspártico-protease do HIV (HIV-PI) através da inibição da atividade das Saps de Candida albicans. Fonte: MUNRO & HUBE,

2002.

No entanto, como a maioria dos medicamentos, cabe aqui

ressaltar os efeitos colaterais causados por estes inibidores, por serem

hidrofóbicos e se depositarem nos adipócitos, podendo causar disfunção

mitocondrial nas células do hospedeiro (MUKHOPADHYAY et al., 2002),

disfunções na diferenciação de adipócitos, atrofia lipídica periférica devido ao

55

aumento de ácidos graxos liberados dos adipócitos mortos por apoptose

(RUDICH et al., 2001; HADIGAN et al., 2002), acúmulo de gordura no

abdômen, devido à interrupção do hormônio do crescimento e de cortisol

(RUDICH et al., 2001; HADIGAN et al., 2002), elevado índice de triglicerídeos

(GOUGEON et al., 2000; LENHARD et al., 2000) e colesterol (LIANG et al.,

2001; DUBE et al., 2002). Apesar desses efeitos colaterais, seus benefícios em

pacientes infectados pelo HIV são significativos, levando ao declínio da carga

viral, aumento da resposta imunológica e conseqüente diminuição das

infecções oportunistas.

56

Figura 4 – Inibidores de serina-protease em desenvolvimento clínico. Fonte: ABBENANTE & FAIRLIE, 2005.

57

Figura 5 – Inibidores de aspártico-protease em desenvolvimento clínico. Fonte: ABBENANTE & FAIRLIE, 2005.

58

2.4.3 Diferenciação celular

A observação de hifas em tecidos infectados e sua maior

resistência à fagocitose sugere tratar-se da forma patogênica de C. albicans,

enquanto a forma ovóide da levedura representa seu estado comensal

(SWEET, 1997).

As espécies de C. albicans exibem a capacidade de crescimento

tanto na forma de levedura como de micélio (tubo germinativo) em resposta

aos diferentes fatores ambientais. Experimentos in vivo demonstram que esta

transição de levedura para micélio deve estar relacionada com a

patogenicidade deste microrganismo, passando, então, a ser considerada

como um importante fator de virulência (CUTLER, 1991). In vitro, esta mudança

morfológica é facilmente induzida através de algumas características

ambientais e/ou nutricionais (como por exemplo: temperatura, pH e fonte de

carbono) (SIMONETTI et al. 1974; BUFFO et al. 1984). No entanto, os

mecanismos fisiológicos envolvidos no processo de morfogênese e regulação

molecular em C. albicans devem ser mais bem esclarecidos (CASANOVA et al.

1997). Por isso vários estudos vêm sendo realizados a fim de se compreender

melhor estes eventos para que se possa usá-los no tratamento e prevenção de

infecções fúngicas, principalmente em pacientes mais susceptíveis.

Os eventos de diferenciação celular são induzidos pelas

mudanças na expressão de genes que codificam fatores específicos, muitos

dos quais são necessários para a virulência do microrganismo (WHITEWAY &

OBERHOLZER, 2004). A via de transdução de sinal pertencente a família de

proteínas Ras – proteína cinase A (PKA) é importante no processo de

59

regulação e diferenciação tanto para a formação de hifas quanto para a

virulência de Candida albicans durante o desenvolvimento da infecção (LO et

al., 1997). Recentemente, UENO e colaboradores (2004) demonstraram que

poliaminas apresentam uma ação “upstream” na ativação da via de sinalização

da adenilato ciclase elevando a concentração de AMP cíclico intracelular,

regulando assim a formação de hifas em Candida albicans (Figura 6).

Figura 6 – Interação de Poliaminas na via de transdução de sinal da Adenilato ciclase-AMP cíclico. Fonte: UENO et al., 2004.

PARK et al. (2005) corroboraram os resultados do estudo anterior

ao observarem, através de um modelo de infecção de células epiteliais orais in

vitro e um modelo de infecção in vivo de camundongos, que a formação de

hifas é mediada pela via das proteínas RAS – cinase A sendo ainda um

mecanismo de virulência chave durante o processo de infecção orofaríngea. No

entanto, WARENDA et al. (2003) ao estudarem a capacidade de diferenciação

60

de Candida albicans em hifas in vitro e in vivo e invasão aos tecidos do

hospedeiro, observaram que cepas mutantes para a produção de septinas

apresentaram capacidade para o crescimento em forma de hifas normal mas

reduzida invasão aos tecidos e atenuação na virulência. A família das septinas

é formada por proteínas responsáveis pela formação dos filamentos do

citoesqueleto e recentemente tem-se investigado a sua importância na

formação de hifas em C. albicans, já que essas proteínas apresentam funções

na morfogênese e em importantes eventos na superfície celular de outros

fungos (LONGTINE et al., 1996; WARENDA et al., 2002). Assim, WARENDA e

colaboradores (2003) concluíram que as septinas são necessárias para a

invasão, o que parece ser mais importante para o sucesso da patogênese de

Candida albicans que a formação de hifas isoladamente. Isso porque as cepas

formadoras de hifas mas com baixa produção de septinas (mutantes) não

foram capazes de produzir infecção.

Em outros fungos, esta via de sinalização celular também é

crucial para o processo de diferenciação celular. D`SOUZA e colaboradores

(2001) observaram em Cryptococcus neoformans que um mutante pka, por

apresentar uma atividade reduzida desta enzima, mostrou com reduzida

virulência quando comparado com uma cepa selvagem. A baixa atividade de

PKA influenciou não somente o processo de diferenciação celular, mas

também a produção de melanina e de cápsula, fatores estes já associados à

patogênese do microrganismo.

Muitos componentes de outras vias de transdução de sinal podem

ser necessárias no controle da morfogênese. A sinalização através do cálcio

61

tem sido associada a diferenciação do estado de levedura para hifa. A

subunidade A da calcineurina, que é regulada pelo cálcio ligado a calmodulina

é necessária para o desenvolvimento adequado da hifa, e a proteína cinase

dependente de cálcio/calmodulina já foi identificada em Candida albicans

(SATO et al., 2004).

2.4.4 Adesão e formação de biofilme de Candida

Para muitos microrganismos a adesão aos tecidos do hospedeiro

é essencial para a patogênese, e as características microbianas responsáveis

por esta adesão às supefícies das mucosas são considerados atributos da

virulência (CASADEVALL & PIROFSKI, 2001). Para C. albicans, a adesão as

superfícies do hospedeiro também é de extrema necessidade para ocorrer o

desenvolvimento da infecção. Além dessa adesão, há a capacidade de

formação de biofilme devido a hidrofobicidade da parede celular. Esta

importante característica permite com que C. albicans colonize além dos

tecidos do hospedeiro, implantes, catéteres e materiais cirúrgicos. Uma das

molécula sinalizadora, farnesol (“quorum-sensing” molécula), que inibe a

formação de hifas em C. albicans, tem apresentado também capacidade de

prevenir a formação de biofilme por este fungo. CAO e colaboradores (2005)

utilizando análises de expressões de genes por “microarray” de uma população

fúngica tratada com farnesol caracterizou uma série de produtos gênicos

importantes para a formação do biofilme.

No entanto, para que ocorra a formação desta comunidade

microbiana altamente estruturada, o biofilme, é necessário haver interação

62

entre moléculas presentes na superfície da célula fúngica e na célula epitelial.

Evidências sugerem as manoproteínas de Candida albicans como as principais

adesinas responsáveis pela adesão às células do hospedeiro (TOSH &

DOUGLAS, 1992).

O fenômeno de adesão é conferido a proteínas especializadas de

superfície celular chamadas de adesinas que se ligam especificamente a

aminoácidos ou açúcares na superfície de outras células ou promovem a

adesão a superfícies abióticas. Todas as adesinas fúngicas compartilham em

comum três domínios estruturais, que são: domínio C-terminal que contém a

âncora de GPI (glicosilfosfatidilinositol) responsável pela ligação da adesina a

parede celular, a porção N-terminal que contém o carboidrato ou peptídeo de

ligação e o domínio central caracterizado pela presença de múltiplas repetições

de serina- e treonina- codificados por uma sequência conservada do DNA

(Figura 7) (VERSTREPEN & KLIS, 2006).

O envolvimento de vários fatores na adesão da Candida às

células epiteliais tem sido também demonstrado, e entre eles, a atividade

proteolítica extracelular (BORG & RÜCHEL, 1988; HUBE, 1996). A secreção de

enzimas proteolíticas aumenta a capacidade do fungo para colonizar e penetrar

nos tecidos bem como escapar do sistema imune do hospedeiro (MacDONALD

& ODDS, 1980; BORG & RÜCHEL, 1988; RAY & PAYNE, 1988; CUTLER,

1991; RÜCHEL et al., 1992; KAMINISHI et al., 1995; KRETSCHMAR et al.,

1999). O “phenotypic swiching” (mudanças reversíveis nas características

fenotípicas das células) também contribui para a aderência, pois permite ao

fungo assexuado adaptar-se às mudanças ambientais. Ou seja, quando ocorre

63

alteração no equilíbrio do meio bucal, pode haver mudança na expressão de

moléculas de superfície da Candida, favorecendo sua aderência na mucosa

bucal e consequentemente infecção (CANNON et al., 1995). Os genes de

adesão são ativados por diversos fatores, tais como: estarvação do meio por

carbono e/ou nitrogênio, mudanças de pH ou alterações nos níveis de etanol

(SAMPERMANS et al., 2005). Estas mudanças da forma “não-aderente” para a

“aderente” permite uma adaptação das leveduras a estas situações de “stress”.

Tem-se sugerido que o DNA proviral do HIV pode estar presente

em células epiteliais bucais e provocar mudanças na superfície celular, de

forma a favorecer a colonização da Candida (QURESHI et al., 1995).

Posteriormente foi demonstrado que C. albicans se liga a um número

significantemente maior de celulas epiteliais bucais de pacientes HIV+ do que

de indivíduos saudáveis. Isto pode significar que receptores das células

hospedeiras possuem papel decisivo na recorrência de candidíase oral em

pacientes infectados pelo HIV (SCHWAB et al., 1997).

64

Figura 7 – Secreção e ancoramento na superfície celular de adesinas fúngicas. As adesinas fúngicas consistem de três domínios. Durante o transporte através

da via de secreção, as adesinas sofrem extensas modificações pos-transducionais. No retículo endoplasmático, o peptídeo sinal da porção N-

terminal é removido e o peptídio da porção C-terminal é substituído pela âncora de GPI, e ainda se inicia o processo de N-glicosilação e O-glicosilação

envolvendo os resíduos de serina e treonina. Acredita-se que íons cálcio sejam necessário para a estalização da longa e semi-rígida estrutura formada pela adesina ao reconhecer seu receptor. Fonte: VERSTREPEN & KLIS, 2006.

O processo de adesão de espécies de Candida às superfícies

do hospedeiro é controlado e induzido por várias cascatas de sinalização

celular tanto no fungo como também no ambiente, em prol de sua virulência.

DRAGO et al. (2000) observaram que células epiteliais orais promoviam a

endocitose de Candida albicans. Mais tarde, PARK e colaboradores (2005)

corroboraram este achado ao demonstrarem que o acúmulo de actina na célula

epitelial ao redor da hifa internalizada sugeriria a endocitose do fungo por estas

células. Assim, concluíram que após a adesão, Candida albicans invade o

65

epitélio oral in vitro através da indução da sua própria endocitose pelas células

do hospedeiro.

Além da adesão, espécies de Candida podem formar biofilmes

tornando esses microrganimos menos susceptíveis aos antifúngicos. Biofilme

de C. albicans consiste em uma mistura de leveduras, hifas e pseudohifas e

apresenta uma camada basal de leveduras que ancora todo este biofilme na

superfície (BAILLIE & DOUGLAS, 2000). Resultados de muitos estudos têm

demonstrado que biofilmes formados por espécies de Candida mostram-se

mais resistentes a importantes agentes antifúngicos utilizados na clínica, como

anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Novos azóis, como

voriconazol e ravuconazol, também mostraram-se ineficazes contra estes

biofilmes (KUHN et al., 2002).

O mecanismo de resistência do biofilme aos agentes

antimicrobianos ainda não está totalmente elucidado. Uma das hipóteses que

pode explicar esta resistência é a presença da matriz restringindo a penetração

dos medicamentos através da formação de uma barreira de difusão (GILBERT

et al., 2002) e somente as camadas mais superficiais estariam em contato com

doses letais dos antibióticos.

2.4.5 Ecto-fosfatases em Candida

Todas as células necessitam monitorar constatemente seus

ambientes internos para responder a estímulos indutores de proliferação,

66

diferenciação e morte celular (DICKMAN & YARDEN, 1999). Em eucariotos, os

processos de fosforilação e defosforilação são eventos chave na manutenção

do balanço de atividades celulares como de processos metabólicos, expressão

gênica, controle do ciclo celular, mecanismos secretórios e de transporte,

organização do citoesqueleto, adesão celular e apoptose (WERA &

HEMMINGS, 1995; BARFORD et al., 1998; McCLUSKEY & SAKOFF, 2001).

As alterações dos estados de fosforilação de proteínas são reguladas por duas

classes de enzimas, as proteína-cinases, que catalisam a adição covalente de

grupos fosfatos a resíduos de aminoácidos, ou através da ação reversa de

proteína-fosfatases (BARFORD et al., 1998). A fosforilação protéica permite a

regulação de atividades enzimáticas através de mudanças conformacionais

alostéricas, ou impedindo o acesso ao sítio catalítico da enzima (JOHNSON &

BARFORD, 1993). Desta forma, a adição ou remoção de um grupo fosfato

pode alterar profundamente a atividade ou propriedade de uma proteína.

As proteínas-fosfatases constituem uma família de enzimas

estrutural e funcionalmente diversas que fazem parte integral do sistema

regulatório de fosforilação e hidrolisam uma variedade de ésteres orgânicos,

incluindo proteínas, com liberação de fosfato inorgânico (FISHER et al., 1991).

Estas enzimas desempenham papel chave na biologia celular de espécies

fúngicas. Vários processos biológicos fundamentais em fungos, tais como ciclo

celular, transcrição, “mating” e diferenciação celular são modulados através da

fosforilação de proteínas (MADHANI & FINK, 1998; DICKMAN & YARDEN,

1999; DA SILVA et al., 1999; ZHAN et al., 2000).

67

Fosfatases de superfície, que apresentam o sítio ativo está

voltado para o meio extracelular, são conhecidas como ecto-enzimas e podem

ser estudadas utilizando células vivas (FURUYA et al., 1998). As ecto-

fosfatases foram detectadas em vários microrganismos, incluindo protozoários

(FERNANDES et al., 1997; MEYER-FERNANDES et al., 1999) e bactérias

(BRAIBANT & CONTENT, 2001). A presença de fosfatases de supefície em

fungos foi estudada, incluindo Cryptococcus neoformans (MAHVI et al., 1974),

S. cerevisiae (MILDNER et al., 1975), Sporothrix schenckii (ARNOLD et al.,

1986), paracoccidiodes brasiliensis (AASEN & ALBORNOZ, 1994), Candida

parapsilosis (FERNANDO et al., 1999), Aspergillus fumigatus (BERNARD et al.,

2002) e Fonsecaea pedrosoi (KNEIPP et al., 2003), através de métodos

citoquímicos e/ou bioquímicos.

O papel fisiológico das ecto-fosfatases expressas em diferentes

microrganismos ainda não foi elucidado, embora alguns estudos sugiram suas

funções. As fosfatases de superfície podem funcionar regulando a fonte de

fosfato inorgânico para o crescimento microbiano, através da hidrólise de

metabólitos fosfomonoéster (GOTTLIEB & DWYER, 1981; FERNANDES et al.,

1997). Essas enzimas foram ainda associadas à diferenciação celular

(BAKALARA et al., 2000). As ecto-fosfatases podem ainda funcionar como

marcadores de virulência, já que amostras virulentas de Leishmania donovani

apresentam níveis de atividade enzimática significantemente maiores do que

os detectados em amostras avirulentas (SINGLA et al., 1992). As fosfatases

podem também interferir nas interações parasito-célula hospedeira

(FERNANDO et al., 1999; KNEIPP et al., 2005). No caso de espécies

68

pertencentes ao gênero Leishmania as fosfatases ácidas podem modular a

adesão a macrófagos (VANNIER-SANTOS et al., 1995) e eventos cruciais

durante a infecção por este parasito, através da regulação da sinalização

celular (MARTINY et al., 1996). Em C. parapsilosis foi demonstrada a

associação da atividade fosfatásica ácida e alcalina com a adesão de

diferentes isolados deste fungo a células epiteliais bucais humanas. Os autores

demonstraram que isolados de Candida parapsilosis que exibiram maior

atividade fosfatásica foram os que apresentaram maior capacidade de adesão

as células epiteliais. Esta relação indica que fosfatases de espécies de Candida

podem desempenhar um papel crucial na potencialização da virulência deste

fungo (FERNANDO et al., 1999). No entanto, na literatura consultada nenhum

estudo foi encontrado sobre a influência da infecção pelo HIV sobre etas

leveduras.

69

3. Objetivos3. Objetivos3. Objetivos3. Objetivos

O presente estudo teve como objetivos:

1 Identificar possíveis associações entre a secreção de serina-protease por

espécies de Candida e os seguintes parâmetros:

� degradação de proteínas presentes na matriz extracelular (laminina,

fibronectina e colágeno) e componentes do soro (albumina humana e bovina e

IgG);

� adesão à células epiteliais (Ma 104);

� formação de biofilme.

� Comparar o perfil de proteínas de superfície de C. albicans isolada de

criança infectada pelo HIV e criança sem evidências clínicas de

imunossupressão com relação ao reconhecimento de proteínas formadoras da

matriz extracelular.

� Avaliar o efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de protease do

HIV no crescimento, diferenciação celular e adesão a células epiteliais (Ma

104) de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV.

� Verificar o possível envolvimento das atividades fosfatásicas ácidas de

superfície de C. albicans isoladas da cavidade bucal de crianças infectadas

pelo HIV e de crianças sem evidências clínicas de imunossupressão em

70

processos de adesão a células epiteliais (Ma 104), e ainda comparar com a

condição sistêmica de cada paciente.

71

4. Materiais e4. Materiais e4. Materiais e4. Materiais e Métodos Métodos Métodos Métodos

4.1 Microrganismos

No presente trabalho foram utilizadas Candida spp. isoladas da

mucosa bucal de crianças infectadas pelo HIV e de crianças sem evidências

clínicas de imunossupressão (COSTA et al., 2003; PORTELA et al., 2005). As

leveduras vêm sendo mantidas em tubos de rosca contendo 5 mL de meio

Sabouraud-dextrose sólido com vaselina estéril no Laboratório de Protistas do

Departamento de Microbiologia Geral do Instituto de Microbiologia Professor

Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

4.2 Condições de cultivo

Para obtenção dos extratos celulares e sobrenadantes de cultivo,

os isolados de Candida, após o crescimento em meio sólido, foram cultivados

em meio BHI (infusão de cérebro e coração, Difco, Bacto) distribuídos em

alíquotas de 10 mL em frasco Erlemeyer de 50 mL permanecendo sob agitação

por 48 horas a 37°C.

Para induzir a secreção de aspártico-protease, as leveduras

foram crescidas por 5 dias a 37oC em meio de cultivo o YCB (Yeast Carbon

Base, Difco, Bacto) suplementado com 1% de BSA (soro albumina bovina) pH

5.5, em um mesmo volume e frasco Erlemeyer.

72

4.3 Contagem do número de células

O crescimento celular foi estimado através de contagem das

células em câmara hematocitométrica de Neubauer (Neubauer Improved

Chamber).

4.4 Obtenção do extrato celular

As células foram coletadas e lavadas três vezes com PBS (pH

7,2) gelado, transferidas para um tubo de 20 mL e ressuspendidas em PBS

contendo os seguintes inibidores proteolíticos: 1,10-fenantrolina a 10 mM, E-64

a 10 µM (L-trans-epoxisuccinil leucilamido-(4-guanidino) butano), fluoreto de

fenilmetanosulfonil (PMSF) a 100 µM, pepstatina a 10 µM. A este material foi

adicionado pérolas de vidro, de diâmetro de 425-600 µm, previamente lavadas

por 12 horas com ácido nítrico e mais 12 horas com água destilada. As

leveduras foram então rompidas utilizando-se um homogenizador de células

(bead-beater) por 5 períodos de 2 minutos cada, intercalados com banhos de

gelo de 1 minuto. O extrato celular foi obtido através da centrifugação a

10.000xg durante 2 minutos.

4.5 Obtenção do sobrenadante de cultivo

As leveduras foram coletadas, na fase logarítmica de

crescimento (48 horas de cultivo), através de centrifugação a 7000xg durante 8

minutos a 4°C. O sobrenadante obtido foi filtrado e m membrana Millipore 0,22

µm e, posteriormente, 3 mL foram submetidos a concentração por ultrafiltração

utilizando microconcentradores Centricon com membrana de exclusão (“cut-

73

off”) igual a 10 kDa, durante aproximadamente 7 horas a 4°C finalizando uma

solução concentrada 30x. Ao sobrenadante concentrado foram adicionados 10

µL de tampão de amostra (SANTOS et al., 1999).

4.6 Viabilidade celular

Após o crescimento as leveduras foram submetidas ao teste de

exclusão do corante azul de Trypan para verificação da viabilidade celular

(PATTERSON, 1979). O sobrenadante de cultivo, concentrado 30x foi utilizado

para dosagem da enzima lactato-desidrogenase (SANTOS et al., 2006).

4.7 Dosagem de proteínas

As proteínas foram quantificadas de acordo com o método

descrito por LOWRY et al. (1951), utilizando-se a soro albumina bovina (BSA)

(Sigma) como solução padrão.

4.8 Determinação do perfil de proteínas totais

Para a análise do perfil de proteínas totais foi realizado um gel de

poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE), contendo gel de empacotamento a 3%, de

acordo com o sistema descrito por LAEMMLI (1970). As amostras foram

adicionadas de 5% de 2-β-mercaptoetanol e aquecidas, em banho-maria, por

aproximadamente 5 min, a 100°C. Os géis foram carregados com 50 µg de

proteína referentes à amostra e a eletroforese processada a 100 V, a 4°C. As

proteínas foram reveladas através da coloração dos géis com 0,2% de

74

Coomassie Brilliant Blue R-250 em metanol:ácido acético:água (50:10:40 v/v/v)

ou com solução de nitrato de prata (GONÇALVES et al., 1984).

4.9 Ensaio para atividade proteolítica

As proteases foram caracterizadas por SDS-PAGE a 10% (com um

gel de empacotamento a 3%), contendo 0,1% de gelatina (Sigma) como

substrato co-polimerizado ao gel (HENSSEN & DOWDLE, 1980). Aos géis foram

aplicados os extratos das leveduras e os sobrenadantes de cultivo concentrado

e a corrida eletroforética realizada a 120 V, a 4°C. Ao término da corrida, os géis

foram incubados em 1% Triton X-100, com e sem os seguintes inibidores

proteolíticos: 1,10-fenantrolina a 10 mM, E-64 a 10 µM, PMSF a 100 µM,

pepstatina a 10 µM, por 1-2 h, à temperatura ambiente, com agitação suave. Os

géis foram, então, lavados com água destilada e incubados por 48 h, a 37°C em

50 mM de tampão fosfato, pH 5,5, suplementado com 2 mM de ditiotreitol (DTT),

na presença e na ausência dos inibidores proteolíticos citados anteriormente.

Depois da digestão enzimática, a revelação das bandas proteolíticas foi feita,

primeiramente, através da coloração do gel com 0,2% de Coomassie Brilliant

Blue R-250 em metanol:ácido acético:água (50:10:40 v/v/v) e, finalmente,

descorados em solução contendo 7% de metanol e 5% de ácido acético, à

temperatura ambiente, com agitação suave, por aproximadamente 16 h

(SANTOS et al., 1999). Ao final da descoloração, os géis foram mantidos em

água destilada, por 1 h, fotografados e postos para secar a temperatura

ambiente, em folhas de papel celofane. Análises densitométricas das bandas

75

proteolíticas foram realizadas utilizando-se o “software” do analisador de

imagens Kodak Digital Science EDAS 120.

4.10 Massa molecular aparente de proteínas e protea ses

As massas moleculares aparentes das proteínas e proteases foram

determinadas por comparação com proteínas padrões de massas moleculares

conhecidas (GIBCO BRL) aplicadas ao gel de poliacrilamida.

4.11 Análise da fragmentação dos substratos protéic os por SDS-PAGE

A identificação das atividades peptidásicas secretórias das

amostras de Candida foi realizada em SDS-PAGE através da análise dos

fragmentos de hidrólise dos substratos protéicos.

Alíquotas de 20 µl (aproximadamente 40 µg) do sobrenadante de

BHI e YCB + 1% de BSA concentrado foram incubados com 10 µl de tampão

fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5 (para o BHI) e fosfato de sódio 50 mM, pH 4,5 e

10 µl das seguintes soluções de proteínas: laminina humana (concentração final

de 2 µg/mL), fibronectina humana (2 µg/mL), BSA (soro albumina bovina) (5

µg/mL), HSA (soro albumina humana) (5 µg/mL) e IgG (imunoglubulina G) (2

µg/mL) por 12 horas a 37oC. Em seguida, o material foi concentrado à vácuo

(“speed vac”) e ressuspenso em 5 µl de água destilada e 5 µl de tampão de

amostra para SDS-PAGE, contendo 10% de β-mercaptoetanol (PUCCIA et al.,

1998). O perfil de proteínas foi analisado através de SDS-PAGE, como descrito

no item 4.8. As proteínas foram evidenciadas após coloração dos géis com 0,2%

de Coomassie brilliant blue R-250 em metanol:ácido acético:água (50:10:40

76

v/v/v). A atividade proteolítica foi também ensaiada na presença de diferentes

inibidores proteolíticos, tendo apenas como substrato o BSA. Para verificação da

capacidade hidrolítica do sobrenadante concentrado do YCB + 1% de BSA, foi

utilizado somente o BSA como substrato.

4.12 Marcação de proteínas de superfície com biotin a

A biotinilação das proteínas de superfície foi realizada segundo o

método descrito por ALTIN & PAGLER (1995). Resumidamente, as células de

Candida foram lavadas três vezes em PBS, pH 8,0, para remoção das proteínas

presentes no meio de cultivo. Uma suspensão correspondente a 2,5 × 107

células/mL em PBS, pH 8,0, foi adicionada de 0,5 mg de Sulfo-NHS-LC-biotina

(Pierce). As suspensões celulares foram incubadas por 1 h a 4oC e, em seguida,

foram centrifugadas a 1.500×g por 2 min. Um controle negativo foi realizado,

consistindo do mesmo número de células incubadas nas mesmas condições,

com exceção da adição da biotina. As células, por sua vez, foram lavadas três

vezes em PBS, para a remoção do excesso de biotina. Finalmente, os extratos

protéicos foram obtidos.

4.13 “Western blotting”

Os polipeptídeos correspondente ao extrato de células foram

separados através de SDS-PAGE e transferidos para membrana de

nitrocelulose (Pharmacia) segundo o método descrito por TOWBIN,

STAEHELIN & GORDON (1979). A transferência foi realizada utilizando-se

tampão contendo 12,5 mM Tris, 96 mM glicina e 20% metanol, por 2 h a 4oC.

77

Após a transferência, as membranas foram incubadas por 16

horas a 4oC, em tampão de bloqueio (TBS, pH 7,2; 0,1% Tween 20; 5% leite

em pó desnatado). Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes por

10 minutos com TBS/0,1% Tween 20.

Para revelação das proteínas de superfície biotiniladas, as

membranas foram incubadas por 1 hora, sob agitação, com estreptoavidina

conjugada à peroxidase (Pierce), diluída 1:400 em tampão de bloqueio. As

membranas foram novamente lavadas três vezes por 10 min com TBS/Tween

20.

Para a detecção de proteínas ligantes a fibronectina, laminina e

colágeno, as membranas foram incubadas por 1 hora, sob agitação, com essas

proteínas de matriz extracelular na concentração de 100 µg/mL em tampão de

bloqueio. As membranas foram então lavadas três vezes por 10 minutos com

TBS/0,1% Tween 20. Após, as membranas foram incubadas com soluções

contendo os anticorpos monoclonais das respectivas proteínas de matriz

(diluição 1:500). Para remoção dos anticorpos que não foram reconhecidos,

realizaram-se três lavagens por 10 minutos com TBS/0,1% Tween 20. Por fim,

as membranas foram incubadas com soluções contendo os anticorpos

secundários conjugados à peroxidase na diluição de 1:2000. Antes da

revelação, as membranas foram lavadas novamente três vezes com TBS/0,1%

Tween 20.

A revelação tanto das proteínas biotiniladas como das ligantes a

proteínas componentes da matriz extracelular foi realizada por

quimioluminescência.

78

4.14 Análise através de citometria de fluxo (FACs)

Após o crescimento por 48 horas em meio BHI, 1 x 106

leveduras/mL de Candida albicans isolada de criança infectada pelo HIV,

criança sem evidência clínica de imunossupressão e ATCC foram incubadas

em uma solução de BSA 1% em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Após

duas lavagens com PBS, as células foram mantidas em soluções distintas de

fibronectina, laminina e colágeno (100 µg/mL cada) por 3 horas a 4oC. As

leveduras foram então lavadas com PBS e fixadas com tampão cacodilato

paraformaldeído 0.1 M, pH 7,2 por 1 hora a temperatura ambiente. As células

fixadas foram novamente lavadas com PBS e sequencialmente incubadas na

presença de anticorpos anti-proteínas de matriz (diluição 1:500) e anticorpos

secundários marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (diluição

1:100) por 1 hora a temperatura ambiente. As leveduras foram novamente

lavadas e 10.000 células foram analisadas no citômetro de fluxo EPICS ELITE

(Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA) equipado com laser de argônio 15 mW

com comprimento de onda de 488 nm. Células controles, que não foram

incubadas com as respectivas soluções com proteínas de matriz extracelular,

foram analisadas previamente.

4.15 Interação de Candida com células epiteliais

A linhagem celular Ma 104 (epitélio renal de macaco), cedida pela

Profa. Carla Holandino, da Faculdade de Farmácia da UFRJ foram utilizadas

para os ensaios de interação celular. As células animais foram cultivadas em

79

frascos de 25 cm2, contendo meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal

bovino (SFB), a 37oC. O controle do pH foi garantido pela adição de 3,0 g/L de

N-(2-hidroxietil)-piperazina-N`-(2-ácido etanosulfônico) (HEPES) e 2,0 g/L de

NaHCO3 na composição do meio, como previamente descrito por FRESHNEY

et al. (1994). Um inoculo inicial de 5 X 104 células/mL foi utilizado e as culturas

mantidas na fase logarítmica de crescimento.

As leveduras foram crescidas em BHI por 48 horas e, em

seguida, lavados três vezes em NaCl 0,85% e incubadas na ausência ou

presença dos inibidores proteolíticos, incluindo drogas anti-retrovirais usadas

no tratamento da infecção pelo HIV e inibidores de fosfatases ácidas durante 1

hora a 37oC. Após este tempo, as leveduras foram lavadas duas vezes com

NaCl 0,85% e uma vez com DMEM. A interação fungo-célula animal foi

realizada conforme descrito por KNEIPP et al. (2005). As células epiteliais

foram cultivadas sobre lamínulas distribuídas em placas de 24 poços. A cada

poço contendo 5 x 104 células animais foi adicionada uma suspensão de

leveduras, em meio de cultura DMEM, contendo 5 x 105 leveduras. Após 1 hora

e 30 minutos de interação a 37oC, as leveduras não aderidas foram retiradas

através de lavagem das culturas com PBS, para posterior fixação com solução

de Bouin e coloração com Giemsa. Para determinação dos índices de adesão,

as lamínulas coradas foram observadas em microscópio óptico (100x). Em

cada experimento foram analisadas 400 células animais e o índice de adesão

determinado.

80

4.16 Efeito de anti-retrovirais do tipo inibidores de protease do HIV no

crescimento e diferenciação celular em C. albicans

Para verificação dos efeitos de inibidores de proteases no

processo de crescimento celular, após o cultivo em meio de cultura BHI (Brain

heart infusion) líquido por 48 horas à 37oC, 1x108 leveduras/mL foram

incubadas por 72 horas em meio BHI na ausência (controle positivo) e na

presença dos inibidores de protease, Ritonavir, Indinavir, Saquinavir e

Nelfinavir em diferentes concentrações (100µM; 200µM; 250µM). O

monitoramento do crescimento foi realizado através de contagem em câmara

de Neubauer a cada 24 horas (item 4.6).

Com a finalidade de observar os efeitos das diferentes drogas no

processo de diferenciação celular de C. albicans, uma suspensão de 1 x 106

leveduras/mL, após terem sido cultivadas em BHI na presença e ausência das

drogas anti-retrovirais por 24 horas, foram induzidas por SFB a diferenciação

(levedura -> tubo germinativo). As células foram lavadas três vezes em PBS e

analisadas através de microscopia óptica.

O efeito dos inibidores no processo de diferenciação também foi

verificado. Para tal, leveduras que ainda não tinham sido crescidas na

presença das drogas anti-retrovirais, foram induzidas a diferenciação por SFB,

na presença dos inibidores de protease do HIV. A análise também foi realizada

através de microscopia óptica utilizando câmara de Neubauer.

81

4.17 Determinação da atividade ecto-fosfatásica em C. albicans

A atividade ecto-fosfatásica foi determinada através da hidrólise

do substrato 4-metilumbeliferil utilizando-se 2,5 x 107 leveduras, crescidas em

meio de cultura BHI líquido por 48 horas à 37oC, após foram suspensas em 0,5

mL de tampão fosfato de sódio pH 5,5. Após 60 minutos à temperatura

ambiente, os tubos foram centrifugados a 1.500 g por 10 minutos (4oC) e 0,2

mL do sobrenadante foi adicionado 0,4 mL de NaOH 1M e submetido à leitura

espectrofotométrica a 425 nm. Todos os experimentos foram feitos em

triplicada e mais um controle, no qual o substrato foi adicionado às células

imediatamente antes do término da reação o que permitiu a avaliação da

hidrólise de 4-metilumbeliferil não específica. A concentração de 4-

metilumbeliferona liberada foi calculada através de uma curva padrão de 4-

metilumbeliferona e as atividades foram expressas em picomoles/h/107 células

liberados.

4.17.1 Efeito de diferentes inibidores na atividade ecto-fosfatásica de C.

albicans

Diferentes inibidores específicos de fosfatases como:

ortovanadato de sódio (Na3VO3, 1 mM), molibdato de sódio (Na2MoO4, 1 mM),

tartarato de sódio (10 mM) e fluoreto de sódio (NaF, 1mM) foram testados. A

atividade fosfatásica foi determinada conforme descrito no item 4.16.

82

4.18 Formação de biofilme por C. albicans

As leveduras foram crescidas em meio de cultura BHI por 48 h à

37oC. Após este período, sistemas contendo uma suspensão de 105 células/mL

com e sem 10 mM de fluoreto de sódio, 1 mM de ortovanadato de sódio, 100,

500, 1000 µM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 1 µg/mL de aprotinina

foram depositados em membranas de policarbonato (diâmetro de 25 mm e com

poros de 0,44 µm; Millipore) previamente esterilizadas (AL-FATTANI &

DOUGLAS, 2004). Para a formação do biofilme, estas membranas foram

mantidas em placa de Petri contendo BHI por 72 h à 37oC. Após o

crescimento, as membranas foram lavadas com salina para remoção das

células não aderidas e posteriormente transferidas para tubos estéreis onde

foram submetidas à agitação em vórtex por 20 segundos. Alíquotas de 100 µl

foram semeadas em placa de Petri contendo BHI e mantidas por 24 h à 37oC.

As membranas também foram preparadas para serem analisadas por

microscopia eletrônica de varredura.

4.19 Microscopia eletrônica de varredura

Após a remoção das células não aderidas através de uma

lavagem suave com solução salina, as membranas com os biofilmes aderidos

foram fixadas com uma solução de glutaraldeído 2,5% contendo 3,7% de

sacarose por 1 hora a temperatura ambiente. As membranas foram então

lavadas com PBS, pH 7,2 e posteriormente pós-fixadas com tetróxido de ósmio

1% em uma solução tampão de cacodilato 0,1 M contendo 0,8% de

ferrocianeto de potássio e cloreto de cálcio 5 mM por 30 minutos a temperatura

83

ambiente. As amostras foram desidratadas em etanol, secas no ponto crítico

com CO2, e por fim, cobertas com ouro. As imagens foram analisadas e obtidas

em microscópio eletrônico de varredura JEOL-JSM-5310 através da emissão

de elétrons secundários.

4.20 Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicada e os

resultados foram expressos através da média ± desvio padrão. Os resultados

foram analisados através dos Programas estatísticos SPSS 11.0 e EPI-INFO

6.04, tendo sempre como valor significante p<0,05.

84

5. Resultados5. Resultados5. Resultados5. Resultados

5.1 Colonização de espécies de Candida isoladas de sítios sub-gengivais

de crianças infectadas pelo HIV

PORTELA e colaboradores (2004) (ANEXO 1) identificaram a

presença de espécies de Candida no sulco gengival em 40,4% de crianças

infectadas pelo HIV, enquanto que no grupo de pacientes sem evidências

clínicas de imunossupressão (HIV-) este valor foi de 7, 14% (p<0,001). Neste

estudo, também foi observado a presença de eritema linear gengival em seis

pacientes infectados pelo HIV, e nessas lesões orais foram isoladas espécies

de Candida (Tabela 1) que tiveram o seu perfil proteolítico determinado através

de SDS-PAGE, tendo a gelatina como substrato.

85

Tabela 1 – Identificação das espécies de Candida isoladas de lesões orais de eritema linear gengival através de testes bioquímicos e análise morfológica. A condição sistêmica de cada paciente portador da lesão (Classificação da infecção pelo HIV, cargal viral e percentual de células CD4) foi obtida através da consulta aos prontuários médicos das respectivas crianças.

Identificação

dos

Pacientes

Idade

(anos)/Sexo

Classificação

da Infecção

pelo HIV

(CDC)

Carga

Viral

(cópias/ml)

CD4

(%)

Leveduras

isoladas/código

A 12/feminino C3 170,000 1 C. albicans/(a)

B 4/masculino C3 66,000 3 C. albicans/ (b)

C 10/masculino C3 110,000 12 C. albicans/ (c1)

C. tropicalis/ (c2)

D 7/masculino B3 37,000 18,5 C. albicans/ (d)

E 8/feminino C2 280,000 27 C. dubliniensis/

(e)

F 5/masculino C3 900 35 C. albicans/ (f)

5.2 Secreção de serina protease por espécies de Candida e degradação

de componentes do soro e da matriz extracelular

No presente estudo, investigamos se espécies de C. albicans e

Candida não-albicans, isoladas de outros sítios da cavidade bucal seriam

capazes de secretar enzimas proteolíticas da classe serina protease. Para tal,

os isolados citados na Tabela 1 foram crescidos em BHI por 48 horas e após

este tempo os sobrenandantes de cultivo foram concentrados 30 vezes e o

perfil proteolítico identificado através de SDS-PAGE (Figura 8). O sobrenadante

de cultivo de todos os sete isolados apresentaram atividades majoritárias com

86

peso molecular aparente variando de 52 a 62 kDa. No entanto, discretas

diferenças qualitativas e quantitativas foram observadas nos perfis proteolíticos

dentro da mesma espécie (Figura 8). No isolado de C. albicans do paciente a,

foram detectadas quatro bandas com atividades proteolíticas de 52, 56, 61 e

104 kDa, enquanto que nos outros isolados desta mesma espécie dos

pacientes b, c, d e f foram detectados proteases com 61; 62 e 52; 62; 62 e 40

kDa, respectivamente. Todas as atividades proteolíticas foram totalmente

inibidas na presença de 10 mM PMSF, um inibidor de serina protease.

Figura 8 – SDS-PAGE 10%, contendo gelatina como substrato, mostrando os diferentes perfis proteolíticos observados em espécies de Candida isoladas de lesões de eritema linear gengival da cavidade oral de crianças infectadas pelo HIV quando cultivadas em meio BHI, por 48 horas a 37oC. Os géis contendo sobrenadantes concentrados (30 vezes), correspondendo a 1,7 x 108 células/mL, foram incubados por 48 horas em 0,5 M de tampão fosfato, pH 5,5 a 37oC. Coloração dos géis com 0,2% de “Coomassie Brilliant Blue” R-250.

87

As outras duas espécies de Candida identificadas, como C.

tropicalis e C. dubliniensis, também foram capazes de secretar esta mesma

classe de protease identificada na espécie de C. albicans. O isolado de C.

tropicalis apresentou uma atividade proteolítica de 44 kDa que não foi

observada em nenhuma das outras espécies identificadas.

Uma correlação positiva foi observada entre o perfil proteolítico e

os dados médicos de cada paciente. No paciente A, que apresentava a

condição sistêmica mais grave (percentual de CD4=1% e elevada carga viral),

também foi observado o perfil proteolítico mais complexo de todos os isolados

identificados.

Com o objetivo de avaliar uma possível função para serina

protease detectada no sobrenadante de cultivo de diferentes espécies de

Candida, além da C. albicans, foi analisada a capacidade de clivar proteínas

importantes para o hospedeiro, como a fibronectina, laminina, IgG, soro

albumina humana e soro albumina bovina. A análise eletroforética em SDS-

PAGE do sobrenadante concentrado de todos os isolados de Candida

evidenciou atividade proteolítica quando estas proteínas foram utilizadas como

substrato (Tabela 2). Com a finalidade de avaliarmos a atividade proteolítica

secretada por C. albicans frente a outros inibidores proteolíticos, o

sobrenadante concentrado foi incubado com BSA na presença e ausência de

inibidores proteolíticos (10 µM pepstatina A, 10 µM E-64, 10 mM PMSF e 10

mM 1,10-fenantrolina). O PMSF, inibidor de serina protease, foi capaz de inibir

completamente a clivagem do BSA. No entanto, discreta inibição foi observada

no sistema contendo fenantrolina (Figura 9).

88

Tabela 2 – Clivagem proteolítica de proteínas do soro e de componentes da matriz extracelular pelo sobrenadante de cultivo de Candida spp. isoladas de lesões de eritema linear gengival de crianças infectadas pelo HIV (±, moderada clivagem; +, intensa clivagem; A, substrato; B, substrato e sobrenadante).

Substrates Yeast Isolate/Code

BSA HSA IgG FN LAM

C. albicans / (a) + + + ± ±

C. albicans / (b) + + + ± +

C. albicans / (c1) + + + ± +

C. tropicalis / (c2) + + + + +

C. albicans / (d) + + + + ±

C. dubliniensis / (e) + + + + +

C. albicans / (f) + + + ± ±

Leveduras isoladas/código Substratos

89

Figura 9 - Clivagem de BSA pelo sobrenadante de cultivo de C. albicans após crescimento em meio de cultura BHI por 48 horas a 370C sob agitação. O sobrenadante de cultivo obtido foi misturado com BSA e adicionado tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5. Estas misturas foram incubadas por 5 horas a 370C, na ausência (b) ou presença dos seguintes inibidores proteolíticos: 1,10-fenentrolina 10 mM (c), E-64 10 µM (d), PMSF 10 mM (e) e pepstatina A 10 µM (f).

Para excluirmos a participação de enzimas proteolíticas de

origem citoplasmática nos ensaios com os sobrenadantes de cultivo,

realizamos a dosagem da lactato desidrogenase, uma enzima citoplasmática

detectada em meio extracelular quando ocorre lise celular. A dosagem da

atividade da enzima lactato desidrogenase no sobrenadante de cultivo não

demonstrou nenhuma atividade (Figura 10). Este resultado elimina a

possibilidade da existência de proteases citoplasmáticas no sobrenadante

como, por exemplo, a Kex 2 que trata-se de uma serina proteases presente no

citoplasma de espécies de Candida. Foi utilizado um extrato celular de Candida

albicans como um controle positivo para a presença da enzima lactato

desidrogenase.

90

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

C andida lisada

sobrenadante B HI(48 hs decrescimento)

sobrenadanteconcentrado B HI(48 hs decrescimento)

Figura 10 – Dosagem da atividade da lactato desidrogenase no sobrenadante, sobrenadante concentrado 30 vezes e extrato celular de C. albicans crescida em meio de cultura BHI por 48 horas a 37oC sob agitação. A atividade foi mensurada através da oxidação do NADH a NAD em espectofotômetro a 340 nm.

Para investigar a capacidade destas leveduras isoladas de lesões

orais de crianças infectadas pelo HIV de secretarem também aspártico

protease, um isolado de C. albicans (Paciente 1) foi crescido em meio de

cultura YCB suplementado com 1% de BSA, pH 4,5, por 5 dias a 37oC sob

agitação. A detecção desta classe de protease foi realizada através da

utilização de anticorpos anti-Sap 1-3, anti-Sap 5 e 6 (Figura 11). O

sobrenadante de cultivo em BHI também foi analisado com o objetivo de

validarmos os resultados anteriores que demonstraram a secreção de serina

protease. Os resultados requerentes ao sobrenadante em BHI demonstraram

ausência de reconhecimento de polipeptídeos referentes às Saps.

91

A B C

1 2 1 2 1 2

43 kDa

41 kDa

Figura 11 – Análise por “Western blotting” de aspártico-protease no sobrenadante de cultivo de C. albicans. O sobrenadante de cultivo de YCB + 1% de BSA (2) e BHI (1) foram analisados através de SDS-PAGE e posteriormente transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram sequencialmente incubadas na presença de anticorpos policlonais anti-Sap 1-3 (A), anti-Sap 6 (B) and anti-Sap 8 (C) na diluição de 1:1000, anticorpo anti-IgG de ovelha anti-coelho na diluição de 1:2500 e posteriormente reveladas com reagentes ECL para quimiluminescência. Massa molecular dos polipeptídeos está expressas em kDa.

5.3 Associação entre a secreção de serina protease e a adesão a células

epiteliais (Ma 104)

Com o objetivo ainda de aferir possíveis funções da serina

protease secretada para o sobrenadante de cultivo de C. albicans quando

crescida em BHI, foi realizada interação celular entre as leveduras tratadas

com diferentes concentrações de PMSF (inibidor de serina protease) e células

epiteliais Ma 104. A interação com células hospedeiras revelou que o

tratamento com PMSF inibiu os índices de adesão de forma dose dependente,

atingindo até 80% de redução nas maiores concentrações do PMSF (Figura

12).

92

Durante a interação de C. albicans com Ma 104, observou-se que

as leveduras não tratadas com o inibidor de protease diferenciaram-se para

tubo germinativo (Figura 13). No entanto, no ensaio onde as leveduras tratadas

com PMSF a partir da concentração de 100 µM, não foi mais observado a

presença de tubos germinativos.

Figura 12 – Efeito do inibidor de serina-peptidae (PMSF) em diferentes concentrações na adesão celular entre leveduras de C. albicans e células epiteliais Ma 104. As leveduras, após crescimento em meio BHI por 48 horas a 37oC, foram previamente incubadas com o inibidor de serina protease, em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5, durante 1 hora. Depois deste tempo as leveduras foram lavadas 2 vezes em PBS e 1 vez em meio DEMEN, e colocadas para interagir com Ma 104 na proporção de 10:1 (leveduras:célula epitelial) por 1 hora e 30 minutos a 37oC. Após este período, o material foi lavado, fixado e submetido à coloração para posterior observação em microscópio óptico. Os índices de adesão foram calculados como descrito em Materiais e Métodos. Os valores representam as médias±desvio padrão de três experimentos diferentes realizados em triplicada.

Índi

ce d

e ad

esão

93

Figura 13 – Efeito do PMSF na interação celular entre leveduras de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV e células epiteliais Ma 104. As leveduras de C. albicans foram previamente incubadas com o inibidor, em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5, durante 1 hora. Depois deste tempo os conídios foram lavados 2 vezes em PBS e 1 vez em meio DEMEN e colocados para interagir com Ma 104 na proporção de 10:1 (levedura:célula epitelial), por 1 hora e 30 minutos a 37oC. Após este período, o material foi lavado, fixado e submetido a coloração para posterior análise em microscópio óptico. Controle (- PMSF) sem adição do inibidor. A partir da concentração de 100 µM de PMSF (+ 100 µM PMSF) houve uma intensa inibição na formação de tubo germinativo.

Foi analisado o perfil de proteínas totais e de proteases

associadas à célula de C. albicans tratadas com diferentes concentrações de

PMSF. Não foi observada nenhuma alteração na expressão de proteínas

associadas à célula. No entanto, em relação ao perfil de proteases associadas

à célula, foi observada inibição da atividade proteolítica a partir da

94

concentração de 0,1 µM, sendo a atividade totalmente abolida na concentração

de 100 µM (Figura 14).

Figura 14 – SDS-PAGE mostrando o perfil de proteínas (A) e proteases (B) associadas à célula de C. albicans na ausência (0) e com o tratamento por 1 hora com PMSF em diferentes concentrações (0,1; 1; 5; 10; 50; 500; 1000 µM).

A

B

95

As proteínas de superfície de Candida albicans possuem uma

importância fundamental no processo de interação fungo-hospedeiro. Foi

analisado também, o perfil protéico de células tratadas com biotina e

posteriormente analisadas por “Western Blotting”. Como descrito em Materiais

e Métodos, as leveduras de C. albicans foram submetidas à marcação com

biotina e posteriormente incubadas com PMSF nas concentrações de 1, 10, 50,

100, 500 e 1000 µM, em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5 por 1 hora.

Depois, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e foi obtido o extrato

celular. A análise do perfil de proteínas celulares biotiniladas demonstrou haver

uma modulação das proteínas de superfície da célula fúngica quando

comparado com as células controle. Observamos que o tratamento com PMSF

a 1, 10 e 50 µM ocasionou uma pequena alteração na expressão de proteínas,

principalmente proteínas com massa molecular acima de 70 kDa. Já nas

células tratadas com PMSF nas concentrações de 100, 500 e 1000 µM, foi

observado modificações nas proteínas com massa molecular abaixo de 40 kDa

(Figura 15).

A análise do sobrenadante deste tratamento revelou um perfil

protéico inverso ao encontrado no extrato de proteínas de superfície da célula

fúngica.

96

Figura 15 – “Western Blotting” mostrando o perfil de proteínas totais biotiniladas associadas à célula após o tratamento com PMSF por 1 hora em diferentes concentrações (A – controle; B – PMSF 1 µM; C – PMSF 10 µM; D – PMSF 50 µM; E – PMSF 100 µM; F – PMSF 500 µM; G – PMSF 1000 µM). 5.4 Efeito de inibidores de serina protease e a for mação de biofilme por C.

albicans

As cepas de C. albicans ao colonizar tecidos do hospedeiro

possuem a capacidade de formar biofilme, que por sua vez está envolvido na

patogênese da infecção causada por este fungo. Assim, foi também nosso

objetivo observar a influência do PMSF e aprotinina – inibidores de serina-

protease durante a formação de biofilme. Experimentos prévios mostraram que

as concentrações que apresentaram efeitos mais significativos nas variáveis

analisadas até então foram a de 100, 500 e 1000 µM de PMSF. Portanto, todos

os experimentos envolvendo a formação de biofilme foram realizados com

estas concentrações.

97

A metodologia escolhida para induzir a formação de biofilme

sobre uma membrana de policarbonato mostrou-se muito eficiente em todos os

sistemas analisados (Figura 16).

Figura 16 – Aspecto macroscópico dos biofilmes de C. albicans crescidos sobre membranas de policarbonato mantidas sobre meio de cultura BHI sólido. Cada sistema era formado de uma suspensão celular com 105 leveduras/mL e inibidores de serina-protease (PMSF e aprotinina) e foram aplicados sobre as membranas previamente esterilizadas. As placas de Petri foram incubadas por 72 horas a 37oC.

Os biofilmes artificiais foram induzidos na ausência (sistema

controle) e presença dos inibidores proteolíticos. Previamente à remoção das

células formadoras do biofilme aderido, as membranas foram cuidadosamente

mantidas em solução salina para remoção das leveduras não-aderidas.

Alíquotas dessas suspensões contendo células não aderidas foram semeadas

em meio de cultura BHI sólido para verificar a influência dos inibidores e de

suas concentrações na formação de um biofilme fortemente aderido. Na Figura

17, podemos observar que os dois inibidores de serina proteases empregados

induziram modificações no perfil de adesão das leveduras formadoras dos

98

biofilmes nos diferentes sistemas. Isso foi revelado ao observar um elevado

crescimento celular avaliado pelo número de unidades formadoras de colônias

(UFC) preferencialmente nos sistemas onde o biofilme foi induzido na presença

do PMSF nas diferentes concentrações. Estes resultados foram corroborados

pelas análises das membranas através de microscopia eletrônica de varredura,

onde observamos um reduzido biofilme nos sistemas com PMSF quando

comparado com o controle.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Rel

ativ

e G

row

th (%

) Co n tro l

PM SF 100

PM SF 500

PM SF 1000

A pro tin in

Figura 17 – Crescimento relativo das leveduras não aderidas nos diferentes biofilmes. Alíquotas das suspensões contendo as células não-aderidas foram inoculadas em meio BHI sólido. Todos os sistemas com inibidores proteolíticos foram capazes de provocar mudanças no padrão de adesão das leveduras na formação de biofilmes. Este achado foi mais significante na presença das diferentes concentrações de PMSF. O sistema controle (barra preta) demonstrou ser formado por um biofilme de C. albicans mais denso e aderido.

Após a remoção das células não aderidas, as membranas foram

transferidas para tubos contendo 1 mL solução salina estéril para serem

Cre

scim

ento

rel

ativ

o (%

)

99

agitadas por 20 segundos em vórtex. Posteriormente, alíquotas destas

suspensões foram semeadas em placas de Petri contendo meio de cultura BHI.

De acordo com a contagem das UFC, foi possível verificar que o biofilme do

sistema controle apresentava mais células aderidas quando comparado com os

outros biofilmes induzidos na presença de inibidores de serina protease (Figura

18). Este achado pôde ser confirmado pela análise destas membranas ao

microscópio eletrônico de varredura. A metodologia utilizada na preparação das

amostras para a microscopia eletrônica tem como característica a não

preservação da matriz do biofilme. O biofilme controle de C. albicans, induzido

na ausência de qualquer tipo de inibidor proteolítico, mostrou uma alta

densidade celular (Figura 19). Este padrão de biofilme não foi observado nos

demais sistemas (Figuras 20, 21, 22 e 23). Além disso, uma acentuada

redução do número de células presentes no biofilme foi observada

principalmente quando concentrações mais altas de PMSF foram empregadas

(Figura 22).

100

0

20

40

60

80

100

120

140

CF

U

Con tro l

PM SF 100

PM SF 500

PM SF 1000

A pro tin in

Figura 18 – Crescimento das leveduras aderidas às membranas formadoras dos biofilmes extraídas através de agitação em vórtex por 20 segundos. Alíquotas de cada sistema foram inoculados em placa de Petri contendo meio BHI. A contagem das UFC correspondentes ao biofilme controle (barra preta) demonstrou ser esse um biofilme mais aderido e denso formado por Candida albicans, o que foi confirmado pela dificuldade na remoção das leveduras da membrana de policarbonato.

101

Figura 19 – Microscopia eletrônica de varredura da formação biofilme de C. albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM; Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37oC. Os procedimentos utilizados durante a preparação das amostras permitiram a visualização das leveduras formadoras do biofilme. No entanto, não foi possível a preservação da matriz presente no biofilme (A e B). Nas imagens C e D pode ser observada a alta densidade celular.

102

Figura 20 - Microscopia eletrônica de varredura da formação biofilme de C. albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM; Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37oC na presença de 100 µM de PMSF. As imagens A, B e C mostram a baixa densidade de leveduras. Na imagem C pode ser observada a presença de “ilhas” de células fúngicas. Nessas ilhas, as leveduras parecem, contudo, semelhantes às do biofilme controle (D).

103

Figura 21 - Microscopia eletrônica de varredura da formação biofilme de C. albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM; Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37oC na presença de 500 µM de PMSF. As imagens A e B mostram também a presença das “ilhas” de leveduras. Apesar da presença destas “ilhas”, a densidade de células fúngicas no restante da membrana de policarbonato é muito baixa (C e D).

104

Figura 22 - Microscopia eletrônica de varredura da formação do biofilme de C. albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM; Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37oC na presença de 1000 µM de PMSF. Em todas as imagens é possível observar a ausência de “ilhas” de células e a densidade de leveduras na membrana de policarbonato foi a mais baixa encontrada.

105

Figura 23 - Microscopia eletrônica de varredura da formação do biofilme de C. albicans isolada da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV sobre membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro; porosidade de 0,4 µM; Millipore) em meio de cultura BHI sólido por 72 horas a 37oC na presença de 2 µg/mL de aprotinina. O tratamento com este inibidor de serina protease causou uma redução significante na densidade de células fúngicas em toda membrana de policarbonato (A e D), mas as “ilhas” formadas por leveduras ainda estão presentes (B e C).

106

5.5 Comparação entre os perfis de proteínas de supe rfície de Candida

albicans isolada de criança infectada pelo HIV e criança se m evidências

clínicas de imunossupressão com relação ao reconhec imento de

proteínas de matriz extracelular

Com o objetivo de verificar a influência da infecção pelo HIV na

capacidade adesiva de C. albicans às proteínas de matriz extracelular e

identificar as proteínas responsáveis por estas ligações, foi empregado um

isolado da cavidade bucal de criança infectada pelo HIV, um isolado da

cavidade bucal de criança sem evidências clínicas de imunossupressão e um

isolado ATCC. As proteínas utilizadas nestes experimentos foram a fibronectina

(HFN), laminina e colágeno tipo IV. A fim de facilitar a comparação entre os

isolados e observar as diferenças entre eles, os resultados foram agrupados de

acordo com a proteína de matriz utilizada.

5.5.1 Fibronectina

Dados na literatura já mostraram que isolados de C. albicans

apresentam afinidade de ligação à fibronectina (HFN), assim como a

caracterização das proteínas adesinas responsáveis por este reconhecimento.

No entanto, com relação a possível influência da infecção pelo HIV no aumento

deste reconhecimento, pouco se tem descrito. Portanto, nossos ensaios iniciais

foram analisar através de citometria de fluxo as leveduras previamente

incubadas com fibronectina e posteriormente com anticorpos monoclonais anti-

HFN. Os resultados demonstraram que todos os isolados testados foram

capazes de se ligarem a fibronectina. No entanto, o isolado oriundo de criança

107

infectada pelo HIV apresentou um índice de ligação significantemente maior

(Figuras 24 e 25).

Figura 24 – Análise por citometria de fluxo da ligação de C. albicans à fibronectina solúvel. As leveduras foram sequencialmente incubadas na presença de HFN, anticorpo monoclonal anti-HFN e anticorpos marcados com FITC (painéis do lado direito). Dez mil células de cada isolado foram analisadas através de citometria de fluxo. Células controle (Ct), que não foram incubadas com HFN, estão expostas nos painéis do lado esquerdo.

108

Figura 25 – Percentual de leveduras fluorescentes após incubação na presença de HFN, anticorpo monoclonal anti-HFN e anticorpos marcados com FITC e analise através de citometria de fluxo.

Figura 26 - Detecção de proteínas ligantes à fibronectina de C. albicans separadas por SDS-PAGE e corados com Coomassie Blue (A) e transferidas para membrana de nitrocelulose seguido por incubações subseqüentes de fibronectina, anticorpos anti-fibronectina e anticorpos conjugados com peroxidase. Os polipeptídios que reagiram com fibronectina foram detectados no extrato total protéico em cada isolado (B).

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(%)

109

Após a obtenção do extrato protéico de cada isolado de C.

albicans através da lise celular com auxílio de pérolas de vidro, as proteínas

foram separadas por SDS-PAGE e corados com Coomassie Blue ou

transferidas para membrana de nitrocelulose para incubação com uma solução

de fibronectina e anticorpos monoclonais para HFN. Na Figura 26 pode ser

observado os polipeptídeos ligantes à fibronectina que são mais expressos no

isolado de C. albicans HIV+.

5.5.2 Laminina

Apesar de não ser observada a mesma intensidade de ligação à

fibronectina, C. albicans isolada da cavidade oral de criança infectada pelo HIV

também apresentou um maior número de proteínas ligantes à laminina que os

demais isolados. No entanto, todas as cepas apresentaram ligação significativa

a esta proteína de matriz extracelular (Figuras 27 e 28).

A detecção das proteínas responsáveis por este reconhecimento

revelou uma semelhança muito grande entre a expressão dos isolados HIV+ e

HIV-. O isolado ATCC apresentou a menor expressão de proteínas ligantes à

laminina (Figura 29).

110

Figura 27 – Análise por citometria de fluxo da ligação de C. albicans à laminina

solúvel (LAM). As leveduras foram sequencialmente incubadas na presença de

HFN, anticorpo monoclonal anti-LAM e anticorpos marcados com FITC (painéis

do lado direito). Dez mil células de cada isolado foram analisadas através de

citometria de fluxo. Células controle (Ct), que não foram incubadas com LAM,

estão expostas nos painéis do lado esquerdo.

111

Figura 28 - Percentual de leveduras fluorescentes após incubação na presença de LAM, anticorpo monoclonal anti-LAM e anticorpos marcados com FITC e analise através de citometria de fluxo.

Figura 29 - Detecção de proteínas ligantes à laminina de C. albicans separadas por SDS-PAGE e coradas com Coomassie Blue (A) e transferidas para membrana de nitrocelulose seguido por incubações subseqüentes de laminina, anticorpos anti-laminina e anticorpos conjugados com peroxidase. Os polipeptídios que reagiram com laminina foram detectados no extrato total protéico em cada isolado (B).

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(%)

112

5.5.3 Colágeno Tipo IV

De todas as proteínas de matriz extracelular analisadas, o

colágeno tipo IV foi a que apresentou a maior semelhança de ligação entre os

três isolados (HIV+, HIV- e ATCC), por isso não apresentando diferença

estatisticamente significante. Embora a infecção pelo HIV não tenha

influenciado no reconhecimento deste isolado de C. albicans a esta proteína de

matriz, os isolados clínicos (HIV+ e HIV-) mostraram expressar mais adesinas

do que a ATCC (Figuras 30 e 31).

Assim como o observado na citometria de fluxo, a análise das

membranas de nitrocelulose com os polipeptídeos responsáveis pela ligação

ao colágeno tipo IV revelou uma semelhança entre as cepas isoladas de

criança infectada pelo HIV e criança sem evidências clínicas de

imunossupressão (isolados clínicos). A cepa ATCC demonstrou reduzida

expressão de proteínas ligantes quando comparado com os demais (Figura

32).

113

Figura 30 – Análise através de citometria de fluxo da ligação de C. albicans ao colágeno tipo IV solúvel (COL IV). As leveduras foram sequencialmente incubadas na presença de COL IV, anticorpo monoclonal anti-COL IV e anticorpos marcados com FITC (painéis do lado direito). Dez mil células de cada isolado foram analisadas através de citometria de fluxo. Células controle (Ct), que não foram incubadas com COL IV, estão expostas nos painéis do lado esquerdo.

114

Figura 31 – Percentual de leveduras fluorescentes após incubação na presença de COL IV, anticorpo monoclonal anti-COL IV e anticorpos marcados com FITC e analise através de citometria de fluxo.

Figura 32 - Detecção de proteínas ligantes ao colágeno tipo IV de C. albicans separadas por SDS-PAGE e corados com Coomassie Blue (A) e transferidas para membrana de nitrocelulose seguido por incubações subseqüentes de COL IV, anticorpos anti-COL IV e anticorpos conjugados com peroxidase. Os polipeptídios que reagiram com colágeno foram detectados no extrato total protéico em cada isolado (B).

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(%)

115

5.6 Avaliação do efeito de drogas anti-retrovirais da classe inibidores de

protease do HIV no crescimento, diferenciação celul ar e adesão a células

epiteliais (Ma 104) de Candida albicans isolada de criança infectada pelo

HIV.

Estudos na literatura têm demonstrado uma grande influência de

drogas anti-retrovirais da classe inibidores de protease do HIV no crescimento

e em fatores de virulência de espécies de Candida. Autores têm atribuído este

achado ao fato destas drogas serem inibidores de aspártico-protease, que

coincidentemente trata-se da mesma classe de protease secretada e

responsável, em grande parte, pela patogenicidade destes fungos. No entanto,

o presente estudo buscou investigar a influência destes inibidores em C.

albicans crescida em BHI, onde há a indução de secreção de serina protease.

Em determinados fungos que secretam esta classe de protease como sendo a

majoritária durante a infecção, estas drogas mostraram-se como opções

antifúngicas.

5.6.1 Avaliação do efeito de drogas anti-retrovirai s da classe inibidores de

protease do HIV no crescimento de Candida albicans isolada de criança

infectada pelo HIV

A avaliação do efeito de diferentes inibidores de aspártico

protease do HIV (indinavir, saquinavir, nelfinavir e ritonavir) sobre o

crescimento de C. albicans crescida BHI por 48 horas à 37oC demonstrou que

todas as drogas apresentaram efeito fungistático (sem significância estatística),

com exceção do Saquinavir o qual, a partir da concentração de 200µM, foi

116

observado morte celular. O tempo necessário para se atingir o maior efeito na

inibição do crescimento, assim como a melhor concentração foi de 24 horas

para o Ritonavir 100µM, 24 horas para o Indinavir 200µM, 24 horas para o

Saquinavir 150µM e 48 horas para o Nelfinavir 250µM, respectivamente (Figura

33).

Como descrito em Materiais e Métodos estes experimentos foram

realizados após o crescimento do isolado de C. albicans (HIV+) em meio de

cultura BHI líquido por 48 horas à 37oC, onde 1x108 leveduras/mL foram

incubadas por 72 horas em meio BHI na ausência (controle positivo) e na

presença dos inibidores de protease Ritonavir, Indinavir, Saquinavir e Nelfinavir

em diferentes concentrações (100µM; 200µM; 250µM). O monitoramento do

crescimento foi realizado através de contagem em câmara de Neubauer a cada

24 horas.

Após análise dos resultados e estipulado o tempo necessário

para se atingir o maior efeito no crescimento e a melhor concentração de cada

droga, este experimento foi repetido utilizando-se UFC com tais valores (Figura

34).

117

Figura 33 – Influência de diferentes inibidores de aspártico protease do HIV sobre o crescimento de leveduras de C. albicans. Após o crescimento em meio BHI por 48 horas à 37oC, 1 x 108 células/mL de C. albicans foram incubadas com drogas anti-retrovirais em diferentes concentrações por 72 horas. A cada 24 horas foi realizada contagem do número de células viáveis (azul de Tripan) e calculado o percentual de crescimento celular em relação ao controle. Todos os experimentos foram realizados em triplicada e os valores representam as médias.

118

0

20

40

60

80

100

120

Antire trovira l drugs

Per

cent

ual o

f gro

wth

(C

FU

) (%

)

Control

Ritonavir 100

Indinavir 200

S aquinavir 150

Nelfinavir 250

Figura 34 – Influência de diferentes inibidores de aspártico protease do HIV sobre o crescimento de C. albicans. Após o crescimento em meio BHI por 48 horas à 37oC, 1 x 108 células/mL de C. albicans foram incubadas com drogas anti-retrovirais em concentrações previamente determinadas por 24 horas. Após esse tempo os sistemas foram repicados para o meio BHI sólido e mantido à 37oC por 24 horas quando foram contadas as UFC. Os valores representam as médias de três experimentos diferentes realizados em triplicada.

Na figura 34 pode ser observado que apenas o Saquinavir

apresentou um efeito promissor com um percentual de inibição celular de

70,3%. A partir destes resultados, foram realizados experimentos com a

finalidade de evidenciar possíveis alvos desta droga (Saquinavir 150 µM),

assim como efeitos sobre determinados fatores de virulência de C. albicans

(formação de tubo germinativo e adesão a células epiteliais).

Per

cent

ual d

e cr

esci

men

to

– U

FC

(%

)

Medicamentos anti-retrovirais

119

5.6.2 Avaliação do efeito do tratamento com Saquina vir na interação

Candida albicans X célula epitelial (Ma 104) e indução de tubo germ inativo

Após determinar a melhor droga com capacidade de inibição do

crescimento, assim como a melhor concentração, realizou-se interação celular

entre as leveduras previamente tratadas e células epiteliais Ma 104. Além da

concentração de 150 µM de Saquinavir, os experimentos também foram

realizados com 100 µM já que a diferença de crescimento entre essas duas

concentrações foi muito elevada.

Os ensaios de adesão foram realizados após as leveduras terem

sido incubadas por 24 horas na ausência (controle) e com Saquinavir 100 e

150 µM, e após esse tempo foram lavadas duas vezes com solução de PBS.

Assim como observado no crescimento celular, a diferença de adesão entre as

duas concentrações mostrou-se estatisticamente significante. No entanto, na

menor concentração utilizada foi observada uma redução da adesão de

aproximadamente 50% em relação ao controle (Figura 35), o que não foi

verificado no crescimento celular entre esses dois sistemas (Figura 34).

120

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

C ontrol Saquinavir 100 Saquinavir 150

Adh

esio

n in

dex

Figura 35 – Efeito do tratamento com Saquinavir na interação celular entre leveduras de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV e células epiteliais Ma 104. As leveduras foram previamente incubadas com o inibidor de aspártico protease do HIV, em meio BHI, durante 24 horas. Depois desse tempo as leveduras foram lavadas três vezes em PBS e uma vez em meio DEMEN, e colocados para interagir com Ma 104 na proporção de 10:1 (leveduras:célula epitelial) por uma hora e trinta minutos a 37oC. Após esse período, o material foi lavado, fixado e submetido à coloração para posterior observação em microscópio óptico. Os valores representam as médias±desvio padrão de três experimentos diferentes, realizados em triplicada.

Com relação à indução de tubo germinativo em C. albicans

tratadas com Saquinavir, observou-se que a concentração de 100 µM da droga

foi capaz de reduzir em 47% a formação de tubo germinativo. A concentração

de 150 µM se mostrou a mais eficiente com relação à inibição do crescimento

celular (Figura 34) e adesão a células epiteliais (Figura 35). No entanto,

apresentou apenas 14% de redução na diferenciação celular de C. albicans

isolada de criança infectada pelo HIV (Figura 36).

Índi

ce d

e ad

esão

121

Candida albicans

Ger

m tu

be (

%)

0

20

40

60

80

100

Control Saquinavir 100 µµµµM Saquinavir 150 µµµµM

Figura 36 - Efeito do tratamento com Saquinavir na indução da diferenciação celular em C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV. As leveduras foram previamente incubadas com o inibidor de aspártico protease do HIV, em meio BHI, durante 24 horas. Depois desse tempo as leveduras foram lavadas três vezes em PBS e colocadas para indução de tubo germinativo na presença de soro fetal bovino por três horas a 37oC. Após esse período, o material foi lavado, fixado e submetido à leitura em câmara de Neubauer. Os valores representam as médias±desvio padrão de três experimentos diferentes, realizados em triplicada.

Tub

o G

erm

inat

ivo

(%)

122

5.6.2 Envolvimento das atividades fosfatásicas ácid as de superfície de C.

albicans isoladas da cavidade bucal de crianças infectadas pelo HIV e de

crianças sem evidências clínicas de imunossupressão no processo de

adesão a células epiteliais (Ma 104)

A atividade de ecto-fosfatases já tem sido associada à virulência

de determinados fungos, inclusive C. parapsilosis. No entanto, na literatura

consultada não foram encontrados estudos sobre esta associação com C.

albicans, muito menos considerando a infecção pelo HIV como fator agravante

desta correlação. Assim foram selecionadas 35 isolados de C. albicans (20

isolados de crianças infectadas pelo HIV e 15 oriundos de crianças sem

evidências clínicas de imunossupressão) e em todos foi avaliado a atividade

fosfatásica. Essa atividade foi constatada através da capacidade de conversão

do substrato 4-metilumberiferil fosfato (4-MUP) a 4-metilumbeliferona (4-MU)

gerando uma fluorescência que foi mensurada por um fluorímetro digital Turner

com um filtro de 360 nm de excitação e um filtro de 450 nm de emissão.

Após uma hora de incubação das leveduras na presença do

substrato fosforilado, a atividade enzimática atingiu 610,27±166,36 e

241,25±78,96 picomoles/h/107 leveduras para o grupo HIV positivo e grupo HIV

negativo, respectivamente. Com isso foi verificada uma correlação positiva

entre a atividade ecto-fosfatásica e a infecção pelo HIV (Mann-Whitney,

p=0,089) (Figura 37). A atividade da lactato desidrogenase do sobrenadante de

cultivo não revelou nenhuma atividade. Isso descarta a possibilidade da

hidrólise do 4-MUP ser gerada por fosfatases intracelulares.

123

Figura 37 – Atividade ecto-fosfatásica de isolados de C. albicans. 107 leveduras foram incubadas por uma hora a temperatura ambiente em um meio de reação contendo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 e 5 mM de 4-MUP. As atividades enzimáticas foram mensuradas através da hidrólise do substrato fosforilado (4-MUP) e expressas em picomoles desse substrato hidrolisado a 4-MU/h/107 leveduras. Valores médios de 610,27±166,36 e 241,25±78,96 picomoles 4-MU/h/107 leveduras para os isolados de crianças infectadas pelo HIV e para o grupo HIV negativo, respectivamente (Mann-Whitney, p=0,089).

Devido a forte influência da infecção pelo HIV na atividade

fosfatásica em C. albicans (Figura 37), buscou-se avaliar dentro do grupo de

isolados de crianças HIV positivas se a condição sistêmica de cada paciente

poderia alterar a atividade desta enzima. Assim, correlações foram realizadas

entre a carga viral e percentual de CD4 de cada paciente com a atividade ecto-

fosfatásica. Na Figura 38 podemos observar uma moderada correlação com a

15 20 N =

HIV+ HIV-

3000

2000

1000

0

-1000

26

10

2

Pho

spha

tase

act

ivity

A

tivid

ade

fosf

atás

ica

124

contagem de linfócitos T CD4+. No entanto, não foi observada nenhuma

correlação entre a atividade fosfatásica e CD4+ (Figura 39).

Figura 38 – Correlação entre as atividades ecto-fosfatásicas de C. albicans isoladas de crianças infectadas pelo HIV com a contagem de linfócitos T CD4+ (r=-0,014; p=0,952).

50 40 30 20 10 0

3000

2000

1000

0

-1000

Pho

spha

tase

act

ivity

Percentual of CD4

Ativ

idad

e fo

sfat

ásic

a

Percentual de CD4

125

Figura 39 - Correlação entre as atividades ecto-fosfatásicas de C. albicans isoladas de crianças infectadas pelo HIV com a carga viral (r=-0,508; p=0,022).

A atividade ecto-fosfatásica das leveduras foi ensaiada utilizando-

se diferentes inibidores clássicos de fosfatase. Como foi observado o

ortovanadato, um potente inibidor de fosfatases ácidas, aboliu completamente

a atividade enzimática das leveduras. Outros inibidores de fosfatase ácida

também foram utilizados como, molibdato de sódio, fluoreto de sódio e fosfato

inorgânico (Pi) e o resultado encontrado foi uma forte inibição da atividade

ecto-fosfatásica. A inibição da fosfatase fúngica promovida por molibdato,

fluoreto e Pi foram reversíveis, enquanto que a inibição por ortovanadato foi

revertida parcialmente (Figura 40).

Viral load

4000003000002000001000000 -100000

3000

2000

1000

0

-1000

Pho

spha

tase

act

ivity

Ati

vida

de fo

sfat

ásic

a

Carga Viral

126

0

20

40

60

80

100

120

None Sod iumorthovanadate

(1mM )

Sod iummolybdate

(1mM )

Sod iumfluoride (1mM )

Pi (10mM )

Inhibito r

Rel

ativ

e ph

osp

hata

se a

ctiv

ity (

%)

Figura 40 – Efeito dos inibidores na atividade fosfatásica de leveduras intactas de C. albicans isolada de criança infectada pelo HIV. As barras pretas representam a atividade enzimática do fungo pré-tratado com os inibidores por 1 hora antes da incubação com o substrato 4-MUP. As barras brancas mostram a atividade ecto-fosfatásica relativa quando os inibidores estão presentes durante a reação com o substrato 4-MUP. O efeito inibitório do molibdato de sódio, fluoreto de sódio e fosfato inorgânico (Pi) foi reversível, enquanto aquele gerado pelo ortovanadato de sódio foi irreversível (* p<0,05). Estas médias percentuais foram obtidas de três experimentos com diferentes suspensões celulares de isolados de crianças HIV+ e convertidos para percentagem a partir do controle. No grupo de crianças sem evidências clínicas de imunossupressão, resultados semelhantes foram observados.

A expressão diferenciada da atividade ecto-fosfatásica nas

células fúngicas dos grupos HIV+ e HIV- proporcionou subsídios para a

realização de novos experimentos a fim de investigar a possível participação

destas ecto-fosfatásicas fúngicas na interação de C. albicans com células

epiteliais. Observou-se, então, que leveduras com elevada atividade enzimática

apresentavam também altos índices de adesão a células do hospedeiro (Ma

*

*

Inibidores

Ativ

idad

e fo

sfat

ásic

a re

lativ

a (%

)

127

104). Análises estatísticas mostraram um alto índice de correlação entre a

atividade enzimática e a interação fungo-célula epitelial (r=0,8) (Figura 41).

0

20

40

60

80

100

120

140

Re

lativ

e p

ho

sph

ata

se a

ctiv

ity

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Ad

hes

ion

ind

ex

Figura 41 – Correlação entre atividade fosfatásica (- -����- -) índice de adesão (-����-) na interação de Candida albicans isoladas de crianças HIV positivas e HIV negativas com células epiteliais (r=0,8; p=0,2).

O pré-tratamento das leveduras com o ortovanadato de sódio

também inibiu a adesão das células fúngicas a células epiteliais, o que sugere

o envolvimento de ecto-fosfatases na interação de C. albicans com uma

linhagem de célula epitelial Ma 104 (Figura 42).

Ativ

idad

e fo

sfat

ásic

a re

lativ

a

Índi

ce d

e ad

esão

128

Figura 42 – Influência da atividade ecto-fosfatásica na interação de quatro isolados de C. albicans com células epiteliais. O pré-tratamento das leveduras com ortovanadato de sódio influenciou negativamente a adesão das células fúngicas em todos os isolados.

Índi

ce d

e ad

esão

Presença do ortovanadato

Ausência do ortovanadato

Isolados de C. albicans

1 2 3 4 1 2 3 4

129

6. Discussão6. Discussão6. Discussão6. Discussão

A epidemia de AIDS continua sendo um grande problema de

saúde em todo o mundo. Várias são as manifestações clínicas da infecção,

podendo ser as lesões orais os primeiros sinais e sintomas em crianças

(LEGGOTT, 1992; GREENSPAN & GREENSPAN, 1993; KATZ et al., 1993;

RAMOS-GOMEZ et al., 1999; SANTOS et al., 2001). Elas estão diretamente

relacionadas com o grau de imunossupressão do paciente e são consideradas

importantes indicadores na progressão da infecção (SANTOS et al., 2001). Das

manifestações orais encontradas em crianças soropositivas, a candidíase

(pseudomembranosa, eritematosa e quelite angular) é a lesão mais comum

(LEGGOTT et al., 1992; SANTOS et al., 2001). No entanto, após o uso da

terapia múltipla combinada com inibidores de protease do HIV (HAART), vem

se observando um declínio não só desta manifestação bucal, como também de

todas outras lesões oportunistas observadas nestes pacientes (PATTON et al.,

2000).

A espécie considerada predominante na infecção fúngica da

cavidade bucal em indivíduos imunocomprometidos é a C. albicans, seguida

ainda por outras espécies, como: C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C.

lusitaniae e C. parapsilosis (SAMARANAYAKE, 1992; REPENTIGNY,

LEWANDOWSKI & JOLICOEUR, 2004). Em 1995, uma nova espécie de

Candida, com características fenotípicas semelhantes às da C. albicans, foi

descrita e denominada C. dubliniensis (SULLIVAN et al., 1995). Em outras

130

manifestações bucais que não apresentam espécies de Candida como agente

etiológico principal, também tem sido descrito o seu isolamento. Relatos na

literatura têm demonstrado que dentre outros patógenos, mais de 50% dos

pacientes com gengivite associada ao HIV apresentam a C. albicans nos sítios

infeccionados (ZAMBON et al., 1990; LUCHT, HEIMDAHL & NORD, 1991). No

presente estudo, demonstramos que 42,3% das crianças infectadas pelo HIV

atendidas na Faculdade de Odontologia da UFRJ apresentavam cultura

positiva para espécies de Candida e esse isolamento esteve diretamente

relacionado com a baixa contagem de linfócitos T CD4, elevada carga viral e

presença de gengivite (PORTELA et al., 2004).

A segunda parte do presente estudo teve como objetivo atribuir

possíveis funções associadas à virulência de serina protease secretada por

espécies de Candida crescida em meio de cultura BHI. O primeiro relato desta

secreção foi dado por nosso grupo (COSTA et al., 2003). Na presente

pesquisa, utilizou-se amostras de Candida isoladas de lesões orais de eritema

linear gengival presente em crianças infectadas pelo HIV, enquanto que o

estudo de COSTA et al. (2003) avaliou amostras de Candida isoladas da

cavidade bucal saudável de crianças infectadas pelo HIV. O eritema linear

gengival trata-se de uma lesão oral com freqüência de aparecimento que varia

de 1,96% a 22% (BARASCH et al., 2000; FONSECA, CARDOSO &

POMARICO, 2000; PORTELA et al., 2000).

As proteases são enzimas amplamente distribuídas na natureza,

sendo importante fator na patogênese de inúmeras doenças microbianas,

possuindo função relevante na adesão, penetração, nutrição, sobrevivência

131

intracelular, multiplicação e diferenciação celular (HUBE, 2000). Muitas

espécies fúngicas, patogênicas ao homen, secretam proteases in vitro

(RODRIGUES et al., 2003). Assim, de acordo com a metodologia utilizada por

COSTA e colaboradores (2003) foi possível a detecção de serina protease

secretada para o meio extracelular pelas espécies de Candida isoladas de

lesões de eritema linear gengival. Esta classe de protease extracelular já foi

descrita em outros fungos, como Aspergillus fumigatus (LARCHER et al.,

1992), Pseudallescheria boydii (LARCHER et al., 1996), Paracoccidioides

brasiliensis (PUCCIA et al., 1998) e Cryptococcus neoformans (RODRIGUES et

al., 2003). Corroborando os resultados de COSTA et al. (2003) observamos

uma variação no padrão de expressão de proteases, principalmente quanto ao

número de bandas líticas dentre vários isolados da mesma espécie. No

entanto, todas as atividades proteolíticas observadas foram completamente

inibidas na presença de 10 mM PMSF, enquanto que no primeiro estudo de

nosso grupo (COSTA et al., 2003) foi observada também a presença de

metaloproteases secretadas por tais microrganismos. Essa diferença pode

estar relacionada ao fato das amostras serem isoladas de diferentes sítios

dentro da cavidade oral. Corroborando este resultado, JIN et al. (2005)

observaram uma freqüência de 1% de variabilidade fenotípica em biofilme de

C. albicans quando comparado a células planctônicas. Os autores citam que as

diferenças observadas nos diferentes fenótipos de C. albicans estão

relacionadas ao padrão de assimilação de carboidratos, adesão, formação de

biofilme, diferenciação e crescimento celular.

132

Os resultados dos perfis de enzimas proteolíticas de C. albicans

do presente estudo sugerem uma relação positiva entre a intensidade do perfil

proteolítico e condição sistêmica dos pacientes. No paciente a foi observado a

condição sistêmica mais grave e um perfil de proteases mais complexo, apesar

de todos os pacientes apresentarem grave comprometimento sistêmico. Todos

os pacientes estavam em uso da terapia combinada anti-retroviral com inibidor

da aspártico protease do HIV. Adicionalmente, este achado corrobora outros

estudos em que foi constatado que imunodeficiência celular, neutropenia

crônica, cancer e outras situações em foi empregada a terapia

imunossupressiva são fatores que predispõem a mudança do fungo de um

estágio comensal para um patogênico (STERWART et al., 1999; HUBE, 2000).

É importante salientar que McCULLOUGH e colaboradores (1995) identificaram

um isolado de C. albicans geneticamente atípica em pacientes infectados pelo

HIV, a qual secreta índices maiores de proteases extracelulares quando

comparada com os isolados de C. albicans de indivíduos normais. No entanto,

DE BERNARDIS et al. (2004) ao compararem o efeito do HAART (terapia anti-

retroviral com associação de diferentes classes de medicamentos incluindo os

inibidores de protease do HIV) na prevalência, produção de SAP e biotipagem

de isolados de Candida spp. observaram que esta terapia inibe a expressão de

SAP mas não elimina ou seleciona cepas de Candida na cavidade oral.

Vários estudos na literatura já demonstraram a ação hidrolítica da

SAP de C. albicans sobre proteínas importantes do hospedeiro, como albumina

(RÜCHEL et al., 1983), colágeno (KAMINISHI et al., 1986; KAMINISHI et al.,

1988), IgA (RÜCHEL, 1981), IgG (KAMINISHI et al., 1995), queratina (NEGI et

133

al., 1984) e hemoglobina (REMOLD et al., 1968). Assim, avaliamos a

capacidade de degradação de proteínas importantes para o hospedeiro por

serina-protease secretada por espécies de Candida. Nossos resultados

sugerem que serina protease secretada participa no estabelecimento da

infecção por possuírem também a especificidade de degradar proteínas de

matriz extracelular (fibronectina e laminina), proteínas do sistema imunológico

(imunoglobulina G) e do soro (albumina humana e bovina). A atividade desta

classe de protease foi demonstrada em outros fungos como capazes de

degradar componentes do hospedeiro, como Paracoccidioides brasiliensis

(MONTENEGRO et al., 1993) e Cryptococcus neoformans (RODRIGUES et al.,

2003).

Para excluirmos a possibilidade de estarmos evidenciando a

enzima Kex2, uma serina protease intracelular, foi realizado em todos os

sobrenadantes de cultivo a dosagem da lactato desidrogenase que se mostrou

ausente em todos os sistemas. A Kex2 é uma serina protease intracelular

presente em espécies de Candida e responsável pela regulação de fatores de

virulência como a expressão de SAP e formação de hifas (NEWPORT et al.,

2003). Com isso foi possível confirmar tratar-se de proteases secretadas para o

sobrenadante de cultivo e não proteases intracelulares que foram liberadas

devido à lise celular. A análise do genoma de C. albicans demonstra a

presença de genes responsáveis pela codificação de serina proteases

secretadas.

COSTA (2001) sugere que um dos motivos pelos quais não foram

identificadas aspártico proteases secretadas (SAP) nos sobrenadantes de

134

cultivo das cepas de Candida spp. isoladas da cavidade bucal de crianças

infectadas pelo HIV, fato que também não observamos no presente estudo,

esteja relacionado ao meio de cultura utilizado. O meio de cultura BHI (infusão

de cérebro e coração) utilizado neste trabalho não induziu a expressão e

secreção de SAP, em contraste com o que ocorreu nos estudos anteriores

onde as leveduras eram cultivadas em meio suplementado com proteínas

exógenas (BSA 1%) (MacDONALD & ODDS, 1980; RÜCHEL et al., 1982; DE

BERNARDIS et al., 1992; KAMINISHI et al., 1995; OLLERT et al., 1995;

MORSCHHÄUSER et al., 1997). Com o objetivo de avaliarmos a influência do

meio de cultura na expressão de SAP, cultivamos isolados de Candida em YCB

(Yeast carbon base) suplementado com 1% de soro albumina bovina. Nossos

resultados mostraram que todos os isolados de Candida quando cultivadas em

YCB suplementado foram capazes de secretar aspártico proteases. A

avaliação da atividade da aspártico protease foi realizada por “Western blotting”

com utilização de anticorpos anti-SAP.

MORSCHHÄUSER et al (1997), ao investigarem se a secreção

de SAP por C. albicans participaria na invasão destes microrganismos para

tecidos mais profundos através da degradação metabólica de proteínas da

matriz extracelular, concluíram que a enzima secretada por estes fungos seria

um fator importante na penetração através dos tecidos mais profundos

podendo, também, atingir a circulação sanguínea. SCHALLER et al., 2005 em

uma recente revisão da literatura sobre enzimas hidrolíticas de C. albicans

mostraram a presença de 10 genes que codificam diferentes isoenzimas de

aspártico proteases que apresentam uma variedade de funções cruciais na

135

patogênese da candidíase. A expressão destas isoenzimas de SAP está

relacionada ao local da infecção no hospedeiro e as diferentes formas celulares

de Candida. Neste contexto, o presente estudo avaliou a influência do PMSF

no processo de interação de C. albicans com células epiteliais (Ma 104) in vitro.

Previamente a interação celular, as leveduras de C. albicans, crescidas em

meio de cultura BHI, foram tratadas por uma hora com PMSF em diferentes

concentrações. Os resultados demonstraram que nos sistemas onde as

leveduras tinham sido tratadas houve uma forte inibição no processo de

adesão de forma dose-dependente a partir da concentração de 0,1 µM.

Observamos também, que a partir da concentração de 100 µM de PMSF foi

evidenciado uma forte inibição do processo de diferenciação de levedura para

tubo germinativo.

Diante destes resultados de interação, o presente estudo analisou

também as possíveis alterações celulares (perfil protéico e proteases

associada à célula) induzidas pelo tratamento com PMSF. O perfil de proteínas

associadas a célula não mostrou diferenças significativas entre o sistema

controle (leveduras sem o tratamento com PMSF) e os demais sistemas com

concentrações variadas de PMSF. No entanto, um dado importante foi

observado no perfil de proteases associadas a célula onde verificamos uma

inibição, também de forma dose-dependente, sendo a atividade proteolítica

totalmente abolida a partir da concentração de 100 µM. Analisando todas estas

modificações celulares em conjunto e os resultados de inibição da

diferenciação celular e adesão a células epiteliais, sugerimos a proteína Kex2

como um dos alvos do PMSF. NEWPORT e colaboradores (2003)

136

demonstraram que a deleção do gene “kexin” (KEX2) em C. albicans acarretou

mudanças no fenótipo e na virulência devido à alterações na expressão de dois

importantes fatores de virulência, expressão de aspártico protease e formação

de hifas. Concluíram assim que a Kex2 participa diretamente na virulência de

C. albicans.

Dando continuidade as análise das alterações celulares, foi

avaliado o perfil das proteínas de superfície de C. albicans através da

marcação com biotina succnilada antes do tratamento com PMSF. Após o

tratamento, foi obtido o extrato celular de cada sistema, realização de “Western

blotting” e revelação dos polipeptideos marcados com biotina. Os resultados

demonstraram que o tratamento pode estar modulando a expressão das

proteínas de superfície de C. albicans, já que no sistema controle a quantidade

de proteínas marcadas foi significantemente menor que nos sistemas onde

houve o tratamento com as diferentes concentrações de PMSF. A análise do

sobrenadante do tratamento revelou a presença dos peptídeos marcados com

biotina no sistema controle. Já no sistema correspondente ao tratamento com

1000 µM de PMSF não foram identificadas proteínas biotiniladas secretadas. A

família de genes ALS (“agglutinin-like sequence”) de C. albicans codifica um

grupo de proteínas contendo glicosilfosfatidilinositol (GPI) que permanecem

ancoradas na superfície celular e funcionam como adesinas. No genoma de C.

albicans existem pelo menos oito diferentes genes ALS. A expressão destes

genes depende, assim como a expressão de Sap, do local onde será

estabelecido a infecção. As células do epitélio oral e células vasculares

endoteliais induzem a expressão de Als1p e Als3p em C. albicans (Filler, 2006).

137

Os nossos resultados demonstraram que o tratamento com PMSF nas diversas

concentrações induziu à uma modificação do perfil das proteínas de superfície

de C. albicans. Estas alterações podem estar impedindo o reconhecimento dos

sítios de ligação específica para as células epiteliais, justificando assim o baixo

índice de adesão encontrado.

É sabido que além do fenômeno de adesão, espécies de Candida

podem formar biofilmes tornando esses microrganimos menos susceptíveis aos

antifúngicos. Biofilme de C. albicans consiste em uma mistura de leveduras,

hifas e pseudohifas e apresenta uma camada basal de leveduras que ancora

todo este biofilme à superfície (BAILLIE & DOUGLAS, 2000). Foi também um

dos objetivos do presente estudo avaliar a influência de inibidores de serina

protease durante a formação de biofilme por C. albicans. Embora existam

muitos trabalhos na literatura sobre o fenômeno da penetração incompleta de

agentes antimicrobianos através do biofilme de Candida, nenhum destes

estudos investigaram o efeito de inibidores proteolíticos na formação do

biofilme. No presente trabalho avaliamos o papel da serina protease secretada

por C. albicans no processo de desenvolvimento de biofilme, empregando o

PMSF nas concentrações de 100, 500 e 1000 µM e aprotinina 2 µg/mL. A

indução à formação de biofilme foi realizada de acordo com a metodologia

descrita por ALVIANO et al. (2005) modificada. Foi empregado membranas de

policarbonato para análise em microscopia eletrônica de varredura (AL-

FATTANI & DOUGLAS, 2004; SAMARANAYAKE et al., 2005). A análise dos

sistemas onde havia a presença dos inibidores revelou a presença de células

menos aderentes quando comparado com o sistema controle. Esse resultado

138

foi avaliado através da contagem das unidades formadoras de colônias

oriundas das suspensões celulares obtidas após lavagens das membranas

para remoção das células não aderidas. Estes resultados também foram

corroborados pela análise das membranas ao microscópio eletrônico de

varredura.

Diante dos resultados observados a partir da utilização de

inibidores de serina proteases, estudos futuros tornam-se necessários a fim de

se identificar in vivo a participação destas enzimas no processo de infecção por

espécies de Candida.

A candidíase orofaríngea é descrita como a lesão mais comum

em indivíduos infectados pelo HIV, com uma prevalência que pode ultrapassar

90% durante o curso da infecção (TORSSANDER et al., 1987; KORTING et al.,

1988; SAMARANAYAKE & HOLMSTRUP, 1989; SAMARANAYAKE, 1992). Em

crianças soropositivas para o HIV esta prevalência se repete, podendo ainda

ser encontrado quadros mais graves da infecção fúngica por causa da

imaturidade do sistema imunológico (FALLOON et al., 1989; LEGGOT et al.,

1992; GREENSPAN & GREENSPAN, 1993; CHIGURUPATI et al., 1996;

RAMOS-GOMEZ et al., 1999). C. albicans é a espécie encontrada com maior

incidência em lesões de candidíase bucal (POWDERLY, 1992; GREENSPAN &

GREENSPAN, 1993; CHIGURUPATI et al., 1996; RAMOS-GOMEZ et al.,

1999). Ela ocorre como um microrganismo comensal na cavidade bucal dos

indivíduos não causando alterações, entretanto, em pacientes

imunocomprometidos, assume características de patogenicidade alterando a

harmonia com o hospedeiro (ARENDORF & WALKER, 1980). Sabendo-se

139

ainda da importância da parede celular fúngica no processo de infecção, o

presente estudo comparou a expressão de proteínas responsáveis pela ligação

a componentes importantes da matriz extracelular (fibronectina, laminina e

colágeno) entre cepas de C. albicans isoladas da cavidade bucal de criança

infectada pelo HIV, criança sem evidência clínica de imunossupressão e uma

cepa ATCC. GOZALBO et al. (2004) atribuem à parede celular fúngica

importância crucial na patogenicidade de C. albicans por ser responsável pela

proteção física da célula, interação com o hospedeiro incluindo adesão aos

tecidos e modulação da resposta imune, podendo ainda ser considerada como

alvo para a terapia anti-fúngica.

No hospedeiro humano, a interação de células a proteínas de

adesão da matriz extracelular desencadeia sinais que afetam a morfologia,

expressão de genes e a sobrevivência de células aderentes (JOHANSSON et

al., 1997). A fibronectina e laminina são importantes componentes da matriz e

servem de pontes de união entre as células e esta matriz extracelular (TIMPL

et al., 1979; SKERL et al., 1984). Além disso, a fibronectina e laminina são

responsáveis pela adesão de vários microrganismos aos tecidos do

hospedeiro, e particularmente a fibronectina está envolvida no processo de

opsonização de Staphylococcus aureus (PROCTOR et al., 1985) e C. albicans

(CALDERONE & SCHELD, 1987). Pode-se citar ainda que estas proteínas têm

sido associadas a fagocitose via sistema complemento e receptores Fc

(BOHNSACK et al., 1985; BROWN, 1986). BOUCHARA et al. (1990)

identificaram receptores específicos no tubo germinativo de C. albicans para

laminina e isso poderia contribuir para o estabelecimento da candidíase. Mais

140

recentemente, HOSTETTER (1999) observou que proteínas de superfície de C.

albicans e C. tropicalis apresentam “motifs” remanescentes de integrinas e

ressalta, para a importância de uma dessas proteínas, Int1p, na adesão,

morfogênese e virulência destes microrganismos. Apesar de muitos estudos

objetivarem a identificação e caracterização destas proteínas participantes do

processo de infecção fúngica, pouco é conhecido sobre a influência da infecção

pelo HIV na expressão destes ligantes.

O presente estudo revelou que a cepa de C. albicans isolada de

paciente HIV positivo apresentou uma expressão significantemente maior de

proteínas ligantes à laminina, colágeno tipo IV e principalmente à fibronectina.

Além da maior capacidade de reconhecimento a proteínas de matriz

extracelular, o processo de degradação dessas proteínas por proteases

secretadas após o estabelecimento das ligações também ocorreu de forma

mais acelerada que as demais cepas. Isso fez com que durante a realização

dos experimentos de “binding” foi importante a adaptação da metodologia

utilizada por RODRIGUES et al. (2003). Os autores preconizavam a realização

de todas as etapas sob temperatura ambiente. No entanto, ao trabalharmos

nestas condições, a cepa de C. albicans isolada de paciente HIV+ não

apresentou ligação à nenhuma proteína de matriz devido à rápida degradação

destes substratos pelos altos índices de proteases secretadas. Assim, como

descrito nos materiais e métodos, todo o experimentos foram realizados sob

baixa temperatura (4oC).

Os peptídeos responsáveis pela ligação à fibronectina, laminina e

colágeno tipo IV nos três isolados mostraram perfis semelhantes e pesos

141

moleculares abaixo de 80 kDa. NÈGRE et al. (1994) demonstraram que um

fragmento de colágeno mostrou-se como um potente inibidor da ligação de C.

albicans à fibronectina. Nos resultados corroboraram os de GOZALBO et al.

(1998) que demonstraram através de microscopia imunoeletrônica que a

enzima da via glicolítica, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase associada à

parede celular de C. albicans está envolvida na adesão das células fúngicas à

fibronectina e laminina.

A introdução da terapia múltipla anti-retroviral com inibidores de

proteases vêm causando uma redução da infecção por Candida em pacientes

infectados pelo HIV devido ao efeito indireto (melhora da condição imunológica

do hospedeiro), como também a um efeito direto sobre as aspártico-proteases

secretadas por estes fungos (BORG-VON ZEPELIN et al., 1999; KORTING et

al., 1999; CASSONE et al., 1999; GRUBER et al., 1999; BERKTIÉ et al., 2001)

exercendo desta forma um efeito protetor contra o estabelecimento da infecção

fúngica. Por isso, os inibidores de aspártico protease do HIV estão sendo alvos

de pesquisas como tratamento alternativo para infecções fúngicas, mesmo nas

infecções onde o agente etiológico trata-se de um microrganismo que não

secrete aspártico protease (MANFREDI, CALZA & CHIODO, 2002; CASOLARI

et al., 2004). Por isso, no presente estudo avaliou-se a influência destes

inibidores de protease do HIV sobre o crescimento, diferenciação celular e

interação de C. albicans com células epiteliais. No entanto, é sabido que estas

leveduras quando são induzidas a secretarem aspártico protease apresentam

forte influência de todas estas drogas, inclusive na expressão de fatores de

142

virulência, como por exemplo diferenciação celular e interação com células do

hospedeiro (CASSONE et al., 1999; BEKTIÉ et al., 2001).

Ao contrário do observado em Cryptococcus neoformans (BLASI

et al., 2004; MONARI et al., 2005) os inibidores de aspártico protease do HIV

não foram capazes de inibir o crescimento de C. albicans crescida em meio

BHI, com exceção do saquinavir que levou a 100% de morte celular na

concentração de 200 µM. Além da inibição do crescimento, as leveduras

tratadas com Saquinavir durante 24 horas em meio de cultura BHI

apresentaram inibição na diferenciação celular (levedura -> tubo germinativo) e

na interação com células epiteliais in vitro. Nossos resultados corroboram

estudos na literatura que observaram, em fungos produtores de serina protease

para o meio extracelular, efeito inibitório no crescimento e na interação com

células hospedeira como conseqüência do tratamento com drogas inibidoras de

aspártico protease do HIV in vitro (BLASI et al., 2004; MONARI et al., 2005).

Estes resultados sugerem a importância da realização de estudos

in vivo com o objetivo de identificar a expressão e secreção de serina durante a

infecção por espécies de Candida na cavidade bucal. Com isso poderíamos

justificar a presença da lesão oral nos pacientes em terapia com estas drogas

anti-retrovirais inibidoras de aspártico protease, já que de acrodo com os

nossos resultados apenas o Saquinavir apresentou atividade antifúngica. Cabe

ainda salientar a necessidade de investigações sobre a concentação real

destes inibidores na saliva dos pacientes infectados pelo HIV, pois na literatura

consultada não foi encontrada tal informação. Assim, poderíamos definir a ação

143

real destas drogas na diminuição da incidência de candidíase oral – efeito

direto ou indireto nos fatores de virulência de espécies de Candida?

144

7. Conclusões7. Conclusões7. Conclusões7. Conclusões

De acordo com os resultados pode mos concluir que:

1 Serina proteases secretadas por espécies de Candida isoladas de lesões de

eritema linear gengival de crianças infectadas pelo HIV foram capazes de

utilizar como substrato proteínas presentes na matriz extracelular (fibronectina

e laminina), proteínas pertencentes ao sistema imunológico (imunoglobulina G)

e componetes do soro (albumina humana e bovina).

� O tratamento das leveduras de C. albicans com PMSF (inibidor de serina

protease) inibiu de forma dose-dependente a adesão deste fungo a células

epiteliais (Ma 104) a partir da menor concentração utilizada (0,1 µM de PMSF).

� O tratamento com PMSF induziu nas leveduras de C. albicans alterações

celulares como, inibição da atividade de proteases associadas a célula, inibição

da diferenciação celular de levedura para tubo germinativo e modulação da

expressão de proteínas de superfície. Estas alterações celulares ocorreram a

partir da concentração de 100 µM de PMSF.

� O tratamento com PMSF e aprotinina (inibidores de serina protease) induziu

a formação de um biofilme de C. albicans com células fracamente aderidas

145

quando comparado ao sistema controle, fato este, que facilitaria a sua remoção

e difusão de medicamentos.

� A infecção pelo HIV parece influenciar a expressão de proteínas

responsáveis pela adesão de C. albicans a proteínas de matriz extracelular. O

isolado de C. albicans de criança infectada pelo HIV apresenta maiores

propriedades adesivas à fibronectina, laminina e colágeno tipo, quando

comparado com os isolados oriundos de pacientes sem evidências clínicas de

imunossupressão.

� O tratamento das leveduras com os inibidores da aspártico protease do HIV

não influenciou no crescimento de C. albicans, com exceção do saquinavir que

na concentação de 200 µM induziu a 100% de morte celular e nas

concentrações de 100 e 150 µM inibiu a diferenciação celular e adesão a

células epiteliais (Ma 104).

� Todos os isolados de C. albicans apresentaram atividade ecto-fosfatásica.

No entanto, os isolados de crianças infectadas pelo HIV apresentaram

atividades significantemente maiores quando comparadas com os isolados de

crianças sem evidências clínicas de imunossupressão. No entanto, não foi

observado correlação positiva entre a atividade enzimática e a condição

sistêmica dos pacientes infectados pelo HIV. Esta atividade enzimática parece

estar envolvida no processo de interação fungo-hospedeiro como um

importante fator no estabelecimento da infecção, já que houve correlação

146

significante entre a elevada atividade ecto-fosfatásica e índice de adesão a

células epiteliais (Ma 104).

A presença de fluoreto de sódio em fluidos salivares parece não ser

importante apenas na prevenção da doença cárie, mas também na prevenção

de infecções fúngicas, principalmente as causadas por C. albicans, por inibir a

formação de um biofilme firmemente aderido produzido por este fungo.

147

8. 8. 8. 8. Referências BibliográficaReferências BibliográficaReferências BibliográficaReferências Bibliográficassss

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190

9. Artigos em Anexo9. Artigos em Anexo9. Artigos em Anexo9. Artigos em Anexo

9.1) Correspondente à Tese de Doutorado

PORTELA, M. B.; SOUZA, I. P. R.; COSTA, E. M. M. B.; HAGLER, A. N.;

SOARES, R. M. A.; SANTOS, A. L. S. Differential recovery of Candida species

from subgengival sites in human immunodeficiency virus-positive and healthy

children from Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol, v. 42, n. 12, p. 5925-27,

2004.

9.2) Realizado em colaboração

COSTA, E. M. M. B.; SANTOS, A. L. S.; CARDOSO, A. S.; PORTELA, M. B. ;

ABREU, C. M.; ALVIANO, C. S.; HAGLER, A. N.; SOARES, R. M. A.

Heterogeneity of metallo and serine extracellular proteinases in oral clinical

isolates of Candida albicans in HIV-positive and healthy chldren from Rio de

Janeiro, Brazil. FEMS Immunol Med Microbiol, v. 38, p. 173-80, 2003.

SANTOS, A. L. S.; De CARVALHO, I. M.; Da SILVA, B. A.; PORTELA, M. B. ;

ALVIANO, C. S.; SOARES, R. M. A. Secretion of serine peptidase by a clinical

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191

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factor for the oarl prevalence of Candida ssp in HIV-infected children? ASDC J

Dent Child. Artigo submetido.

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