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JANAÍNA SIQUEIRA BORDA
MAPEAMENTO DAS PROJEÇÕES RETINIANAS PARA O SISTEMA
ÓPTICO ACESSÓRIO, COLÍCULO SUPERIOR E COMPLEXO PRÉ-
TECTAL DO SAGUI (Callithrix jacchus).
Natal-RN
2015
Tese de Doutorado apresentada ao
programa de Pós-graduação em
Psicobiologia da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte
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JANAÍNA SIQUEIRA BORDA
MAPEAMENTO DAS PROJEÇÕES RETINIANAS PARA O SISTEMA
ÓPTICO ACESSÓRIO, COLÍCULO SUPERIOR E COMPLEXO PRÉ-
TECTAL DO SAGUI (Callithrix jacchus).
Orientador: Jeferson de Souza Cavalcante
Natal-RN
2015
Tese de Doutorado apresentada ao
programa de Pós-graduação em
Psicobiologia da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte
2
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Borda, Janaína Siqueira.
Mapeamento das projeções retinianas para o sistema óptico acessório, colículo superior e complexo pré-
tectal do sagui (callithrix jacchus). / Janaína Siqueira Borda. – Natal, RN, 2015.
89 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-
Graduação em Psicobiologia.
1. Callithrix jacchus. – Tese. 2. Sistema motor visual. – Tese. 3. Botões sinápticos. – Tese. I. Cavalcante,
Jeferson de Souza. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 599.821
3
TÍTULO
MAPEAMENTO DAS PROJEÇÕES RETINIANAS PARA O SISTEMA ÓPTICO
ACESSÓRIO, COLÍCULO SUPERIOR E COMPLEXO PRÉ-TECTAL DO SAGUI
(Callithrix jachus)
AUTOR
JANAÍNA SIQUEIRA BORDA
DATA DA DEFESA
26/08/2015
BANDA EXAMINADORA
Profº. Francisco Gilberto de Oliveira
Universidade Regional do Cariri (URCA).
Profº. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN).
Profº. Expedito Siva do Nascimento Júnior
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
Profº. Judney Cley Cavalcante
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
Profº. Jeferson de Souza Cavalcante
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
4
“Saúde, obrigação e divertimento. Qualquer alteração nessa ordem pode comprometer a nossa
vida.”
(Abbas Hassan El-Aouar)
5
AGRADECIMENTOS
Por nunca ter perdido a minha fé e a Deus que, em sua bondade infinita, deu-me força,
paciência, resignação e compreensão para conseguir passar por momentos turbulentos e ainda
assim conseguir finalizar mais uma etapa de minha vida.
A minha amada mãe, que nunca me deixou desistir, sempre segurando em minha mão,
sonhando junto comigo e sendo a minha fortaleza, e a quem dedico inteiramente esse
trabalho. Obrigada minha mãe por tudo.
Ao meu esposo Jerônymo, por está sempre ao meu lado, pelas idas e vindas ao hospital, por
está ao meu lado nos momentos em que a dor era insuportável. Por, junto com minha mãe,
não ter me deixado desistir. Obrigada por todos os incentivos, apoios e principalmente por
caminhar de mãos dadas comigo.
A Dr. Hylas Ferreira, meu cirurgião torácico que devolveu minha qualidade de vida e sem o
qual eu não conseguiria hoje está terminando esse trabalho. Obrigada por seu
profissionalismo, competência e que por suas mãos outras pessoas possam ser curadas.
Aos que hoje não se encontram ao meu lado fisicamente, mas estarão sempre presentes em
meu coração: minha avó Alzira, meu avô Luís Siqueira, minha tia e madrinha Maria Luisa, ao
meu padrasto Otávio Lima e a minha sogra Cristina Leite. Obrigada a todos pelos
ensinamentos e exemplos de dignidade, amor, honestidade, mostrando-me que a perseverança
é um dom indispensável para a realização de qualquer projeto de vida.
A toda a minha família: irmãos, cunhadas, tios(as), primos(as) pelos incentivos, cuidados e
principalmente pelo grande amor que nos une.
Ao meu amigo e orientador, Jeferson De Souza Cavalcante por todo o incentivo, paciência,
dedicação e principalmente por sua compreensão em todos os momentos em que se foi
necessária.
6
Aos meus amigos-irmãos, André e Rovena, por todas as preocupações, amizade,
solidariedade, ajudas e principalmente por estarem ao meu lado em momentos importantes de
minha vida.
A todos que compõem o LENq e o LabNeuro da UFRN, em especial Kayo, Rodolfo, Eudes,
Felipe, Ruthnaldo, Paulo, Joacil, Gilberto, Miriam, Expedito, Judney e Regina. Cada um de
alguma forma contribuiu para a concretização desse trabalho, seja ajudando com palavras de
incentivo, apoios e principalmente com a ajuda na parte estatística e de utilização de
Software.
A toda a turma de alunos da Pós-graduação em Psicobiologia.
A todos os professores do programa de Pós-graduação em psicobiologia, em especial a Fívia
Lopes e Arrilton Araújo.
A todos os funcionários do Departamento de Morfologia, Fisiologia e Núcleo de
Primatologia da UFRN.
A CAPES, CNPq, REUNI pelo suporte financeiro indispensável.
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 8
ABREVIATURAS 10
RESUMO 12
ABSTRACT 13
1. INTRODUÇÃO 14
1.1 – Sistema motor visual ou motor ocular 16
1.1.1 – Sistema óptico acessório
1.1.2 – Colículo Superior
1.1.3 – Complexo pré-tectal
17
21
22
1.2 – Sagui (Callithrix jachus): o modelo experimental 24
2. JUSTIFICATIVA 27
3. OBJETIVOS 28
3.1 – Objetivo geral
3.2 – Objetivos específicos
28
28
4. METODOLOGIA 29
4.1 – Injeção intraocular da subunidade b da toxina colérica
4.2 – Perfusão transcardiaca
4.3 – Remoção do encéfalo e microtomia
4.4 – Imunoistoquímica
4.5 – Análise dos resultados
4.6 – Medição de área e perímetro celular
29
30
31
31
33
33
5. RESULTADOS 34
5.1 – Sistema óptico acessório
5.2 – Colículo superior
5.3 – Complexo pré-tectal
34
34
35
6. DISCUSSÃO 52
6.1 - Sistema óptico acessório
6.2 – Colículo superior
6.3 – Complexo pré-tectal
54
57
59
7. CONCLUSÃO 64
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS 65
8
9. REFERÊNCIAS 66
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Callithrix jachus
Figura 2: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR nos
núcleos IFSP, NTL e NTM do SOA.
Figura 3: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR no
núcleo IFSP e caracterização de seus botões sinápticos.
Figura 4: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR no
NTL e caracterização de seus botões sinápticos.
Figura 5: Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões
sinápticos dos núcleos IFSP e NTL do SOA.
Figura 6: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR no
CoS e caracterização de seus botões sinápticos,
Figura 7: Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões
sinápticos do CoS.
Figura 8: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR nos
núcleos NTO, NPO, NPA e NPP do complexo pré-tectal e no NTD do
SOA e caracterização dos botões sinápticos do NTO e NPO.
Figura 9: Caracterização dos botões sinápticos do NTO.
Figura 10: Caracterização dos botões sinápticos do NTO e NPO ipsolateral.
Figura 11: Caracterização dos botões sinápticos do NPP.
Figura 12: Caracterização dos botões sinápticos do NTD do SOA.
Figura 13: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR nos
núcleos NPO, NTO, NPA, NPP do complexo pré-tectal e NTD do SOA e
caracterização dos botões sinápticos do NTO e NPO.
Figura 14: Caracterização dos botões sinápticos do NPA
10
Figura 15: Caracterização dos botões sinápticos do NTD.
Figura 16: Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos núcleos do
complexo pré-tectal e d NTD do SOA.
Figura 17: Medição da área e perímetro dos botões sinápticos do complexo pré-tectal
e do NTD do SOA. Análise por Kruskal-Wallis e teste Post-hoc.
11
ABREVIATURAS
ABC Complexo avidina-biotina peroxidase
CoS Colículo superior
CTb Subunidade b da toxina colérica
DAB Diaminobenzidina
EW Edinger-Westphal
FIG Folheto intergeniculado
HRP Horseradish peroxidase
IFSP Núcleo intersticial do fascículo superior
IFSPm Núcleo intersticial do fascículo superior, fibras mediais
NPA Núcleo pré-tectal anterior
NPAd Núcleo pré-tectal anterior dorsal
NPAv Núcleo pré-tectal anterior ventral
NPM Núcleo pré-tectal medial
NPO Núcleo pré-tectal olivar
NPP Núcleo pré-tectal posterior
NROB Núcleo da raiz óptica basal
NSQ Núcleo supraquiasmático
NTD Núcleo terminal dorsal
NTL Núcleo terminal lateral
NTM Núcleo terminal medial
NTMd Núcleo terminal medial dorsal
NTMv Núcleo terminal medial ventral
NTO Núcleo do trato óptico
12
PLi Núcleo limitante posterior
ROB Raiz óptica basal
SOA Sistema óptico acessório
TRH Trato retinohipotalâmico
WGA-HRP HRP conjugado com aglutinina de germe de trigo
13
RESUMO
O sistema óptico acessório, o Complexo pré-tectal, e o colículo superior são
importantes centros de controle de uma variedade de movimentos oculares, sendo
extremamente necessários para a formação de imagem, consequentemente para a percepção
visual. O sistema óptico acessório é constituído pelos núcleos: núcleo terminal dorsal, núcleo
terminal lateral, núcleo terminal medial e núcleo intersticial do fascículo superior posterior.
Do ponto de vista funcional eles contribuem para a estabilização da imagem, participando da
atividade visuomotora onde todas as células do sistema respondem a movimentos lentos dos
olhos e a estímulos visuais, o que é importante para o próprio funcionamento dos outros
sistemas visuais. O complexo pré-tectal compreende um conjunto de núcleos situados na
transição mesodiencefálica, são eles: núcleo pré-tectal anterior, núcleo pré-tectal posterior,
núcleo pré-tectal medial, núcleo pré-tectal olivar e o núcleo do trato óptico, sendo todos
recipientes de projeção retiniana e funcionalmente estão relacionados com a via do reflexo
pupilar a luz e o nistagmo optocinético. O colículo superior é uma importante estação visual
subcortical formado por camadas e, apresenta um papel funcional importante no controle dos
movimentos dos olhos e da cabeça em resposta a estímulos multissensoriais. Nosso objetivo
foi fazer um mapeamento das projeções retinianas que incidem sobre o sistema óptico
acessório, os núcleos do complexo pré-tectal e os do colículo superior, buscando
principalmente, no caso do complexo pré-tectal, uma melhor delimitação dessas estruturas,
por meio do rastreamento anterógrado com a subunidade B da toxina colérica (CTb) seguido
de técnica imunoistoquímica e, caracterizar (medir área e diâmetro) os botões sinápticos
presentes nas fibras/terminais dos núcleos do complexo pré-tectal. Em nossos resultados o
sistema óptico acessório, incluindo uma região que parece ser o núcleo terminal medial, e o
colículo superior apresentaram-se fortemente marcados por fibras/terminais imunorreativos a
CTb, bem como o complexo pré-tectal nos núcleos: núcleo trato óptico, núcleo pré-tectal
olivar, núcleo pré-tectal anterior e núcleo pré-tectal posterior. De acordo com a caracterização
dos botões foi possível fazer uma melhor delimitação desses núcleos.
Palavras-chave: Sistema motor visual, CTb, Callithrix jacchus, botões sinápticos
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ABSTRACT
The accessory optical system, the pretectal complex, and superior colliculus are
important control centers in a variety of eye movement, being extremely necessary for image
formation, consequently to visual perception. The accessory optical system is constituted by
the nuclei: dorsal terminal nucleus, lateral terminal nucleus, medial terminal nucleus and
interstitial nucleus of the posterior superior fasciculus. From a functional point of view they
contribute to the image stabilization, participating in the visuomotor activity where all system
cells respond to slow eye movements and visual stimuli, which is important for the proper
functioning of other visual systems. The pretectal complex comprises a group of nuclei
situated in mesodiencephalic transition, they are: anterior pretectal nucleus, posterior pretectal
nucleus, medial pretectal nucleus, olivary pretectal nucleus and the nucleus of the optic tract,
all retinal projection recipients and functionally are related to the route of the pupillary light
reflex and the optokinetic nystagmus. The superior colliculus is an important subcortical
visual station formed by layers and has an important functional role in the control of eye
movements and head in response to multisensory stimuli. Our aim was to make a mapping of
retinal projections that focus on accessory optical system, the nuclei of pretectal complex and
the superior colliculus, searching mainly for pretectal complex, better delineation of these
structures through the anterograde tracing with the B subunit of cholera toxin (CTb) followed
by immunohistochemistry and characterized (measured diameter) synaptic buttons present on
the fibers / terminals of the nucleus complex pré-tectal. In our results accessory optical
system, including a region which appears to be medial terminal nucleus and superior
colliculus, were strongly marked by fibers / terminals immunoreactive CTb as well as
pretectal complex in the nucleus: optic tract, olivary pretectal nucleus, anterior pretectal
nucleus and posterior pretectal nucleus. According to the characterization of the buttons it was
possible to make a better definition of these nucleus.
Keywords: Visual motor system, CTb, Callithrix jacchus, synaptic buttons
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1. INTRODUÇÃO
Em grande parte dos vertebrados, principalmente na ordem primata, a visão é uma
forma de sensibilidade fundamental para a adaptação ao meio ambiente uma vez que a
sensibilidade a luz capacita os animais, entre eles os humanos, a detectar presas, predadores e
parceiros sexuais. Considerando que o conhecimento animal é adquirido por meio dos
sentidos podemos afirmar que a visão, de longe, é a fonte de conhecimento mais importante
para esses animais (Gengenfurtner e Kiper, 2003; Nassi e Callaway, 2009).
Na maioria dos animais, o olho é uma estrutura especializada em captação de sinais
luminosos que, em sua grande parte, são destinados a “formação de imagem”, uma definição
clássica da função visual. O processamento da informação visual começa no olho, mais
precisamente na sua túnica interna chamada retina, onde uma camada de células
fotorreceptoras capta informação luminosa, chegam às células ganglionares da retina e estas a
transmite até áreas do diencéfalo e mesencéfalo e daí para o córtex visual primário, local em
que a percepção visual começa a ser formada (Gengenfurtner e Kiper, 2003; Nassi e
Callaway, 2009).
As células fotorreceptoras da retina envolvidas com a “formação de imagens” são os
cones e bastonetes. Essas células são assim chamadas em virtude de suas formas distintas. Os
bastonetes respondem em níveis extremamente baixos de iluminação e são primariamente
responsáveis pela visão noturna. Os cones, em contraste, são menos sensíveis a baixos níveis
de luz. Eles são primariamente responsáveis pela visão sob alta iluminação e para cor e
detalhes, portanto os bastonetes são responsáveis pela visão noturna e os cones pela diurna. A
captação do sinal luminoso é apenas o começo do processamento visual, axônios das células
ganglionares da retina reúnem-se em feixes nos nervos ópticos, que distribuem a informação
visual na forma de potenciais de ação, a diversas estruturas encefálicas. O nervo óptico
carrega a informação luminosa para o cérebro, onde alguns alvos desse nervo estão
envolvidos na regulação dos ritmos biológicos, sincronizados com o ciclo diário claro-escuro;
outros estão envolvidos no controle da posição e da óptica do olho, neste trajeto esses nervos
se cruzam na altura do hipotálamo formando o quiasma óptico. Deste quiasma saem os tratos
ópticos que vão a caminho do tálamo lateral, mais precisamente o complexo geniculado
lateral, que por sua vez recebe esta informação e envia para o córtex visual primário
(Gengenfurtner e Kiper, 2003; Nassi e Callaway, 2009).
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Podemos chamar os terminais axônicos das células ganglionares da retina de:
projeções retinianas. De acordo com estudos que descrevem as projeções retinianas
publicadas nas últimas décadas, podemos classifica-las em dois grandes sistemas: o sistema
formador de imagem e o sistema não-formador de imagem (Martinet et al., 1992; Qu et al.,
1996; Fite e Janusonis, 2001; Fite e Janusonis, 2002; Matteu et al., 2003; Cavalcante et al.,
2005; Engelberth et al., 2008).
O sistema formador de imagem é composto basicamente pelo sistema visual primário
que compreende uma série de estruturas que vão desde a retina até o córtex visual, passando
por vários conjuntos neuronais localizados no diencéfalo e mesencéfalo. Entre eles se
encontram o complexo geniculado lateral do tálamo, principal estação de processamento e
retransmissão do sinal visual clássico (Kaas e Huerta, 1988); o sistema óptico acessório
(SOA), o qual esta envolvido no controle da posição e da óptica do olho, contribuindo para
estabilizar imagens na retina durante o movimento da cabeça (Simpson, 1984; Weber, 1985;
Cooper e Magnin, 1986; Giolli et al., 2006); o colículo superior (CoS), responsável por
integração de vários sinais visuo-motores; e pelos núcleos do complexo pré-tectal,
responsáveis pelo controle do reflexo pupilar a luz (constrição da pupila induzida por um
aumento da iluminação na retina) (Kaas e Huerta, 1988),
O sistema não-formador de imagem é composto pelo sistema de temporização
circadiano que apresenta em sua composição um conjunto de estruturas neurais, incluindo um
marca-passo encarregado da geração de ritmo, vias sincronizadoras e vias de saída aos
comportamentos (Ruzak e Zucker, 1979; Moore-Ede et al., 1982; Meijer e Rietveld, 1989;
Moore, 1992; 1994; Turek, 1994; Morin e Allen, 2006; Cavalcante et al., 2006). O núcleo
supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo é o principal marca-passo desse sistema de
temporização circadiano, e tem sido objeto de extensa pesquisa nas últimas décadas, logo
depois da confirmação da projeção da retina para essa área (Hendrickson et al., 1972; Moore e
Lenn, 1972; Moore, 1973). Tanto o NSQ quanto o folheto intergeniculado do tálamo de
roedores (FIG), outro componente desse sistema, recebem projeção da retina apresentando
como função a geração, sincronização e modulação dos ritmos biológicos (Moore-Ede et al.,
1982; Rusak, 1989; Reuss, 1996; Miller et al., 1996; Costa et al., 1998; Morin e Allen, 2006;
Cavalcante et al., 2006; Lima et al., 2012). Estudos de projeção retiniana usando traçadores
mais sensíveis têm mostrado outras áreas reconhecidamente “não-formadoras de imagem” ou
ditas não visuais, descritas como retino-recipientes, tais como o núcleo habenular (Qu et al.,
1996), o núcleo dorsal da rafe (Foote et al., 1978; Shen e Semba, 1994; Fite et al., 1999; Fite
17
e Janusonis, 2001), o núcleo parabraquial (Fite e Janusonis, 2002; Engelberth, 2008), os
núcleos talâmicos intralaminares e da linha média (Cavalcante et al., 2005) e a zona incerta
(Lima, 2008; Morais, 2014) e alguns núcleos hipotalâmicos (Costa et al., 1999; Canteras et
al., 2011).
Esse trabalho é focado em algumas estruturas que desempenham a função visuomotora
e que recebem projeção direta da retina, mas especificamente no SOA, no CoS e no complexo
pré-tectal, em que essa atividade visuomotora é amplamente definida por incluir todos os
tipos de movimentos intraocular e extraocular, incluindo aqueles da pupila e da pálpebra
(Morin e Blanchard, 2005), e também exercendo um controle para manter a imagem estável
na retina (Chilton e Guthrie, 2004).
1.1. Sistema motor visual ou sistema motor ocular
Sempre se acreditou que a função básica dos músculos extraoculares seria a de mover
os olhos de modo a posicionar a imagem na região retiniana de maior precisão sensorial. Os
músculos extraoculares não apenas otimizam a percepção: são verdadeiramente essenciais
para que ela ocorra, pois a paralisação completa deles, ou a utilização de truques
experimentais que fixam a imagem em um mesmo ponto da retina resultam no rápido
desaparecimento da percepção por que os receptores se adaptam e param de enviar sinais para
os neurônios seguintes. Por isso, em condições normais, mesmo que os olhos estejam fixando
firmemente algum objeto, ocorrem pequenos movimentos oculares que deslocam a imagem
para um ponto e outro da retina, impedindo a adaptação (Hubel e Wiesel, 1979; Gregory,
1997).
Há muitos tipos de movimentos oculares, que servem a diferentes funções. Quanto a
coordenação binocular, podem ser conjugados, se os dois olhos se movem na mesma direção
e com a mesma velocidade; ou disjuntivos se se movem em direções diferentes (convergentes
e divergentes). Quanto à velocidade, podem ser sacádicos, se forem muito rápidos e
independentes do movimento dos objetos externos; ou de seguimento, se forem lentos e
“presos”, relacionados ao deslocamento de algum objeto. Finalmente, quanto à trajetória
podem ser radiais, quando o eixo visual se desloca angularmente para qualquer direção; ou
torsionais, quando o eixo permanece fixo, movendo-se o olho em rotação à sua volta (Hubel e
Wiesel, 1979; Gregory, 1997).
18
Os movimentos oculares podem ser reunidos em dois grupos, segundo a sua função:
aqueles destinados a estabilizar o olhar e aqueles que objetivam desviar o olhar (Hubel e
Wiesel, 1979; Gregory, 1997).
Os movimentos de estabilização do olhar são involuntários e de natureza
essencialmente reflexa: visam manter estável a imagem na retina, apesar dos movimentos dos
objetos e do próprio individuo. Os movimentos de desvio de olhar são diferentes porque
podem ter um significativo componente voluntário, consciente (Hubel e Wiesel, 1979;
Gregory, 1997).
Acredita-se que os movimentos de desvio do olhar tenham se originado, durante a
evolução, a partir dos movimentos de estabilização, já que estes existem em todos os
vertebrados, enquanto aqueles só apareceram nos animais que possuem fóveas ou regiões
similares de maior acuidade. Coerentemente, os movimentos de estabilização envolvem
circuitos reflexos mesodiencefálicos cuja origem está nos fotorreceptores do olho e nos
mecanorreceptores do labirinto vestibular, enquanto os movimentos de desvio do olhar
acrescentam aos circuitos subcorticais fortes influências do córtex cerebral veiculadas através
de fibras que terminam no colículo superior e regiões próximas. Em ambos os casos, o
ambiente visual funciona como um poderoso imã que atrai os olhos e a cabeça para ponto do
espaço que contém o estímulo relevante (Hubel e Wiesel, 1979; Gregory, 1997).
Assim, o SOA, o CoS e o complexo pré-tectal são importantes centros de controle de
uma variedade de movimentos oculares (Lui et al., 1995) e nas próximas seções os
componentes deste “sistema motor visual” serão discutidos detalhadamente.
1.1.1. Sistema óptico acessório
Embora o SOA tenha sido reconhecido anatomicamente a mais de cem anos e está
presente em todas as classes dos vertebrados (Mai, 1978), os primeiros estudos fisiológicos só
foram registrados a partir de 1959 (Marg et al., 1959). Em 1908, Bochenek descreveu em
coelhos uma coleção de fibras ópticas que ele chamou de “fascículo acessório anterior” do
qual se originou o nome atual “sistema ótico acessório”, proposto por Hayhow no final da
década de 50 (Hayhow, 1959). Segundo ele, o sistema era constituído de dois feixes de fibras
ópticas que se originam na retina contralateral, os fascículos ópticos medial e superior, e três
núcleos alvos do mesencéfalo: Núcleo terminal dorsal (NTD), o núcleo terminal lateral (NTL)
e o núcleo terminal medial (NTM) (Hayhow et al., 1960; Giolli, 1961, 1963; Simpson, 1984;
19
Cooper e Magnin, 1986; kaas e Huerta, 1988). Os neurônios encontrados imersos nas fibras
posteriores do fascículo superior foram posteriormente agrupados sob a denominação de
núcleo intersticial do fascículo superior posterior (IFSP) (Giolli et al., 1984; Benassi et al.,
1989; Blanks et al., 1995), localizado mais rostralmente (Blanks et al., 1995), um quinto
grupo nuclear, o núcleo intersticial do fascículo superior, fibras mediais (IFSPm) foi
identificado em Macaca fascicularis por Cooper et al (1990) (Lui et al., 1995). Os neurônios
dos distintos núcleos parecem estar envolvidos com movimentos direcionais complementares
em algumas espécies: NTD, horizontal têmporo-nasal; NTL, vertical superior-inferior; NTM,
vertical inferior e superior (Cooper e Magnin, 1986). Esta organização é conservada através
dos mamíferos, incluindo os principais grupos primatas (Cooper e Magnin, 1986) e esses
núcleos são em geral de fácil delimitação nos mamíferos, mas o NTM embora bastante
evidente em roedores é, na maioria das vezes, muito difícil de delimitar em primatas (Cooper
e Magnin, 1986; Cooper et al., 1990).
Como resultado de estudos anatômicos e fisiológicos desenvolvidos principalmente a
partir da década de 50 e intensificados nas décadas de 70 e 80, sabe-se que as células
ganglionares da retina fornecem uma importante entrada para estes núcleos e, do ponto de
vista funcional eles contribuem fundamentalmente para a estabilização da imagem,
participando da atividade visuomotora onde todas as células do sistema respondem a
movimentos lentos dos olhos e a estímulos visuais, o que é importante para o próprio
funcionamento dos outros sistemas visuais. Portanto, pode-se dizer que apesar do nome, o
SOA pode ser considerado parte do sistema visual primário (Simpson, 1984), no que diz
respeito ao seu funcionamento.
O NTM se localiza no tegmento mesencefálico, medialmente ao pedúnculo cerebral
sobre o nível imediatamente rostral à saída do nervo oculomotor (Weber e Giolli, 1986), e tem
como principal referência em primatas ser exatamente medial ao NTL. A projeção da retina
para o NTM é geralmente contralateral e esparsa em primatas, sendo bastante densa em
roedores (Itaya e Van Hoesen, 1983), como no caso de um estudo com esquilos terrestres da
Califórnia (Spermophilus beecheyi) onde foi demonstrado que o NTM é densamente e
completamente inervado por fibras da retina contralateral e recebe uma escassa e difusa
inervação ipsilateral (Major et al., 2003). O NTL fica entre o braço do colículo inferior e o
núcleo geniculado medial, ao aspecto ventromedial, sobre a junção mesodiencefálica (ver
Kaas e Huerta, 1988). Lin e Giolli (1979) mostraram que o NTL recebe uma projeção
retiniana bilateral com predominância contralateral, mesmo mostrando um componente
20
ipsolateral significativo. O NTD de primatas se localiza lateralmente ao teto do mesencéfalo,
caudalmente ao núcleo geniculado medial e ventrolateralmente ao braço do colículo superior
(ver Kaas e Huerta, 1988), recebe uma inervação retiniana basicamente contralateral, mas em
Rhesus (Lin e Giolli, 1979) este núcleo recebe tanto projeção contralateral como um pequeno
componente ipsolateral, destacando, dessa forma, um padrão muito semelhante ao encontrado
no sagüi (Cavalcante, 2002).
O fascículo inferior do trato óptico acessório é formado por um grupo de fibras
provenientes da retina que vêm através do nervo ótico, cruzam posteriormente no quiasma
óptico, são deslocadas medialmente a partir do trato óptico principal pelas fibras que
compõem as comissuras supraópticas de Gudden e Meynert. Na borda medial do pedúnculo
cerebral, as fibras do fascículo inferior divergem do curso do trato óptico principal e
prosseguem posteriormente, algumas fibras passando através das regiões hipotalâmica lateral
e subtalâmica adjacentes, enquanto outras permanecem em relação à borda medial do
pedúnculo cerebral, para terminarem no NTM, um núcleo proeminente no tegmento
mesencefálico ventral. Este núcleo é limitado lateralmente pelo pedúnculo cerebral e a
substância negra, e medialmente pelo pedúnculo mamilar e o lemnisco medial. Enquanto isso,
o fascículo superior é formado por um grupo de fibras ópticas que se destacam da margem
posterior do trato óptico e margem ventral do braço do colículo superior para caminhar
suficientemente através do pedúnculo cerebral para sua borda medial e finalmente para o
NTM. O fascículo superior foi dividido formalmente em três componentes de fibras
denominadas anterior, médio e posterior (Hayhow, 1966). As fibras anteriores partem da
margem ventroposterior do trato óptico principal, anteriormente a um ponto onde esta linha de
separação coloca-o em estreita relação com o corpo geniculado lateral. Essas fibras caminham
superficialmente em direção posteromedial para a borda medial do pedúnculo cerebral e então
prosseguem posteriormente para atingirem o NTM ventralmente. As fibras médias do
fascículo superior deixam o trato óptico principal no ponto relacionado ao corpo geniculado
lateral, ventroposteriormente. Elas descem superficialmente, através da superfície
anterolateral do corpo geniculado medial e algumas delas provenientes enviam para o NTL,
que forma uma proeminência imediatamente ventral ao corpo geniculado medial, justaposto à
base dorsolateral do pedúnculo cerebral. Outras fibras prosseguem pela superfície do
pedúnculo cerebral para o NTM. As fibras posteriores do fascículo superior originam-se em
grande parte da margem ventrolateral do braço do colículo superior, algumas fazendo sinapses
no NTD, localizado no sulco entre a borda ventral do braço do colículo superior e a borda
21
dorsoposterior do corpo geniculado medial. Outras fibras prosseguem mais adiante,
relacionando-se ventralmente com a superfície posterolateral do corpo geniculado medial,
atingindo o NTL e o NTM. Alguns neurônios também estão situados fora destes núcleos, ou
seja, dentro de fibras posteriores do fascículo superior (Hayhow et al., 1960; Simpson, 1984).
Estudos pioneiros com técnicas de degeneração e mesmo autorradiografia, mostravam
um SOA incompleto em primatas, uma vez que, embora apresentando um NTL proeminente e
um NTD, não se evidenciava uma projeção direta da retina para a região tegmentar ventral,
onde o NTM é habitualmente encontrado em outros mamíferos (Giolli, 1963; Campos-Ortega
e Gleis, 1967; Campos-Ortega e Cluver, 1968; Campbel, 1969; Hendrickson et al., 1970;
Tigges e O’Steen, 1974; Tigges et al., 1977; Lin e Giolli, 1979). Mais uma vez, o
aperfeiçoamento das técnicas de traçador neural veio permitir o delineamento completo desse
sistema em primatas. Assim, com HRP intraocular, fibras retinofugais marcadas, ainda que
raras, puderam ser traçadas para uma pequena área contralateral entre a parte mais caudal do
corpo mamilar e a borda medial do pedúnculo cerebral de um macaco do Velho Mundo,
sugerindo a presença de uma divisão ventral do NTM (Terubayashi e Fujisawa, 1988). Além
disso, foram descritas projeções retinianas para um grupo de neurônios na formação reticular
mesencefálica, considerados o homólogo da divisão dorsal do NTM (Weber e Giolli, 1986;
Cooper e Magnin, 1986; 1987; Cooper et al., 1990). As projeções retinianas no macaco
japonês (Macaca fuscata) foram revisadas com a subunidade B da toxina colérica (CTb), a
projeção retiniana permitiu delinear as divisões dorsal e ventral do NTM (Nakagawa et al.,
1998). Blanks et al. 1995 consideram a existência no cérebro do sagüi (Callithrix jacchus), o
NTD, NTL, NTM e o IFSP, o que é corroborado por Cavalcante, 2002.
Em aves, anfíbios e répteis o SOA consiste de um único fascículo, que se separa do
trato óptico principal imediatamente após o cruzamento no quiasma óptico, e um único núcleo
terminal localizado à margem ventral do tegmento mesencefálico, ligeiramente rostral à saída
do nervo oculomotor (III par). Este fascículo e seu núcleo terminal receberam muitos nomes,
mas os nomes mais amplamente aceitos são raiz óptica basal (ROB) para o fascículo e núcleo
da raiz óptica basal (NROB) para o núcleo. Em pássaros, o ROB parte dorsal, os quais juntos
compõem o complexo ROB (Brecha et al, 1980; Simpson, 1984). Também em peixes o SOA
foi delineado com o método autorradiográfico, constatando-se evidentes diferenças
interespecíficas com respeito a local, tamanho e número dos núcleos presumidos do SOA
(Simpson, 1984).
22
1.1.2. Colículo superior
O CoS é uma importante estação visual subcortical. Em mamíferos, o CoS forma a
metade rostral do teto do mesencéfalo e aparece como uma saliência de cada lado da linha
média, abaixo da parte posterior do córtex cerebral (Parent, 1996). Em outros vertebrados, a
estrutura equivalente é conhecida como teto óptico. Devido a extensa evolução do neocórtex
em mamíferos, acredita-se que o teto óptico das aves retém um papel ainda mais efetivo na
integração sensório-motora do que o CoS de mamíferos (Shimizu e Karten, 1993). O CoS é
formado na maioria dos mamíferos por sete camadas, classificadas do sentido da periferia
para a substância cinzenta periaquedutal em superficiais, intermediárias e profundas, Segundo
Huerta e Harting (1984), as superficiais vão da I a III, as intermediárias são as camadas IV e
V e profundas VI e VII (ver Kaas e Huerta, 1988), porém, alguns autores costumam
classificar as intermediárias junto com as superficiais (Parent, 1996). Em primatas, fibras da
retina se projetam bilateralmente para as camadas superficiais do CoS, através do braço do
CoS. Fibras oriundas do córtex visual primário também chegam às suas camadas superficiais.
Pelas suas camadas profundas, o CoS recebe fibras de uma variedade de regiões, tais como
medula espinal, colículo inferior, tegmento mesencefálico, pars reticulata da substância
negra, substância cinzenta central e quase toda a extensão do neocórtex, incluindo as áreas
sômato-sensoriais, motoras e pré-motoras, e campo ocular frontal. Sua principal via de saída é
o trato teto-espinal, através do qual indiretamente alcança os neurônios motores dos músculos
extra-oculares e os músculos axiais do pescoço. O CoS tem saída também para a porção mais
anterior do núcleo pulvinar, que por sua vez se projeta para o córtex (Benevento e Fallon,
1975; Partlow et al., 1977; Benevento e Standage, 1983; Kaas e Huerta, 1988).
Estudos realizados em sagüi demonstraram uma densa inervação da retina sobre as
camadas mais superficiais do CoS (Cavalcante, 2002), assim como demonstrado
anteriormente em outros primatas (ver Kaas e Huerta, 1988) e em outros vertebrados (Itaya e
Van Hoesen, 1982; Paloff et al., 1985).
Assim, pelas suas conexões, o CoS tem um papel importante no controle dos
movimentos dos olhos e da cabeça em resposta não somente a estímulos visuais, mas a
estímulos multissensoriais, particularmente pelos impulsos que envia para a parte cervical da
medula espinal por meio do trato teto-espinal, com a finalidade de fazer girar a cabeça, e para
o “centro de fixação do olhar” da formação reticular paramediana da ponte, com a finalidade
de controlar os movimentos sacádicos do olho (Kaas e Huerta, 1988). Um estudo de lesão no
23
pré-tecto e CoS mostrou que essas duas áreas medeiam o efeito direto da luz sobre o sono
(Miller et al., 1998).
1.1.3. Complexo pré-tectal
Baseado em estudos em mamíferos não primatas e vertebrados não mamíferos, certas
estruturas mesencefálicas visuais estão implicadas na detecção do movimento no campo
visual e a geração do movimento ocular.
O complexo pré-tectal compreende um conjunto de núcleos situados na transição
mesodiencefálica, funcionalmente relacionado com a via do reflexo pupilar a luz e o nistagmo
optocinético (Hutchins e Weber, 1985). Este complexo foi estudado anatomicamente em um
primata do Novo Mundo, o macaco-de-cheiro (Saimiri scilereus) (Weber, 1985), no qual
foram definidos cinco núcleos: pré-tectal anterior (NPA), pré-tectal posterior (NPP), pré-tectal
medial (NPM), pré-tectal olivar (NPO) e o núcleo do trato óptico (NTO), sendo todos
recipientes de projeção retiniana (Hutchins e Weber, 1985). Esta organização geral do pré-
tectal é similar aos relatados em outras espécies, incluindo camudongo (Pak et al., 1987), rato
(Scalia e Arango, 1979), furão (Zhang e Hoffmann, 1993), gato (Kaneseki e Sprague, 1974), e
humanos (Borostyankoi-Baldauf e Herczeg, 2002). Alguns autores consideram esta zona
medial como sendo parte do NTO e, no mapeamento, o NTO é uma fina faixa interposta entre
o aspecto ventromedial do NPO e o aspecto dorsomedial do NPP, em primatas (Lui et al.,
1995). Estudos de lesão em Macaca fascicularis sugerem que o NTO do complexo pré-tectal
participa da via do nistagmo optocinético horizontal (Kato et al., 1986), considerando o NTO
como sendo uma estrutura fundamental para manter a estabilidade do olhar durante o
movimento da cabeça (Yakushin et al., 2000). Estudos demonstraram que o NPA pode estar
associado com o sistema somatossensorial, tendo sido implicado no processamento da
informação de dor (Rees e Roberts, 1987; 1993; Rees et al., 1995). Além disso, estudos
pioneiros indicaram a presença de uma entrada retiniana apenas esparsa para uma porção
restrita do NPA em roedores (Hayhow et al., 1962; Scalia e Arango, 1979), embora modestas
projeções retino-NPA tenham sido referidas em outros mamíferos, como gatos (Weber e
Hutchins, 1982; Willians e Chalupa, 1983; Hutchins, 1991); e coelhos (Giolli e Guthrie, 1969;
Takahashi et al., 1977). O NPM, por sua vez, parece estar envolvidos em processamento de
informação relacionada a modalidades auditivas (Kudo et al., 1983) e visuais (Itaya, 1980;
Itaya e Itaya, 1985).
24
Além da projeção retiniana, outra importante aferência para o complexo pré-tectal,
porém, é a das camadas superficiais do CoS, que se projetam densamente para o NTO e NPP
e esparsamente para o NPA (Harting et al., 1980). As camadas profundas do CoS enviam uma
moderada projeção para o NPM. A maioria das aferências corticais para o complexo pré-tectal
incidem sobre o NPA, NPP e NTO e são provenientes das áreas visuais (Graham et al., 1979).
As conexões eferentes do complexo pré-tectal têm sido pouco estudadas. Sabe-se que
o NPO projeta-se para o complexo de Edinger-Westphal (EW), do qual neurônios pré-
ganglionares parassimpáticos inervam o gânglio ciliar do olho, fornecendo dessa forma o
substrato anatômico para o reflexo pupilar a luz (Clarke et al., 2003), ou seja, a via de
mediação da constrição da pupila é executado através do núcleo EW e do gânglio ciliar
(Klooster et al., 1993). O NPO também se projeta para o NPO contralateral, o pulvinar medial
e os núcleos do sistema óptico acessório (Carpenter e Pierson, 1973), e inerva o núcleo da
comissura posterior e os pré-tectais anterior e posterior. O NTO, NPA e NPP mandam fibras
para o núcleo da comissura posterior, os núcleos pulvinar inferior e medial, núcleo pré-
geniculado e o núcleo geniculado lateral dorsal em Macaque monkeys (Carpenter e Pierson,
1973).
Assim, junto com o NTO, o NPO é o núcleo pré-tectal mais intensamente estudado por
sua contribuição essencial ao reflexo pupilar a luz (Gaillard et al., 2013).
Dados de Benevento e Standage (1983) revelam que o complexo pré-tectal também
inerva o pulvinar lateral e que no complexo pulvinar as áreas que recebem aferências do
colículo superior também recebem aferências pré-tectais. Os núcleos pré-tectais também
inervam núcleos relés pré-cerebelares, como o núcleo reticular lateral, zona incerta e núcleos
intralaminares do tálamo (Weber e Harting, 1980). Uma descrição em ratos de uma projeção
dos núcleos NPO e NPP para o núcleo supraquiasmático (Mikelsen e Vrang, 1994) sugere que
esses núcleos também possam desempenhar um papel no sistema de temporização circadiana.
25
1.2. Sagui (Callithrix jacchus): O modelo experimental
Figura 1- Callithrix jacchus
O sagüi (Callithrix jacchus), um macaco do Novo Mundo, é um primata do gênero
Callithrix pertencente ao filo Chordata, classe Mammalia, superordem Archonta, ordem
Primates, família Callithricidae e subfamília Callitrichinae.
É um primata neotropical, e sua ocorrência é nos estados brasileiros do Maranhão,
Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, norte e litoral da
Bahia, até o Recôncavo Baiano (Vivo, 1991). A distribuição da espécie Callithrix jacchus
abrange dois domínios morfoclimáticos, o das caatingas e o das florestas pluviais atlânticas,
bem como a área de transição entre ambos (nomenclatura segundo Ab’Saber, 1977).
É um animal de pequeno porte, medindo cerca de 30 cm de corpo e mais 17 cm de
cauda, o que confere equilíbrio ao animal. O seu peso varia entre 230 a 420g. Como
características diagnósticas da espécie apresentam tufos circum-auriculares brancos, mancha
branca mediana presente na testa; manto distinto estendendo-se até os ombros, terço posterior
do dorso apresentando padrão estriado de coloração; ventre castanho escuro agrisalhado;
cauda anelada, anéis cinza-claro estreitos e anéis negros-agrisalhados mais largos (Vivo,
1991). Costumam se alimentar de frutos, pequenos insetos, ovos de aves, aranhas, pequenos
répteis, brotos de folhas, sementes e da goma de árvores.
Os sagüis apresentam o hábito diurno. São territoriais e demarcam seus territórios
utilizando substâncias odoríferas produzidas por órgãos especializados, as glândulas cutâneas
de cheiro, e a urina em alguns processos (Alonso, 1984). Os primatas em geral são animais de
26
orientação essencialmente visual, apresentando um sistema visual bem desenvolvido. São
animais sociais, formando pequenos grupos familiares (Erkert et al., 1986; Erkert, 2008) e são
facilmente adaptáveis à vida em cativeiro (Menezes et al., 1993).
Entre os primatas, os macacos da família Callithrichidae exibem uma alta taxa
reprodutiva. O período gestacional é de aproximadamente 5 meses, com 1 a 3 filhotes por
parto. O nascimento de gêmeos é normal em cativeiro e no ambiente selvagem e as fêmeas
são capazes de conceber uma nova cria de 10 a 30 dias após o parto. A maturidade sexual é
alcançada em torno de 18 meses, e a média de vida em cativeiro é em cerca de 13 anos
(McNeilly et al., 1981; Ziegler et al., 1990; Chandolia et al., 2006; Nishijima et al., 2012).
Nessa espécie, embora não ocorram diferenças morfológicas entre os sexos, são encontradas
diferenças expressivas de estratégia reprodutiva entre machos e fêmeas (Abbot et al., 1998;
Saltzman et al., 1997a, 1997b, Silva e Souza, 1997).
Apesar dos avanços nas técnicas não invasivas para estudo do cérebro humano vivo,
estudos com animais ainda são necessários para a abordagem e compreensão do sistema
nervoso (Solomon e Rosa, 2014). Assim, esta espécie é um sujeito experimental interessante
como modelo para a visão primata por apresentar uma boa acuidade visual (capacidade de
discriminar detalhes espaciais, perceber forma e contorno dos objetos), talvez esta seja a
característica mais marcante da visão primata (Mitchell e Leopold, 2015), são dicromatas, e
tanto a retina como a via visual subcortical são muito semelhantes aos dos macacos do Velho
Mundo e humanos. E também devido ao seu tamanho pequeno, reprodução rápida e pronta
disponibilidade (Spartz, 1978; Krubitzer e Kaas, 1990; Dick et al., 1991; Williams et al.,
1992; Troilo et al., 1993; Ghosh et al., 1996). Além disso, as áreas corticais e sub-corticais
que controlam os movimentos dos olhos têm sido identificados no sagui (Mitchell e Leopold,
2015), fator de bastante relevância para este trabalho. Além do interesse crescente no sagui
como uma espécie modelo para complementar o macaco Rhesus e o rato de laboratório (Mus
musculus), que são comumente usados para estudar os circuitos neurais que apoiam a visão
humana.
O ancestral comum mais recente dos seres humanos com o sagui viveu
aproximadamente 35-40 milhões de anos atrás, antes do nosso antepassado mais recente com
o macaco (25-30 milhões de anos atrás) e muito tempo depois de seu antepassado mais
recente com o rato (80-90 milhões de anos atrás) (Janecka et al., 2007; Springer et al., 2011).
Assim, de um ponto de vista puramente filogenético, o sagui oferece um ponto intermédio da
comparação entre as duas espécies (Mitchell e Leopold, 2015). Para neurociência visual, o
27
sagui também oferece uma série de vantagens experimentais distintas sobre cada um desses
sistemas-modelo, e aponta para áreas onde um este modelo animal promete lançar uma nova
luz sobre os mecanismos de cognição visual no cérebro humano (Mitchell e Leopold, 2015).
A neurociência visual tem se beneficiado com décadas de estudos comparativos, como
a paralaxe (alteração, mudança, diferenças) proporcionada pelo estudo de várias espécies
ajudando a identificar traços que são características fundamentais do cérebro de mamíferos e
outras características que são únicas para os primatas, incluindo humanos (Mitchell e
Leopold, 2015).
28
2. JUSTIFICATIVA
Considerando a visão uma forma de sensibilidade fundamental para a adaptação dos
primatas ao meio ambiente é importante que se conheça os aspectos envolvidos no
processamento dessa informação visual. Em estudos prévios para a dissertação de mestrado
foi realizada a identificação da projeção retiniana, caracterização citoarquitetônica e
neuroquímica da principal estação visual primária, o núcleo geniculado lateral dorsal,
estrutura envolvida na formação da imagem. Além desta estação visual primária para a
formação de imagem, é fundamental que se faça um mapeamento mais detalhado das
projeções retinianas que incidem sobre aquelas estações subcorticais envolvidas nos
movimentos oculares ou “sistema óptico motor”, ou seja, sobre o sistema óptico acessório, o
colículo superior, e os núcleos do complexo pré-tectal, buscando principalmente, no caso do
complexo pré-tectal, uma melhor delimitação dessas estruturas. Servindo como base para
trabalhos futuros em que se deve fazer uma identificação neuroquímica dessas estruturas. Essa
caracterização pode nos fornecer aspectos morfológicos importantes para a função visual.
A proximidade filogenética entre o ser humano e os primatas não humanos, nos
proporciona estudos comparativos entre estas espécies. O sagui como um primata do Novo
Mundo, de pequeno porte e encontrado abundantemente em nossa região, é bastante utilizado
em estudos morfológicos e adquiriu um status importante em pesquisas biomédicas em
diversas partes do mundo, em especial, aquelas relacionadas com o aspecto visual por
apresentar uma boa acuidade visual e, tanto a retina como a via visual subcortical são muito
semelhantes aos dos macacos do Velho Mundo e humanos. Portanto ele representa um sujeito
experimental interessante para o nosso estudo.
29
3. OBJETIVOS
3.1 – Objetivo geral:
Fazer um mapeamento das projeções retinianas que incidem sobre o sistema óptico
acessório, o colículo superior, e os núcleos do complexo pré-tectal, buscando
principalmente, no caso do complexo pré-tectal, uma melhor delimitação dessas
estruturas.
3.2 – Objetivos específicos
Mapear a projeção retiniana para os núcleos que formam o sistema óptico acessório
através da injeção intraocular unilateral da subunidade b da toxina colérica, e revelar
as fibras/terminais coradas com esta substância, através da técnica de
imunoistoquímica.
Mapear a projeção retiniana para as camadas superficiais do colículo superior através
da injeção intraocular unilateral da subunidade b da toxina colérica, e revelar as
fibras/terminais coradas com esta substância, através da técnica de imunoistoquímica.
Mapear a projeção retiniana para os núcleos que formam o complexo pré-tectal
através da injeção intraocular unilateral da subunidade b da toxina colérica, e revelar
as fibras/terminais corados com esta substância através da técnica de
imunoistoquímica.
Caracterizar (medir área e diâmetro) os botões sinápticos presentes nas
fibras/terminais imunorreativos a subunidade b da toxina colérica que inervam os
núcleos do complexo pré-tectal, considerando que os núcleos que formam este
complexo são de difícil delimitação.
30
4. METODOLOGIA
Foram utilizados três sagüis adultos jovens machos, pesando entre 230-390g, em boas
condições de saúde. Todos provenientes do Núcleo de primatologia da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte. Neste local, os animais foram mantidos em gaiolas de alvenaria e
tela de arame, medindo 2,0 x 1,0 x 2,0m, estando expostos a condições de temperatura,
umidade e iluminação naturais, com alimentação e água continuamente a disposição. Todos
os cuidados foram tomados durante o manuseio dos animais, buscando sempre seu bem-estar,
assim como minimizar ao máximo qualquer possível estresse e/ou sofrimento, recebendo
também acompanhamento de um médico veterinário durante todos os procedimentos.
Importante inferir que esses animais também foram utilizados em outros projetos realizados
no laboratório de Neuroanatomia da UFRN. Os procedimentos experimentais seguiram
estritamente as normas estipuladas através da Lei Arouca (Lei nº 11,798) que regulamenta o
uso de animais para a pesquisa cientifica. Todos os experimentos foram aprovados pelo
Comitê de Ética em uso de animais da UFRN (CEUA-UFRN nº 001/2012).
4.1. Injeção intraocular da subunidade b da toxina colérica.
A fim de investigar as projeções retinianas para os possíveis alvos do sistema motor
visual fizemos inicialmente um rastreamento anterógrado com a subunidade b da toxina
colérica (CTb). Esse traçador é captado pelo corpo neuronal e transportado via fluxo
axoplasmático aos terminais, não possuindo propriedade transináptica. Os animais
receberam como medicação pré-anestésica o cloridrato de tramadol e xilazina, ambos na
dose de 5mg/Kg administrados por via intramuscular. O tramadol é um opióide necessário
para potencializar o efeito da analgesia adequada ao procedimento, enquanto que a
xilazina é um relaxante muscular. Passados 15 minutos após o pré-anestesico, os animais
foram do Núcleo de Primatologia para a sala de procedimentos cirurgicos do laboratório
de Neuroanatomia, onde foram induzidos e mantidos em anestesia inalatória com
isoflurano e oxigênio 100% administrado através de máscara, até atingir o plano
anestésico. Evidenciado a completa anestesia do animal, eles foram submetidos a uma
injeção intra-ocular unilateral de 80 µl de uma solução aquosa do traçador neuronal
anterógrado, a CTb (CTb, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, CA) a 0,1%,
contendo dimetilsulfóxido a 10 % para aumentar a permeabilidade e consequentemente,
31
melhorar a captação dessa substância pelas células ganglionares da retina. A injeção foi
realizada no olho esquerdo, seguindo o protocolo do laboratório, utilizando-se uma agulha
calibre 30 (8,00mm x 0,3mm), lentamente, sob pressão, com auxilio de uma micro-bomba
propulsora, que impulsiona a solução num fluxo de 1µl/minuto. Essa agulha foi
introduzida na junção esclera-corneal, atingindo o corpo vítreo, em um ângulo de
aproximadamente 45º. Após o término do fluxo da solução, a agulha permaneceu no local
por mais 15 minutos, visando diminuir um possível refluxo da solução. Após a retirada da
agulha foi colocada terramicina, que é uma pomada oftálmica cicatrizante, no olho do
animal. Encerrado o procedimento da injeção intra-ocular, os animais retornaram à uma
gaiola da sala de recuperação do Núcleo de Primatologia, permanecendo em observação
pelo período de sobrevida de 5 dias, tempo ideal para o transporte do traçador, da retina
para toda a parte do sistema nervoso. Passado esse período de sobrevida os animais
passaram pelos procedimentos de perfusão e microtomia.
4.2. Perfusão transcardiaca.
Após um período de sobrevida de 5 dias, o animal foi novamente anestesiado seguindo
o mesmo procedimento do tópico anterior e em seguida colocado em decúbito dorsal sobre
uma grade numa capela de perfusão. A grade encontrava-se inclinada num ângulo de
aproximadamente 45 graus, para favorecer a fixação do tecido nervoso. Uma vez certificado
de que o animal estava profundamente anestesiado, iniciou-se o procedimento cirúrgico.
Com o auxilio de uma pinça de Allis o processo xifoide do animal foi preso
tracionando-o para cima, enquanto lhe foi seccionada a pele, partes moles e as costelas pelas
bordas inferiores do gradil costal, sendo a incisão prolongada pelas paredes laterais do tórax
até que o coração ficou exposto dentro da cavidade torácica. Uma agulha conectada a uma
bomba de perfusão foi introduzida no ventrículo esquerdo através do ápice do coração na
direção da aorta ascendente e posteriormente, realizando-se uma pequena incisão no átrio
direito, com a finalidade de escoar as soluções de perfusão, foi então ligada a bomba
peristáltica para a impulsão de 300ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH
7,4 com heparina (Liquemine, 2 ml/1000ml de solução salina) com o objetivo de lavar o
sistema circulatório do animal prevenindo a formação de coágulos e possibilitando a melhor
penetração do fixador nos tecidos. Em seguida foi introduzido 700ml de solução fixadora
(paraformaldeído a 4%, Vetec Química Fina) em duas velocidades. Na primeira metade, numa
32
velocidade de 90ml/min e na segunda metade a uma velocidade e de 25ml/min
aproximadamente, de modo que todo o fluxo de soluções durou em torno de 30 minutos.
4.3. Remoção do encéfalo e microtomia.
O encéfalo foi removido da cavidade craniana através da secção de tecidos moles e
ostectomia dos ossos da calota craniana, passadas pelo menos duas horas após a perfusão. em
seguida pós-fixados na mesma solução fixadora, acrescida de sacarose a 30% por 4 horas e
então colocados em outra solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 até
serem submetidos a microtomia.
Para a microtomia, o encéfalo foi congelado em gelo seco e seccionado em micrótomo
de deslizamento, obtendo-se secções coronais de 30µm, coletadas seriadamene em seis
compartimentos em um meio liquido contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Cada um desses
compartimentos teve uma das seis secções, de maneira que a distância entre uma secção e a
seguinte fosse de aproximadamente 180µm. Estes cortes ficaram armazenados em uma
solução anti-congelante contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
4.4. Imunoistoquímica.
A reação foi feita pelo método ABC (protocolo avidina-biotina complexo peroxidase;
ABC, kit Elite, Vector labs, Burlingame, CA, USA) para marcação simples com
imunoperoxidase. A concentração do anticorpo utilizado seguiu a especificação técnica do
fabricante. Nesta análise, anticorpo específico foi usado para identificar a expressão da
substância neuroativa, a CTb injetada, nos terminais.
O protocolo ABC utilizado seguiu as seguintes etapas:
1. Os cortes foram submetidos a cinco lavagens de cinco minutos cada, em
solução tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, em agitador orbital;
2. As secções foram pré-tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3% em
tampão fosfato por 20 minutos para inativação da peroxidase endógena.
Este pré-tratamento visa retirar o excesso de aldeídos e recuperar a
antigenicidade;
3. As secções foram colocadas em contato com o anticorpo específico
primário obtido em cabra (List Biological [1:1000]) diluído em tampão
33
fosfato contendo Triton-X 100 a (ICN Biomedicals) 0,4% e soro normal
(Sigma Chemical Company [1:50]) do animal em que foi obtido o
anticorpo secundário durante 18 a 24 horas (20ºC);
4. Em seguida, as secções foram colocadas em contato com o anticorpo
secundário biotinilado obtido em jumento (Jackson Immunoresearch
Laboratories; [1:1000]), diluído em Triton-X 100 a 0,4%, por 90 minutos;
5. Após esta etapa, incubamos os cortes em uma solução contendo avidina e
biotina previamente diluída (30 minutos antes) em Triton X-100 contendo
NaCl, por 90 minutos;
6. Para visualizar a reação, os cortes foram colocados em contato com um
cromógeno, a diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St Louis, MO, USA) a
2,5% diluída em tampão fosfato (0,1M / pH 7,4);
7. Entre cada uma das etapas foram realizadas cinco lavagens do tecido, de
cinco minutos cada, com tampão fosfato a 0,1 M e pH 7,4, em um agitador
orbital;
8. Os cortes foram montados em lâminas de vidro (Specimen) previamente
gelatinizadas com gelatina-alúmem-cromo (Vetec Química Fina) e postas
para secar a temperatura ambiente;
9. Após a secagem, as lâminas foram mergulhadas em uma solução de
tetróxido de ósmio a 0,05%, por 30 segundos, para intensificação da reação.
Posteriormente, as lâminas passaram pelo processo de desidratação em
álcoois (Cromato Produtos Químicos) de concentrações gradativamente
maiores (70, 90 e 100%), 5 minutos cada, e deslipidificados com xilol
(Cromato Produtos Químicos), mergulhados em dois recipientes por 5
minutos cada, em seguida foram cobertas com lamínulas usando-se DPX
(Aldrich Milwaukee, WI). Após montadas estavam prontas para serem
examinadas ao microscópio óptico.
34
4.5. Análise dos resultados
A avaliação do resultado imunoistoquímico foi realizada com o auxílio de um
microscópio óptico (Olympus, BX-41) utilizando campo claro. As imagens foram
digitalizadas utilizando uma câmera (Nikon, DXM-1200) acoplada ao microscópio e
conectada a um computador, sendo subsequentemente operacionalizadas para ajuste de brilho
e contraste com o programa Adobe Photoshop CS2.
4.6. Medição de área e perímetro celular
Dos animais que foram processados para CTb foram feitas imagens em objetivas de
10x e 20x, dos núcleos a serem trabalhados, do qual das imagens em objetiva de 20x foi
selecionada e recortada uma área, utilizando o programa Adobe Photoshop CS2, melhor
evidenciando o núcleo a ser trabalhado dos quais podíamos ver em detalhes os critérios
estabelecidos para a medição dos diâmetros de área e perímetro das células.
Após esse passo, as imagens passaram a ser trabalhadas utilizando o software Canvas
X para análise das fibras e terminais retinianos, onde foi possível medir parâmetros de área e
perímetro dos botões. Em cada foto, com aumento de 20x, foi realizada a medição de 80
células por núcleo e cada núcleo foi analisado com uma média total de 240 células medidas
(nº de casos x 80 células). Dessa forma, representamos com estatística descritiva a
distribuição desses dados não paramétricos por Box-plots do SOA, CoS e os núcleos do
complexo pré-tectal. Além disso, analisamos por kruskal-wallis, seguido do teste de post-hoc
de Dunn, possíveis diferenças significativas nesses parâmetros dos núcleos do complexo pré-
tectal. Os dados foram expressos como mediana (Q3-Q1).
35
5. RESULTADOS
Foram processados encéfalos de três animais, número que foi satisfatório para os
nossos propósitos, os quais foram retirados da cavidade craniana após perfusão transcardiaca,
submetidos à microtomia de congelação e os cortes submetidos à imunoistoquímica para
revelação da CTb injetada intraocularmente.
5.1. Sistema Óptico Acessório
O SOA apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais imunorreativos a CTb
(CTb-IR) em todos os seus núcleos, incluindo uma região que parece ser o NTM (Figura 2).
Os botões terminais apresentaram uma pequena variabilidade da forma nos dois núcleos do
SOA analisados conjuntamente, o IFSP (Figura 3) e o NTL (Figura 4), a maioria apresentou-
se de uma maneira ovalada, mas também foi possível observar muitos botões terminais
arredondados e poucos num modelo mais alongado. Presença de fibras, tanto curtas como
umas mais alongadas, algumas delas chegando a conter mais de um botão terminal. Os
valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões desses núcleos podem ser
vistos, em conjunto, na figura 5. A caracterização dos botões do NTD bem como os valores
descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões desse núcleo foram analisados em
conjunto com os núcleos do complexo pré-tectal.
5.2. Colículo Superior
O CoS apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais CTb-IR principalmente
em sua camada superficial (Figura 6). Os botões terminais apresentaram uma variabilidade da
forma nos casos estudados. Em sua grande maioria apresentaram-se em forma ovalada, mas
podendo-se também observar botões em formatos arredondados, alongadas e triangulares,
esses em menores números. Presença de fibras e estas podendo conter mais de um botão
(Figura 6). Os valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões desse núcleo
podem ser vistos na figura 7.
36
5.3. Complexo Pré-Tectal
O complexo pré-tectal apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais CTb-IR
principalmente nos núcleos: NTO, NPO, NPA, NPP (Figuras 8 e 13), incluindo o NTD do
SOA, analisado em conjunto com esse complexo. O NTO contralateral apresentou botões
arredondados e ovalado, havendo uma maior aglomeração dos mesmos; presença de fibras,
algumas delas podendo conter mais de um botão terminal em sua extensão (Figuras 8, 9 e 10).
O mesmo padrão foi seguido pelo NTO ipsolateral (Figura 13). Nesse núcleo, a mediana da
área dos botões terminais foi de 0,46 (0,56-0,38), enquanto a média do perímetro foi de 2,50
(2,76-2,22) (Figura 16). O NPO contralateral foi caracterizado pela presença de botões
terminais nas formas ovaladas e arredondadas, presença de fibras, algumas contendo mais de
um botão terminal em sua extensão (Figuras 8 e 10). O mesmo padrão foi seguido pelo NPO
ipsolateral (Figura 13), porém, com botões terminais um pouco mais agrupados, aglomerados.
Nesse núcleo, a mediana da área dos botões terminais foi de 0,47 (0,60-0,37), enquanto a
média do perímetro foi de 2,52 (2,83-2,28) (Figura 16). O NPP, tanto o contralateral como o
ipsilateral, apresentaram botões terminais arredondados, mas em sua grande maioria
apresentaram-se na forma ovalada, botões espaçados, sem aglomeração, presença de fibras,
algumas contendo mais de um botão terminal em sua extensão (Figura 11). Nesse núcleo, a
mediana da área dos botões terminais foi de 0,54 (0,67-0,43), enquanto a média do perímetro
foi de 2,71 (3,03-2,43) (Figura 16). O NPA, tanto o contralateral como o ipsilateral, foram
caracterizados por botões terminais nas formas arredondadas e ovaladas, presença de fibras,
algumas delas contendo mais de um botão em sua extensão, a apresentando-se em uma forma
mais espaçada (Figura 14). Nesse núcleo, a mediana da área dos botões terminais foi de 0,46
(0,59-0,37), enquanto a média do perímetro foi de 2,50 (2,83-2,24) (Figura 16). O NTD
contralateral foi caracterizado com a presença de fibras, algumas delas podendo conter mais
de um botão terminal em sua extensão (Figura 12). Os botões apareceram nas formas
arredondadas e ovaladas. Esse mesmo padrão foi seguido pelo NTD ipsolateral. (Figura 13 e
15). Nesse núcleo, a mediana da área dos botões terminais foi de 0,46 (0,60-0,36), enquanto a
média do perímetro foi de 2,49 (2,84-2,23) (Figura 16). A análise por kruskal-wallis mostra
que há diferença significativa das medianas tanto no parâmetro de área (H=40,25; p=0,0001)
quanto de perímetro dos botões (H=43,11; p=0,0001). O teste post-hoc para comparações
múltiplas revela que essas diferenças se dão na comparação do NPP com os demais núcleos
(Figura 17)
37
Figura 2 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade contra subunidade b da toxina colérica nos núcleos: intersticial
do fascículo superior posterior (A), núcleo terminal lateral (B) e núcleo terminal medial (B’).
IFSP, núcleo intersticial do fascículo superior posterior; NTL, núcleo terminal lateral; NTM,
núcleo terminal medial. Barra: 300 µm em A e B’; 200 µm em B; 100 µm em C.
IFSP
A B
NTL
C
NTM
B’ TM
38
Figura 3 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade contra subunidade b da toxina colérica no núcleo intersticial do
fascículo superior posterior (A, B e C). Em detalhe a área que foi submetida a medição dos
diâmetros de área e perímetro das células neurais (botões) do núcleo intersticial do fascículo
superior posterior (B). C representa a caixa delimitada em B. D mostra os botões após serem
trabalhados no Software Canvas X. IFSP, núcleo intersticial do fascículo superior posterior;
GLD, núcleo geniculado lateral dorsal. Barra: 300 µm em A; 100 µm em B; 100 µm em C.
D
B
IFSP
C
IFSP
IFSP
A
39
Figura 4 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade contra subunidade b da toxina colérica no núcleo terminal
lateral (A, B e C). Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e
perímetro das células neurais (botões) do núcleo terminal lateral (B). C representa a caixa
delimitada em B. D mostra os botões após serem trabalhados no software Canvas X. NTL,
núcleo terminal lateral; GLD, núcleo geniculado lateral dorsal. Barra: 300 µm em A; 100 µm
em B; 100 µm em C.
C
NTL
B
NTL
A
NTL
GLD
D
40
Figura 5 – Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões do núcleo
intersticial do fascículo superior posterior e do núcleo terminal lateral do sistema óptico
acessório (A). Medição da área e perímetro dos botões do núcleo intersticial do fascículo
superior posterior e do núcleo terminal lateral do sistema óptico acessório (B).
A
B
41
Figura 6 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade contra a subunidade b da toxina colérica no colículo superior (A
e A’). Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro das
células neurais (botões) do colículo superior (B). C representa a caixa delimitada em B. D
mostra os botões após serem trabalhados no software Canvas X. Aq, aqueduto mesencefálico;
CoI, colículo inferior; CoS, colículo superior; PAG, substância cinzenta pariarquedutal. Barra:
300 µm em A; 200 µm em A’; 100 µm em B; 100 µm em C.
A’
CoS
A
Aq
CoS
CoI
PAG
B C
D
42
Figura 7 – Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões do colículo
superior (A). Medição da área e perímetro dos botões do colículo superior (B).
A
B
43
Figura 8 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade contra a subunidade b da toxina colérica nos núcleos: núcleo do
trato óptico, núcleo pré-tectal olivar, núcleo pré-tectal posterior, do complexo pré-tectal,
núcleo terminal dorsal, do sistema óptico acessório (A’). Em detalhe a área que foi submetida
a medição dos diâmetros de área e perímetro das células neurais (botões) do núcleo do trato
óptico e núcleo pré-tectal olivar do complexo pré-tectal (B’). C’ representa a caixa delimitada
em B’. D’ mostra os botões do núcleo do trato óptico (A) e núcleo pré-tectal olivar (B) após
serem trabalhados no software Canvas X. NTO, núcleo do trato óptico; NPO, núcleo pré-
tectal olivar; NPP, núcleo pré-tectal posterior; NTD, núcleo terminal dorsal. Barra: 300 µm
em A’; 100 µm em B’; 100 µm em C’.
NPO
NTO
NTD
A’ NTO
NPO
B’
D’ A
B
C’
NTO
NPO
NPP
44
Figura 9 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro
das células neurais (botões) do núcleo do trato óptico (A). B representa a caixa delimitada em
A. C mostra os botões do núcleo do trato óptico após serem trabalhados no software Canvas
X. NTO, núcleo do trato óptico. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.
NTO
B
C
NTO
A
45
Figura 10 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro
das células neurais (botões) do núcleo do trato óptico e núcleo pré-tectal olivar (A’). B’
representa a caixa delimitada em A’. C’ mostra os botões do núcleo do trato óptico (A) e
núcleo pré-tectal olivar (B) após serem trabalhados no software Canvas X. NTO, núcleo trato
ótico; NPO, núcleo pré-tectal olivar. Barra: 100 µm em A’; 100 µm em B’.
C’
NTO
NPO
A’
A
B
NTO
NPO
B’
46
Figura 11 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro
das células neurais (botões) do núcleo do pré-tectal posterior (A). B representa a caixa
delimitada em A. C mostra os botões do núcleo pré-tectal posterior após serem trabalhados no
software Canvas X. NPP, núcleo pré-tectal posterior. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.
C
B
NPP
A
NPP
47
Figura 12 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro
das células neurais (botões) do núcleo terminal dorsal (A). B representa a caixa delimitada
em A. C mostra os botões do núcleo terminal dorsal após serem trabalhados no Software
Canvas X. NTO, núcleo do trato óptico. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.
NTD
B
C
NTD
A
48
Figura 13 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade contra a subunidade b da toxina colérica nos núcleos: núcleo do
trato óptico, núcleo pré-tectal olivar, núcleo pré-tectal anterior, núcleo pré-tectal posterior, do
complexo pré-tectal, núcleo terminal dorsal, do sistema óptico acessório (A’). Em detalhe a
área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro das células neurais
(botões) do núcleo do trato óptico e núcleo pré-tectal olivar do complexo pré-tectal (B’). C’
representa a caixa delimitada em B. D’ mostra os botões do núcleo do trato óptico (A) e
núcleo pré-tectal olivar (B) após serem trabalhados no Software Canvas X. NTO, núcleo do
trato óptico; NPO, núcleo pré-tectal olivar; NPA, núcleo pré-tectal anterior; NPP, núcleo pré-
tectal posterior; NTD, núcleo terminal dorsal. Barra: 300 µm em A’; 100 µm em B’; 100 µm
em C’.
NTO
NPO NPA
NTD
NTO
NPO
B’
A
B
A’
NPP
NTO
NPO
C’ D’
49
Figura 14 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro
das células neurais (botões) do núcleo pré-tectal anterior (A). B representa a caixa delimitada
em A. C mostra os botões do núcleo pré-tectal anterior após serem trabalhados no software
Canvas X. NPA, núcleo pré-tectal anterior. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.
A’
NPP
A B
C
NPA NPA
50
Figura 15 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro
das células neurais (botões) do núcleo terminal dorsal do sistema óptico acessório (A). B
representa a caixa delimitada em A. C mostra os botões do núcleo terminal dorsal após serem
trabalhados no software Canvas X. NTD, núcleo terminal dorsal. Barra: 100 µm em A; 100
µm em B.
NPA
A
NTD
B
NTD
A
C
51
Figura 16 – Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro (Per.) dos núcleos do
complexo pré-tectal em conjunto com o núcleo terminal dorsal do sistema óptico acessório.
NPO, núcleo pré-tectal olivar; NTO, núcleo do trato óptico; NPA, núcleo pré-tectal anterior;
NTD, núcleo terminal dorsal; NPP, núcleo pré-tectal dorsal.
NPO NTO NPA NTD NPP
Área
(µm²)
Per.
(µm)
Área
(µm²)
Per.
(µm)
Área
(µm²)
Per.
(µm)
Área
(µm²)
Per.
(µm)
Área
(µm²)
Per.
(µm)
Mínimo 0,1900 1,640 0,2100 1,700 0,1600 1,530 0,1400 1,440 0,2000 1,770
Quartil
1 0,3700 2,283 0,3800 2,270 0,3700 2,243 0,3600 2,223 0,4325 2,430
Mediana 0,4700 2,520 0,4650 2,500 0,4600 2,500 0,4600 2,490 0,5450 2,715
Quartil
3 0,6000 2,838 0,5675 2,760 0,5900 2,838 0,6000 2,840 0,6700 3,038
Máximo 1,250 4,250 1,600 4,980 1,220 3,990 2,860 6,120 1,850 5,050
52
Figura 17 – Medição da área e perímetro dos botões do complexo pré-tectal e do núcleo
terminal dorsal do sistema óptico acessório. A análise por Kruskal-wallis mostra que há
diferença significativa das medianas tanto no parâmetro de área (H=40,25; p=0,0001) quanto
de perímetro dos botões (H=43,11; p=0,0001). O teste post-hoc para comparações múltiplas
se dão na comparação do NPP com os demais núcleos.
53
6. DISCUSSÃO
Os estudos sobre projeções retinianas possibilita uma melhor visualização dos
terminais axonais e um pouco sobre seu trajeto. Algo fundamental para compreensão do
funcionamento de diversos sistemas que utilizam a informação visual (Rouiller e Welker,
2000). A CTb, a subunidade B da toxina colérica, que foi introduzida como um traçador
neuroanatômico por Stoeckel e colaboradores em 1977, é um traçador axonal, altamente
sensível, que atua tanto retrogradamente como anterogradamente (Angelucci et al, 1996;
Gaillard et al, 2013), revelando detalhes morfológicos de arborizações terminais aferentes,
além de identificar alguns novos alvos da retina (Mikkelsen, 1992; Reiner et al., 1996; Ling et
al., 1998; Derobert et al., 1999; Lima, 2008; Engelberth et al., 2008; Morais et al., 2014). Sua
utilização como traçador das vias retinianas tem sido amplamente empregada em diversos
animais, como pombo (Shimizu et al, 1994), primatas (Nakagawa et al, 1998; Costa et al,
1999; Mitrofanis et al, 2004; Cavalcante et al, 2005; Engelberth et al, 2008; Lima et al, 2012)
e roedores (Youngstrom et al., 1991; Abrahamson e Moore, 2001; Mitrofanis, 2005; Gaillard
et al, 2013). No mocó, um roedor pertencente à família caviidae, vários alvos retinianos já
foram detectados utilizando CTb, como o NSQ e FIG (Nascimento Jr et al, 2010a), núcleo
médio dorsal do tálamo (Sousa, 2013; Nascimento Jr et al, 2010b) e núcleo paraventricular do
tálamo (Nascimento Jr et al, 2008), trabalhos estes que comprovam a eficácia da CTb para
estudos de traçados axonais nesta espécie. Como também a CTb tem sido usada
frequentemente para demonstrar a morfologia da arborização retiniana no mesencéfalo de
animais adultos como em ratos (Mikkelsen, 1992), hamster (Johnson et al., 1988; Ling et al.,
1997a,b, 1998), Camudongo (Miura et al., 1997), furão (Angelucci et al., 1996) e macacos
(Nakagawa et al., 1998).
No contexto das características sobre como as informações aferentes chegam em seus
alvos, diversos estudos demonstraram que a morfologia das fibras axonais e dos terminais
sinápticos apresentam diferenças importantes, e que estas também refletem em variações
funcionais, sobre como as informações são transportadas e processadas (Sherman e Guillery,
2011).
A informação visual é segregada em modalidades como cor, forma e movimento a
nível da retina (Livingstone e Hubel, 1988). Células ganglionares da retina compreendem
mais de uma dúzia de variados tipos, estruturas e funções (Masland, 2001; Wässle, 2004), e
diversas modalidades são transmitidas paralelas à distintas zonas do cérebro pelos seus
54
axônios (Rodieck, 1998). E para o sucesso do processo virtual requer que a luz refletida por
objetos distantes seja localizada com relação ao individuo que vê e ao ambiente que o cerca;
que ocorra algum tipo de identificação dos objetos com base em seus tamanhos, formas, cores
e na experiência prévia, que os movimentos dos objetos sejam detectados e, por fim, que o
reconhecimento dos objetos seja possível em toda a gama de condições de iluminação
normalmente experimentada pelo individuo em seu habitat. (Bear et al., 2008). Desta forma,
podemos afirmar que a visão é um processo ativo no qual movemos nossos olhos para
explorar o mundo. E os movimentos oculares apresenta um problema complexo para a
percepção: ocorrem cerca de três vezes por segundo e com cada movimento do olho uma nova
imagem inside sobre a retina. Mesmo assim, percebe-se um mundo visual estável. O
remapeamento da informação visual é um mecanismo neural que pode contribuir para a
estabilidade visual (para revisão, ver Berman e Colby, 2009)
As projeções retinianas também são importantes por enviarem informações para
estruturas do sistema de temporização circadiana, responsável pela geração e modulação dos
ritmos circadianos. Como já citado anteriormente, este sistema é composto por osciladores,
vias de entrada sincronizadoras e vias para efetores comportamentais (Rusak e Zucker, 1979;
Meijer e Rietveld, 1989; Morin, 1994; Turek, 1994, Cavalcante et al., 2006).
A existência da principal via sincronizadora desde sistema, o trato retinohipotalâmico
(TRH), foi confirmada em estudos realizados em várias espécies de mamíferos, incluindo
primatas do Velho e do Novo Mundo (Hendricson et al., 1972; Moore e Lenn, 1972; Moore,
1973; 1993; Costa et al., 1999; Canteras et al., 2011).
Projeções ópticas adicionais para estruturas usualmente não consideradas como parte
do sistema visual também foram descritas em várias espécies de mamíferos, tais como, o
núcleo pericentral do colículo inferior em gatos, ratos e macaco Rhesus (Itaya e Van Hoesen,
1982; Paloff et al., 1985), núcleo ântero dorsal do tálamo no mussaranho das árvores (Conrad
e Stumpf, 1975), núcleos da rafe em gatos e ratos (Foote et al., 1978; Shen e Semba, 1994) e
até mesmo estruturas telencefálicas, tais como o tubérculo olfatório e núcleo da banda
diagonal de Broca, em hamster, ratos, coelhos, ouriços, preguiças, morcegos, tamanduás,
Spalax ehrenberghi e Macaca fascicularis (Cooper et al., 1989; Levine et al., 1991;
Youngstrom et al., 1991).
O significado funcional das projeções da retina em núcleos fora do núcleo geniculado
lateral, CoS, complexo pré-tectal, SOA e NSQ continua a ser estabelecido. Está provado que
estes alvos principais, citados acima, estão associado com o sistema “formador de imagem”,
55
vias visuomotoras e sistema “não-formador de imagem”. É improvável que pequenas entradas
da retina identificadas em algumas outras estruturas desempenhem um significativo papel na
formação de imagem (Matteau et al., 2003).
Em relação aos núcleos aqui estudados, detectamos a presença de fibras e terminais
CTb-IR nos núcleos: NTL, NTD, IFSP incluindo uma região que se supõe ser o NTM, todos
do SOA; camada superficial do CoS e os núcleos: NTO, NPO, NPA e NPP do complexo pré-
tectal. Esses núcleos são importantes centros de controle de uma variedade de movimentos
oculares (Lui et al., 1995). Demonstrando assim a importância que se conheça anatômica e
fisiologicamente essas estruturas. Muito interesse tem sido demonstrado na via neuro-
anatômica envolvendo o controle dos movimentos dos olhos (Clarke et al., 1987).
O presente estudo é um passo preliminar na investigação sobre os caminhos neurais
subservindo o movimento ocular em sagui (Callithrix jachus), primatas do Novo Mundo em
que a anatomia dos núcleos envolvidos é similar a de outros macacos (Reis e Machado, 1981).
Além disso, estudar as diferenças entre os botões é importante para entender a fisiologia da
integração multissensória – podendo ter propriedades fisiológicas distintas.
6.1. Sistema Óptico Acessório
Fluxo óptico é a principal fonte de informação sobre o auto movimento e a
composição tridimensional do ambiente durante a locomoção. É processado pelo SOA em
todos os vertebrados (Eckmeier e Bischof, 2008).
Em nossos resultados, o SOA apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais
CTb-IR em todos os seus núcleos, inclusive em uma região que acreditamos ser o NTM. Os
botões terminais apresentaram uma pequena variabilidade da forma de dois núcleos do SOA
analisados conjuntamente, o NTL e o IFSP, a maioria apresentou-se em uma maneira ovalada,
mas também foi possível observar muitos botões terminais arredondados e poucos num
formato mais alongado. Presença de fibras, tanto curtas como algumas mais alongadas,
algumas delas chegando a conter mais de um botão terminal por toda sua extensão.
O SOA de mamíferos acredita-se ser constituído de dois pequenos feixes de fibras
óticas, o fascículo inferior e superior do trato óptico acessório, e três núcleos retino-
recipientes no mesencéfalo anterior, o NTM, NTL, NTD (Hayhow, 1959; Hayhow et al.,
1960). O NTM está ainda dividido em setores dorsal (NTMd) e ventral (NTMv) baseado em
critérios citoarquitetonicos e conectividade de fibras nervosas (Hayhow et al., 1960; Giolli et
56
al., 1984). O NTM, o principal núcleo do SOA de roedor, tem sido descrito como uma
estrutura alongada localizada na porção ventral do tegmentum mesencéfalico, medial ao
pedúnculo cerebral e substancia nigra, caudal ao núcleo subtalâmico, lateral ao corpo mamilar
o ao núcleo interpeduncular e, especialmente no porquinho-da-india (Cavia porcellus), rostral
ao inicio do nervo oculomotor (Laatsch 1969). No entanto, em Macacos do Velho Mundo,
tem havido alguns relatos conflitantes sobre a presença e localização do NTM, enquanto que a
localização do NTL e NTD é bem caracterizada (Nakagawa et al., 1998). Em mamíferos, este
núcleo, tipicamente o mais conspícuos dos três núcleos terminal originalmente descrito por
Hayhow (1959 e 1966) e Hayhow et al (1960) foi considerado tanto vestigial ou ausente em
primatas (ver Weber, 1985). Cooper et al, 1990, Cooper e Magnin, 1986 e Lui et al.,1995
relataram que uma divisão ventral do NTM não foi observada no macaco, entretanto Itaya e
Van Hoesen, 1983 e Terubayashi e Fujisawa, 1988, apontaram que algumas fibras retinofugal
marcadas poderia ser traçada para uma pequena área contralateral localizada entre a parte
mais caudal do corpo mamilar e a borda medial do pedúnculo cerebelar do macaco do Velho
Mundo, o que sugere a presença de uma divisão ventral do NTM (Nakagawa et al., 1998).
Além disso, Cooper et al., 1990 e Cooper e Magnin, 1986;1987, descreveram a projeção
retiniana para um grupo de neurônios na formação reticular mesencefálica, que consideravam
ser homologo a divisão dorsal do NTM; Nakagawa et al., 1988, discordou dessa opinião
(Nakagawa et al., 1998). Devido a essa controvérsia, o grupo re-analisou a localização dos
terminais retinofugal no NTM do macaco japonês, Macaca fuscata, usando a CTb como
traçador anterógrado (Nakagawa et al., 1998). O estudo de Nakagawa et al., 1998 confirmou e
ampliou resultados anteriores sobre as projeções retinianas a divisão ventral e dorsal do NTM
do SOA em macacos do Velho Mundo (Nakagawa et al., 1998). A existência da via
retinofugal para a divisão ventral do NTM foi incerto em estudos anteriores sobre projeções
retinianas para Macacos do Velho Mundo (Giolli, 1963; Hendrickson et al., 1970; Lin e
Giolli, 1979; Weber e Giolli, 1986; Kaas e Huerta, 1988; Zhang e Hoffmann, 1993), com
exceção de três relatos positivos (Gillilan, 1941; Itaya e Van Hoesen, 1983; Terubayashi e
Fujisawa, 1988). Dois registros (Itaya e Van Hoesen, 1983; Terubayashi e Fujisawa, 1988)
confirmaram a conclusão de Gillilan (Gillilan, 1941), e indicou uma via retiniana para a
divisão ventral do NTM do “Macaco Monkey” com traçadores HRP (Horseradish peroxidase)
ou WGA-HRP (HRP conjugado com aglutinina de germe de trigo) (Nakagawa et al., 1998).
No entanto, Cooper et al, 1990 e Cooper e Magnin, 1986 relataram uma ausência da entrada
retiniana para a divisão ventral do NTM em macaco Rhesus após a injeção intraocular de
57
aminoácido radioativo (Nakagawa et al., 1998). Ao contrário dos registros em “macaco
Monkey” (Cooper et al., 1990; Cooper e Magnin, 1986), Nakagawa et al., 1998 demonstrou
em seus estudos a projeção retinofugal para a divisão ventral do NTM e a organização
citoarquitetonica destes núcleos no macaco japonês (Nakagawa et al., 1998). A localização
desses núcleos mostrado nesse estudo é similar as do esquilo, tupaia e macaco esquilo (ver
Simpson, 1984); esta região foi localizada perto da superfície ventral da região tegmental
apenas medial à borda do pedúnculo cerebral ao nível da parte caudal do corpo mamilar
(Nakagawa et al., 1998). Em nosso estudo não foi possível localizar com precisão o NTM,
apenas identificamos uma região que acreditamos ser o NTM. No entanto, seria preciso mais
estudos para essa confirmação.
O significado funcional desta estrutura visual permaneceu obscuro e praticamente
desconhecido para um longo período de tempo (Lui et al., 1990). Depois as hipóteses de que
estava envolvido na regulação dos ritmos circadiano e discriminação a sensibilidade luminosa
tinham sido avançadas (ver revisão por Simpson, 1984), o papel da NTM e seu homólogo em
não-mamíferos, o núcleo da ROB, na mediação da reflexo optocinético vertical foi descoberto
com base em estudos eletrofisiológicos e de lesão (Walley, 1967; Lazar, 1983; Fite et al.,
1979; Simpson et al., 1979; Grasse e Cynader, 1982; Clement e Magnin, 1984) e
posteriormente através de investigações metabólicas usando o método de autorradiografia d
14C-2-desoxiglucose (McKenna e Wallman, 1981,em pombos; Biral et al., 1987, em ratos;
Lui et al., 1987; Benassi et al., 1989, em porcos-da-índia).
Em nossos resultados podemos observar que a inervação para o SOA é bilateral, com
predominância contralateral, idêntico ao que foi encontrado em um estudo realizado no
Esquilo terrestre da Califórnia (Spermophilus beecheyi), que tem um SOA bem desenvolvido
(Major et al., 2003). Nesse trabalho também foi demonstrado que o hipotálamo, o SOA, o
pré-tecto, o complexo geniculado lateral, o pulvinar e o CoS todos recebem uma significativa
inervação contralateral e uma menor inervação ipsilateral (Major et al., 2003). A organização
do SOA é altamente conservada entre os vertebrados (Major et al., 2003). Um padrão similar
também foi encontrado no rato-da-relva do Nilo, onde mostrou que os principais núcleos
terminais do SOA contralateral para o olho injetado são substancialmente marcados e
nenhuma entrada ipsilateral foi encontrada no NTD e no IFSP (Gaillard et al, 2013). Lin e
Giolli (1979) mostraram que o NTL recebe uma projeção bilateral com predominância
contralateral, mesmo mostrando um componente ipsolateral significativo.
58
O SOA no mesencéfalo de mamíferos é uma importante estrutura subcortical e sugere-
se ser a primeira estação primária de retransmissão pós-retiniana na via de mediação do
reflexo optocinético vertical e horizontal, uma classe de compensação dos movimentos
oculares que serve ao proposito funcional de estabilização de imagens na retina durante o
auto-movimento e/ou do movimento em volta (Simpson, 1984). O SOA, portanto, é
necessário para uma boa acuidade visual (Westheimer e Mckee, 1975) e também para a
velocidade de discriminação (Nakayama, 1981), ou seja, os neurônios do SOA mostram
seletividade a velocidade e direção (Simpson et al., 1979) e respondem bem a objetos
brilhantes que se movem a velocidade lenta, e suas direções preferenciais correspondem
aproximadamente para cima, para baixo, ou temporo-nasal movimento no campo visual
(Simpson et al., 1979). Portanto os núcleos do SOA estão recebendo muita atenção
atualmente porque eles são importantes para o controle do olhar e interação visual – vestibular
(Simpson et al., 1988) .
Podemos chegar a conclusão que o SOA em primatas repete a organização básica do
SOA visto em espécies não-primatas com poucas modificações, ou seja, o NTL torna de
longe, o seu núcleo mais evidente (mais visível), enquanto o NTMd é nitidamente de tamanho
reduzido e o NTMv é praticamente ausente. (ver Simpson et al., 1988).
6.2. Colículo Superior
Há uma extensa literatura sobre a organização estrutural e funcional do colículo
superior em mamífero (Sprague et al., 1972; Goldberg e Robinson, 1978; Gordon, 1975). O
CoS é uma estrutura laminada que forma duas eminências achatadas localizadas no teto
rostral do mesencéfalo e que desempenha um papel importante integrando informações de
vários sistemas sensoriais (ou seja, visão, audição e somatossensação), bem como na geração
de sinais que resultam em movimentos dos olhos, orelhas, cabeça e do corpo (ver Stein e
Meredith, 1993), portanto, estudos comprovam que a manutenção da integridade do CoS é
essencial para manter no animal a capacidade de integrar sinais visuais e auditivos no controle
do comportamento de orientação (Burnett et al., 2004), constituindo assim um modelo de
estrutura favorável para os estudos de processos de transformação sensório-motora (Grantyn e
Grantyn, 1982). Em resumo, os sistemas auditivos e visuais inicialmente codificam a
informação espacial em quadros de referência distintos. No CoS, no entanto, ambas as
modalidades convergem para formar mapas topograficamente alinhados de espaço sensorial
59
(Stein e Meredith, 1993). Uma questão interessante refere-se ao processo pelo qual a visão
influencia o desenvolvimento do mapa auditivo. Animais privados de pistas visuais normais
durante a infância desenvolver representações auditivas anormais (Withington-Wray et al,
1990; Knudsen et al, 1991; Withington, 1992; King e Carlile, 1993). Em aves e répteis o teto
óptico é a estrutura homóloga ao CoS dos mamíferos e de modo geral constitui uma estação
primária das vias ópticas. Iniciando-se com os répteis, à medida que um número maior de
fibras provenientes da retina fazem uma conexão mais forte com o tálamo e
consequentemente com o córtex visual, o papel funcional do CoS na discriminação visual vai
diminuindo progressivamente (Parent, 1996). O CoS é formado na maioria dos mamíferos por
sete camadas, classificadas do sentido da periferia para a substância cinzenta periaquedutal
em superficiais, intermediárias e profundas. Segundo Huerta e Harting (1984), as superficiais
vão da I a III, as intermediárias são as camadas IV e V e profundas VI e VII (ver Kaas e
Huerta, 1988). Alguns autores costumam classificar as intermediárias junto com as
superficiais (Parent, 1996). Essa divisão é bastante interessante do ponto de vista funcional, já
que as camadas superficiais detêm função visual e as profundas são polimodais.
As células das camadas superficiais respondem a estímulos de movimentação no
campo visual (Sterling e Wickelgren, 1969), facilitando desta forma a orientação e busca
visual. Já as células das camadas profundas respondem a estímulos auditivos, somáticos e
mesmo visuais, às vezes separados e às vezes em diversas combinações (Gordon, 1972). Cada
colículo é interconectado via comissura intercolicular, a qual tem sido proposta participar do
papel de orientação do olhar. Essa interconexão tem sido demonstrada em várias espécies,
incluindo primatas não-humanos e humanos (Tardif e Clarke, 2002).
Em nossos resultados, o CoS se apresentou fortemente marcado por fibras/terminais
CTb-IR principalmente em sua camada superficial assim como demonstrado anteriormente
em outros primatas (ver Kaas e Huerta, 1988) e em outros vertebrados (Itaya e Van Hoesen,
1982; Paloff et al., 1985), mostrando uma inervação mais densa nas camadas mais
superficiais e à medida que vamos chegando às camadas intermediarias essa densidade vai
diminuindo. Os botões terminais apresentaram uma variabilidade da forma nos casos
estudados. Em sua grande maioria apresentaram-se em forma ovalada, mas podendo-se
também observar botões nas formas arredondadas, alongadas e triangulares, esses em menores
números. A característica dos botões podem influenciar na atividade multissensorial do CoS
(Fuentes-Santamaria et al., 2008). O CoS apresenta diversas funções multissensoriais como
por exemplo, em algumas espécies, os sinais coliculares podem também ser usados para
60
direcionar a boca ou na direção da comida ou para defesa (Rato: Redgrave et al., 1996).
Porém a ênfase desse trabalho é no controle colicular do olhar, no entanto, não se deve
esquecer que existe especializações, e que a função do núcleo colicular não é apenas uma e
sim possuindo várias vertentes como: controlar o comportamento, direcionar o animal para os
objetos de interesse e afastar de objetos que podem representar ameaça (May, 2006). Mesmo
um exame superficial do CoS de diferentes mamíferos, foi demonstrado que há variações
entre as espécies de mamíferos e dentre a mais notável é que a camada superficial varia
consideravelmente de tamanho (May, 2006).
A distribuição dos terminais retinianos foi descrita em diversas espécies de primatas
(Tigges e Tigges, 1981; Perry e Cowey, 1984). Em trabalho com macacos-prego (Cebus
apella), assim como em outros primatas já estudados, o CoS recebe projeção bilateralmente,
sendo que, a distribuição ipsilateral difere da distribuição contralateral. As projeções
ipsilaterais terminam profundamente, de forma mais esparsa e descontínua em relação às
projeções contralaterais (Frazão, 2008). O que vai de encontro a nossos resultados, onde
demonstramos no sagui um padrão de projeção bilateral, em que não encontramos diferenças
entre projeções contralateral e ipsolateral em sua porção mais rostral, porém, em sua porção
mais caudal, encontramos uma maior projeção contralateral.
O CoS do rato-da-relva do Nilo exibe uma proeminente forma de camadas em secções
coronais (Gaillard et al, 2013). As sete camadas clássicas podem ser razoavelmente
distinguidas pelo método de Nissl.
Neurônios que compõem o CoS formam camadas que refletem suas projeções
aferentes e eferentes e características fisiológicas (Albano et al.,1978; Moschovakis et al.,
1988; Bourne e Rosa, 2003). Estudos anteriores também tem demostrado que estas diferenças
funcionais e conectivas são refletidas no corpo celular e morfologia dendritica (Rhoades et al.,
1991).
6.3. Complexo Pré-Tectal
Diferentemente do SOA e do CoS em que foi feita uma analise descritiva, no
complexo pré-tectal foi realizada uma analise comparativa entre os núcleos, com a finalidade
de melhor delimitar este complexo. Por esse motivo foi analisado o NTD do SOA em
conjunto com os núcleos do complexo pré-tectal. Devido a grande diversidade celular do
61
complexo pré-tectal e algumas dificuldades em delimitar claramente suas subdivisões, o
núcleo e localização destas varia de autor para autor.
Nos mamíferos, o complexo pré-tectal foi subdividido em cinco núcleos: o NTO,
NPO, NPP, NPA e NPM (Berman, 1977; Hutchins, 1991). Alguns estudos ampliaram, no
entanto, as projeções da retina tanto para o NPA como para NPM, pelo fato de ser uma
questão de debate a existência ou não de projeção retiniana para esses núcleos em mamíferos
(Hutchins e Weber, 1985; Hutchins, 1991; Zhang e Hoffmann, 1993). Os autores em geral
concordam que a projeção da retina para as zonas do pré-tecto são difíceis de distinguir em
secções coronais (Matteau et al., 2003).
O complexo pré-tectal apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais CTb-IR
principalmente nos núcleos: NTO, NPO, NPA, NPP. Padrão similar encontrado em gatos,
onde um trabalho também usando a CTb, observou densa marcação em grande parte do NTO,
do NPO e do NPP, porém, apresentou uma escassa marcação dos terminais no NPA e NPM
(Matteau et al., 2003); e também encontrado em roedores, como por exemplo no rato-da-
relva-do Nilo, em que o trato óptico principal atinge mais de seis núcleos pré-tectal, isto é, o
NPA, o núcleo limitante posterior (PLi), NPO, NPM, NPP e o NTO. Todos os núcleos
recebem entrada visual bilateral, com predominância contralateral (Gaillard et al., 2013).
Ainda neste trabalho, o núcleo NPA pode ser dividido em dorsal (NPAd) e uma divisão
ventral (NPAv) de acordo com diferenças de densidades celulares (Gaillard et al., 2013).
Terminais derivados ipsilateralmente se assemelham as do olho contralateral (Gaillard et al.,
2013). Padrão semelhante ao encontrado em nossos resultados, com exceção da divisão dorsal
e ventral do NPA.
O NTD contralateral foi caracterizado com a presença de fibras, algumas delas
podendo conter mais de um botão terminal em sua extensão. Observamos que há uma
projeção bilateral da retina para este núcleo, porém, com uma predominação contralateral. Em
Reshus (Lin e Giolli, 1979), este núcleo recebe tanto projeção contralateral com um pequeno
componente ipsolateral, destacando, dessa forma, um padrão muito semelhante ao que
encontramos no sagui. Os botões apareceram nas formas arredondadas e ovaladas, com um
mesmo padrão sendo seguido pelo NTD ipsolateral. O NTO contralateral apresentou botões
arredondados e ovalado, havendo uma maior aglomeração dos mesmos; presença de fibras,
algumas delas podendo conter mais de um botão terminal em sua extensão. O mesmo padrão
foi seguido pelo NTO ipsolateral. Concluímos que há uma projeção bilateral da retina para
esse núcleo, diferente ao que já foi encontrado em roedores murinos (Kato et al., 1992;
62
Aarnouste et al., 1995; Bai et al., 2001; Hannibal e Fahrenkrug, 2004), hamsters (Morin e
Blanchard, 1997; Muscat et al., 2003) e esquilo terrestre (Major et al., 2003) onde uma
esparsa entrada derivada ipsilateralmente para o NPO foi observado. Esta entrada está bem
definida no rato-da-relva-do Nilo (Gaillard et al, 2013).
O NTD e o NTO são centros visuais primários apresentando um papel essencial na
geração dos movimentos oculares de fase lenta durante nistagmo optocinético horizontal
(Telkes et al., 2001).
O NPO contralateral foi caracterizado pela presença de botões terminais nas formas
ovaladas e arredondadas, presença de fibras, algumas contendo mais de um botão terminal em
sua extensão. O mesmo padrão foi seguido pelo NPO ipsolateral, porém, com botões
terminais um pouco mais agrupados, aglomerados. O NPA contralateral foi caracterizado por
botões terminais nas formas arredondadas e ovaladas, presença de fibras, algumas delas
contendo mais de um botão em sua extensão, a apresentando-se em uma forma mais espaçada.
O NPA ipsolateral seguiu o mesmo padrão, com uma predominação de botões terminais na
forma ovalada. Padrão idêntico ao encontrado no rato-da-relva-do Nilo, em que o NPA é
composto por células de tamanho médio (13.2 ± 1.6µm, n=118) ovoide ou piriforme (Gaillard
et al, 2013). A divisão dorsal, principalmente em sua borda, é limitada por fibras fortemente
marcadas de grande calibre inicialmente ocorre dentro do braço do colículo superior. A
maioria dessas fibras vira para baixo e termina quase que imediatamente, enquanto que a
maioria espalha mais profundamente no centro do NPAd. O NPAv é desprovido de entrada
retiniana significativa. A maioria dos terminais tem um diâmetro muito pequeno e exibe uma
característica de configuração tipo cordão que engloba pequenas varicosidades alongadas
(2.41± 0.39µm, n=44) e botões terminais esféricos (2.07 ± 0.44 µm em diâmetro, n=47).
(Gaillard et al., 2013).
O NPP contralateral apresentou botões terminais arredondados, mas em sua grande
maioria apresentaram-se na forma ovalada, botões espaçados, sem aglomeração, presença de
fibras, algumas contendo mais de um botão terminal em sua extensão. O NPP ipsolateral
seguiu o mesmo padrão, porém com botões terminais e fibras mais aglomerados. Há uma
diferença no que por exemplo, foi encontrado no rato-da-relva-do Nilo em que a projeção para
o NPP é visivelmente maior que aqueles encontrados em camundongos, ratos e esquilos
terrestres (Scalia, 1972; Perry e Cowey, 1979; Major et al., 2003). O impacto funcional destas
diferenças topográficas entre as espécies é atualmente desconhecida (Gaillard et al, 2013). Por
63
isso a necessidade de se estudar em um maior número de espécies possíveis, incluindo os
primatas, como o sagui.
Em uma analise comparativa daqueles núcleos do complexo pré-tectal, o NPP foi o
único que apresentou uma diferença em relação a área e perímetro.
Com base na morfologia neuronal, neurônios CTb-IR do pré-tectal são provavelmente
células de projeção, devido a pericários retrogradamente marcados a partir do GLD,
mostrando tamanhos similares e distribuição característica destes neurônios (Clarke et al.,
1987).
O NTO e o NPO recebem uma extensa entrada primária da retina (Simpson et al.,
1988), dado também encontrado em nossos resultados e além disso, observamos que há uma
integração entre eles, dificultando um pouco suas delimitações, o que corrobora com o
trabalho de Büttner-Ennever e colaboradores, 1996, no qual demonstrou que em primatas, o
NPO é completamente incorporado dentro do NTO, de modo que investigações
neuroanatômicas sobre o NTO sempre envolve o NPO também. Mas com base em
estimulação, lesão e estudos anatômicos, a função do NPO é considerada completamente
diferente do NTO (Büttner-Ennever et al., 1996). Ambos os núcleos são envolvido em
reflexos visuo-motores; o NTO no nistagmo optocinético horizontal (Simpson et al., 1988), e
o NPO no reflexo pupilar a luz (Trejo e Cicerone, 1984). O NTO foi estudado com grande
detalhe no nível ultraestrutural, por meio de coloração Golgi (Nunes Cardozo e van der Want,
1987), por traçadores (Nunes Cardozo e van der Want, 1990) e por imunoistoquímica (Nunes
Cardoso et al., 1991; 1994; van der Want e Nunes Cardozo, 1988).
Segundo um trabalho com lesões em macacos, realizado por Yakushin et al, 2000,
podemos inferir a importância do NTO no acompanhamento (rastreamento) de objetos
durante a perseguição e na manutenção da estabilidade do olhar durante o movimento da
cabeça que produz movimento campo completo do visual que o cercam. Podemos inferir que
o NTO é uma estrutura fundamental para manter a estabilidade do olhar durante o movimento
da cabeça em um ambiente iluminado (Yakushin et al., 2000)
O NTO e os núcleos do SOA participam da geração do nistagmo optocinético, este
processo é gerado em resposta ao movimento contínuo do campo visual, sendo que, as
características do nistagmo optocinético dependem de vários fatores, por exemplo, estado
atencional, distância do objeto, fixação no campo visual ou movimento sacádico do objeto de
interesse (Pola e Wyatt, 1993).
64
O NPO contém neurônios sensíveis à luminosidade, que auxilia o reflexo pupilar à luz,
mostrando um aumento no padrão de disparo após a exposição à luminosidade crescente
(Clarke e Ikeda, 1985a,b), ou seja, o reflexo pupilar a luz basicamente é a constrição do
músculo da íris, em resposta à iluminação da retina (Young e Lund, 1998).
O reflexo pupilar a luz é uma parte importante no exame neurológico de vitimas de
traumas. Depois do gerenciamento das vias aéreas, respiração e circulação, uma avaliação
mais concisa completa do sistema nervoso central é necessária para identificar as vítimas com
potencial lesão cerebral ou medular. O reflexo pupilar à luz é uma ferramenta de triagem
rápida no diagnóstico de lesões de massa intracraniana e danos ao hipotálamo, mesencéfalo,
ou ponte (Plum e Posner, 1980). Quanto melhor se conhecer as regiões envolvidas mais
rápido e melhor será o diagnóstico. E também tem provado ser um excelente indicador não
invasivo de doenças neurológicas e função visual (Young e Lund, 1998). Este teste
relativamente simples também foi utilizado para testar a eficácia de transplantes da retina
(Klassen e Lund, 1987; 1988) como também de transplantes de fotorreceptores intraretiniano
(del Cerro et al., 1991; Silverman et al., 1992; Whitely et al., 1996), bem como para o estudo
do impacto funcional da degeneração de fotorreceptores em doenças degenerativas da retina
herdadas (Trejo et al., 1989; Whiteley et al., 1993; 1994).
As vias neurais centrais subjacentes a esse reflexo foi completamente definido. A íris é
inervada por nervos ciliares curtos cujos corpos celulares estão no gânglio ciliar, o qual é
inervada pelo núcleo EW (Warwick, 1954; Sillito e Zbrozyna, 1970). Os aferentes do EW tem
sido assunto de muitos debates, e parecem diferir entre as espécies, mas há evidências que em
ratos se defende uma projeção direta do NPO (Young e Lund, 1998).
Baseado em nossas observações morfológicas, sugere-se que neurônios contendo CTb
pode apresentar um papel nas várias funções pré-tectais como o nistagmo optocinético,
reflexo pupilar e modular a atividade do núcleo transmissão subcortical visual
65
7. CONCLUSÃO
I. Nesse estudo foi possível fazer o mapeamento da projeção retiniana para os
núcleos que formam o sistema óptico acessório, para as camadas superficiais do
colículo superior e para os núcleos do complexo pré-tectal através da injeção
intraocular da CTb.
II. Através da projeção retiniana encontramos uma região que acreditamos ser o
núcleo terminal medial do sistema óptico acessório.
III. A caracterização (medição da área e do diâmetro) dos botões sinápticos presentes
nas fibras/terminais imunorreativos a CTb que inervam os núcleos do complexo
pré-tectal nos possibilitou fazer uma melhor delimitação desses núcleos.
66
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo é um passo preliminar na investigação sobro os caminhos neurais
subservindo o movimento ocular em sagui (Callithrix jachus), primata do Novo Mundo em
que a anatomia dos núcleos envolvidos é similar a de outros macacos, representando assim,
um sujeito experimental interessante para nosso estudo e objetivos. Os estudos sobre
projeções retinianas possibilita uma melhor visualização dos terminais axonais e um pouco
sobre seu trajeto. Além disso, estudar as diferenças entre os botões é importante para entender
a fisiologia da integração multissensória. Demonstrando assim a importância que se conheça
anatômica e fisiologicamente essas estruturas. Muito interesse tem sido demonstrado na via
neuro-anatômica envolvendo o controle dos movimentos dos olhos
Neste trabalho conseguimos concluir todos os objetivos propostos e desta forma, temos
uma ferramenta importante que pode nos servir com base para trabalhos futuros em que se
deve fazer uma identificação neuroquímica das estruturas aqui estudas.
67
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