Manual de AnÃ_lisis en Fresco y anÃ_lisis BacteriolÃ³gico en Campo

Manual de Análisis en Fresco y Bacteriológico en Camarón. LASA

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA

DIRECCION DE RECURSO NATURALES

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRONOMICAS Y VETERINARIA

Laboratorio de Análisis de Sanidad Acuícola

Manual de Análisis en Fresco

y análisis Bacteriológico en

Camarón.


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Análisis en fresco El análisis en fresco es la técnica que se utiliza para monitorear el estado de

salud de los organismos y la realización de diagnósticos presuntivos en

laboratorio y campo. Consiste en la disección del camarón para observar las

alteraciones que presenten en órganos y tejidos del mismo.

Equipo y material para análisis en fresco.

* Caja de portaobjetos.

* Caja de cubreobjetos.

* Estuche de disección.

* Guantes de látex.

* Solución salina al 2.0%.

* Papel secante.

* Balanza de precisión.

* Microscopio compuesto con objetivos de 10, 20, 40 y 100X.


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Preparación de material

El material a utilizar consiste en portaobjetos, cubreobjetos y equipo de

disección y estos deberán estar en condiciones de asepsia para evitar

cualquier tipo de contaminación.

El área de trabajo deberá estar limpia y despejada, con excepción de los

materiales que serán utilizados.

El personal deberá de asearse las manos, así como usar bata, cubre bocas y

guantes de látex.

Procedimiento

1. Los organismos se pesan, para sacar el peso promedio.

2. Se anotan grado de pigmentación, si presenta alguna coloración

anormal, tiempo de coagulación, si presenta alguna laceración o

necrosis.

3. Se selecciona una pequeña porción de cada tejido u órgano. Cada

porción se coloca en un portaobjetos separados y limpios, se les

adicionan unas gotas de solución salina al 2% y se pone el

cubreobjetos.

Las muestras a tomar son:

a) Branquias: Con tijeras finas se toma una pequeña porción y se coloca en el

portaobjetos para buscar: cuerpos de inclusión viral, epibiontes, hongos,

bacterias, melanizaciones, deformaciones, etc.


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b) Hepatopáncreas: Se elimina todo el exoesqueleto el cefalotórax para

descubrir el hepatopáncreas y el estómago. Se observa la coloración (color

normal, verde oscuro), el tamaño del hepatopáncreas para decidir si hay

atrofia (reducción de tamaño) o hipertrofia (aumento de tamaño) de este

órgano. Con un bisturí se parte por la mitad y se observa la coloración del

fluido. Se toma una pequeña muestra y se coloca en un portaobjetos para

buscar; BP, MBV, gregarias, bacterias y cantidad de lípidos presentes.

c) Intestino: El abdomen, se separa del cefalotórax, telson y urópodos para

facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el

intestino que puede o no contener hilo fecal, con una pinza fina se extrae con

cuidado, se pesa y se coloca en el portaobjetos de la siguiente manera: uno

de los extremos del intestino se detiene con una pinza con el portaobjetos

ligeramente inclinado, se presiona ligeramente el intestino y con las pinzas se

jala para extraer el contenido que se analiza al microscopio para buscar:

gregarinas, nematodos, MBV y BP.

d) Músculo: Se toma una pequeña muestra de músculo, especialmente que

muestre opacidad de tipo lechoso, se coloca en un portaobjetos y se presiona

para facilitar la búsqueda de microsporidios.

e) Cefalotórax: se corta una muestra de cefalotórax con unas tijeras, se le

retira la cutícula para que permita observar en el microscopio, se coloca en


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un portaobjetos con una gota de solución salina, en el se van a observar

cuerpos de inclusión (WSSV).

4. Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio iniciando con

el objetivo de menor aumento y finalizando con el de mayor.

Se anotan todas las observaciones.

Grados de severidad

Grado SIGNOS CLINICOS 0 No presenta signos clínicos de infección por patógenos, parásitos o

epicomensales. No presentan lesiones características de síndromes. 1 Presencia muy baja de patógenos, parásitos o epicomensales. En

aquellos donde tiene un número estándar permitido, este se encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas lesiones características del síndrome.

2 Se observa la presencia baja y moderada de patógenos, parásitos o epicomensales. Se observan muchas lesiones características del síndrome. Incremento en la mortalidad.

3 Se observa la presencia moderada de patógenos, parásitos o epicomensales. Se observan muchas lesiones características del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento.

4 Se observa gran cantidad de patógenos, parásitos o epicomensales. Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy letal con altas mortalidades.

Fuente: Lightner, 1996.


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Pesado de los organismos Registro de observaciones

Muestra de Branquias Muestra de Cefalotorax

Muestra de Hepatopáncreas Muestra de intestino


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ANALISIS BACTERIOLOGICO

Las bacterias del genero Vibrio, se han reportado a menudo como patógenas oportunistas

para camarón, tanto en la fase larvicultura como en la engorda.

Vibriosis: Se puede definir como una enfermedad ocasionada por bacterias del genero

Vibrio en organismos acuáticos. Esto por consiguiente, también es válido para infecciones

ocasionadas por este género en camarones, independientemente del estadio de

desarrollo de estos.

La vibriosis conocida también como el “síndrome de la gaviota”, ha sido la causa de

grandes pérdidas económicas en la industria camaronera, quizás por un desconocimiento

de las técnicas de diagnóstico, así como de los tratamientos frente a estos problemas. En

este negocio que es de gran riesgo el tiempo es fundamental, por eso por medio de

técnicas de diagnóstico de campo, se tomarán los correctivos (medicación) antes de que

ocurra la mortalidad masiva en el estanque. Esta enfermedad es producida por bacterias

Gram negativas del género Vibrio, las especies más comúnmente asociadas con este

problema son:

- V. parahaemoliticus

- V. vilnificus

- V. harveyi

- V. alginolyticus


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Se presentan ocasionalmente:

- V. damsela

- V. fluvialis

- V. spendidus

Equipo y material para análisis bacteriológico

Materiales:

*Tubos de ensayo con tapón de rosca de 16 x 150 mm.

*Matraces Erlenmeyer de 500 ml

*Matraces Erlenmeyer de 1000 ml.

*Probeta graduada de 100 ml.

*Probeta graduada de 500 ml.

*Vasos de precipitado de 100, 500 y 1000 ml.

*Cajas petri desechables.

*Asas microbiológicas.

*Espátula con mango de madera.

*Recipientes para pesar medio de cultivo.

*Gradilla de plástico para tubos.

*puntillas para micropipetas.

*Micropipetas.

*Estuche de disección.

*Varilla de vidrio acodada.


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*guantes de látex.

Agares y reactivos:

* Agar TCBS (Tiosulfato Citrato Bilis sacarosa)

*Agar Muller Hinton

*Agar TSA (Tripticasa Soya Agar)

*Cloruro de sodio

*Citrato de sodio

*Alcohol al 96°

*Antibióticos: Oxitetraciclina, Enrofloxacina, Florfenicol (Sensidiscos).

Equipo:

*Parrilla de calentamiento.

*Mechero de alcohol o gas.

*Balanza de precisión.

*Incubadora de 20 a 40 °C.

*Olla de presión de 25 litros.


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Materiales empleados para el diagnóstico por Bacteriología

Preparación de la solución Salina

Esta solución se realiza para la dilución de la muestra que generalmente

deberá tener una salinidad similar a la del medio en que se está

desarrollando el cultivo de camarón, por lo general se prepara al 2% y 2.5%.

Preparación del Citrato de Sodio

Esta solución es preparada al 10% y actúa como anticoagulante, esta se

emplea al momento de extraer la hemolinfa de los organismos y como medio

de transporte para trasladar la muestra de la granja al laboratorio.

Preparación de agar TCBS.

Este medio es específico para el crecimiento de bacterias del género Vibrio

spp, aunque en la práctica también se ha observado que también pueden

crecer otros tipos de bacterias como Pseudomonas spp y Aeromonas spp. Es

un medio diferencial entre el género Vibrio, las especies que utilizan la

sacarosa para producir ácido, producen colonias de color amarillo: V.

alginolyticus, V. cholerae, V. angillarum, V. fluvialis. Las que crecen sin utilizar

la sacarosa son verdes V. parahaemolyticus, V. damsella, V. fisheri, V.

mimicus, V. bollisea, V. harveyi.


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Para la preparación del agar TCBS se deben seguir los siguientes pasos:

1. Se requiere agua destilada

2. Se pesa en área estéril 88 gr/l de agua destilada

3. Se disuelve el agar con el agua

4. Se procede a calentar hasta que hierva (tener cuidado que no se riegue

al hervir)

5. Dejar enfriar a 45°C

6. Se vierte en cajas previamente esterilizadas

7. Se deja solidificar y debe tener cuidado que no quede humedad en las

cajas

8. Guardar en un lugar seco y estéril

9. Es importante recordar que este agar NO necesita esterilizarse en el

AUTOCLAVE

Preparación de agar TSA.

Este es un medio donde crecen todo tipo de bacterias, se emplea

comúnmente para aislar y purificar bacterias.

1. Se pesa la cantidad requerida de acuerdo al número de placas a

utilizar.

2. Para este medio se agrega 2.0 gr de NaCl por cada 100 ml.


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3. Se disuelve el medio en agua destilada en un matraz y se calienta en

una parrilla hasta punto de ebullición para que se disuelva por

completo.

4. Se esteriliza en autoclave a 120 °C por 15 minutos.

5. Se deja enfriar hasta alcanzar una temperatura de 45°C, y

posteriormente se vacía en cajas de petri, se espera a que solidifique y

se guarda en un lugar seco y estéril.

Preparación de agar Mueller Hinton.

En este medio de cultivo crece todo tipo de colonia y es un medio ideal para

realizar pruebas de sensibilidad de antibióticos (empleado para

antibiogramas).

1. Pesar la cantidad requerida de acuerdo al número de placas a utilizar.

2. Agregar 2.0 gr de NaCl por cada 100ml.

3. Se disuelve el medio en agua destilada en un matraz y se calienta en la

parrilla hasta punto de ebullición para que se disuelva completamente.

4. Se esteriliza en autoclave a 120 ° C por 15 minutos.

5. Se deja enfriar hasta que alcance una temperatura de 45°C y

posteriormente se vacía en cajas petri, se espera a que solidifique y se

guarda en un lugar seco y estéril.


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Nota: (*) El agar TSA (para purificaciones) y el MULLER-HINTON (para

antibiogramas) deben ser ajustados a una salinidad final similar a la de la

muestra analizada, y ser esterilizados.

Técnicas de siembra

Siembra directa

El análisis bacteriológico se realiza en hepatopáncreas o en mercado,

dependiendo del tamaño del camarón, así tenemos que en camarones con

peso de hasta 0.8 gramos se realiza macerados y en camarones superiores a

un peso de un gramo, se le realiza extracción de hepatopáncreas para el

análisis y extracción de hemolinfa.

Técnica para macerado

1. Seleccionar de 10-15 camarones juveniles o 25 post-larvas para el análisis

(camarones de hasta 0.8 gramos)

2. Desinfectar los animales a macerar, enjuagándolos con alcohol al 70%.

Permitir que el exceso de alcohol se evapore hasta que no quede olor al

mismo.


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3. Desinfectar un mortero y adicionar solución salina estéril (2%) en una

relación de 1:1 con respecto al peso de los animales.

4. Colocar las post-larvas juveniles en el mortero previamente desinfectado

y con la solución salina.

5. Se procede a macerar hasta que todos los camarones estén

completamente triturados.

6. Mezclar el inoculo.

7. Usando la micropipeta con puntillas, previamente esterilizadas, tomar la

muestra y sembrarla en agar TCBS.

8. Secar con una varilla acodada previamente esterilizada al mechero y

enfriada.

9. Incubar en forma invertida la caja petri inoculada por un tiempo de 18 a

24 horas a temperatura 28-30°C.

10. Luego del período de incubación, se realiza la lectura de las colonias tanto

verdes como amarillas y se multiplica por los 10 ml de solución en que se

macero, se divide entre el número de larvas maceradas, se divide entre

los ml sembrados.

11. se calcula el porcentaje de verdes, dividiendo las colonias verdes entre el

total, y multiplicándolo por 100 (%).

12. Se registran los resultados y se evalúan para completar el diagnóstico.


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Técnica para macerado de hepatopáncreas

1. Seleccionar de 10-15 camarones juveniles o 25 larvas para el análisis

(camarones de hasta 0.8 gramos)

2. Desinfectar los animales, enjuagándolos con alcohol al 70%. Permitir que el

exceso de alcohol se evapore hasta que no quede olor al mismo.

3. Se extraen varios hepatopáncreas hasta completar un gramo.

4. Desinfectar un mortero y adicionar solución salina estéril (2%) en una

relación de 1:1 con respecto al peso de los hepatopáncreas.

5. Colocar los hepatopáncreas en el mortero previamente desinfectado y con

la solución salina.

6. Se procede a macerar hasta que todos los hepatopáncreas estén

completamente triturados.

7. Mezclar el inoculo.

8. Usando la micropipeta con puntillas, previamente esterilizadas, tomar la

muestra y sembrarla en agar TCBS.

9. Secar con una varilla acodada previamente esterilizada al mechero y

enfriada.

10. Incubar en forma invertida la caja petri inoculada por un tiempo de 18 a

24 horas a temperatura 28-30°C.


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11. Luego del período de incubación, se realiza la lectura de las colonias tanto

verdes como amarillas y se multiplica por los 10 ml de solución en que se

macero, se divide entre el peso de los hepatopáncreas, se divide entre los ml

sembrados.

12. se calcula el porcentaje de verdes, dividiendo las colonias verdes entre el

total, y multiplicándolo por 100 (%).

Materiales necesarios Extracción de hepatopáncreas

Pesado de hepatopáncreas Muestra con solución salina al 2%


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Macerado de hepatopáncreas Toma de muestra

Secado de la muestra Siembra de la muestra

Conteo de UFC/gr a las 24 hrs. Incubación de la muestra


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Técnica de siembra de hemolinfa

1. Se limpia toda la cutícula del camarón con una torunda de algodón

impregnada con alcohol al 96 %; poniendo énfasis en la asepsia de las

áreas cercanas al corazón o lo periopodos; según sea el caso.

2. Se procede a hacer la extracción de hemolinfa con una jeringa de

insulina (aproximadamente 50 microlitros, dependiendo del tamaño

del camarón), de tal manera que la aguja entre al corazón sin llegar a

tocar el hepatopáncreas. Otro sitio donde se puede extraer la

hemolinfa es el seno ventral y en la base del cuarto o quinto

pereiópodo.

3. La hemolinfa extraída es cuantificada y sembrada en una placa de

TCBS, teniendo cuidado de distribuirla por toda la placa con la ayuda

de una varilla acodada de vidrio por toda la superficie del agar.

4. La placa se incuba de 28 a 30 °C por 18 a 24 horas.

5. Pasado el tiempo de incubación se procede a realizar el conteo de

colonias para establecer las unidades formadoras de colonia por

mililitro (UFC/ml). Es importante saber la cantidad de hemolinfa que

fue sembrada.

6. Para sacar la estimación se divide el número de colonias entre el

volumen de hemolinfa sembrada en ml.


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Citrato de sodio al 1% Extracción de hemolinfa

Siembra en placa de TCBS Secado con varilla acodada


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INTERPRETACION DE RESULTADOS

Interpretación tentativa de los tipos de colonias bacterianas obtenidas de

camarones en agar TCBS.

Juveniles y adultos de camarón

Tipos de UFC en

agar TCBS

Larvas y postlarvas

>103 <103

Hepatopáncreas

(UFC/gr)

>105 >105

Verdes Luminiscentes

100 %

grave serio grave serio

Verdes > 50 % serio elevado-serio serio elevado-serio

Verdes < 50 % elevado-serio elevado elevado normal-

elevado

Amarillas elevado normal-elevado normal-elevado

normal

FUENTE: GÓMEZ-GIL


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Purificación de bacterias en TSA

La purificación de bacterias en el cultivo de TCBS es importante realizarla

siempre, pero principalmente cuando las colonias no están bien aisladas o el

cultivo supera las 24 horas, para evitar contaminación y errores en la

identificación. Por ello se procede a:

a) Seleccionar las colonias para la resiembra

b) La resiembra se realiza en agar TSA (ajustado a la salinidad del

medio) Incubar a 28-30°C por 18-24 horas

c) Las colonias que crecen en TSA, nos servirán para realizar

antibiogramas, así como para la identificación bacteriana.

Toma de muestra


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Siembra por estría cruzada

Cultivo a las 24 horas


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Pruebas de sensibilidad a antibióticos “Antibiogramas”

a) Las colonias para este análisis deben ser típicas, aisladas y purificadas

b) Para el análisis tomamos 4 a 5 colonias y las colocamos en 5 ml de

solución salina al 2%, agitamos e igualamos a un MacFarland 0.5 a 1.0

(Estándar de turbidez)

c) Luego humedecemos un hisopo con esta solución

d) Pasar el hisopo por toda la superficie del agar MULLER-HINTON (ajustado

a la salinidad del medio)

e) Dejar absorber el inoculo de 5 a 10 minutos

f) Aplicar los antibióticos correspondientes con ayuda de un dispensador o

pinza esterilizada. Sólo deberán aplicarse de 5-6 antibióticos por placa de

agar MULLER-HINTON

g) Incubar las placas en posición invertida a 28-30°C por 24 horas

h) Después de la incubación, se procede a medir los diámetros de los halos

de sensibilidad en milímetros correspondientes a cada uno de los

antibióticos colocados para luego compararlos con las tablas indicadas

para cada tipo de antibiótico y establecer la sensibilidad o resistencia de

las bacterias aisladas.


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Toma de la muestra Dilución de la muestra

Toma de la muestra con hisopo Siembra de la muestra

Aplicación de sensidiscos Resultados


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INTERPRETACIÓN DEL DIÁMETRO EN LA LECTURA DE LOS TEST DE

SENSIBILIDAD

Grado de sensibilidad Diámetro de inhibición

Muy sensible 17 mm

Sensible 12-16 mm

Intermedio 8-11 mm

No sensible < 7 mm

Fuente: AVIMEX 2008

Enro-blend* Aqua (Enrofloxacina blindada)

Flor-blend*Aqua (Florfenicol blindado)

Oxi-blend* 50 grado acuicola (Oxitetraciclina)

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