MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGO … · COM SORO HOMÓLOGO APRESENTAM GRANDE NÚMERO DE ......
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MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGO CULTIVADOS
COM SORO HOMÓLOGO APRESENTAM GRANDE NÚMERO DE
CORPOS LIPÍDICOS E AÇÃO MICROBICIDA REDUZIDA
CONTRA O TOXOPLASMA GONDII
LAURA AZEREDO MIRANDA MOTA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO 2009
II
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGO CULTIVADOS
COM SORO HOMÓLOGO APRESENTAM GRANDE NÚMERO DE
CORPOS LIPÍDICOS E AÇÃO MICROBICIDA REDUZIDA
CONTRA O TOXOPLASMA GONDII
LAURA AZEREDO MIRANDA MOTA
“Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como requisito das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia”.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO 2009
III
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGO CULTIVADOS COM
SORO HOMÓLOGO APRESENTAM GRANDE NÚMERO DE CORPOS
LIPÍDICOS E AÇÃO MICROBICIDA REDUZIDA CONTRA O TOXOPLASMA
GONDII
LAURA AZEREDO MIRANDA MOTA
“Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como requisito das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotenologia”.
Aprovada em 13 de Fevereiro de 2009.
Comissão Examinadora:
_______________________________________________________________
Prof.ª Patrícia Torres Bozza (Dra. em Ciências concentração em Farmacologia)
- FIOCRUZ
Prof.ª Maura Da Cunha (Dra. em Ciência) - UENF
Prof.ª Andréa Cristina Veto Arnholdt (Dra. em Ciência) - UENF
_______________________________________________________________
Prof. Renato Augusto DaMatta (Dr. em Ciência) – UENF
(Orientador)
IV
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, no
Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro sob a orientação do Professor Doutor Renato
Augusto DaMatta.
Apoio Financeiro:
• Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado do Rio
de Janeiro (FAPERJ);
• Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq);
• Fundação de Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
V
O Senhor é a porção da
minha herança e do meu
cálice, tu és o sustentáculo
da minha sorte. Louvarei ao
Senhor que me aconselha;
até de noite o meu coração
me ensina (Sl 16:5,7).
VI
Dedico esta Tese a DEUS,
aos meus pais, Regina e
Odilon e ao meu amado
esposo Pedro Ivo.
VII
Agradecimentos
A Ti, Senhor Jesus, grande em misericórdia e graça, pelo sustento e
capacitação durante toda a jornada, pelo cuidado e amor de Pai.
Ao meu amado Pedro Ivo Botelho Mota, por me ajudar e me amar em todos
os momentos, pela compreensão e paciência.
Aos meus pais, Odilon Miranda Filho e Regina Célia Azeredo Miranda, por
me ensinarem com amor a temer a Deus e andar em seus caminhos. A
enxergar mais além, a ser o que sou. Obrigada papai e mamãe. Amo vocês.
Aos meus sogros Nivaldo Borges Francisca Mota, pelo amor a mim
dispensado e por me fazer uma filha.
Aos meus irmãos Álvaro Miranda, Maria Angélica Santos e Juliana Moura
pela convivência e aprendizados que tivemos juntos, e seus respectivos
cônjuges: Fanny Miranda, Carlos Elias Santos e Saulo Moura . Amo cada um
de maneira especial.
Ao meu querido orientador Prof. Dr. Renato Augusto DaMatta, pela amizade,
carinho e atenção durante todo tempo de convivência. Por me ensinar com
paciência todas as coisas, provendo conhecimento e crescimento.
A Prof. Dra. Maura da Cunha por ter feito parte de meu crescimento me
dando suporte sempre que precisei e por mais uma vez aceitar fazer parte de
minha banca. Agradeço também por ceder gentilmente vermelho de nilo para
fluorescências e pelo auxílio na microscopia eletrônica de transmissão.
A Prof. Dra. Patrícia Torres Bozza, Dra. Heloísa da Silva Bizarro D’Ávila,
Prof. Dra. Michelle Frazão Muzitano, Dra. Andréa Cristina Vetö Arnholdt por
contribuírem de alguma maneira neste trabalho.
A minha amiga Juliana Azevedo da Silva, por estar ao meu lado neste
momento, me ajudando a carregar a carga.
Ao querido Prof. Dr. Sérgio Henrique Seabra pela obtenção do Soro
Homólogo. Pela animação e carinho com todos, sempre disposto a ajudar.
A Caroliny Samary Lobato que tanto me ajudou. Obrigada pela amizade e
ensinamentos e pelo lindo caderno de protocolo! Obrigada minha querida!
A Juliana da Cruz Padrão, uma amizade tão bonita, difícil de encontrar.
Obrigada amiga pela força e preocupação, por sempre estar me auxiliando
nesta caminhada.
VIII
A Juliana Costa de Azevedo, João Cláudio Damasceno de Sá e todo o grupo
do LBCT e demais companheiros de bancada (Cristiane Souza Carvalho, Carla
Cristina Leite, João Roberto Neto, Carolina Torturella Rath, Luciana Lemos
Rangel da Silva, Juliana Dias, Juliana Santos), juntamente com os técnicos
(Darli Keller, Rosemary Maciel, Adriana Martins, Fábio Conceição, Beatriz
Ribeiro e Geovana Moraes).
IX
SUMÁRIO
Resumo XI
Abstract XII
Lista de Abreviatura e Siglas XIII
INTRODUÇÃO 1
1- Revisão bibliográfica 1
1.1- Macrófago 1
1.1.1- Funções dos macrófagos 4
1.1.1.1- Fagocitose: 4
1.1.1.2- Citotoxidade celular: 5
1.1.1.3- Célula apresentadora de antígenos: 7
1.2- Corpos lipídicos 8
1.2.1- Composição do corpo lipídico 9
1.2.2- Corpo lipídico nas células 10
1.2.3- Geração de corpo lipídico 11
1.3- Toxoplasma gondii 13
1.3.1- Ciclo biológico 13
1.3.2- Transmissão do parasita 13
1.3.3- Invasão da célula hospedeira 15
1.3.4- Sucesso do parasita 16
1.3.5- Lipídios em Toxoplasma gondii 17
1.3.5.1 – Colesterol 19
OBJETIVOS 21
MATERIAIS E MÉTODOS 22
1- Obtenção e cultura de células 22
1.1- Macrófagos 22
1.2- Obtenção de soro homólogo 22
1.3- Toxoplasma gondii 22
2- Interação com Toxoplasma gondii 22
3- Ativação dos macrófagos 23
4- Preparo do material para observação em microscopia óptica 24
4.1- Observação dos macrófagos por contraste interferencial. 24
4.2- Marcação de compartimentos ácidos 24
X
4.3- Marcação de corpos lipídicos 24
5- Preparo de material para microscopia eletrônica de transmissão para
detecção de lipídios insaturados
24
6- Microscopia eletrônica de varredura 25
7- Avaliação da produção de óxido nítrico 25
8- Avaliação da produção de prostaglandina E2 25
9- Análise estatística 26
RESULTADOS 27
1- Morfologia dos macrófagos cultivados com soro fetal bovino e soro
homólogo
27
2 - Análise da ação microbicida de macrófagos peritoneais cultivados com
soro homólogo e soro fetal bovino
34
2.1- Produção de óxido nítrico e prostaglandina E2 34
2.2- Interação com Toxoplasma gondii 36
2.3- Inibição inespecífica da via ciclooxigenase 36
3- Análise da associação entre corpo lipídico e vacúolo parasitóforo
contendo Toxoplasma gondii
37
3.1- Microscopia óptica de fluorescência e Microscopia eletrônica de
transmissão
37
DISCUSSÃO 40
CONCLUSÃO 45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46
XI
Resumo
Embora os corpos lipídicos (CL) sejam organelas presentes em muitos
tipos celulares, suas funções não são completamente entendidas. Tem sido
sugerido que CL são marcadores estruturais de células envolvidas em
processo inflamatório, responsáveis pela geração de prostaglandina E2 (PGE2).
Contudo, não se sabe como a presença desta organela altera a capacidade
microbicida de macrófago. Neste trabalho relatamos que macrófagos
peritoneais cultivados com soro homólogo (SH) apresentaram grande número
de CL, produziram menos óxido nítrico (NO), mais PGE2 e foram menos
eficientes para controlar o crescimento do Toxoplasma gondii quando
comparado a macrófagos cultivados com soro fetal bovino, controle negativo
para CL. Tratamento destas células com indometacina, inibidor da produção de
PGE2, aumentou a capacidade microbicida destes macrófagos. Além disso,
houve associação de vacúolo contendo T. gondii com CL, indicando que o
parasita pode se beneficiar diretamente desta fonte lipídica. Portanto, o cultivo
de macrófagos com SH tornou estas células menos microbicidas,
possivelmente pela maior produção de PGE2, a qual reduziu a produção de
NO.
Palavras-chave: macrófagos, corpos lipídicos, óxido nítrico, prostaglandina E2,
capacidade microbicida, Toxoplasma gondii.
XII
Abstract
Although lipid bodies (LB) are organelles present in several cell types,
their function are not completely understood. It has been suggested that LB are
structural markers of cells involved in inflammatory process, responsible for
prostaglandin E2 (PGE2) generation. However, it is not known how the presence
of this organelle alters macrophage microbicidal capacity. Here we report that
mouse peritoneal macrophages cultured with homologous serum (HS)
presented a great number of LB, produced less nitric oxide (NO), more PGE2
and were less efficient to control Toxoplasma gondii growth when compared to
macrophages cultured with fetal bovine serum, negative control to LB.
Treatment of these cells with indomethacin, inhibitor of PGE2 production,
increased microbicidal capacity of these macrophages. Furthermore,
association of vacuole containing T. gondii with LB was observed, indicating
that the parasite may benefit directly from this lipid source. Nevertheless the
cultive of macrophages with HS turned these cells less microbicidal, possibly by
the higher production of PGE2 that reduced NO production.
Keywords: macrophages, lipid bodies, nitric oxide, prostaglandin E2,
microbicidal capacity, Toxoplasma gondii
XIII
Lista de Abreviatura e Siglas:
• ADRP: proteína relacionada à diferenciação de adipócitos – do inglês:
adipose differentiation-related protein;
• CG: complexo de Golgi;
• CL: corpo(s) lipídico(s);
• COX: ciclooxigenase;
• DAPI: 4’, 6-diamidino-2-phenylindole;
• DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium;
• EIA: ensaio imunoenzimático;
• EL: endolisossomos;
• IFN-α, β e γ: interferona-α, β e γ - do inglês - interferon-α, β e γ;
• IL: interleucina;
• LDL: lipoproteína de baixa densidade – do inglês: low density lipoprotein;
• LPS: lipopolissacarídeo;
• MAP kinases: proteíno-quinases ativadas por mitógenos – do inglês:
mitogen activated protein kinases;
• MT: mitocôndria;
• MVP: membrana do vacúolo parasitóforo;
• NO: óxido nítrico – do inglês: nitric oxide;
• PAF: fator de ativação de plaquetas – do inglês: platelet activating factor;
• PAT: família composta por perilipina, ADRP e TIP47;
• PGE: prostaglandina E (PGE 1, PGE2);
• PI3K: fosfatidilinositol-3-quinase – do inglês: phosphatidil inositol 3-
phosphate;
• PKC: proteína quinase C – do inglês: protein kinase C;
• PLC: fosfolipase C - do inglês: phospholipase C;
• RE: retículo endoplasmático;
• SFB: soro fetal bovino;
• SH: soro homólogo (soro de camundongo);
• TNF: fator de necrose tumoral - do inglês: tumoral necrose factor;
• VN: vermelho de nilo;
• VP: vacúolo parasitóforo;
1
INTRODUÇÃO
O macrófago é a célula mais diferenciada do sistema mononuclear
fagocitário (van Furth et al., 1972) extremamente efetivo na primeira linha de
defesa imunológica e homeostasia do organismo. Esta célula é ativada após
contato com patógeno ou moléculas provenientes desses, assim como
moléculas resposta do sistema imune. A ativação clássica aumenta a
capacidade microbicida do macrófago levando a grande produção de óxido
nítrico (NO) (Gordon, 2003).
O tecido inflamado causa muitas mudanças na função e morfologia do
macrófago, incluindo aumento no número de corpos lipídicos (CL) (Pacheco et
al., 2002; Melo et al., 2003; D’Avila et al., 2006). Macrófagos com grande
número de CL têm sido descritos em muitos locais de infecção/inflamação tais
como lavados broncoalveolares de pacientes com a síndrome da angústia
respiratória aguda (SARA) (Triggiani et al., 1995), nas juntas de pacientes com
artrite inflamatória (Coimbra & Lopes-Vaz, 1971; Bozza et al., 1996), e na
arteriosclerose (Li & Glass, 2002).
CL são organelas ricas em lipídios, altamente reguladas, presentes em
vários os tipos de células eucarióticas de plantas, algas, protozoários,
leveduras, células animais bem como em procariotos (revisto por Zweytick et
al., 2000). Esta organela consiste de um centro de lipídios neutros altamente
hidrofóbicos, formado principalmente de tri e diacilglicerol, esterol, e ésteres de
colesterol circundado por uma monocamada de fosfolipídios com composição
única de ácido graxo e com um diverso e variável conjunto de proteínas
(Tauchi-Sato et al., 2002). A função bem conhecida de CL é o estoque de
componentes necessários para a biogênese de membranas ou a formação de
componentes lipofílicos específicos como, por exemplo, hormônios esteróides
(Zweytick et al., 2000).
Além disso, CL estão envolvidos em outros processos celulares como
tráfego vesicular (Brasaemle et al., 2004; Liu et al., 2004; Fujimoto et al., 2004;
Martin et al., 2005) e função inflamatória (Weller et al., 1999; Pacheco et al.,
2002; Bandeira-Melo et al., 2002; Melo et al., 2003, 2006; Bozza et al., 2007;
D’Ávila et al., 2008). Muitos estudos relacionam a presença desta organela com
a produção de mediadores inflamatórios (Dvorak et al., 2003; Bozza et al.,
2
1997, 1998; Pacheco et al., 2002), porém pouco é conhecido a respeito desta
organela e sua influência na modulação da capacidade microbicida de células.
Infecção in vivo e in vitro com patógenos intracelulares aumenta o
número de CL em macrófagos. Esta organela localiza enzimas que sintetizam
eicosanóides e seu aumento se correlaciona com maior produção destes
mediadores inflamatórios lipídicos tais como prostaglandina E2 (PGE2)
(Pacheco et al., 2002; Melo et al., 2003; D’Avila et al., 2006). PGE2 pode inibir a
resposta imune tipo Th1 e desativar macrófagos através da redução de fator de
necrose tumoral-alfa (TNF-alfa) e da produção de NO (Renz et al., 1998; Betz
& Fox, 1991; Freire-de-Lima et al., 2000). Então é razoável levantar a hipótese
de que a presença de CL torna o macrófago menos microbicida.
Analisando o envolvimento da sialoadesina, um receptor que reconhece
ácido siálico, na associação de Trypanosoma cruzi à macrófagos, Monteiro et
al. (2005) confirmaram que a cultura de macrófagos peritoneais de
camundongo com soro homólogo (SH) induz não somente a expressão de
sialoadesina, mas também grande número de vesículas. Aqui relatamos esta
descoberta mostrando que estas vesículas são CL, esses macrófagos
produzem mais PGE2, menos NO, e conseqüentemente são menos
competentes no controle do crescimento do Toxoplasma gondii. Além disso, a
associação de CL com esse parasita foi observada sugerindo que esta
organela é importante fonte de lipídios para a replicação intracelular do
parasita.
1- Revisão bibliográfica
1.1- Macrófago
O macrófago tem origem a partir da célula tronca hematopoiética, sendo
a célula mais diferenciada do sistema mononuclear fagocitário (van Furth et al.,
1972). Este sistema compreende progenitores da medula óssea que se
diferenciam em monócitos. Esses migram para o sangue, circulam pelo
organismo e migram de forma constitutiva ou direcionada para os tecidos, se
tornando desta forma macrófagos. Nos tecidos essas células exercem função
fagocitária efetora na primeira linha de defesa da imunidade inata fagocitando
microrganismos. Macrófagos fagocitam também restos celulares contribuindo
para a homeostase do organismo.
3
Macrófagos são uma grande população celular na maioria dos tecidos
no organismo, aumentando em número durante a inflamação, injúria e na
presença de tumores (Hume, 2006). Estas células possuem vasta distribuição
no organismo podendo ser encontrados no sistema nervoso central (microglia),
nos ossos (osteoclasto), na medula óssea, na região gastrointestinal, na
sinóvia, nos órgãos endócrinos e linfóides, no baço, no fígado (células de
Kupffer), no timo, no pulmão (macrófago alveolar), na pele, em tecido
inflamado, em tecido conjuntivo (histiócito), em cavidades serosas (macrófago
peritoneal e pleural), e em muitos outros locais (Dougherty & McBride, 1984;
Auger & Ross et al., 1992; Mosser & Edwards, 2008).
Os macrófagos podem ser residentes ou ativados. O macrófago
residente é distribuído constitutivamente através do organismo sempre na
ausência de qualquer sinal inflamatório. As heterogeneidades funcional,
morfológica e fenotípica podem refletir o ambiente em que estas células se
desenvolveram e vivem. Macrófagos residentes são adaptados ao seu
ambiente local para realizar funções específicas. Estas células funcionam
como sensores na inflamação e regeneradores de tecidos, onde há um
aumento no reconhecimento de suas interações com outras células residentes
em cada órgão.
Os macrófagos se tornam ativados após contato com moléculas
produzidas pelo sistema imune em resposta à invasores ou com moléculas de
patógenos. A superfície do macrófago possui diversas moléculas marcadoras,
muitas são receptores envolvidos na imunidade inata e adquirida, como revisto
por Taylor et al. (2005). Com um estímulo específico, o macrófago se torna
ativado (metabolismo aumentado para maior produção de substâncias de
defesa), aumentando a capacidade microbicida levando a produção de
espécies reativas de oxigênio e nitrogênio tal como NO (Gordon, 2003). A
ativação do macrófago é fundamental para conferir resistência à várias
infecções geradas por patógenos intracelulares (Mackaness, 1969, 1971),
como por exemplo, o parasita intracelular obrigatório T. gondii. A produção de
NO resulta na redução do crescimento deste parasita, indicando que o NO é
um potente agente microbicida (Adams et al., 1990). No entanto, Seabra et al.
(2002) mostraram inibição parcial da produção de NO em macrófagos ativados
4
infectados por T. gondii, indicando que esta é uma das formas de escape do
parasita.
Além da produção de NO, o macrófago ativado exibe aumento em uma
ou mais atividades funcionais, tais como: no metabolismo celular, na
mobilidade, na atividade da enzima lisossomal, na capacidade citotóxica; ou
até mesmo a exibição de nova atividade funcional (Adams & Hamilton, 1984;
1992). Estas modificações aumentam a elaboração de importantes produtos
de fagócitos mononucleares, incluindo proteases neutras do lisossomo
(colagenase, elastase, angiotensina convertase, ativador de plasminogênio, e
cisteína protease – ativas em pH neutro), lipases (lipoproteína lipase e
fosfolipase A2) (Nathan, 1987), hidrolases ácidas, componentes do
complemento, inibidores de enzima, citocinas como interleucina – 1 (IL-1),
TNF-α e fatores promotores de hematopoiese. Cada macrófago possui
determinado padrão de respostas gênicas singular em relação ao estímulo por
ele sofrido, sendo, portanto, considerado único (Hume et al., 2002; 2006). Este
perfil está relacionado á natureza do conjunto de estímulos recebidos por ele,
bem como sua localização, gerando um grande potencial destrutivo (Gordon,
1995).
Outra habilidade intrigante desta célula é a de transdiferenciação.
Alguns estudos sugerem que as células do sistema mononuclear fagocitário
podem derivar de progenitores não hematopoiéticos purificados (elementos
vasculares, incluindo células endoteliais, miofibroblastos e células do músculo
liso) (Fernandez et al., 2000; Schemeisser et al., 2001; Sawano et al., 2001)
importantes no reparo de tecidos (Elsheikh et al., 2005). Além disso, a
habilidade de monócitos se transformarem em macrófagos tem aberto portas
para a discussão do caminho reverso.
1.1.1- Funções dos macrófagos
Dado a importância do macrófago no desempenho de muitas funções
no organismo destacamos algumas que chamam mais atenção:
1.1.1.1- Fagocitose: processo no qual partículas de tamanho maior que 0,5
µm estranhas ou componentes próprios do organismo como células
apoptóticas são endocitadas, através da emissão de pseudópodes. A célula é
atraída por gradiente quimiotático liberado pelas moléculas oriundas das
partículas como microrganismos invasores (Metchnikoff, 1905 apud Ian, 1973).
5
A fagocitose é uma das funções mais observadas (Metchnikoff, 1891 apud Ian,
1973) e segue alguns passos. Primeiramente, há reconhecimento de
moléculas da superfície de partículas ou células através de receptores
fagocíticos (Fc, complemento, etc) do macrófago (Adams & Hamilton, 1988);
após este processo ocorre a internalização, formando o vacúolo fagocítico. A
internalização pode ocorrer com ou sem opsonização caso o antígeno possua
algum determinante em sua superfície que possa ser reconhecido diretamente
pelo macrófago, por exemplo, resíduos de carboidratos (Sung et al.,1983).
Após a ingestão, ocorre a fusão deste vacúolo fagocítico com lisossomas
gerando assim o fagolisossoma. Nesta fase o material fagocitado é digerido
parcialmente gerando epítopos (restos de antígenos na superfície celular), os
quais podem ser expostos na superfície do macrófago via moléculas MHC de
classe II (apresentação de antígenos, ver item “c” abaixo). Esta apresentação
é feita aos linfócitos T, os quais produzem linfocinas (interferona- gamma -
IFN-γ) culminando na ativação de macrófagos. Parte desta linfocina fica no
local e parte vai para o sangue estimulando, dentre muitas funções, a
diferenciação e formação de células de defesa para aumentar a fagocitose e a
produção de mediadores químicos.
1.1.1.2- Citotoxidade celular: destruição de células tumorais e/ou células
infectadas através da interação dos macrófagos com partículas estranhas
liberadas pelo patógeno ou advindas de outras fontes. Estas partículas
estranhas desencadeiam em macrófagos a produção de mediadores tóxicos
como radicais de oxigênio, serina proteases, TNF-α, NO e outros, bem como a
ativação do sistema complemento, culminando na lise celular e eliminação da
célula tumoral ou infectada (Adams & Hamilton, 1988). Macrófagos ativados
por citocinas como IFN-γ, TNF-α ou IL-1 têm grande capacidade microbicida,
quando comparado aos macrófagos não ativados (Nathan, 1987).
O metabolismo basal dos macrófagos pode ser significantemente
afetado por interações receptor-ligante (Adams & Hamilton, 1984), que
normalmente resultam no “burst” respiratório que é a liberação de radicais de
oxigênio. O envolvimento de receptores para porção Fc de imunoglobulinas,
para complemento, e receptores para glicoproteínas manose terminal pode
estimular o “burst respiratório” (Nathan & Root, 1977; Johnston, 1981).
6
Fagocitose mediada por receptor para porção Fc de imunoglobulinas também
resulta na liberação de grandes quantidades de radicais de oxigênio e
metabólitos de ácido aracdônico (Klebanoff, 1988).
Neste processo, o oxigênio molecular é reduzido à água. Isto se dá
através da redução do oxigênio molecular a ânions superóxido, peróxidos de
hidrogênio e radicais de hidroxila, que são chamados intermediários de
oxigênio reativo, chegando finalmente á água. Em adição aos sistemas
citotóxicos dependentes de oxigênio, eles possuem uma variedade de
grânulos que possuem atividade microbicida através da secreção de elastase,
colagenase, lipase, desoxirribonuclease, polissacaridase, sulfatases,
fosfatases e defensinas, além de intermediários reativos de nitrogênio
(Elsbach & Weiss, 1988; Vazquez-Torres & Balish, 1997). O “burst
respiratório” requer a ativação de uma oxidase NADPH, quando o estímulo é
externo (McPhail & Snyderman, 1983), e resulta numa atividade alterada do
complexo oxidase da membrana e a redução de oxigênio molecular a
superóxido (Babior, 1984), que é rapidamente convertido a peróxido de
hidrogênio e radicais hidroxila, provendo assim atividade oxidativa e
microbicida dentro do fagossoma e no ambiente extracelular.
Uma segunda conseqüência da interação receptor-ligante é a liberação
de ácido aracdônico pela fosfolipase A2, provenientes de estoques celulares
de fosfolipídios e sua subseqüente conversão via lipooxigenases ou
ciclooxigenases (COX) a leucotrienos e prostaglandinas, respectivamente
(Pawlowski et al., 1983). Os macrófagos são a maior fonte destes produtos e
sua liberação constitui um importante aspecto na função destas células
(Bonney & Davies, 1984). Os metabólitos do ácido aracdônico incluem
prostaciclina, tromboxana, PGE2 e LTB4 (Pawlowski et al., 1983). A fosfolipase
A2 regula a disponibilidade de ácido aracdônico, pois ela é responsável pela
clivagem do ácido de sua forma estocada em reservatórios de fosfolipídios
neutros. Os níveis de lipooxigenases ou COX controlam o padrão do
metabolismo para o ácido aracdônico liberado.
A Prostaglandina E1 (PGE1) e E2 (PGE2), produto do ácido aracdônico,
possuem papel de auto-regulação. Isto é devido a regulação da participação
do macrófago na inflamação por um segundo sistema mensageiro envolvendo
cAMP. Tanto PGE1 quanto PGE2 elevam a concentração de cAMP em
7
leucócitos através da ativação da adenilato ciclase, mediada por receptor
(Takenawa et al., 1986). O aumento dos níveis de cAMP atenua a ativação do
macrófago induzido por quimiocina (quimioatraentes). Algumas quimiocinas
como o MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) também aumentam o nível
de cAMP celular, através da inibição da destruição de cAMP, mediada por
cálcio. Isto pode servir como uma ação de auto-regulação da ativação em
leucócitos, induzida por quimiocina (Chantry et al., 1998; Snyderman & Uhing,
1988).
No controle de tumores, os macrófagos agem de três maneiras: inibindo
a divisão do tumor (através da liberação de mediadores que agem em todas as
células presentes que estão proliferando), contato direto resultando em lise
tumoral (TNF-α e serina proteases são os maiores candidatos a mediadores
tóxicos, além da possível participação de intermediários reativos de oxigênio –
Adams & Hamilton 1984, 1988) e citotoxicidade celular dependente de
anticorpos (a destruição do tumor realizada pelo macrófago ocorre após
opsonização deste por anticorpos) (Adams & Hamilton 1984; 1988).
1.1.1.3- Célula apresentadora de antígenos: como as células dendríticas,
macrófagos têm também função ativa na apresentação de antígenos. Há
ingestão de partículas (próprias ou estranhas) por endocitose, processamento
(através da redução destas partículas a peptídios), e posteriormente exposição
do antígeno à superfície, via MHC, que é apresentado aos linfócitos T
(Germain & Margulies, 1993). A apresentação via MHC pode ser classe I ou
classe II. Em geral, antígenos apresentados por moléculas MHC da classe I
vêm de proteínas do citosol, enquanto antígenos apresentados por moléculas
MHC da classe II vêm de proteínas do ambiente extracelular. Após
apresentação aos linfócitos há produção de linfocinas como IFN-γ, que atua
em macrófagos aumentando suas capacidades efetoras importantes na
imunorregulação (Stark et al., 1998).
A chave de todo perfil desempenhado pelo macrófago é a presença de
diversos receptores apresentados em sua superfície, garantindo assim grande
habilidade e versatilidade de respostas frente à patógenos e às diversas
condições do organismo. São os receptores que alteram e determinam o
controle das atividades dos macrófagos como diferenciação, reconhecimento,
8
endocitose, migração e secreção de moléculas envolvidas na modulação da
ativação celular e da resposta imune.
1.2- Corpos lipídicos
A formação de CL intracelulares ocorre em algum ponto do ciclo de vida
de praticamente todos os organismos incluindo plantas, mamíferos, algas,
protozoários e leveduras, bem como alguns procariotos (revisado em Zweytick
et al., 2000). Foi observado que os CL estocam lipídios neutros (ácidos
graxos) para obtenção de energia, para biogênese de membranas (ácidos
graxos e colesterol), e ou para formação de componentes lipofílicos
específicos (hormônios esteróides). Diferentes tipos celulares possuem
composições lipídicas distintas. Em vertebrados, CL de adipócitos, ricos em
triacilglicerol provêem a maior fonte de estoque de energia para o corpo,
enquanto que CL de muitas outras células ricos em colesterol fornecem
material para síntese local de membrana e reparo.
Há evidências que a formação de CL compartimentalizando enzimas é
um evento celular altamente regulado e que estas estruturas desenvolvem
papel chave no aumento da capacidade de leucócitos em gerar eicosanóides
sob condições inflamatórias (Bozza & Bandeira-Melo, 2005; D’Ávila et al.,
2008).
A composição protéica dos CL é bem heterogênea, com proteínas
estruturais (família PAT - Perilipinas, Adipofilinas – também conhecidas como
ADRP, do inglês: adipose differentiation-related protein - e TIP 47 – proteína
de interação de porção terminal de 47 kilodaltons – do inglês – tail interacting
protein of 47 kilodaltons), enzimas metabólicas, quinases (MAP quinases – do
inglês - mitogen activated protein; PI3K - fosfatidilinositol-3-quinase; PKC-
proteína quinase C) (Yu et al., 1998, 2000), proteínas da família Rab (Ozeki et
al., 2005), GTPases (Liu et al., 2004; Fujimoto et al., 2004), enzimas
relacionadas a formação de eicosanóides (Dvorak et al., 1993; Bozza et al.,
1997, 1998; Pacheco et al., 2002; Bozza & Bandeira-Melo, 2005) e caveolina
(Fujimoto et al., 2001; Brasaemle et al., 2004; Pol et al., 2004, Wan et al.,
2007; Martin & Parton, 2005). Portanto, os CL podem funcionar não somente
no metabolismo lipídico (biogênese e catabolismo), como também no tráfego
de membrana e sinalização intracelular. Funções inflamatórias e
imunorregulatórias também têm sido descritas (Weller et al., 1999; Pacheco et
9
al., 2002; Bandeira-Melo et al., 2002; Melo et al., 2003, 2006; Bozza et al.,
2007). A diferente composição protéica do CL indica que este compartimento é
complexo e metabolicamente ativo (Murphy, 2001; van Meer, 2001; Tauchi-
Sato et al., 2002).
Embora a presença de CL em células e tecidos tenha sido percebida
logo nas primeiras observações de seções histológicas coradas, a elucidação
das funções e composição dos CL é relativamente recente. As primeiras
hipóteses a respeito das funções desempenhadas pelos CL datam da década
de 70 (Brown et al., 1975; Brown & Goldstein, 1976; Goldstein et al., 1974).
Estas hipóteses sugeriam que esta organela provia um mecanismo
homeostático para regular níveis intracelulares de lipídios (Greenberg et al.,
1991). Apesar das especulações de que os CL funcionavam como uma
importante fonte de colesterol para manutenção, reparo e síntese de
membranas poucos estudos direcionados à formação e dissolução destas
organelas foram realizados durante as décadas de 70 e 80. Em 1991, no
laboratório de Constantine Londos, foram identificadas as perilipinas em
adipócitos (Greenberg et al., 1991). Esta descoberta permitiu entender um
pouco a respeito do funcionamento desta organela, já que a perilipina recobre
a superfície do CL e desempenha papéis críticos na regulação do metabolismo
de lipídios neutros.
1.2.1- Composição do corpo lipídico
CL consistem de uma monocamada de fosfolipídios anfipáticos,
glicolipídios e ou esteróis que circundam um centro de lipídios neutros. Na
maioria das células a cerne de lipídios neutros contém triacilglicerol e ésteres
de colesterol. Este cerne também pode estocar ésteres de retinol e ou lipídios
da classe de diacilglicerol (Bartz et al., 2007). Esta variação na composição
lipídica está relacionada ao tipo celular e a função requerida desta organela
em determinado tecido. CL ricos em triacilglicerol funcionam como depósito de
energia sendo mobilizado para produção de ATP através da β-oxidação em
tecido muscular (Brasaemle, 2007).
CL de macrófagos podem conter ésteres de esterol, triacilglicerol e
colesterol. O colesterol requerido para a geração de CL em macrófagos é
importado de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidada por radicais livres
(Ross, 1993). O influxo de partículas de lipídios oxidados pode romper o
10
sistema normal para a esterificação de colesterol e a conversão em CL
citosólicos, levando a uma hiperacumulação de colesterol esterificado e não-
esterificado. A proteína responsável pela esterificação do colesterol e sua
conseqüente conversão de uma bicamada lipídica a componente de CL é acil-
CoA:colesterol acil- transferase (ACAT) (Chang et al., 1995).
Esta organela é coberta por um ou mais de 5 membros da família de
proteínas perilipina, incluindo adipofilina, TIP 47, perilipina, OXPAT ( proteína
da família PAT expressa em tecidos oxidativos, também chamada de MLDP –
do inglês – Myocardial Lipid Droplet Protein- ou LSDP5 – do inglês – Lipid
Storage Droplet Protein 5 ), S3-12, LSD1 - presentes em vertebrados - e LSD2
- presentes em insetos - (do inglês – Lipid Storage Droplet proteins 1 e 2).
Membros desta família compartilham níveis variados de seqüência de
similaridade, associação a CL e funções na estabilização do CL. Dentre estas
proteínas a perilipina possui maior representatividade (Blanchette-Mackie et
al., 1995; Servetnick et al., 1995; Brasaemle et al., 1997), sendo a mais
estudada (Brasaemle et al., 2008). Ela desempenha importantes funções na
regulação da lipólise estimulada pela regulação basal e hormonal.
A proteína ADRP parece atuar como proteína estrutural que circunda os
CL, em diferentes tipos celulares, servindo de centro de nucleação para
acumulação de lipídios e/ou agindo como âncora dentro da célula (Heid et
al.,1998; Nakamura & Fujimoto, 2003; Brasaemle et al., 2004). Esta proteína é
descrita como uma proteína marcadora específica de CL (Brasaemle et al.,
1997; Heid et al.,1998). A ADRP é considerada um eficiente transportador de
ácidos graxos livres (Gao & Serrero, 1999; Serrero et al., 2000, Atshaves et al.,
2001), apesar de se ligar com alta afinidade a colesterol para deslocar ácidos
graxos (Atshaves et al., 2001). Robenek et al. (2006) sugerem que a ADRP
está envolvida pelo menos no crescimento, senão na formação inicial de CL, já
que muitos papéis funcionais têm sido propostos para esta proteína como
empacotamento de lipídios neutros dentro de CL (Brasaemle et al., 1997) e
lançamento de substratos lipídicos para os CL (Gao & Serrero, 1999), bem
como modulação da lipólise (Larigauderie et al., 2004).
1.2.2- CL nas células
Estas organelas estão presentes em neutrófilos, eosinófilos, linfócitos,
mastócitos, monócitos/macrófagos, normalmente em número limitado (Dvorak
11
et al., 1983; Galli et al., 1985; Weller et al., 1985; Weller et al.,1991 a; Weller et
al., 1991 b; Melo et al., 2006). O aumento no número e tamanho de CL em
macrófagos relacionados à doença infecciosa (Weller et al., 1999; Pacheco et
al., 2002; Melo et al., 2003; D’Avila et al., 2006), reforça a idéia da formação do
CL como um evento natural em células envolvidas na inflamação (Melo et al.,
2003), podendo funcionar como marcador estrutural de células engajadas no
processo inflamatório (Melo et al., 2006). A geração e função destas organelas
ainda não estão completamente definidas.
Algumas doenças humanas como arterioesclerose, esteatoses,
obesidade, diabetes e certos tipos de câncer (Heid et al.,1998; Murphy &
Vance, 1999; Martinez-Botas et al., 2000; Larigauderie et al., 2004; Mishra et
al., 2004) estão ligadas ao mau funcionamento do metabolismo de CL, sendo
demonstrada a presença de proteínas não esperadas na superfície de CL em
condições patológicas (Cole et al., 2002). A excessiva acumulação de CL
em macrófagos desempenha importante papel no desenvolvimento de
arterioesclerose (Xu et al, 2006). Entender a formação das células espumosas,
os caminhos para impedir o acúmulo de CL em macrófagos e os mecanismos
que aumentam a produção de eicosanóides podem ser de valor terapêutico
para prevenir a arterioesclerose e para intervenção farmacológica
antiinflamatória (Li & Glass, 2002). Várias drogas têm sido descritas como
capazes de inibir a formação de CL (Bozza et al., 1996, 2002; Vieira-de-Abreu
et al., 2005), tais como: indometacina, aspirina e outras drogas
antiinflamatórias não esteróides - salicilato de sódio, NS-398 (Bozza et al.,
1996, 2002; Vieira-de Abreu et al., 2005), porém nenhum inibidor específico foi
ainda identificado. A hipótese da inibição da formação de CL como alvo para
terapia antiinflamatória tem sido testada em diferentes modelos.
1.2.3- Geração de corpo lipídico
Os CL também se associam à diferentes organelas no interior celular.
Associações com mitocôndria, fagossomo, peroxissomo, ribossomo,
membrana perinuclear e até vesículas secretórias têm sido descritas (Wan et
al., 2007; Binns et al., 2006; Dvorak et al., 1983; Dvorak et al., 2003; D’Ávila et
al.,2006; van Manen et al., 2005). As interações melhores caracterizadas são
relativas às cisternas do retículo endoplasmático (RE) liso (Dvorak et al., 1991;
Bozza et al., 1997, Ozeki et al., 2005; Martin & Parton, 2005).
12
Estudos mostram evidências consistentes que a geração de CL ocorre
no RE (Londos et al., 1999; Zweytick et al., 2000; Martin & Parton, 2005;
Coppens & Vielemeyer, 2005), o que explicaria a organização do CL, com
cerne de lipídios neutros circundados por uma monocamada de fosfolipídios
(Brown, 2001; Murphy, 2001; Tauchi-Sato et al., 2002). Os lipídios neutros são
sintetizados a partir de ácidos graxos e colesterol, por enzimas do RE. A
geração dos CL ocorre entre os dois folhetos da membrana do RE. Ao
alcançar determinado tamanho eles se desprendem levando consigo uma
monocamada de membrana. Apesar deste modelo corrente ser consistente,
Robenek et al. (2006) têm mostrado que a geração de CL pode ser diferente
dos modelos de biogênese desta organela até agora apresentados, porém a
gênese desta organela continua relacionada ao RE.
A geração de CL pode ser estimulada pela presença no meio
extracelular de lipídios agonistas como ácidos graxos cis-insaturados, ácido
oléico (Chen et al., 2002; Huang & Chen, 2006) e ácido aracdônico (van
Manen et al., 2005) (Bozza et al., 1996; Weller et al., 1989). Porém, a oferta de
ácidos graxos saturados não é capaz de induzir a formação desta organela ao
passo que estímulos de natureza protéica, como citocinas e quimiocinas o são
(Bozza et al., 1998; Bartemes et al., 1999; Bandeira-Melo et al., 2001, 2002;
Maya-Monteiro et al., 2008; Pacheco et al., 2007). Isso reflete a complexidade
e especificidade da regulação de estímulos que disparam a geração desta
organela. Além dos ácidos graxos insaturados, outros estímulos são capazes
de induzir a formação de CL. Dentre eles estão o PAF (fator de ativação de
plaquetas) (Bozza et al., 1996; de Assis et al., 2003), ativadores de PKC, como
ésteres de forbol (Bozza et al., 1996; Pacheco et al., 2002; Weller et al., 1991)
e lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas (Pacheco et al., 2002,
Bozza & Bandeira-Melo, 2005).
Tem sido relatada que a incubação de macrófagos e de outras células,
envolvidas ou não na inflamação, com LDL acetilada (Greenspan et al., 1985;
Robenek et al., 2005; Klinkner et al., 1995), ou LDL oxidada (Pacheco et al.,
2002; Xu et al., 2006) dispara a geração de CL, ao passo que a LDL em sua
forma nativa não causa esta geração. A incubação de macrófagos com estas
moléculas tem sido utilizada para a geração de modelos de macrófagos “tipo
células espumosas” presentes na placa arterioesclerótica. Desta forma a
13
morfologia e formação destas células têm sido estudadas. No nosso modelo, a
geração do CL se dá simplesmente pelo cultivo de macrófagos com SH, sendo
um importante modelo para análise da gênese e dos fatores indutores de CL,
assim como as prováveis mudanças funcionais desta célula.
1.3- Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, doença que
acomete em torno de 50% da população mundial além dos outros animais
homeotérmicos (Ferguson, 2002). Este parasita pertence ao reino protista, filo
Apicomplexa, classe Conoidasida, subclasse Coccidia, ordem Eucoccidiida,
subordem Eimeriida, família Sarcocystidae, subfamília Toxoplasmatinae,
gênero Toxoplasma, espécie Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1908).
T. gondii é adaptado a vida intracelular e seu ciclo é dividido em 2 fases:
assexuada e sexuada (Ferguson, 2002).
1.3.1- Ciclo biológico
Há três tipos de estágios infectivos de T. gondii: taquizoítos (“tachos” =
rápido em grego), forma multiplicativa presente na fase aguda da infecção;
bradizoítos (“brady” = devagar em grego), forma replicativa lenta presente em
cistos teciduais, muito observado na fase crônica; esporozoítos presentes em
oocistos liberados por felídeos (Dubey & Frenkel, 1973; Dubey et al., 1998).
A fase assexuada do ciclo biológico do T. gondii ocorre em tecidos de
vários hospedeiros vertebrados homeotérmicos, intermediários ou definitivos. A
fase sexuada ocorre exclusivamente no epitélio intestinal de felinos,
hospedeiros definitivos, no qual os oocistos são gerados e liberados nas fezes
contaminando o ambiente e, consequentemente, outros hospedeiros (revisto
por Holliman, 1997). Normalmente, a fase assexuada gera, de forma peculiar,
dois novos parasitos a cada ciclo celular mitótico, sendo este processo
denominado “endodiogenia” (Scheffield & Melton, 1968). É no hospedeiro
definitivo que ocorre a gamogamia, diferenciação das formas replicativas em
gametas, onde após fecundação gera-se o oocisto. Os oocistos em contato
com o ar atmosférico sofrem esporogonia – esporulação (Dubey et al., 1998)
com o aparecimento de dois esporocisto contendo quatro esporozoítos.
1.3.2- Transmissão do parasita
O grande sucesso deste parasita está no fato da coexistência benigna
com o seu hospedeiro na maioria das infecções. Ademais, sua habilidade de
14
interconversão, promove um metabolismo que se adequa à sua sobrevivência
e multiplicação dependendo do tipo de resposta imune de seu hospedeiro,
tendo, sobretudo, estocagem apropriada de nutrientes (Coppin et al., 2003).
A infecção deste parasita se dá mediante invasões de células
eucarióticas do hospedeiro. Isto pode ocorrer através da ingestão de água
contaminada com oocistos ou comida contaminada com oocistos ou cistos
teciduais, contato direto com taquizoítos e até por meio de contato com insetos
carreadores das formas do parasita (principalmente a barata) (Bahia Oliveira et
al., 2003). Até em mamíferos marinhos como golfinhos, baleias e outros
animais têm-se encontrado relatos acerca de infecção causada pelo T. gondii
(Dubey et al., 2003). Após ter acesso ao organismo do hospedeiro
intermediário, o T. gondii segue pelo trato digestório onde, em contato com
enzimas do suco gástrico, liberam as formas infectivas no intestino, os
esporozoítos de oocistos ou bradizoítos de cistos teciduais. Estes, por sua vez,
penetram em células do epitélio intestinal onde se diferenciam e se dividem
originando taquizoítos. Os taquizoítos invadem e se multiplicam em grande
variedade celular, podem ser convertidos em bradizoítas gerando cistos
teciduais, sendo encontrados em diversos tecidos, particularmente no sistema
nervoso central e no músculo (Dubey et al., 1998).
A persistência de cistos teciduais pode ocorrer por toda a vida de um
indivíduo, sendo que algum cisto pode se romper liberando bradizoítos, porém
são normalmente controlados pelo sistema imune. Em caso de pacientes
imunocomprometidos, os bradizoítos não são controlados se multiplicando e
invadindo diversos tecidos levando a morte do hospedeiro.
Outra forma de se adquirir a toxoplasmose é a infecção congênita ou
vertical que ocorre quando taquizoítos atravessam a placenta infectando o feto
e tecidos do embrião (Jones et al., 2001). Este tipo de infecção geralmente
resulta da infecção aguda materna durante a gravidez. Em caso de grávidas
na fase crônica da doença, a transmissão pode ocorrer devido alguma
disfunção imune que leve a reativação da doença (Remingtom et al., 1994). A
severidade da doença congênita é inversamente proporcional a idade
gestacional, sendo os primeiros três meses fatais.
15
1.3.3- Invasão da célula hospedeira
Toxoplasma gondii é capaz de invadir e se multiplicar em qualquer célula
nucleada. A invasão pode ocorrer de duas maneiras, por fagocitose ou por
penetração ativa (Werk, 1985; Dobrowolski & Sibley, 1996; Dobrowolski et al.,
1997; Dowse & Soldati, 2004). Este parasita invade ativamente diversos tipos
celulares num processo dependente de um motor de actina-miosina
(Dobrowolski & Sibley, 1996; Sibley, 2003). Para isto é necessária a adesão às
células, principalmente pela região apical do parasita onde há participação de
proteínas adesivas provenientes de organelas secretoras: micronemas (Soldati
et al., 2001) e róptrias (Dubremetz, 2007; Boothroyd & Dubremetz, 2008). As
moléculas secretadas por ambas organelas são importantes para a entrada do
parasita na célula hospedeira e subversão de suas funções microbicidas
(Boothroyd & Dubremetz, 2008). O movimento da estrutura apical do parasita,
o conóide, também está relacionado com a penetração e criação de um
vacúolo contendo o parasita denominado de “vacúolo parasitóforo”. Neste
vacúolo existe um ambiente intracelular adequado para o crescimento e
desenvolvimento do parasita (Chiappino et al., 1984). Grânulos densos
(Blackman & Bannister, 2001) também são organelas secretoras do parasita.
Seus conteúdos são descarregados logo após a invasão e associam-se com a
membrana do vacúolo parasitóforo. Estas moléculas têm função na aquisição
de nutrientes da célula hospedeira (Carruthers, 2000; Denkers & Butcher,
2005). Além do mais, este processo é criticamente dependente da mobilização
de cálcio do meio extracelular e de reservatórios internos do parasito –
acidocalcisomas (Moreno & Zhong, 1996), revisado recentemente por Miranda
et al.(2008).
As róptrias auxiliam na geração da membrana do vacúolo parasitóforo
(VP), formado majoritariamente por lipídios da membrana plasmática da célula
hospedeira e somente 20% de lipídios secretados pelo próprio parasita (Suss-
Tobby et al., 1996; Coppens & Joiner, 2003). Estudos revelam que lipídios e
algumas proteínas tanto do parasita quanto da célula hospedeira são
incorporados a membrana do VP (MVP) (Coppens & Joiner, 2001; Charron &
Sibley, 2002).
A atividade de algumas enzimas dos parasitos parece também estar
envolvida no processo de invasão, incluindo uma fosfolipase A2 dependente
16
de cálcio, uma fosfolipase C específica para fosfatidilcolina e uma serina
protease (Saffer & Schwartzman, 1991; Ricard et al., 1999; Conseil et
al.,1999).
Enquanto ocorre a internalização do parasita, há a formação de uma
estrutura transitória, a junção móvel (Mordue et al., 1999a). Ela permite que
proteínas da célula hospedeira sem porção citoplasmática integrem a MVP, o
que o faz diferente substancialmente das membranas endossomais, não
fazendo parte da via endomembranar escapando, assim, da fusão com o
lisossomo (Mordue et al., 1999b). A junção móvel representa também um
ponto importante, onde possivelmente ocorre conexão entre o citoesqueleto da
célula hospedeira e do parasito (Mordue et al., 1999a). O VP é um
compartimento essencial para a sobrevivência do parasita na célula
hospedeira. Ele protege o parasita do ataque da célula hospedeira enquanto
permite a utilização de componentes desta célula para sobrevivência,
crescimento e multiplicação.
1.3.4- Sucesso do parasita
O parasita possui apenas uma mitocôndria, que se mantém funcional
após a invasão e formação do VP. Depois de alcançado o meio interno da
célula hospedeira, o parasita estrutura a posição de organelas celulares, como
mitocôndrias e RE da célula hospedeira. Desta forma estas organelas se
localizam no entorno do VP se associam com a MVP, facilitando a
incorporação de elementos provenientes destas organelas, além de receber
nutrientes de baixo peso molecular por passagem passiva (Sinai et al., 1997),
permitindo assim, a sobrevivência e crescimento do T. gondii. Isto também
pode estar relacionado à incapacidade do T. gondii de sintetizar de novo
alguns fosfolipídios (Azzouz et al., 2002). Magno et al. (2005) sugerem que a
MVP sofre modificações no decorrer do processo de infecção para facilitar a
sobrevivência e a proliferação do patógeno dentro da célula hospedeira,
garantindo assim o curso da doença.
O metabolismo lipídico celular é de extrema importância para a
replicação do parasita. Coppens & Joiner (2003) mostraram que a depleção de
colesterol da membrana da célula hospedeira por processos farmacológicos
seguida de retirada de colesterol residual antes da interação com os parasitas
causou redução da taxa de invasão e formação do VP. O colesterol exógeno é
17
rapidamente entregue ao VP concentrado-se no parasita. T. gondii é altamente
dependente da interceptação ativa de colesterol derivado de LDL (Coppens et
al., 2000). Em células infectadas a endocitose de LDL, mediada por
receptores, sofre aumento significativo quando comparada com células não
infectadas (Foussard et al., 1991).
Com isso há necessidade de entender como CL de macrófagos se
associam ao VP contendo o T. gondii. A presença dos CL deixariam os
macrófagos menos microbicidas contra o T. gondii?
1.3.5- Lipídios em Toxoplasma gondii
Os lipídios são de fundamental importância na manutenção de estruturas
celulares. A membrana biológica do T. gondii é composta por complexa mistura
de lipídios neutros e polares, onde 3 categorias são encontradas: lipídios
obtidos diretamente da célula hospedeira; lipídios sintetizados completamente
pelo parasita sem o auxílio da célula hospedeira; lipídios obtidos da célula
hospedeira modificados pelo parasita (transformação no parasita de lipídios
precursores da célula hospedeira em lipídios complexos). Apesar do T. gondii
ter a capacidade autônoma para sintetizar fosfolipídios, está sempre pronto a
captar precursores da célula hospedeira com o intuito de construir lipídios mais
complexos (Charron & Sibley, 2002; Gupta et al., 2005).
Toxoplasma gondii possui deficiência enzimática para a síntese de
moléculas de esterol, sendo, portanto, necessário o desvio destes lipídios,
intactos, do citoplasma da célula hospedeira para o parasita (Coppens et al.,
2000). A síntese de triacilglicerol no T. gondii é localizada no RE e o lipídio é
estocado em CL localizados no citoplasma do parasita (Quittnat et al., 2004).
Toxoplasma gondii também possui grande variedade de
glicerofosfolipídios sendo fosfatidilcolina o lipídio mais abundante (75% dos
fosfolipídios), seguido de fosfatidiletanolamina (10%), fosfatidilinositol (6%) e
ácidos fosfatídicos (1%) (Gupta et al., 2005). A síntese de fosfatidilcolina é
estimulada em resposta a invasão e replicação do parasita dentro das células
hospedeiras (Charron & Sibley, 2002). Há presença de colesterol na membrana
do T. gondii, derivado principalmente de LDL internalizado pela célula
hospedeira (Coppens et al., 2000). Este parasita também é competente para
sintetizar ésteres de colesterol graças à presença da acil-CoA: colesterol
18
aciltransferases no RE. Estes ésteres de lipídios são os lipídios neutros mais
abundantes em CL do parasita (Nishikawa et al., 2005).
Glicosilfosfatidilinisitol, a maior classe de glicolipídios em T. gondii, serve
como âncora na membrana plasmática para grande número de proteínas
(Tomavo et al., 1992; Striepen et al., 1997; Zinecker et al., 2001). Sua geração
começa no RE do parasita com a transferência de N-acetilglucosamina para
fosfatidilinositol (Wichroski & Ward, 2003).
Muitos experimentos foram realizados para analisar o tráfego lipídico da
célula hospedeira para T. gondii. Para isto sondas lipídicas fluorescentes ou
radioativas foram usadas para se entender a captação e a interconversão de
lipídios exógenos. Vacúolos intracelulares de T. gondii contêm muitas
estruturas esféricas neutras positivas para vermelho nilo (Sonda et al., 2001;
Charron & Sibley, 2002; Quittnat et al., 2004), confirmando a habilidade de
estocagem de colesterol pelo parasita em CL (Nishikawa et al., 2005).
Após a entrada do T. gondii na célula há uma reorganização de
organelas da célula hospedeira. O VP rapidamente se torna fisicamente
associado à mitocôndria, RE e complexo de Golgi (CG) (Sinai et al.,1997; Sinai
& Joiner, 2001). Este posicionamento do VP próximo a mitocôndria e RE pode
representar zonas privilegiadas de troca de lipídios. Uma transferência direta
de fosfolipídios pode ocorrer da mitocôndria do hospedeiro para regiões da
membrana do VP. Perturbação das proteínas do parasito que medeiam a
retenção organelar na MVP, como por exemplo, róptrias deficientes quanto ao
seu conteúdo, resulta na falha do recrutamento da mitocôndria hospedeira pelo
VP para adquirir lipídios da célula hospedeira, induzindo a detenção do
crescimento do parasita tanto in vitro, quanto em camundongos (Nakaar et al.,
2003). Estudos morfológicos ilustram que T. gondii é equipado para desviar
grande variedade de lipídios de diferentes estruturas celulares da célula
hospedeira, como membrana plasmática (MP), CG e endolisossomos (EL). Os
lipídios obtidos diretamente da célula hospedeira são inseridos na MVP
concomitantemente à invasão do parasita, ou são internalizados pelos
parasitas para ser subseqüentemente translocados a compartimentos
específicos, incluindo MP, CG, RE, CL e róptrias.
Toxoplasma gondii, tanto intravacuolar quanto livre, é competente na
captação de vários ácidos graxos de seu ambiente (Quittnat et al., 2004).
19
Parasitas extracelulares expressam receptores únicos de superfície que
seletivamente se ligam e captam lipoproteínas do meio de cultura ou da célula
hospedeira (Seghal et al., 2005).
Estudos utilizando colesterol radioativo mostram sua parcial conversão
em ésteres de colesterol, sendo estocado em CL (Nishikawa et al., 2005;
Seghal et al., 2005). Sob condições de excesso de LDL, a atividade de
esterificação de colesterol é significantemente aumentada, indicando que
parasitas controlam adaptativamente o suprimento massivo de colesterol pela
produção da forma estocada de colesterol. A esterificação do colesterol pelo
hospedeiro e parasito é essencial para ótima proliferação do T. gondii (Sonda
et al., 2001).
Apesar da segregação do VP com o sistema endomembranar da célula
hospedeira, o VP obtém lipídios exógenos ou seus precursores a partir da
célula hospedeira. Isto implica na existência de mecanismos moleculares para
translocação de lipídios através da MVP e MP do parasita, e para tráfego
regulado para compartimentos intra-parasita próprio. Coppens et al. (2006)
mostrou que vesículas endocíticas são entregues ao espaço do VP, porém de
maneira indiscriminada. Isso foi possível devido a condutos formados por
invaginações mediadas por microtúbulos (Coppens et al., 2006). Além disso, o
parasita pode também ganhar acesso a fontes potenciais de lipídios pelo
recrutamento de RE e mitocôndria da célula hospedeira que se associam ao
VP (Sinai et al., 1997). A subseqüente produção de precursores lipídicos em
lipídios complexos aponta para a habilidade dos parasitas em explorar
competentemente as reservas lipídicas da célula hospedeira.
As proteínas que são constitutivamente liberadas dentro do VP pelos
parasitas em crescimento desempenham papel instrumental na aquisição de
lipídios da célula hospedeira. Isto foi observado por Schwab et al. (1994), em
que a habilidade do T. gondii de modificar a permeabilidade da MVP permite
livre difusão de pequenas moléculas como açúcares, aminoácidos, bases
nucleares e co-fatores provenientes do citoplasma da célula hospedeira para o
espaço vacuolar.
1.3.5.1- Colesterol
Toxoplasma gondii é auxotrófico para colina e colesterol. A falta de
colina e colesterol, bem como seu bloqueio tem um efeito desfavorável para o
20
crescimento do parasita. A remoção de LDL do meio resulta na detenção da
multiplicação do parasito (Coppens & Joiner, 2003) pela falta de mecanismos
compensatórios para repor colesterol. O excesso de colesterol desviado pelo
parasita é rapidamente neutralizado e estocado em CL (Sonda et al., 2001).
Este parasita desvia colesterol de derivados de LDL que tenham
transitado através de lisossomos da célula hospedeira (Coppens et al., 2000;
2006). O colesterol derivado de LDL é transportado de lisossomos para a
membrana da célula antes de sua redistribuição a vários compartimentos
celulares por mecanismos indefinidos (Haynes et al., 2000). A transferência de
colesterol de pós-endo-lisossomos para VP ocorre de maneira contrária ao
colesterol derivado de LDL, não envolvendo a membrana plasmática
hospedeira como intermediário (Seghal et al., 2005).
O movimento de colesterol para o VP requer temperatura permissiva
para transporte vesicular, energia metabólica e microtúbulos funcionais. A
presença de proteínas ligadoras de colesterol na MVP e na membrana
plasmática promove a entrega de colesterol ao T. gondii.
Células infectadas com T. gondii têm seu consumo de colesterol
aumentado em até três vezes (Coppens et al., 2000), porém, apesar do desvio
de colesterol ser alto, as membranas das organelas da célula hospedeira
contêm colesterol e CL são formados normalmente (Seghal et al., 2005).
21
OBJETIVOS
Objetivo geral
Analisar o efeito do cultivo com soro homólogo de macrófagos
peritoneais de camundongos verificando ação microbicida e associação de
corpo lipídico com Toxoplasma gondii.
Objetivos específicos
• Analisar a natureza das vesículas que aparecem nos macrófagos
peritoneais de camundongos cultivados com soro homólogo;
• Estudar a ação microbicida dos macrófagos cultivados com soro
homólogo e soro fetal bovino analisando produção de óxido nítrico e
prostaglandina E2, e multiplicação de taquizoítos de T. gondii;
• Utilizar inibidores da via ciclooxigenase para bloquear a produção de
prostaglandina E2 e testar a ação microbicida destes macrófagos;
• Analisar a associação de corpo lipídico ao vacúolo parasitóforo.
22
MATERIAIS E MÉTODOS
1- Obtenção e cultura de células
1.1- Macrófagos
Os macrófagos foram obtidos após lavado peritoneal em camundongos
Suíços, machos, adultos (10 ml de Hank’s por animal). Para plaqueamento em
placa de 24 poços foram usados 4 animais, e para garrafa de 25 cm2 2 animais
por experimento. A suspensão celular do lavado foi centrifugada a 500 g por 10
min a 4° C. O sedimento foi ressuspenso em 4 ml de solução de Hank’s, sendo
que para placas de 24 poços foram semeados 150 µl por poço. Após aderência
de 1 h a 37° C, atmosfera de 5% de CO2, as células foram lavadas 2 vezes e
cultivadas em Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) com 2% de soro
homólogo (SH) ou fetal bovino (SFB).
1.2- Obtenção de soro homólogo
O SH foi obtido a partir da coleta de sangue de camundongos por punção
cardíaca utilizando seringa de 3ml e agulha 26 G. O sangue coagulou na
seringa por 6h a 25 ºC. O soro foi coletado com pipeta Pasteur, transferido para
tubos cônico e centrifugado a 600g por 10 min a 4° C, sendo posteriormente
inativado (30 min, 56 ºC), aliquotado (200 µl) e estocado no freezer a -20º C.
1.3- Toxoplasma gondii
Taquizoítos de T. gondii (cepa RH) foram mantidos por meio de
passagens na cavidade peritoneal de camundongos realizadas a cada 2 ou 3
dias de infecção. Para obtenção dos parasitas foi realizado lavado peritoneal
(5 ml de Hank’s por animal), o qual foi centrifugado a 500g por 10 min a 4 ºC.
O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 1000g por 10 min a 4º C. Os
parasitas foram ressuspensos em 1 ml de DMEM e contados em câmara de
Neubauer.
2- Interação com Toxoplasma gondii
Interação do T. gondii com macrófagos foi realizada para determinar: a)
desenvolvimento do parasita (ação microbicida) em macrófago cultivados com
SH e SFB e b) associação dos CL dos macrófagos cultivados com SH com o
VP. Nos dois casos os macrófagos foram cultivados por 24h e a interação foi
realizada com 5 X 105 parasitas por poço. Após 1h, as células foram lavadas 2
vezes com Hank’s a 37º C para remoção dos parasitas livres.
23
Para se determinar o desenvolvimento do T. gondii, os macrófagos
foram cultivados, sem lamínula, por 5 dias após a interação. Metade da placa
de 24 poços foi ativada (item 3) logo após interação. Em alguns casos 1 µg/ml
de indometacina (inibidor de COX) foi adicionado todos os dias do cultivo,
anteriormente e após a interação, visando verificar o papel da PGE2 na
capacidade microbicida dos macrófagos. Cinco dias após a interação, os poços
foram raspados com ponteira amarela, o sobrenadante homogeneizado
retirando-se uma alíquota de 10 µl, diluída 10 vezes em líquido de contagem (4
% de formalina em PBS) para quantificação dos taquizoítos em câmara de
Neubauer.
Para verificar a associação de CL dos macrófagos com o VP em
microscopia óptica de fluorescência (item 4.3), os macrófagos foram cultivados
sobre lamínulas em DMEM suplementado com SH e submetidos à interação
com T. gondii por 2 e 24 h. Após estes cultivos, os CL e os núcleos celulares
foram marcados com vermelho de nilo e DAPI, respectivamente (item 4.3), e
fotografados no microscópio Zeiss Axioplan equipado com contraste
interferencial de Normanski, iluminação epifluorescente e lâmpada de mercúrio
HBO 50. Para confirmação da associação dos CL com o VP, as células foram
processadas para observação por microscopia eletrônica de transmissão (item
5).
3- Ativação dos macrófagos
Os macrófagos foram ativados de duas formas distintas: a) para
dosagem de NO e PGE2 sem infecção do T. gondii e b) para a avaliação da
multiplicação do parasita.
Na primeira situação, os macrófagos foram cultivados por 1 (tempo de
aderência), 24 e 48 h e ativados com interferona-γ (IFN-γ), 50U/ ml, e LPS, 0,1
µg/ml, por 24 h. Após este período, os sobrenadantes foram coletados e os
níveis de NO e PGE2 avaliados (itens 6 e 7). Na segunda situação, os
macrófagos foram cultivados por 24 h, infectados e ativados com a mesma
concentração de IFN-γ e LPS. Neste caso, os níveis de NO foram avaliados
para confirmar a ativação.
24
4- Preparo do material para observação em microscopia óptica
4.1- Observação dos macrófagos por contraste interferencial.
Os macrófagos foram cultivados por 24 h com os soros, lavados e
fixados em 1% de glutaraldeído em PBS. Após 1 h, as células foram montadas
sobre lâmina com 10 µl de PBS e observadas no microscópio equipado com
contraste interferêncial de Normanski. A área de superfície dos macrófagos SH
e SFB foi avaliada através da análise de 50 células digitalizadas no sistema
Sys em 3 experimentos independentes.
4.2- Marcação de compartimentos ácidos
Os macrófagos cultivados por 48 h em SH ou SFB foram lavados, e
incubados com 5 µg/ml de laranja de acridina (marcador para compartimentos
acídicos) em DMEM a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. Após 20 min, os
macrófagos foram lavados 1 vez com Hank’s, montados sobre lâmina em 10 µl
de DMEM e observados em microscopia de fluorescência utilizando o filtro BP
546.
4.3- Marcação de corpos lipídicos
Os macrófagos foram cultivados por 24 h em SH, fixados com 4% de
paraformaldeído em PBS por 10 min, lavados em PBS e incubados por 15 min
em 1 µg/ml de vermelho de nilo em PBS (Greenspan et al., 1985). As células
foram lavadas, montadas em 0,4µg/ml de DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)
em N-propil-galato e observados em microscopia de fluorescência utilizando o
filtro BP 468.
5- Preparo de material para microscopia eletrônica de transmissão para
detecção de lipídios insaturados
Macrófagos obtidos de lavados peritoneais foram cultivados em
garrafas conforme o item 1. Após 24h de cultivo em SH as células foram
infectadas ou não com o T. gondii, lavadas, e cutivadas por mais 8 h. As
células foram fixadas com 2,5% de glutaraldeído em tampão fosfato (0,1M, pH
7,2), lavadas uma vez em tampão fosfato e em seguida lavadas em tampão
imidazol (0,1M, pH 7,5) e pós-fixadas em 2% de tetróxido de ósmio em tampão
de imidazol por 2 h, protegido da luz. As células foram lavadas novamente,
desidratadas em série acetônica e embebidas em resina epóxi (Epon ®).
25
Cortes semi-finos foram corados com acetato de uranila e fotografados no
microscópio eletrônico de transmissão Zeiss 900.
6- Microscopia eletrônica de varredura
As células foram fixadas em 2.5% de glutaraldeído em tampão
cacodilato de sódio (0,1M, pH 7,2). O material foi lavado em tampão cacodilato
de sódio e pós-fixado em tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato de
sódio, por 10 min. Posteriormente, o material foi lavado em tampão cacodilato
de sódio e desidratado em série acetônica. O material foi seco pelo método do
ponto crítico, metalizado com ouro em aparelho Sputtering (SCD 050 – BAL
TEC) e observado no microscópio eletrônico de varredura, Zeiss-962.
7- Avaliação da produção de óxido nítrico
A produção de NO foi analisada indiretamente pela leitura colorimétrica
do nitrito nos diferentes sobrenadantes das culturas pelo reagente de Griess,
conforme descrito por Green et al. (1992). Foram coletados 50µl do
sobrenadante por poço, misturados na proporção de 1:1 com o reagente de
Griess (1 volume de 1% de Sulfanilamida em 5% de ácido ortofosfórico em
água deionizada com volume igual de 0,1% de N-[1- Naphthyl]
Ethylenediamida em água deionizada) em placa de 96 poços. Após 10 min, a
mistura foi submetida à leitura num espectrofotômetro para placa de 96 poços
utilizando 540 nm como comprimento de onda. A concentração foi calculada
por uma curva padrão pré-calibrada usando nitrito de sódio diluído em DMEM
como padrão (Ding et al.,1998).
8- Avaliação da produção de prostaglandina E2
Os níveis de PGE2 foram avaliados em duplicata através de ensaio
imunoenzimático (EIA) de competição, seguindo protocolo estabelecido pelo
fabricante do kit (Cayman Chemical). As placas eram pré-cobertas com IgG
monoclonal de cabra anti-camundongo. Este ensaio é baseado na competição
entre a PGE2 da amostra e a PGE2 conjugada à acetilcolinesterase, enzima
cujo substrato é acetilcolina. A forma conjugada da PGE2 compete com a
PGE2 da amostra pelos sítios de ligação nos anticorpos monoclonais.
A placa foi montada com 100 µl do EIA Buffer e 50 µl de PGE2 marcada
no controle (“branco”), e nos outros poços foram colocados EIA Buffer,
sobrenadantes de culturas diluídas 100 vezes (amostra), PGE2 conjugada, na
proporção 1:1:1 (50 µl de cada) e incubada “overnight” a temperatura
26
ambiente. A placa foi lavada 5 vezes com Wash Buffer do kit, para remover
qualquer reagente não ligado, e acrescentado 200 µl por poço do reagente
Ellman (reagente contendo acetilcolina). A placa foi coberta com “parafilm” e
papel alumínio sendo submetida à agitação por 2 h até ocorrer a reação.
A intensidade colorimétrica da reação, determinada por
espectrofotometria, é proporcional à concentração de PGE2 conjugada ligada
ao anticorpo em cada poço, a qual é inversamente proporcional à
concentração livre de PGE2 presente no poço durante a incubação. Ou seja,
quanto maior a concentração de PGE2 na amostra, menor será a ligação de
PGE2 conjugada à acetilcolinesterase e, portanto, menor a intensidade
colorimétrica. Os resultados de absorbância foram convertidos em
concentrações de PGE2 por comparação dos dados gerados pela curva-
padrão construída com concentrações conhecidas de PGE2.
9- Análise estatística
As amostras foram analisadas pelo teste t de Student (P≤0,05).
27
RESULTADOS
1- Morfologia dos macrófagos cultivados com soro fetal bovino e soro
homólogo
Os macrófagos cultivados com SFB e SH apresentaram diferenças
morfológicas e estruturais. O macrófago SFB apresenta em sua grande maioria
uma forma estrelada ao se aderir ao substrato enquanto o macrófago SH
apresenta forma alongada unidirecionalmente e grande número de vesículas
(Figura 1 A e B).
Para determinar se existia alguma diferença significativa na área da
superfície destes macrófagos as imagens foram digitalizadas e as áreas foram
calculadas. A área superficial de macrófagos cultivados com SH foi
significativamente (P≤0,05) maior que a área de macrófagos cultivados com
SFB (Figura 2).
Estas diferenças morfológicas foram também confirmadas por
microscopia eletrônica de varredura (Figura 1 C e D). Podemos observar
grande número de protusões na superfície do macrófago cultivado com SFB
(Figura 1 C). Uma membrana com aparência lisa na região onde o contorno
das vesículas se concentra foi observada no macrófago SH (Figura 1 D).
28
Figura 1. Macrófagos cultivados com soro fetal bovino (Mo SFB – A e C) e
macrófagos cultivados com soro homólogo (Mo SH – B e D) observados por
contraste interferencial e diferencial de Normanski e por microscopia eletrônica
de transmissão cultivados por 24 (A e B) e 48 horas (C e D). Espraiamento
estrelado do Mo SFB (A e C) e alongado unidirecionalmente do Mo SH (B e
D). Além da morfologia diferenciada do MoSH pode ser notado a presença de
grande número de vesículas bem como seu contorno (B e D respectivamente -
seta). Barra: 40 µm (A e B) e 20 µm (C e D).
D C
29
Figura 2. Média da área superficial dos macrófagos (µm2) cultivados com soro
fetal bovino (SFB - barra preta) ou soro homólogo (SH - barra branca).
*Valores significativamente diferentes do SFB de acordo com o teste t de
Student (P≤0,05). Área avaliada em 50 células de cada tipo de cultivo em 3
experimentos.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Méd
ia d
a ár
ea d
os m
acró
fago
s
SFB SH
*
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Méd
ia d
a ár
ea d
os m
acró
fago
s
SFB SH
*
30
Buscando descobrir a natureza das vesículas (Figura 1 B - seta) presentes em
macrófagos cultivados com SH, macrófagos cultivados com ambos os soros
foram incubados com laranja de acridina. Esse marcador é um corante vital
que revela o pH de compartimentos exibindo fluorescência verde para
compartimentos de pH não ácidos e fluorescência laranja para compartimentos
de pH ácidos. Ambos os macrófagos apresentaram marcação de numerosas
vesículas de cor laranja-avermelhada por todo citoplasma evidenciando
grande quantidade de compartimentos ácidos (Figura 3 C e D), porém a
marcação foi negativa para as vesículas evidenciadas por contraste
interferencial (Figura 3 A e B). As vesículas observadas nos macrófagos SH
(Figura 3 B) não foram marcadas com laranja de acridina (Figura 3 D),
descartando a possibilidade dessas serem lisossomos.
31
Figura 3. Macrófagos peritoneais de camundongos cultivados por 48 horas
com soro fetal bovino (SFB – A e C) e soro homólogo (SH – B e D) corados
com laranja de acridina. Microscopia de contraste interferencial de Normanski
(A e B). Microscopia de fluorescência (C e D). Pode-se observar numerosas
vesículas coradas com laranja de acridina em C e D. As vesículas
evidenciadas em B não foram coradas em D (setas). Barra: 40 µm.
Estas vesículas foram identificadas como CL após marcação positiva
para coloração de vermelho de nilo (corante fluorescente seletivo para lipídios
neutros) (Figura 4).
A B
C D
32
Figura 4. Macrófagos peritoneais de camundongos cultivados por 48 horas
com soro fetal bovino (SFB – A e B) e soro homólogo (SH – C e D) corados
com vermelho de nilo. Microscopia de contraste interferencial diferencial de
Normanski (A, C). Microscopia de fluorescência (B, D). Pode-se observar
numerosas vesículas coradas em D. Estas vesículas também estão presentes
em B (seta). Barra: 40 µm.
A C
B D
33
Através do uso desta sonda lipídica foi possível determinar que alguns
dos macrófagos recém-obtidos de lavado peritoneal apresentavam esta
organela em pequeno número (0h). Contudo 24 h após cultivo destas células
com SH havia grande número de CL. Também foi observado que o número de
CL aumentava de forma direta a percentagem de soro utilizada no cultivo de
macrófagos (tabela 1).
Tabela 1. Contagem do número de CL em macrófagos recém obtidos do
peritônio (0h), cultivados com soro fetal bovino (SFB) ou soro homólogo (SH)
por 24 e 48 horas com variações nas percentagens de soro.
Mo sem CL (%) Mo com CL (%) N de CL/Mo (%) Sem soro 0h 56,07 ± 5,36 43,93 ± 5,36 2 ± 0,1
2% (48h) 83,08 ± 12,43 16,92 ±12,43 1,80 ± 0,31 SFB 2% (24h) 81,33 ± 6,91 18,67 ± 6,91 2,23 ± 0,53
5% (24h) 35,77 ± 9,40 64,23 ± 9,40 5,34 ± 0,88 10% (24h) 23,63 ± 3,26 76,37 ± 3,26 11,26 ± 1,96 2% (48h) 1,28 ± 1,45 98,72 ± 1,45 16,8 ± 6,15
SH 2% (24h) 5,85 ± 5,87 94,15 ± 5,87 12,87 ± 3,2 5% (24h) 1,69 ± 1,46 98,31 ± 1,46 23,20 ± 5,13 10% (24h) 0 ± 0 100 ± 0 31,30 ± 6,74
A natureza lipídica destas vesículas foi então confirmada por análise
ultra-estrutural através da microscopia eletrônica de transmissão usando a
técnica do ósmio-imidazol (Figura 5). Podemos localizar os CL nos macrófagos
cultivados com SH (Figura 5 B) como inclusões elétron-densas evidentes.
Estas vesículas também estão presentes em macrófagos SFB, porém em
pequenas quantidades (Figura 5 A).
34
Figura 5. Microscopia eletrônica de transmissão de macrófagos cultivados com
soro fetal bovino (A) e com SH (B) cultivados por 48 horas utilizando a técnica
de ósmio-imidazol. Em B podemos notar grandes corpos lipídicos, inclusões
elétron-densas (seta). Barra: 1 µm
2 - Análise da ação microbicida de macrófagos peritoneais cultivados
com soro homólogo e soro fetal bovino
2.1- Produção de óxido nítrico e prostaglandina E2
Nosso próximo interesse foi determinar como a cultura de macrófagos
com diferentes soros alterava a capacidade microbicida destas células. Devido
à presença de poucos CL em macrófagos recém-obtidos da cavidade
peritoneal de camundongos suíços adultos, cultivamos estes macrófagos com
SFB ou SH por 24 e 48 h antes da ativação para determinar a produção de NO
e PGE2. Macrófagos recém-obtidos do peritônio também foram ativados após 1
hora (período de adesão), seguindo seu cultivo por 24 horas com os soros. Os
níveis de produção destas moléculas foram avaliados 24 h após ativação
através da análise do sobrenadante. Em todos os diferentes tempos de cultivo
analisados, a produção de NO foi significativamente menor no macrófago
cultivado com SH do que no macrófago cultivado com SFB e decrescia
conforme aumentava o tempo de cultivo (Figura 6 A).
A B
35
Diferentemente da produção de NO, a produção de PGE2 apresentou
um pico no macrófago cultivado por 24 h, quando os CL apresentavam maior
número (Figura 6 B). As diferenças apresentadas com relação à produção
deste mediador lipídico entre os macrófagos cultivados com SFB e SH
também foram significativas (Figura 6).
Figure 6. Produção de óxido nítrico (NO - µM) e prostaglandina E2 (PGE2 -
pg/ml) de macrófagos cultivados com soro homólogo (SH - barra branca) e soro
fetal bovino (SFB - barra preta) por 1, 24 e 48 horas. Após o período de cultivo,
macrófagos foram ativados com interferona-gama e lipopolissacarídeo.
Sobrenadantes foram coletados 24 horas após ativação e tiveram os níveis de
NO e PGE2 avaliados. *Valor significativamente diferente entre os soros de
acordo com o teste t de Student.
Tempo de cultivo
Pro
duçã
o de
óxi
do n
ítric
oP
rodu
ção
de P
rost
agla
ndin
aE
2
Tempo de cultivo
Pro
duçã
o de
óxi
do n
ítric
oP
rodu
ção
de P
rost
agla
ndin
aE
2
36
2.2- Interação com Toxoplasma gondii
Além da análise da produção de NO, interações com o protozoário T.
gondii foram realizadas para corroborar a ação microbicida destes macrófagos.
Esta análise foi realizada por meio de contagens de taquizoítos do
sobrenadante de macrófagos ativados ou não, 5 dias após interação com o
parasita. Por contagem direta de taquizoítos verificamos uma quantidade
significativamente maior de taquizoítos em macrófagos cultivados com SH
quando comparados aos macrófagos cultivados com SFB (Tabela 2).
2.3- Inibição inespecífica da via ciclooxigenase
Como observado, macrófagos SH produzem elevados níveis de PGE2,
quando comparado a macrófagos SFB, com pico na produção em 24h. Estudos
têm mostrado que a alta produção de PGE2 pode levar a queda na produção
de NO (Renz et al., 1998; Betz & Fox, 1991; Freire-de-Lima et al., 2000). Com
isso nosso próximo questionamento foi se a menor produção de NO nos
macrófagos SH era causada pela alta produção de PGE2 e se isto poderia
alterar a capacidade microbicida destas células. Para isto foi acrescentado
diariamente à cultura de macrófagos peritoneais de camundongos suíços,
indometacina (inibidor inespecífico da COX). Passados 5 dias, o número de
taquizoítos foi avaliado para determinar o desenvolvimento do T. gondii.
Macrófagos cultivados com SH foram menos microbicidas quando comparados
com macrófagos cultivados com SFB, independente do estado de ativação
(Tabela 2). Como esperado, a ativação aumentou a capacidade microbicida
dos macrófagos resultando em menor crescimento do parasita (Tabela 2). A
adição de indometacina não alterou a capacidade microbicida de macrófagos
não ativados (Tabela 2). Contudo, o crescimento de taquizoítos foi menor em
macrófagos ativados e tratados com indometacina. Nenhuma diferença na
ação microbicida entre macrófago cultivado com SFB e SH foi detectada
quando a indometacina foi adicionada (Tabela 2).
37
Tabela 2. Ação microbicida contra Toxoplasma gondii de macrófagos ativados
e residentes cultivados com soro fetal bovino (SFB) ou soro homólogo (SH)
com ou sem indometacina (indo).1
Indo SFB SH
Macrófago residente 8,95 ± 0,1452,* 15,6 ± 2,93
Macrófago ativado 2,47 ± 2,67* 5,55 ± 7,07
Macrófago residente + 6,55 ± 4,75* 14,5 ± 13,35
Macrófago ativado + 1,79 ± 1,26 2,17 ± 1,70
1. Macrófagos, ativados ou residentes, com ou sem indometacina, foram
infectados com T. gondii e cultivados por 5 dias. Taquizoítos foram contados na
câmara de neubauer.
2. Valores devem ser multiplicados por 105 e estão expressos como médias e
desvio padrão em triplicadas de um experimento representativo de 3.
* Diferença estatisticamente significativa (P≤ 0.05) em relação a macrófagos
cultivados com SH através do cálculo pelo teste t de Student.
3- Análise da associação entre corpo lipídico e vacúolo parasitóforo
contendo Toxoplasma gondii
3.1- Microscopia óptica de fluorescência e Microscopia eletrônica de
transmissão
Experimentos realizados com vermelho de nilo e DAPI mostraram
associação entre vacúolos contendo T. gondii e CL. Após 2 h de infecção foi
possível observar associação de CL com o parasita (Figura 7 – 2 h). Passado
24 h, rosáceas foram observadas próximas a CL (Figura 7 – 24 h). Este
resultado foi confirmado a nível ultra-estrututural em que CL foram vistos em
íntimo contato com o VP e até proximamente associado ao parasita
intracelular (Figura 8).
38
Figura 7. Macrófagos cultivados com soro homólogo (SH) e infectados com
Toxoplasma gondii. Microscopia de fluorescência (A, B). Contraste
interferencial de Normanski (C). Após 2 e 24 h de infecção CL (A) e núcleo (B)
foram marcados por vermelho de nilo e DAPI, respectivamente. Note os
taquizoítos (seta) próximo aos CL.
2 h
24 h
39
Figura 8. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de macrófagos
peritoneais de camundongo cultivados por 24 horas com soro homólogo (SH)
e infectados por 8 horas por Toxoplasma gondii (Tg) marcadas pela
citoquímica do ósmio-imidazol. Note a associação dos corpos lipídicos (CL)
com o vacúolo parasitóforo do parasito. Barra: 1 µm.
Tg
Tg
Tg
CL
CL
CL
40
DISCUSSÃO
CL são organelas lipídicas altamente heterogêneas, dinâmicas e
reguladas. Sua geração ocorre em diversos tipos celulares, sendo requeridos
em processos inflamatórios e infecciosos (revisto em Bozza et al., 2007; D’Ávila
et al., 2008). Dependendo de certos estímulos, leucócitos apresentarão a
geração de CL. Esta gama de estímulos pode gerar CL com composições
lipídicas diferenciadas, resultando, portanto em diferentes funções (Bozza et
al., 2007). Neste trabalho descrevemos que macrófagos peritoneais de
camundongo cultivados com SH apresentam mudanças morfológicas e gênese
de CL. Estes macrófagos produzem mais PGE2 e menos NO. Além disso, são
menos microbicidas ao T. gondii, apresentando maior replicação de taquizoítos.
Com a inibição da PGE2, através do uso diário de indometacina, a capacidade
microbicida alcançou o nível do macrófago ativado cultivado com SFB. Estes
resultados indicam que CL induzidos pelo cultivo com SH alteram a capacidade
microbicida pela maior capacidade dos macrófagos produzirem PGE2. Este
sistema celular pode ser um bom modelo para estudar CL em macrófagos.
A primeira observação que chamou a atenção após cultivo de
macrófagos peritoneais com SH foi o grande número de vesículas. Foi
claramente demonstrada que a natureza destas vesículas não era ácida, mas
sim lipídica. Isto foi confirmado pela análise ultra-estrutural dos macrófagos por
meio da microscopia eletrônica de transmissão utilizando a técnica ósmio-
imidazol. Estas organelas apareceram como estruturas eletrodensas
características. Portanto, as “vesículas” induzidas pelo cultivo em SH são CL
típicos.
Além disso, houve clara diferença no espraiamento dos macrófagos
quando os soros foram usados. O macrófago cultivado em SFB possui um
espraiamento estrelado, enquanto o macrófago SH possui espraiamento
unidirecional. Tem sido demonstrado que macrófagos submetidos a diferentes
tratamentos têm sua capacidade de espraiamento modificada (Jenney &
Anderson, 2000). Não se tem idéia do que há no SH que possa causar
diferentes espraiamentos. Novos estudos devem ser realizados para
determinar este provável fator.
Além da morfologia e estrutura diferenciada macrófagos não ativados
cultivados com SH permanecem intactos por mais tempo em cultura, quando
41
comparados a macrófagos cultivados com SFB. (dados não mostrados,
observações de rotina). Esta característica nos leva a sugerir que por serem
menos microbicidas, os macrófagos SH respondem de uma forma mais
atenuada a infecção permanecendo aparentemente intactos por mais tempo.
Isto também pode ter alguma relação com o número de taquizoítos, pois devido
macrófagos cultivados em SFB apresentarem uma resposta microbicida maior
que o macrófagos SH, se exaurem de forma a morrer mais rápido na cultura,
barrando desta forma a replicação do T. gondii. Além disso, alto nível de NO
em cultura é tóxico para célula (Brune et al., 1998). A mesma “sobrevida” dos
macrófagos cultivados com SFB é observada nos macrófagos ativados. Porém
quando esses são comparados aos não ativados eles também resistem mais a
infecção, contudo não possuem maior número de parasitos devido à produção
de níveis mais elevados de NO, agente microbicida, contribuindo para o
controle da infecção.
A influência de CL na capacidade microbicida de leucócitos não tem sido
testada sistematicamente. Está claro que a infecção por patógenos
intracelulares induz o aparecimento de CL em leucócitos como revisto
recentemente (Bozza et al., 2007 e D’Ávila et al., 2008). No modelo descrito
neste trabalho foi possível correlacionar a presença de CL com maior produção
de PGE2. Esta correlação tem sido mostrada em muitos modelos celulares
diferentes (Pacheco et al., 2002; Melo et al., 2003; D’Avila et al., 2006). Melo et
al. (2003; 2006) correlacionaram positivamente a presença de CL em
macrófagos peritoneais e cardíacos de camundongos com doença de Chagas,
à produção de PGE2. Esses resultados indicam que CL têm papel na produção
de eicosanóides observada durante a doença de Chagas (Melo et al., 2003,
2006). D’Avila et al. (2006) demonstraram recentemente que o Mycobacterium
bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) induz a formação de CL durante a
infecção in vivo e que estes eram sítios predominantes de síntese de PGE2 em
macrófagos ativados. O aumento de CL durante a infecção intracelular induzida
pelo T. cruzi e M. bovis BCG foi correlacionado com a maior geração de PGE2
e localização da COX-2 dentro de CL (Melo et al., 2003; D’Avila et al., 2006).
Portanto, está claramente estabelecido que CL aumentam a produção de
PGE2, a qual inibe a resposta tipo Th1 (Renz et al., 1998; Betz & Fox, 1991;
Frei-de-Lima et al., 2000), incluindo a capacidade microbicida de macrófago.
42
A ligação de TNF-α a superfície de macrófagos contribui para ativação
desta célula (Auger & Ross, 1992). Altas concentrações de PGE2 aumentam a
concentração de cAMP, que suprime a síntese de TNF-α, contribuindo para
desativação do macrófago (Renz et al., 1998). A desativação do macrófago,
neste processo, é reforçada pela inibição da produção de linfocinas de T helper
tipo Th1 pela PGE2, enquanto não ocorre inibição de células Th2, não inibindo,
portanto IL-5 e IL-4 (Betz & Fox, 1991). Tanto IL-4, quanto IL-13 são geradas
na resposta Th2, fazendo parte da ativação alternativa, em que macrófagos
passam a produzir IL-10 e são menos microbicidas (Gordon, 2003).
Demonstramos neste trabalho que a menor capacidade microbicida do
macrófago SH é devido à produção de PGE2 que provavelmente regula
negativamente a produção de NO. Quando este eicosanóide foi inibido, o
macrófago SH se tornou mais microbicida ao T. gondii, diminuindo desta forma
o número de taquizoítos. Então o possível mecanismo envolvido na menor
capacidade microbicida pode estar sendo desencadeado por algum
componente do SH que culmina na geração de CL através do disparo de uma
sinalização intracelular específica. Tem sido proposto que a geração de CL na
célula hospedeira após a infecção por patógenos pode fazer parte do
mecanismo de evasão de parasitas (Bozza et al., 2007). Esta hipótese faz
sentido e deve ser investigada.
Um dos mecanismos usados pelos macrófagos na destruição de
parasitas é a geração de espécies de oxigênio reativo (Lowenstein & Padalko,
2004) desencadeado a partir do contato e fagocitose de partículas estranhas
ou debris celulares (Adams & Hamilton, 1998). O peróxido de hidrogênio é o
principal produto gerado pelo “burst respiratório”. A fagocitose de T. gondii por
fagócitos mononucleares reduz significativamente o disparo pontual da
produção de espécies de oxigênio reativo, comparado a fagocitose de outros
patógenos (Sibley et al., 1986; DaMatta et al., 2000). Este fato pode estar
interligado a diferença no desenvolvimento de taquizoítos nos macrófagos
cultivados com SH e SFB. Isto porque a redução das espécies de oxigênio
reativo pode ser diferente em ambos os macrófagos, contribuindo para a
diferença na capacidade microbicida dos macrófagos. Em estudos futuros
pretende-se verificar possível diferença na produção destas espécies de
oxigênio reativo.
43
Macrófagos cultivados com SFB produziram significativamente mais NO
do que os cultivados com SH. Como observado por Seabra et al. (2002, 2004),
a inibição da produção de NO pelo T. gondii em macrófagos não elimina a ação
microbicida deste agente, já que até mesmo em pequenas quantidades o NO
tem algum poder de ação. Isso foi observado pela redução do número de
taquizoítos em macrófagos ativados comparado com macrófagos não ativados.
Tanto o aumento na produção de eicosanóides, quanto menor produção de NO
podem ser responsáveis pela menor capacidade microbicida dos macrófagos
cultivados com SH, a qual é traduzida numa maior taxa de desenvolvimento de
taquizoítos.
A associação de CL com taquizoítos foi observada por microscopia
óptica e confirmada a nível ultra-estrutural. O contato íntimo de CL com VP
claramente estabeleceu que o T. gondii pode tirar vantagem dos lipídios
acumulados da célula hospedeira, como já verificado por Coppens et al. (2006).
Como se sabe, o VP, não-fusogênico, se torna rapidamente associado com
locais de biossíntese lipídica da célula hospedeira, o RE e mitocôndria (Sinai &
Joiner et al., 1997, 2001). Neste trabalho a associação observada do VP com o
CL não excluiu sua associação com a mitocôndria nem com RE, fazendo com
que a presença do CL funcionasse como uma fonte extra de energia. Isso é
corroborado pelo estudo de Charron & Sibley (2002) mostrando que os CL
presentes no T. gondii podem também funcionar como locais de
armazenamento de lipídios.
Em células de mamíferos, o colesterol sintetizado de novo e adquirido
exogenamente via LDL é esterificado por ácidos graxos e estocados em CL.
Toxoplasma gondii contém colesterol (Foussard et al., 1991), porém falta a
maquinaria biossintética para produzir esteróis (Coppens et al., 2000). Este
parasita desvia colesterol das células hospedeiras de mamíferos por um
mecanismo não identificado. Sob condições de excesso de LDL, a atividade de
esterificação de colesterol na célula hospedeira é significantemente aumentada
em presença do parasita. Esse fato indica controle adaptativo dos parasitas no
suprimento massivo de colesterol, estocando colesterol através da esterificação
deste. A esterificação do colesterol derivado de LDL aumenta o número de CL
no T. gondii (Coppens et al., 2000; Sharron & Sibley, 2002; Nishikawa et al.,
2005). Como T. gondii é auxotrófico para colina e colesterol, a falta ou bloqueio
44
destes resulta na detenção da multiplicação do parasita (Coppens et al., 2000).
Por conseguinte, excesso de colesterol leva a multiplicação desenfreada do
parasita devido à capacidade dele desviar LDL do meio, neutralizando-o e o
estocando em seus CL, gerando assim grande número de taquizoítos. Este fato
certamente corrobora a explicação do maior número de taquizoítos
encontrados em macrófagos cultivados com SH. Nestes macrófagos a
disponibilidade de lipídios nos CL, incluindo o colesterol, pode facilitar a
sobrevivência e multiplicação do parasita. A depleção de LDL da célula
hospedeira, por sua vez, causa o progressivo consumo do material estocado
em CL do parasita (Coppens & Vielemeyer, 2005). As imagens mostradas na
figura 8 nos permitem observar ainda a presença de CL associado diretamente
ao parasita e não somente ao VP. Este fato sugere que o parasita pode estar
se beneficiando diretamente da fonte de lipídio para seu desenvolvimento.
Os resultados do presente estudo sugerem fortemente que os CL
contribuem para a sobrevivência do T. gondii no interior dos macrófagos e
diminuem o potencial de ação microbicida de macrófagos cultivados com SH
provavelmente através do aumento na produção de PGE2 e pela associação
do CL com o VP. Mais estudos estão sendo realizados para determinar neste
modelo que componente do SH está induzindo a geração de CL, como ocorre
essa gênese e qual a via de sinalização envolvida na geração desta organela.
45
CONCLUSÃO
Os dados obtidos durante este trabalho e a análise conjunta de outros
trabalhos nos dão condições de sugerir algumas conclusões a respeito do que
foi tratado neste estudo.
Macrófagos cultivados com SH apresentam grande número de
vesículas, as quais ao serem caracterizadas mostraram ser CL. Estes
macrófagos são um bom modelo para estudo da gênese e função desta
organela. A presença de CL nestes macrófagos torna-os menos microbicidas,
possivelmente pela desativação celular como consequência da alta produção
de PGE2 e ou disponibilidade de suprimento lipídico, quando comparado com
macrófagos cultivados com SFB, facilitando a replicação do parasita
intracelular T. gondii. Isto pode ser corroborado pela associação existente
entre VP e CL.
46
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