Luận văn

Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình

sản xuất Chitin theo phương

pháp sinh học kết hợp hóa học

i

LỜI CẢM ƠN

Qua 2 tháng nỗ lực phấn cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các

thầy cô và bạn bè em đã hoàn tất đề tài này. Qua đây em xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc đến Tiến sĩ: Nguyễn Duy Nhứt và cô giáo: Phan Thị Thương

người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình thự tập và trực

tiếp hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề

tài.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cô trong khoa

công nghệ hoá phân tích đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức

trong những năm học vừa qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô

phụ trách phòng thí nghiệm hoá phân tích, cùng thầy cô bộ môn công nghệ

hoá, bộ môn hoá phân tích và công nghệ thực phẩm, các anh chị và cô chú

ở Viện nghiên cứư và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện thuận

lợi trong suốt thời gian thực tập.

Chân thành cảm ơn các bạn sinh viên lớp CĐH 29, cùng các bạn sinh

viên thực tập tại phòng thí nghiệm ở Viện đã nhiệt tình giúp đỡ động viên

em.

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến

cùng anh chị em thân yêu. Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn

tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Sinh viên

Trần Thị Mỹ Châu

ii

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... iv

a.Khử lần 1: Dùng acid benzoic ............................................................................. 39

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương

pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)......................23

Bảng 2. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain

(Trần Thị Luyến, 2003)...........................................................................27

Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret...34

Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret............34

Bảng 5. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công

đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase...............................................36

Bảng 6. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

enzyme Alcalase.......................................................................................36

Bảng 7. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công

đoạn khử protein bằng NaOH................................................................38

Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

NaOH........................................................................................................38

Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công

đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH.....................................................39

Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng

C6H5COOH.............................................................................................40

Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công

đoạn khử khoáng bằng HCl....................................................................41

Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng

HCl............................................................................................................41

Bảng 13. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng (%).................46

Bảng 14. Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng

enzyme Alcalase.......................................................................................47

Bảng 15. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

enzyme Alcalase.......................................................................................47

Bảng 16. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc

nhất............................................................................................................48

Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH...49

iv

Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

NaOH........................................................................................................50

Bảng 19. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc

nhất............................................................................................................50

Bảng 20. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử

lý khử protein bằng enzyme Alcalase và NaOH ở điều kiên tối ưu....52

Bảng 21. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ

khử khoáng bằng C6H5COOH..............................................................53

Bảng 22. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng

C6H5COOH.............................................................................................53

Bảng 23. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử

protein bằng enzyme Alcalase, NaOH và C6H5COOH ở điều kiên tối

ưu...............................................................................................................55

Bảng 24. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ

khử khoáng bằng HCl.............................................................................55

Bảng 25. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl55

Bảng 26. Kết quả đo OD330nm...............................................................................1

Bảng 27. Kết quả đo OD570nm...............................................................................1

Bảng 28. Bảng bố trí thí nghiệm.............................................................................2

Bảng 29.Các thí nghiệm ở tâm phương án.............................................................2

Bảng 30. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

enzyme Alcalase.........................................................................................3

Bảng 31.Các số liệu dùng để tính toán....................................................................4

Bảng 32. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein

bằng enzyme ..............................................................................................6

Bảng 33.Các thông số tối ưu....................................................................................6

Bảng 34. Bảng bố trí thí nghiệm..............................................................................7

Bảng 35.Các thí nghiệm ở tâm phương án.............................................................7

Bảng 36.Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

NaOH..........................................................................................................8

Bảng 37. Các số liệu dùng để tính toán...................................................................9

Bảng 38.Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử protein bằng NaOH10

v

Bảng 39.Các thông số tối ưu..................................................................................10

Bảng 40. Bảng bố trí thí nghiệm............................................................................11

Bảng 41. Các thí nghiệm ở tâm phương án..........................................................11

Bảng 42. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng

C6H5COOH.............................................................................................11

Bảng 43.Các số liệu dùng để tính toán..................................................................12

Bảng 44. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử khoáng bằng

C6H5COOH ............................................................................................14

Bảng 45. Các thông số tối ưu.................................................................................14

Bảng 46. Bảng bố trí thí nghiệm............................................................................15

Bảng 47. Các thí nghiệm ở tâm phương án..........................................................15

Bảng 48. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

NaOH .......................................................................................................15

Bảng 49. Các số liệu dùng để tính toán.................................................................16

Bảng 50. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử khoáng bằng HCl...17

Bảng 51. Các thông số tối ưu.................................................................................18

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.Cấu tạo của Chitin.......................................................................................4

Hình 2. Cấu tạo của Chitosan..................................................................................5

Hình 3.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á.................15

Hình 4.Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman...................17

Hình 5.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)...................17

Hình 6.Quy trình sản xuất của Pháp....................................................................18

Hình 7.Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản....................20

Hình 8. Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện

khoa học Việt Nam...................................................................................21

Hình 9. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học

với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003)........................22

Hình 10. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản........................24

Hình 11. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006)......................25

Hình 12. Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan....................26

Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất.....................................................................32

Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin không dùng acid benzoic.(đối chứng)........33

Hình 15.Công thức của phức Biuret.....................................................................42

Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret...............45

Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret.........................46

Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân bằng enzyme theo

phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson..................................49

Hình 19. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm NaOH theo phương pháp

đường “lên dốc” của BoxWillson..........................................................52

Hình 20. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm C6H5COOH theo

phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson..................................54

Hình 21. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm HCl theo phương pháp

đường “lên dốc” của BoxWillson..........................................................57

Hình 22.Thiết bị ổn nhiệt Memmert.....................................................................18

Hình 23. Thiết bị đo Uvmini-1240.........................................................................19

Hình 24.Máy li tâm.................................................................................................19

vii

Hình 25.Thiết bị Vortex..........................................................................................19

Hình 26.Sự bắt màu của dung dịch BSA sau khi cho thuốc thử Biuret............20

Hình 27. Công thức cấu tạo của Sodium citrate..................................................20

Hình 28. Mono Sodium Citrate Anhydrous.........................................................20

Hình 29. Dung dịch protein và thuốc thử Biuret.................................................21

Hình 30. Thủy phân đầu tôm.................................................................................21

Hình 31. Đầu tôm đã được vô hoạt enzyme sau khi thủy phân(dùng nhiệt).....21

Hình 32. Phế liệu tôm sau khi thủy phân..............................................................22

Hình 33. Phế liệu tôm sau khi thủy phân bằng enzyme Alcalase và xử lý NaOH

...................................................................................................................22

Hình 34. Phế liệu tôm đã khử protein và khư khoáng lần 1 bằng C6H5COOH

...................................................................................................................22

Hình 35. Phế liệu tôm(PLT) đã khử protein bằng enzyme(trái), PLT đã khử

protein bằng enzyme và NaOH...............................................................23

Hình 36. PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH(trái), PLT đã khử

protein và khử khoáng bằng C6H5COOH............................................23

viii

LỜI MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài:

Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hoá

học có sử dụng các loại hoá chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài gây ảnh hưởng

tới chất lượng chitin-chitosan và các chế phẩm khác được sản xuất từ phế liệu giáp

xác. Vì vậy, việc nghiên cứu một quy trình kết hợp phương pháp hoá học với

phương pháp sinh học đồng thời giảm tối đa lượng hoá chất sử dụng là rất cần thiết

góp phần giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm.

Ngoài ra, còn có rất nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu giáp xác sản xuất các

mặt hàng có giá trị khác như: Astaxanthin, thức ăn chăn nuôi, chiết rút chất mùi…

nhưng công nghệ gây ô nhiễm nên không cho phép tận dụng các chất có hoạt tính

khác.

Do đó việc sử dụng nguồn phế liệu từ vỏ tôm đã được triển khai tại rất nhiều

các khu vực trong nước. Việc tận dụng phế liệu vỏ tôm tập trung chủ yếu vào sản

xuất thức ăn cho gia súc, các sản phẩm Chitin-Chitosan, glucosamine,

oligosaccharide… Tuy nhiên theo điều tra ban đầu thì trong công nghệ sản xuất

Chitin-Chitosan trong nước hiện nay đều thực hiện chủ yếu theo phương pháp hóa

học dẫn đến chất lượng chưa cao, hầu hết các cơ sở sản xuất Chitin-Chitosan chưa

có một hệ thống xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn. Nguyên nhân chủ yếu là do hàm

lượng chất lơ lửng, trong đó chủ yếu là các chất có nguồn gốc từ protein. Chúng có

tính chất là rất khó lắng trong quá trình xử lí. Như vậy, nếu chúng ta có thể thu hồi

protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase thì sẽ tận dụng được nguồn

chất dinh dưỡng trong phế liệu đầu vỏ tôm để làm bột dinh dưỡng cho người, thức

ăn cho gia súc, gia cầm, từ đó nâng cao nâng cao được giá trị của nguyên liệu, giảm

tải cho quá trình xử lí nước thải, hạn chế sự ô nhiễm môi trường. Đồng thời việc sử

dụng thủy phân bằng enzyme sẽ hạn chế việc sử dụng hóa chất, gây ô nhiễm môi

trường. Trong thực tế hiện nay tại các cơ sở sản xuất phải thu nhân nguyên liệu từ

các khu vực xa, không tập trung và khối lượng không lớn gây khó khăn về chi phí

vận chuyển. Do vậy việc nghiên cứu ứng dụng chế độ thủy phân bằng enzyme góp

1

phần kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu, giảm chi phí do phơi hoặc sấy khô

nguyên liệu, giảm sự ô nhiễm môi trường do không vận chuyển tạm thời, đồng thời

loại bỏ một phần các chất khoáng, protein.

Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Chế biến-

Khoa Chế biến-Trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của cô Thạc sĩ Ngô

Thị Hoài Dương, em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản

xuất Chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học.”

2.Mục đích của đề tài:

Xác định các điều kiện tối ưu để khử protein từ phế liệu tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase và NaOH, đồng thời xác định các điều

kiện tối ưu để khử khoáng bằng acid benzoic kết hợp HCl nhằm giảm thiểu hóa chất

sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao chất lượng Chitin.

3. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài:

Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất chitin với mục

đích tận dụng nguồn protein từ đầu tôm, hạn chế sử dụng hóa chất nhằm giảm ô

nhiễm môi trường và sản xuất ra chitin-chitosan có chất lượng cao và ứng dụng vào

các lĩnh vực đặc biệt như ứng dụng trong y học, mỹ phẩm…. Đề tài cũng là nguồn

tài liệu hữu ích phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này.

4. Nội dung của đề tài:

- Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin-chitosan

- Nghiên cứu sản xuất Chitin bằng phương pháp sinh học

Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme kết hợp với NaOH

Tối ưu hóa quá trình khử khoáng có sử dụng acid benzoic

- Đề xuất quy trình.

PHẦN 1.

2

TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA

CHITIN-CHITOSAN.

1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN-CHITOSAN

1.1.1. Sự tồn tại của Chitin-Chitosan trong tự nhiên

Chitin và dẫn xuất của nó là Chitosan là những polysaccharide mạch thẳng,

chúng phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, Chitin tồn tại ở cả động vật và thực

vật. Ở động vật thủy sản, Chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt là ở vỏ tôm, cua, ghẹ,…

Vì vậy, chúng là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất Chitin-Chitosan.

Trong động vật: Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ bao của một

số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn,

Chitin được coi là chất tạo xương hữu cơ chính ở động vật không xương sống.

Trong thực vật: Chitin có trong vách tế bào của nấm và một số loài tảo

chlorophyceae. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Nó có cấu trúc gồm

nhiều phân tử được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống

dạng sợi ít nhiều có tổ chức. Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của Chitin,

nó liên kết dưới dạng phức hợp Chitin-protein,Chitin với các hợp chất hữu cơ,…

khi tồn tại như thế Chitin có sự đề kháng đối với các chất thủy phân, hóa học và

enzyme. Do đó nó gây khó khăn cho việc tách chiết và tinh chế. Tùy thuộc vào đặc

tính của cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người

ta có thể thấy sự thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của Chitin.

Trong tự nhiên, Chitosan rất hiếm gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nấm

(đặc biệt: zygomycetes, mucor,…) và ở vài loại côn trùng như ở thành bụng của

mối chúa. Sự deacetyl bằng kiềm, Chitin tạo thành Chitosan và tan được trong dung

dịch acid acetic loãng.

1.1.2. Cấu trúc và tính chất của Chitin-Chitosan

1.1.2.1 Cấu trúc của Chitin-chitosan

Chitin-Chitosan là một polysaccharide nên có cấu trúc dạng chuỗi.

Trong đó : Chitin : R : -NH-COCH3

Chitosan : R : -NH2

3

CHITIN: Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nó có cấu trúc tuyến

tính gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside.

Công thức phân tử: (C8H13O5N)n

Phân tử lượng : M = (203,19)n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:

Đối với tôm hùm : n = 700÷800

Đối với cua : n = 500÷600

Đối với tôm thẻ: n = 400÷500

Công thức cấu tạo:

Hình 1.Cấu tạo của Chitin.

CHITOSAN: Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, gồm các phân tử D-

1,4glucosamine. Khi xử lý kiềm đặc từ Chitin ta thu được Chitosan.

Công thức phân tử : (C6H11O4N)n

Phân tử lượng: M= (161,07)n

Công thức cấu tạo :

4

Hình 2. Cấu tạo của Chitosan.1.1.2.2. Tính chất của Chitin-Chitosan

CHITIN:

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và

các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu. Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm

đặc, nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2)

tạo thành dung dịch keo.

Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO4, nước javen, NaClO, …người ta

lợi dụng tính chất này để khử màu cho Chitin.

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884÷890 cm.

Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính

hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da. Chitin bị men lysozyme, một loại men chỉ

có ở cơ thể người, phân giải thành monome N-acetyl-D-glucosamine.

Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac

(NH3), không hòa tan trong thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia. Điều này có thể là do

sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại vị trí C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH3) đã

ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết.

Khi nung nóng Chitin trong dung dịch NaOH đặc thì Chitin sẽ bị khử mất

gốc acetyl tạo thành Chitosan. Khi đun nóng Chitin trong acid HCl đặc thì Chitin sẽ

bị thủy phân tạo thành Glucosamine 85,5%, acid acetic 14,5%.

5

CHITOSAN:

Đặc tính cơ bản của Chitosan: Chitisan có nguồn gốc thiên nhiên, không độc,

dùng an toàn cho người trong thức ăn, thực phẩm, dược phẩm, có tính hòa hợp sinh

học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có nhiều tác dụng sinh học đa

dạng: có khả năng hút nước, giữ ẩm, kháng nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại

khác nhau, kích thích tăng sinh tế bào ở người, động vật, thực vật, có khả năng nuôi

dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.

Tính chất hóa học : Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không

mùi, không vị, hòa tan dễ dàng trong dung dịch acid loãng. Loại Chitosan có khối

lượng trung bình thấp từ 100000÷400000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và

trong thực phẩm.

Tính chất sinh học: Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như : tính

kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát

triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo

dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u.

Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to

vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết.

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptid- insulin, kích thích việc tiết

ra insulin ở tuyến tụy nên Chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều

công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống

miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung

thư, HIV/AISD, chống tia tử ngoại, chống ngứa,… của Chitosan.

1.1.3. Ứng dụng của Chitin-Chitosan:[2][5][10]

1.1.3.1. Trong y học và mỹ phẩm

Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm:

Tá dược độn, tá dược chính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang

mềm, nang cứng…làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác

dụng chậm kéo dài, làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết

thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol

6

máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương,

loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn

dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư và chống HIV.

Dùng làm vật liệu y sinh: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ

khâu phẫu thuật, mô cấy ghép…

Trong mỹ phẩm chitosan được bổ sung vào kem chống khô da, kem lột mặt để tăng

độ bám dính, tăng độ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím…

1.1.3.2. Trong công nghiệp thực phẩm[3]

Chitosan được xem như một phụ gia tạo độ cứng, tạo keo, phân lớp và khử

axit của trái cây và đồ uống, tăng cường mùi vị tự nhiên. Tạo màng để bao gói thực

phẩm, hoa quả, rau tươi. Là một polyme dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính

sinh học đa dạng, chitosan được coi là thành phần bổ dưỡng đưa vào thực phẩm,

bánh kẹo, nước giải khát, thức ăn vật nuôi và thủy sản. Chitosan sử dụng để chống

hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm.

1.1.3.3. Ứng dụng trong nông nghiệp[2][5]

Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân

chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh.

Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống

bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.

1.1.3.4. Ứng dụng trong sinh học

Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh

vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp

polymer sinh học.

1.1.3.5. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác.

Trong công nghiệp dệt:

Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa, ưu điểm có thể thay thế

được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ xát, bề mặt

đẹp, bền trong kiềm.

7

Làm vải chịu nước, không bắt lửa: Hòa tan chitosan trong dung dịch acid

acetic loãng cùng với axetat nhôm và axit stearic thu được hỗn hợp. Hỗn hợp này

đem sơn lên vải, khi khô tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và không bắt

lửa. Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động.

Làm sợi Chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na2SO4 bão hòa rồi đem kéo

sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai. Đem sợi này trộn với sợi

cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi Chitin-cellulose. Khả năng bắt màu thuốc nhuộm

càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin.

Trong công nghiệp giấy:

Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng bằng 1%

trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bền của giấy khi ẩm ướt, tăng độ nét

khi in. Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy.

Trong ngành phim ảnh:

Phim chitosan có độ nhớt rất cao, không tan trong nước, acid. Độ cứng được cải

thiện bằng cách tổng hợp đúc chitosan, rồi xử lý phim bằng dung dịch acid.

Ứng dụng trong mỹ phẩm:

Chitosan được sử dụng trong sản xuất kem chống khô da, do bản chất

chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì da bởi những nhóm NH4+ thường được các

nhà khoa học gắn với những chất giữ nước hoặc những chất lọc tia cực tím. Vì vậy

chitosan là gạch nối giữa hoạt chất của kem và da.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TÔM VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

CHITIN-CHITOSAN.

1.2.1. Giới thiệu về phế liệu tôm

Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn chính

là đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng. Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong

những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn. Diện tích nuôi tôm đã

tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm

2003. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu

tôm đông lạnh chiếm 47%, đứng thứ 2 sau xuất khẩu dầu khí. Năm 2004, xuất khẩu

8

thuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó

tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản. Năm 2006 kim ngạch

xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với

năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ

USD, chiếm 44,3 % tổng kim ngạch xuất khẩu. Năm 2007, tổng kim ngạch xuất

khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so với năm 2006

Mục tiêu xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2010, Việt Nam phấn đấu đạt giá trị 4 -

4,5 tỷ USD. Ðịnh hướng đến năm 2020, chế biến xuất khẩu thủy sản tiếp tục là

động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản và mang lại

nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống lao động nghề cá. Tôm

được dự kiến đạt khoảng 483 nghìn tấn nguyên liệu để phục vụ cho xuất khẩu

khoảng 390.000 tấn năm 2010. Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến

Thủy sản, Đại học Thuỷ sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính

khoảng 45.000 tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm. Trần Thị

Luyến (2004) cho biết trong vỏ tôm tươi chitosan chiếm khoảng 5% khối lượng,

trong vỏ tôm khô khoảng 20-40% khối lượng. Như vậy hàng năm có thể sản xuất

gần 5000 tấn chitosan phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả

kinh tế cho ngành Thuỷ sản .

Phế liệu tôm (PLT) là những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tôm

bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy

cách hoặc tôm bị biến màu. Tuỳ thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế

liệu có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm. Có thể lấy tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii làm ví dụ, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm.

Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm. Với sản phẩm

tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ đuôi của tôm chiếm khoảng 25% trọng

lượng tôm. Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%,

như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37%. Lượng phế liệu này có thể

giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế

biến tốt hơn. Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng

9

chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho

ngành thuỷ sản.

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30-70%

(Watkin và cộng sự, 1982 ; Evers và Carroll [19], trung bình khoảng 50% so với

khối lượng tôm chưa chế biến. Halanda và Netto (2006) cho rằng phế liệu tôm có

thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [20]. Phần lớn tôm được đưa vào chế biến

dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu. Phần đầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ,

đuôi và chân chiếm 10-15% trọng lượng của tôm nguyên liệu. Tuy nhiên, tỉ lệ này

tuỳ thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng [5] [6].

Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm[5]

Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này

thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất

hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác giữa protein và các chất

không hòa tan.

Vỏ chia làm 4 lớp chính:

Lớp biểu bì

Lớp màu.

Lớp canxi.

Lớp không bị canxi hóa.

- Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp

màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa chitin nhưng lớp biểu bì thì không

- Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện của những thể hình hạt của

vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khí hoặc những

không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh,

là con đường cho caxi thẩm thấu vào.

- Lớp biểu bì: những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ

bởi Fucxin, có điểm pH =5,1 không chứa chitin. Nó khác với các lớp vỏ còn lại, bắt

màu xanh với anilin xanh. Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của acid ở

nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt.

10

- Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải

đều khắp.

- Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một

phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền

vững không có canxi và puinone.

Thành phần sinh hoá của vỏ tôm

Protein: Thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng

Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi được vứt

lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của đầu tôm. Nếu

công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu

nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu khó xử lý hơn.

Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với

chitin, Canxi Carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…

như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.

Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các

protein dưới dạng phức hợp chitin-protein; liên kết với các hợp chất khoáng và các

hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng.

Canxi: Trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ

yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá

trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó

khăn cho quá trình khử khoáng.

Sắc tố: Trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là

Astaxanthin.

Enzyme: Theo tạp chí Thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme protease của

đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi. Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội

tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu.

Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần

khác như: nước, lipid, phospho,…

1.2.2. Công nghệ sản xuất Chitin-Chitosan

11

Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy

ở dạng tinh khiết. Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và

canxi . Vì vậy, nó cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kỳ mục đích

thương mại nào. Phương pháp dùng để phân tách và tinh sạch chitin phải đảm bảo

lấy đi khoáng và tận dụng được các hợp chất có giá trị khác. Do đó, nhiều phương

pháp đã được áp dụng cho việc thu hồi chitin. Hơn nữa, tính hữu ích của các nguồn

chitin khác nhau phụ thuộc vào sự sẵn có của nguyên liệu, phương pháp đơn giản,

hàm lượng chitin, và sự phù hợp để tận thu các sản phẩm có giá trị khác.

Hiện nay việc làm sạch chitin bao gồm hai bước chính:

- Khử khoáng: Loại bỏ khoáng bằng acid hoặc là một tác nhân tạo phức.

- Khử protein: Tách protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease.

Hai bước này có thể đổi vị trí cho nhau phụ thuộc vào phương pháp thu hồi

protein, carotenoid và hơn nữa là ứng dụng chitin. Chitin sử dụng như một chất hấp

thụ hay hỗ trợ enzyme nên khử khoáng trước, bởi vì bước này lấy đi muối khoáng

và bảo vệ cấu trúc chitin đảm bảo sự deacetyl polysaccharid khi xử lý kiềm nhẹ để

khử protein. Tăng cường mức deacetyl gia tăng các nhóm amino tự do tham gia vào

quá trình hấp phụ và gắn kết protein. Tuy nhiên, để thu hồi protein thì nên thực hiện

bước khử protein trước. Khi đó, sản lượng protein và chất lượng là lớn nhất . Sau

quá trình khử khoáng và khử protein, sản phẩm được tẩy màu bằng acetone hoặc

hydrogen peroxide. Bước này là không cần thiết và phụ thuộc vào yêu cầu của sản

phẩm cuối cùng. Có hai phương pháp chính để sản xuất chitin: phương pháp hóa

học và phương pháp sinh học.

-Phương pháp hóa học: Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc sử

dụng HCl hoặc acid hữu cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phòng với cơ chế

như sau:

CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O

Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là:

12

a. Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến

sản phẩm còn nhiều tạp chất. Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm

chất lượng sản phẩm.

b. Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá

lớn sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí.

c. Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến

chất lượng sản phẩm. Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị

nát sẽ rất khó xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm

sau này. Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không bị

loại triệt để.

Thông thường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian phải ngắn nếu có

điều kiện ta có thể xử lý ở nhiệt độ thấp thời gian dài thì chất lượng sẽ tốt hơn.

-Phương pháp sinh học: Trong phương pháp sinh học chỉ khác tại công đoạn

khử protein và deacetyl không sử dụng hoá chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn,

nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để. Việc deacetyl được

thực hiện bởi enzyme deacetylase. Sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao

do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hoá chất [6]

Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như

giá thành sản phẩm có thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ

hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hoá học nhưng không thể đạt

được bằng phương pháp sinh học . Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp

này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một

trong những khó khăn trong phương pháp hoá học để sản xuất chitin là thể tích chất

thải có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý quá lớn. Những chất này là

do trong công đoạn khử khoáng và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải

có các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường và điều này làm cho giá thành

sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hoá học có thể gây

nên sự thuỷ phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994),

biến đổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993) và gây ô nhiễm môi trường

13

(Allan và cộng sự, 1978) [20]. Điều này là do không xác định được bản chất hoạt

động của hoá chất cũng như sự khác nhau về hàm lượng chitin trong nguyên liệu.

Ngược lại, trong phương pháp sinh học thì thể tích chất không lớn, protein sau quá

trình thủy phân bằng enzyme có thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho

gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi. Hơn nữa sẽ

hạn chế được việc xử lý môi trường. Vì vậy, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng

nhất hơn về các đặc tính lý hoá thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý

nhẹ hơn như việc sử dụng enzyme.

Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzyme protease và vi khuẩn có

khả năng tạo protease để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hoá học. Quá

trình này giúp tận dụng tối đa giá trị của nguồn phế liệu và hạn chế ảnh hưởng đến

môi trường. Hall & De Silva (1994) đã đề xuất một phương pháp khử khoáng đơn

giản bằng việc sử dụng lên men lactic như là một phương pháp bảo quản phế liệu.

Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm

pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN-CHITOSAN TRÊN THẾ

GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của

Chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành

công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn

Độ, Pháp.

Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với

nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ như:[5]

1.3.1. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học

- Quy trình của Stevens

14

Hình 3.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á

Cao hơn 1%

Cao hơn 1%

Phế liệu tôm tươi

Khử protein(NaOH 4%, t = 24 giờ,

to=30oC)

Kiểm tra hàm lượng protein

Khử khoáng(HCl 4%, t=24 giờ, to=30oC)

Kiểm tra hàm lượng khoáng

Chitin

15

- Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman:

HCl 2Mto phòngt = 48hw/v = 1/2.5

Vỏ tôm hùm

Ngâm HCl

Rửa trung tính,sấy khô, nghiền mịn

Ngâm HCl

Li tâm

Rửa trung tính

Ngâm NaOH

Li tâm

Rửa trung tính

Ngâm NaOH

Li tâm

Rửa trung tính

Rửa sạch bằng li tâm

Làm khô

Chitin dạng bột màu kem

NaOH 1Mto = 100oCt= 42hw/v = 1/2,5

NaOH 1MTo = 100oCT= 12hw/v = 1/2,5

HCl 2Mto phòngt = 5hw/v= 1/10

16

Hình 4.Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của HackmanNhận xét: Quy trình này gồm nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65

giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất

đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất.

- Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản):

Hình 5.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)

Nhận xét: Quy trình đã đơn giản hóa công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian

sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan

thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt

thấp do nhiệt độ xử lý ở các công đoạn khá cao.

1.3.2. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến:

Vỏ cua khô

Khử chất vô cơ

Rửa trung tính

Sấy khô

Khử protein và chitin

Rửa trung tính

HCl 2Mto=120oCt= 1h

NaOH 15Mto= 150oCt = 1h

Sấy khô

Chitosan

17

Quy trình sản xuất của Pháp:

Hình 6.Quy trình sản xuất của Pháp

Hấp chín, phơi khô

Xay nhỏ

Tách protein

Rửa trung tính

NaOH 3,5%to = 65oCt = 2hw/v = 1/10

Ngâm HCl

Ngâm aceton

Ngâm NaOCl

Rửa trung tính

Deacetyl chitin

Rửa trung tính

Chitosan

Vỏ tôm

HCl 1Nto phòngt = 2hw/v = 1/10

NaOCl 0,135%to phòngt = 6 phútw/v = 1/10

NaOH 40%to = 85oCt = 4hw/v = 1/4

To phòngT = 30 phútw/v = 1/5

18

Ưu điểm: Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều.

Sản phẩm thu được rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để.

Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch

polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt. Mặt khác, aceton rất

đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao. Chưa kể đến các yếu tố an toàn sản

xuất công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay.

Việc nghiên cứu sản xuất Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất

phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta. Năm 1978 trường Đại học

Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết Chitin-Chitosan do Đỗ Minh Phụng thực hiện.

- Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại học Thủy sản:

Nhận xét: Sản xuất chitosan theo quy trình này sản phẩm tạo thành có chất

lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp. Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất

oxy hóa do đó dễ làm ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm.

Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và

có giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: trường Đại học Thủy sản, Trung

tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam, Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội,

Trung tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản – Viện nghiên cứu môi trường Thủy

sản 2, …đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng công nghệ này. Trong đó, các kết

quả công bố gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Thủy sản Nha

Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo

hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ enzyme.

Những kết quả đó đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu của tôm

đông lạnh và trước những yêu cầu khắc khe hơn về chất lượng của chitin, chitosan

trên thị trường đầy tiềm năng hiện nay.

19

Hình 7.Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản.

Nhận xét : Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy

màu. Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công,

nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian sử lý dài (công đoạn khử

khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm.

Vỏ tôm khô

Ngâm HCl

Rửa trung tính

Ngâm NaOH

Rửa trung tính

HCl 6Nto phòngt = 48hw/v = 1/2,5

NaOH 8%to = 100oCt = 2hw/v = 1/2,5

Tẩy màu

Chitin

Nấu trong NaOH

Rửa trung tính

Chitosan

NaOH 40%to = 80oCt = 24hw/v = 1/1

20

- Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa

học Việt Nam.

Hình 8. Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam

Nhận xét: Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không

đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện lại kéo

dài, nhiều công đoạn.

Ngâm HCl

Rửa trung tính

Nấu trong NaOH

Rửa trung tính

Ngâm HCl

HCl 4%to phòngt = 24h

NaOH 3%to = 90÷95oCt = 3h

HCl 4%to phòngt = 24h

Rửa trung tính

Nấu trong NaOH

Rửa trung tính

Nấu trong NaOH đặc

Chitosan

Nguyên liệu

NaOH 3%to = 90÷95oCt = 3h

NaOH 40%to = 90÷95oCt = 3h

21

- Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với

một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến)

Hình 9. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003)

Nhận xét: phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có

chất lượng không thua kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý

kiềm. tổng thời gian cần thiết giảm rất nhiều và như vậy nếu so về mặt kinh tế thị

đây là phương pháp tốt hơn hẳn. Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm

là dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử

dụng. Theo quy trình công nghệ này sản phẩm chitosan dạt được có các chỉ tiêu

chất lượng như bảng 1

Vỏ tôm khô Vỏ tôm tươi

Ngâm HCl Ngâm HCl

Rửa trung tính

Khử protein, lipid

HCl 10%to phòngt =5hw/v = 1/10

HCl 10%to phòngt= 5hw/v = 1/5

NaOH 40%to = 80±2oCt = 5hw/v = 1/10

Rửa trung tính

Chitosan

22

Bảng 1. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)

Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quảMàu sắc Trắng đẹp Độ Deacetyl 76,25%Trạng thái Mềm mại Tổng thời gian thực hiện 9,5 giờĐộ ẩm 10% Nts 8,07%Hàm lượng tro 0,023% Hiệu suất 40,25Hàm lượng các chất

không tan

1,6% Độ tan 98,32%

Độ nhớt 14,48oE Phản ứng biure Âm tính

-Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản.

Quy trình của trung tâm chế biến có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi máy

móc thiết bị phức tạp. Do đó rất dễ dàng để sản xuất lớn. Tuy nhiên thời gian sản

xuất kéo dài và nồng độ hóa chất sử dụng còn khá cao, vẫn chưa có hướng xử lý

nước thải từ quá trình sản xuất.

23

Hình 10. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản

Phế liệu tôm

Rửa sơ bộ

Khử khoáng

Ngâm rửa trung tính

Khử protein

HCL 7%v/w=5/1To phòngT=24h

NaOH 40%v/w10/1To=80oCT=6,5h

Rửa trung tính

Deacetyl hóa

Ngâm rửa trung tính

Phơi, sấy

Chitosan

NaOH 6%v/w=5/1To phòngT=24h

24

1.3.3. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp sử dụng enzyme:

-Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto[27]

Hình 11. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006)

Ưu điểm: Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm

Chitin thu được có chất lượng khá tốt, màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố trong công

đoạn chiết astaxanthin. Ngoài ra còn tận thu được protein và astaxanthin mang lại hiệu quả

kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đáng kể lượng hóa chất sử dụng.

Phế liệu tôm

Khử protein bằng enzyme Alcalase

Ly tâm (4oC, 15 phút)

Phần bã Phần dịch nổi phía trên

pH = 8,5to = 55oCtỷ lệ E/NL 3%w/v = 1/1

Sấy lạnhChiết Astaxanthin bằng dầu nành và hỗn hợp dung môi

Khử khoáng HCl 2,5%, 2h, to

phòng

Bột protein

Rửa trung tính

Sấy khô (60oC, 16h)

Chitin

25

Nhược điểm: Enzyme đắt tiền dẫn đến chi phí giá thành sản phẩm cao.

- Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến,

2003)[6]

Hình 12. Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan(Trần Thị Luyến, 2003)

Vỏ tôm khô Vỏ tôm tươi

Ngâm HCl Ngâm HCl

Rửa trung tính

Khử protein

HCl 10%To phòngT = 5hw/v = 1/10

HCl 10%To phòngT = 5hw/v = 1/5

Rửa sạch

Deacetyl

Rửa trung tính

Làm khô

Chitosan

Chitin

Rửa trung tính

26

Bảng 2. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain (Trần Thị Luyến, 2003)

Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quảMàu sắc Trắng, trong Độ nhớt 15,25oE

Trạng thái Mềm mại Độ Deacetyl 78,25%Độ ẩm 10,10% Nts 8,25%

Hàm lượng tro 0,68% Hiệu suất 41,25%Hàm lượng các

chất không tan

0,92% Độ tan 98,37%

Nhận xét : Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình

khác. Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất của quy trình có ưu thế hơn hẳn.

Nhưng để nâng cao chất lượng của chitosan có thể sử dụng enzyme papain thay thế

cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng

cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng, điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả

cao. Tuy nhiên, cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này. Cần

tiếp tục nghiên cứu và sản xuất enzyme deacetylase để thay thế hoàn toàn cho

NaOH đặc trong công đoạn deacetyl.

Gần đây Đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Chitin từ đầu-vỏ tôm bằng các

phương pháp sinh học (Sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa) do tác giả

Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú thực hiện nhằm thu nhận chitin từ phế liệu đầu

vỏ tôm bằng phương pháp công nghệ enzyme.[12][13]

Nguyên liệu để phục vụ thí nghiệm bao gồm: phụ phẩm đầu và vỏ tôm khô (Nam

Định), phụ phẩm sau khi mua về được sấy lại cho khô giòn ở nhiệt độ 40oC rồi nghiền nhỏ

thành bột để thu nhận chitin. Vỏ dứa được thu mua ở chợ. Nghiên cứu thử nghiệm tách

chiết chitin bằng phương pháp hóa học. Kết quả cho thấy, lượng chitin trung bình

thu được từ 100g nguyên liệu bột đầu – vỏ tôm khô là 7,4-7,5 g. Kết quả này thấp

hơn nhiều so với các số liệu công bố trong các tài liệu khác. Nguyên nhân là do

nhóm nghiên cứu đã sử dụng đầu vỏ tôm chứa nhiều thịt. Hiệu suất thu hồi chitin

phụ thuộc vào mẫu nguyên liệu đó chứa nhiều hay ít protein.

Tiếp tục tách chiết chitin nhờ sử dụng enzyme bromelanin, tác giả cho rằng,

việc xử lý bột vỏ tôm với dịch ép bã dứa không chỉ loại được phần lớn lượng

27

protein của vỏ tôm mà còn loại được hết các chất khoáng trong vỏ tôm. Dịch ép bã

dứa có nhiều axit hữu cơ có phản ứng với các chất khoáng trong vỏ tôm. Phương

pháp này tỏ ra có nhiều ưu điểm như: không cần axit để loại khoáng, tiêu tốn ít xút

cho loại protein, hiệu quả thu hồi chitin cao hơn, chất lượng phế phẩm chitin nhận

tốt hơn và ít gây ô nhiễm môi trường hơn. Nhược điểm duy nhất của phương pháp

là mất nhiều thời gian thực hiện quy trình.

28

PHẦN 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên

cứu. Đầu tôm được lấy từ nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng chế biến tại Công ty Cổ

phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa. Nguyên liệu sau khi lấy được vận

chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt có nhiệt độ < 5oC về phòng thí nghiệm.

Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo trong thời gian 5 phút. Trong

trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch → bao gói → bảo quản đông ở điều kiện

nhiệt độ -20oC tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường.

2.1.2. Enzyme Protease[15]

Đề tài sử dụng enzyme Alcalase được mua tại công ty Novozyme, Tp. Hồ

Chí Minh. Enzyme Alcalase 2.4 FG thu được từ Bacillus licheniformis. Đây là

enzyme được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi sinh vật. Sử dụng enzyme Alcalase

cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính toán được lượng base yêu cầu để

duy trì pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân. Chọn enzyme này cũng dựa

trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của các amino acid vào giai

đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986),

đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson và

Rasco, 2000).

Hoạt tính 2,4 AU-A/g.

Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷10oC.

Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8

Nhiệt độ: 50 ÷ 60 oC (122 ÷ 1400F)

DH (%) tối đa 15 ÷ 25.

Để kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừng phản

ứng enzyme gần với DH % xác định. Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách

29

xử lý nhiệt ở 850C, thời gian 10 phút hoặc protease Alcalase bị bất hoạt tại pH = 4

hay thấp hơn trong khoảng 30 phút. Phản ứng có thể dừng tức thời bằng cách thêm

vào các acid thích hợp như: acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic, acetic .

Tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới các điều kiện công nghiệp và nó có thể

khó để kiểm soát DH % do sự thủy phân vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt.

2.1.3. Acid benzoic (C6H5COOH)

Axit benzoic, C7H6O2 (or C6H5COOH), là một chất rắn tinh thể không màu

và là dạng carboxylic acid aromatic đơn giản nhất. Tên của nó được lấy theo gum

benzoin, là một nguồn để điều chế axid benzoic. Acid yếu này và các muối của nó

được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm. Đây là một chất ban đầu quan trọng để

tổng hợp nhiều chất hữu cơ khác. Acid benzoic đã được phát hiện vào thế kỷ 16.

Việc chưng cất khô gum benzoin đã được mô tả lần đầu tiên bởi Nostradamus

(1556), và sau đó là bởi Alexius Pedemontanus (1560) và Blaise de Vigenère

(1596). Justus von Liebig và Friedrich Wöhler đã xác định cấu trúc của acid

benzoic vào năm 1832. Họ cũng đã nghiên cứu quan hệ giữa acid hippuric và acid

benzoic. Năm 1875, Salkowski đã phát hiện ra khả năng kháng nấm của acid

benzoic, do đó nó đã được sử dụng bảo quản một số loại trái cây ...

CTPT: C6H5COOH

Phân tử gam : 122,12 g/mol

Bề ngoài : Chất tinh thể rắn, không màu

Tỷ trọng : 1,32g/cm2, solid

Điểm nóng chảy: 122,4oC (395oK)

Độ sôi : 249oC (522oK)

Độ hòa tan trong nước: Tan được ( nước nóng )(3,4g/l ở 25oC)

Độ hòa tan trong methalnol, diethylether : tan được

Độ acid (pKa): 4,21

2.1.4. Nguyên liệu khác

NaOH tinh thể dạng phân tích.

HCl dạng phân tích

30

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu

Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần

Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu NL phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến

đỏ, không lẫn tạp chất. NL sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa

nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. NL được rửa sạch và xay nhuyễn

(trong đó có 100% là đầu tôm , tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng

một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là 0,5 ÷ 0,8 cm) và tiến hành làm thí

nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi polyme

( mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC.

2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật

Phương pháp bố trí thí nghiệm: dùng phương pháp qui hoạch thực nghiệm

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Mô tả quy trình

Nguyên liệu vỏ đầu tôm được xay nhỏ và khử protein bằng enzyme protease

(Alcalase) trong môi trường có pH và tỷ lệ E/S theo tỷ lệ nghiên cứu. Tiến hành

thuỷ phân protein để chọn ra thời gian, tỷ lệ E/S, nhiệt độ thích hợp. Sau khi tìm

được chế độ tối ưu ta tiến hành thuỷ phân rồi lọc tách riêng phần dịch và phần bã.

Phần dịch tận dụng thu protein và asthaxanthin dùng để sản xuất thức ăn chăn nuôi.

Phần bã được rửa sạch, phơi khô, tiếp tục khử protein bằng NaOH, khử khoáng

bằng C6H5COOH và HCl, ở mỗi công đoạn cũng tiến hành thực hiện để chọn được

chế độ tối ưu (nồng độ, thời gian xử lý) sau đó rửa sạch và thu được Chitin.

Quy trình dự kiến sản xuất chitin từ phế liệu tôm:

31

Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất.

Xay nhỏ

Tách protein bằng enzyme Alcalase

Dịch protein

Tỉ lệ E/NL:[0,1-0,5%]Nhiệt độ: [40-60oC]Thời gian:[4-10h]

Khử protein bằng NaOH

CM

= 0,012÷0,018M

Thời gian: 4÷10hNhiệt độ phòng

Rửa

Rửa

Rửa

Chitin

Khử khoáng bằng acid benzoic

Khử khoáng bằng HCl

Đầu tôm

CM

= 1÷3%

Thời gian: 8÷10hNhiệt độ phòng

CM=0,6÷0,8MThời gian: 4÷10hNhiệt độ phòng

32

Sau khi tìm được các thông số tối ưu của các công đoạn, ta tiến hành sản

xuất Chitin theo các thông số tối ưu của công đoạn khử protein bằng enzyme và

NaOH, còn ở công đoạn khử khoáng ta chỉ dùng HCl, không dùng C6H5COOH.

Theo Nguyễn Văn Toàn và cộng sự đã nghiên cứu [22], công đoạn khử

khoáng chỉ dùng HCl 1,1M; ngâm trong 12 giờ ở 30oC được áp dụng đối với phế

liệu đầu vỏ tôm, kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong Chitin là 1,11±0,01%. Ở

đây đối tượng nguyên liệu được nghiên cứu là phế liệu đầu tôm, đầu tôm thường thì

hàm lượng khoáng cao hơn cho nên em đã dự kiến quy trình đối chứng với nồng độ

HCl là 1,2M; và ngâm trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng. Quy trình dự kiến sản xuất

đối chứng như sau:

Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin không dùng acid benzoic.(đối chứng)

Xay nhỏ

Tách protein bằng enzyme Alcalase

Bã đã tách protein Dịch protein

Tỉ lệ E/NL:0,42%Nhiệt độ: 56oCThời gian:8,8 giờ

Khử protein bằng NaOHNồng độ:2,4%Thời gian:12,2 giờ.Nhiệt độ phòng

Khử khoáng bằng HCl

Chitin

Nồng độ:1,2MThời gian:16 giờNhiệt độ phòng

Đầu tôm

33

2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn của phương pháp

Microbiuret và phương pháp Biuret

● Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret:

Hòa tan 0.1 gam huyết thanh bò (BSA) trong NaOH 3% tạo thành các nồng

độ khác nhau sao cho nồng độ protein trong dịch thuộc khoảng từ 0.05-0.5g/l.

Chuẩn bị 7 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 1 đến 7, sau đó cho các dung

dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau:

Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret

Ống nghiệm Nồng độ Số ml dịch BSA(ml) Số ml NaOH 3%(ml)

1 0 0 4

2 0,05 0,2 3,8

3 0,1 0,4 3,6

4 0,2 0,8 3,2

5 0,3 1,2 2,8

6 0,4 1,6 2,4

7 0,5 2 2

Sau đó lấy mỗi mẫu 4ml, thêm vào đó 200μl thuốc thử Microbiuret,vortex

cho đều và ủ sau 15 phút mang đi đo ở bước sóng 330nm. (Sử dụng ống 0 làm mẫu

blank).

● Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret:

Pha dung dịch chuẩn BSA: Hòa tan 0,5 gam BSA vào trong 50ml nước cất,

khuấy dần dần khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng nước cất (Hàm lượng

BSA: 10mg/ml).

Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0-5 sau

đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau:

Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret

34

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

0 1 2 3 4 5

BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4

Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10

Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng

trong thời gian 30 phút.

Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở

bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank)

2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm

thẻ chân trắng

–Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret.

–Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC

2.2.2.3. Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu

a. Khử lần 1: dùng enzyme alcalase

Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm [8][9]

Mục đích của quá trình tối ưu là chọn một chế độ công nghệ thích hợp cho

quá trình loại bỏ protein từ đầu tôm bằng enzyme Alcalase sao cho hàm lượng

protein khử được là tốt nhất.

Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân, qua các thí

nghiệm thăm dò và kế thừa kết quả nghiên cứu trước đây, đề tài chọn các yếu tố cố

định như sau:

- pH = 8

- Tỷ lệ nguyên liệu / nước là 1:1

- Còn lại 3 thông số: tỷ lệ enzyme bổ sung, nhiệt độ và thời gian thủy phân ảnh

hưởng đến hiệu suất khử protein. Đề tài nghiên cứu quy hoạch thực nghiệm phân tích hồi

35

quy 3 yếu tố, sau đó tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp đường dốc nhất để tìm

giá trị tối ưu.

Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độ enzyme trong khoảng: [0,1%-0,5%]

- Nhiệt độ thủy phân trong khoảng: [40oC-60oC]

- Thời gian thủy phân trong khoảng: [4h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân

(Y) (% theo vật chất khô) → Min.

Bảng 5. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase.

N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%)

1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1

2 0,5 40 4 1 1 -1 -1

3 0,1 60 4 1 -1 1 -1

4 0,5 60 4 1 1 1 -1

5 0,1 40 10 1 -1 -1 1

6 0,5 40 10 1 1 -1 1

7 0,1 60 10 1 -1 1 1

8 0,5 60 10 1 1 1 1

Bảng 6. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase

STT U1 U2 U3 Y(%)

9 0,3 50 7

10 0,3 50 7

11 0,3 50 7

U1: nồng độ enzyme (%)

U2: nhiệt độ thủy phân (oC)

U3: thời gian thủy phân (giờ)

36

b. Khử lần 2 dùng NaOH:

Các thí nghiệm của mẫu khử protein bằng NaOH theo phương pháp quy

hoạch thực nghiệm:

Khử protein bằng xút loãng là phương pháp sử dụng xút ở nồng độ thấp để thủy

phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạng peptit, pepton, acid

amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu. Như trên đã nói protein

trong phế liệu tôm tồn tại dưới hai dạng là dạng tự do thường là phần thịt trong đầu,

chân, đuôi tôm và phần protein liên kết với chitin và các thành phần khác vì vậy muốn

loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu phải sử dụng các tác nhân hóa học hoặc sinh học để

thủy phân protein. Tuy nhiên, phương pháp sinh học không thể loại bỏ protein một cách

triệt để được, do đó ta phải kết hợp cả 2 phương pháp sinh học và hóa học để đảm bảo

hàm lượng protein còn lại trong Chitin là < 1%.

Phương trình phản ứng biểu diễn quá trình khử protein như sau:

H2N-CH-CO-NH-CH-CO- H2N-CH-CO-NH-CH- + H2N-CH-COOH

R1 R2 R1 R2 R3

Polypeptid Peptid Acid amin

Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng

với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

CH2OCOR1 CH2OH

CHOCOR2 + 3NaOH CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa

CH2OCOR3 CH2OH

Triaxylglycerol Glycerol Xà phòng

NaOH

to cao

37

Thông thường hàm lượng của lipid trong nguyên liệu không cao do vậy

không cần nghiên cứu loại bỏ lipid trong công nghệ sản xuất chitin-chitosan vì phần

nhỏ lipid đã bị thủy phân theo phản ứng trên.

Các yếu tố cố định:

- Nhiệt độ : 40oC

- Tỷ lệ mẫu đem đi xử lý NaOH/dung dịch NaOH là: 1/10(w/v)

Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độ NaOH trong khoảng: [0,1%-0,3%]

- Thời gian xử lí NaOH trong khoảng: [8h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân

(Y) (% theo vật chất khô) → Min.

Bảng 7. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng NaOH

N U1(Nồng độ NaOH(%))

U2 (Thời gian (h))

X0 X1 X2 Y(%)

1 0,1 8 1 -1 -1

2 0,3 8 1 1 -1

3 0,1 10 1 -1 1

4 0,3 10 1 1 1

Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH.

STT U1 U2 Y(%)

5 0,2 11

6 0,2 11

7 0,2 11

U1 : Nồng độ NaOH(%)

U2: Thời gian xử lí NaOH(giờ)

2.3.4.3. Thí nghiệm xác định chế độ khử khoáng

38

a. Khử lần 1: Dùng acid benzoic

Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng acid benzoic theo phương

pháp quy hoạch thực nghiệm

Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả năng khử khoáng của axít

benzoic trên nguyên liệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và

NaOH ở điều kiện tối ưu.

Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong

dung dịch acid benzoic. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy

hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục)

đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau:

Các yếu tố cố định:

- Nhiệt độ : nhiệt độ phòng

- Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch acid benzoic =1/15(w/v)

Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độ C6H5COOH trong khoảng: [0,012M- 0,018M]

- Thời gian xử lí C6H5COOH trong khoảng: [4h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng

(Y) (% theo vật chất khô) → Min.

Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH

NU1 (nồng độ

C6H5COOH (M))U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%)

1 0,012 4 1 -1 -1

2 0,018 4 1 1 -1

3 0,012 10 1 -1 1

4 0,018 10 1 1 1

39

Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH

STT U1 U2 Y(%)

5 0,015 7

6 0,015 7

7 0,015 7

U1 : Nồng độ C6H5COOH(M)

U2: Thời gian xử lí ngâm C6H5COOH (giờ)

b. Khử lần 2: Dùng acid chlohydric

Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng HCl theo phương pháp quy

hoạch thực nghiệm:

Sau khi khử protein bằng enzyme và NaOH thì % hàm lượng khoáng còn lại rất

lớn, dùng acid benzoic không thể loại bỏ khoáng một cách triệt để được, do đó ta phải

kết hợp sử dụng cả acid hữ cơ kết hợp acid vô cơ để đảm bảo hàm lượng khoáng còn lại

trong Chitin là < 1%.

Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả năng khử khoáng của axít

chlohydric trên nguyên liệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza

và NaOH và đã khử khoáng một phần bằng acid benzoic ở điều kiện tối ưu.

Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong

dung dịch HCl. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch

thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác

định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau:

Các yếu tố cố định:

- Nhiệt độ : nhiệt độ phòng

- Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch HCl =1/10(w/v)

Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độ HCl trong khoảng: [0,6M- 0,8M]

40

- Thời gian xử lí HCl trong khoảng: [4h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (%

theo vật chất khô) → Min.

Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng HCl.

N U1(Nồng độ HCl(M))

U2 (Thời gian (h))

X0 X1 X2 Y(%)

1 0,6 4 1 -1 -1

2 0,8 4 1 1 -1

3 0,6 10 1 -1 1

4 0,8 10 1 1 1

Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl

STT U1 U2 Y(%)

5 0,7 7

6 0,7 7

7 0,7 7

U1 : Nồng độ HCl (M)

U2: Thời gian xử lí ngâm HCl (giờ)

2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC:[1]

2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo

TCVN 3700-1990.

2.3.2. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC.

2.3.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret:

Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành một

phức chất màu tím (phản ứng biuret). Màu sắc của phức chất tỷ lệ với số liệu peptid

(-CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa

albumin và globulin.

41

Hình 15.Công thức của phức Biuret.

2.3.3.1. Dụng cụ

-Dụng cụ thủy tinh(ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức,

bình tam giác, pipette), vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm

- Micropipet (100-1000μl)

-Thiết bị đo UV-Vis mini1240

2.3.3.2. Hóa chất

- NaOH

- Na2CO3 (Sodium Cabonate)

- CuSO4.5H2O

- Na3C6H5O7.2H2O (Sodium citrate)

2.3.3.3. Tiến hành

● Pha dung dịch thuốc thử Microbiuret:

Lấy 173g Sodium citrate và 100g Sodium carbonate, đem hòa tan trong

nước nóng nhưng không để nước sôi.

Lấy 17,3g CuSO4 hòa tan trong 100ml nước cất và thêm vào hỗn hợp trên.

Sau đó thêm nước cất vào cho đủ 1 lít.

● Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm

● Xử lý mẫu:

42

Lấy 1g mẫu + 20ml NaOH 3% →ủ ở 80oC,trong 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp này

được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, rồi sau đó mang đi lọc. Khi lọc, dùng từ 10-15ml

NaOH 3% để rửa bã.

Sau đó đem dịch đi li tâm ở 5000 vòng/15 phút → Lấy dịch → Pha loãng sao

cho hàm lương protein nằm trong dãi bước sóng.

Lấy 4ml + 200μl Microbiuret → đo ở bước sóng 330nm.

Kết quả đo được tương ứng với giá trị y (OD330nm), dựa vào phương trình

đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch. Từ đó tính ra được

phần trăm protein có trong mẫu theo công thức tính sau:

100/)100.(1000.

100..%

Mcm

CVprotein

−=

V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng(ml)

C: Hàm lượng protein trong 1 ml(mg/ml)

m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (gam)

Mc: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%)

2.3.4. Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Biuret:

2.3.4.1. Dụng cụ: giống như phương pháp Microbiuret.

2.3.4.2. Hóa chất:

NaOH

CuSO4.5H2O

C4H4NaKO6.4H2O (Kali Natri tartrat)

BSA (Bovine serum albumin)

2.3.4.3. Tiến hành:

Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375 gam CuSO4.5H2O và 8,0571 gam

C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH

10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất .

Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm.

Xử lí mẫu:

Cách 1: Ngâm 3-5gam nguyên liệu khô hoặc 3-10 gam nguyên liệu ướt trong

NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15w/v. Sau đó đem ủ ở 95oC trong 6 giờ.

43

Cách 2: Xử lí mẫu giống như trên nhưng không ủ ở 95oC trong 6 giờ mà ủ ở

nhiệt độ phòng 12 giờ, sau đó nâng nhiệt lên 95oC trong 1 giờ.

Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì thêm

nước cất vào cho đủ 100ml. Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc chân

không bằng giấy lọc Whatman Filter paper.

Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lượng protein bằng thiết bị đo UV-

Vis mini1240.

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý theo phần mềm Excel

2003. Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần,

lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm.

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

44

3.1. Kết quả đường chuẩn xây dựng được theo phương pháp Microbiuret và

phương pháp Biuret:

3.1.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret :

Kết quả đo được (ở phụ lục)

Phương trình đường chuẩn.

Đồ thị đường chuẩn BSA

y = 1.4689x + 0.0027

R2 = 0.9998

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Hàm lượng protein(mg/ml)

OD3

30nm

Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret

3.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Biuret:

Kết quả đo mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn (ở phụ lục)

45

Đồ thị đường chuẩn BSA

y = 0.0509x - 0.001

R2 = 0.9999

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

Hàm lượng protein(mg/ml)

OD

570n

m

Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret.3.2. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ:

Kết quả phân tích thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng được

trình bày tại bảng 3.1.

Bảng 13. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng (%)

Chỉ tiêu Protein Lipid Tro Chitin

Thành phầnhóa học (%)

49 4,7 25,2 18,3

(Tính theo vật chất khô)

Kết quả phân tích cho thấy tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có hàm

lượng protein trong phế liệu tôm khá cao. Kết quả này cho thấy cần sử dụng

phương pháp sinh học để thủy phân protein để tận dụng lượng protein có chất

lượng vào việc chế biến thức ăn gia súc,… đồng thời nghiên cứu hoàn thiện quy

trình sản xuất chitin vừa có hiệu quả kinh tế, vừa mang ý nghĩa môi trường.Hàm

lượng khoáng trong đầu tôm cũng khá cao, hàm lượng lipid và hàm lượng Chitin

được tham khảo.[13]

46

3.3. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase:

Công đoạn khử protein này được thực hiện bằng cách bổ sung enzyme

Alcalase để thủy phân phế liệu tôm. Các thông số tối ưu được xác định bằng

phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần

mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục)

đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein như sau:

Bảng 14. Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Alcalase

N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3Y(%) lượng

protein còn lại

1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183

2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941

3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023

4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233

5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383

6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916

7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975

8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423

Bảng 15. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase

N0 U1 U2 U3 Y(%)

9 0,3 50 7 12,67

10 0,3 50 7 12,7970

11 0,3 50 7 13,8167

Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau:

Y= 12,5298 – 1,0145*X1 – 0,8808*X2 – 2,1623*X3 (1)

47

Thảo luận: Phương trình (1) tương thích với thực nghiệm :qúa trình thủy

phân để khử protein của phế liệu tôm bằng enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:

nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian …Qua phương trình trên ta thấy quy luật biến

đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ enzyme (X1), nhiệt độ thủy phân

(X2) và thời gian khử protein (X3) thì hàm lượng protein còn lại trong phế liệu tôm

(Y) giảm xuống, nhưng thời gian thủy phân và nồng độ enzyme ảnh hưởng tới hàm

lượng protein nhiều hơn so với nhiệt độ thủy phân. Từ phương trình (1) nếu muốn

khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng độ enzyme, thời gian khử protein và

nhiệt độ thủy phân; song việc tăng cao nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và kéo

dài thời gian khử protein như thế nào cho hợp lí để tiết kiệm được thời gian và chi

phí sản xuất mà vẫn đảm bảo được lượng protein còn lại trong phế liệu tôm là ít

nhất. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường

dốc nhất và thu được kết quả các thí nghiệm tiếp theo ở bảng 16

Bảng 16. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất

Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa

Tên U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) Y(%)

Mức cơ sở 0,3 50 7

Bước làm tròn 0,04 2 0,6

Thí nghiệm 12 0,34 52 7,6 9,451

Thí nghiệm 13 0,38 54 8,2 9,2528

Thí nghiệm 14 0,42 56 8,8 8,0102

Thí nghiệm 15 0,46 58 9,4 8,655

Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấy ở thí nghiệm thứ 14 hàm lượng protein

còn lại trong phế liệu tôm là thấp nhất.

48

9.4519.2528

8.0102

8.655

7

7.5

8

8.5

9

9.5

10

12 13 14 15

Thí nghiệm

Hàm

lư

ợn

g p

rote

in c

òn

lại(

%)

Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân bằng enzyme theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson.

Nhận xét và thảo luận: Bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực

nghiệm toán học cho phép dần tới điểm tối ưu nhất. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa

toán học cao với độ tin cậy là 95%. Điểm tối ưu đạt được ở thí nghiệm thứ 14 với nồng

độ enzyme là 0,42%, ở nhiệt độ 56oC và ứng với thời gian tương ứng là 8,8 giờ.

3.4. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng NaOH:

Công đoạn khử protein được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung

dịch acid NaOH loãng. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch

thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục)

đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein như sau.

Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH

N U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) X0 X1 X2Y (%) lượng

protein còn lại

1 1 8 1 -1 -1 1,78

2 3 8 1 1 -1 1,04

3 1 14 1 -1 1 1,34

4 3 14 1 1 1 0,82

49

Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH

N0 U1 U2 Y(%)

9 2 11 1,1214

10 2 11 1,0764

11 2 11 1,1319

Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau :

Y= 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2)

Thảo luận: Phương trình (2) tương thích với thực nghiệm và qua phương

trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ dung

dịch NaOH (X1) và thời gian khử protein (X2) thì hàm lượng protein trong phế liệu

tôm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ NaOH ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều

hơn. Từ phương trình (2) nếu muốn khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng

độ NaOH và thời gian khử protein; song việc tăng cao nồng độ NaOH và kéo dài

thời gian khử protein sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt

mạch polymer từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ

mức cơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và thu được kết

quả các thí nghiệm tiếp theo ở bảng 19

Bảng 19. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất

Tên U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) Y(%)

Mức cơ sở 0,2 11

Bước chuyển động 4 4

Bước làm tròn 0,2 0,6

Thí nghiệm 9 2,2 11,6 1,08

Thí nghiệm 10 2,4 12,2 0,96

Thí nghiệm 11 2,6 12,8 0,91

Thí nghiệm 12 2,8 13,4 0,86

50

Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấy ở thí nghiệm thứ 10 hàm lượng protein

trong chitin tương đối thấp tương ứng với nồng độ NaOH là 2,4%, ở 12,2 giờ. Nếu

nâng cao nồng độ protein và thời gian xử lý khử protein thì hàm lượng giảm không

đáng kể. Mặt khác, tăng nồng độ NaOH làm tăng chi phí sản xuất và giảm độ nhớt

chitosan. Hàm lượng protein trong chitin ảnh hưởng lớn đến chất lượng chitin vì

protein làm giảm độ tan của chitin trong acid HCl đặc và ảnh hưởng tới chất lượng

của các chế phẩm được sản xuất từ chitin như: Glucosamin, chitosan…

Khi hàm lượng protein trong chitin cao thì trong công đoạn deacetyl ta phải

tăng hàm lượng NaOH và kéo dài thời gian deacetyl để khử hết protein và làm tăng

độ deacetyl. Nhưng nồng độ NaOH càng cao và thời gian xử lý khử protein càng

dài thì dễ gây cắt mạch glucoside từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Vì

vậy em quyết định chọn các thông số tối ưu cho công đoạn xử lý khử protein như

trên.

Từ các thí nhiệm ở phần tối ưu hoá công đoạn khử protein theo quy hoạch

thực nghiệm ta vẽ được đồ thị sau:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

8 11 11.6 12.2 12.8 13.4 14

Thời gian ngâm NaOH(giờ)

Hàm

lượn

g pr

otei

n cò

n lạ

i(%

)

1.0%

3.0%

2.0%

2.2%

2.4%

2.6%

2.8%

51

Hình 19. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm NaOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillsonNhận xét:

Qua đồ thị trên ta thấy khi nồng độ NaOH thấp thì dù thời gian có kéo dài thì

hàm lượng protein trong chitin cũng rất cao (1,34%). Khi nồng độ NaOH tăng dần

và thời gian khử protein tăng dần thì hàm lượng protein giảm dần. Ở nồng độ NaOH

2,4% protein trong mẫu <1% là hàm lượng protein đạt tiêu chuẩn của chitin-

chitosan hiện nay. Ở nồng độ NaOH 2,4% cho hàm lượng protein tương đối thấp

(0,96%), ở nồng độ NaOH 2,6% và 2,8% hàm lượng protein còn lại trong phế liệu

tôm thấp hơn 0,96% nhưng nồng độ NaOH cao có ảnh hưởng đến chất lượng của

Chitin-Chitosan sau này, mặc khác còn tốn thêm chi phí. Vì vậy có thể chọn nồng

độ NaOH=2,4% trong thời gian 12,2 giờ làm thông số tối ưu cho công đoạn khử

protein.

Vậy thông số tối ưu cho công đoạn khử protein là: Nồng độ NaOH=2,4%,

thời gian xử lý 12,2 giờ, tỷ lệ w/v=1/10, nhiệt độ (40±1 oC).

3.5. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử khoáng bằng acid benzoic:

Phế liệu tôm đã qua khâu xử lý enzyme và NaOH có thành phần hoá học

được trình bày ở bảng 20.

Bảng 20. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử lý khử protein bằng enzyme Alcalase và NaOH ở điều kiên tối ưu

STT Thành phần Hàm lượng (%) trong phế liệu tôm1 Protein 0,962 Khoáng 62,43 Độ ẩm 13,86

Từ bảng 20 ta thấy sau khi xử lý protein bằng enzyme Alcalase và NaOH

hàm lượng protein giảm đáng kể (hiệu quả khử protein 98%). Nhưng hàm lượng

khoáng còn rất nhiều vì môi trường khử protein bằng enzyme là môi trường kiềm

(pH=7,2). Một phần khoáng được tách ra do phần protein liên kết với khoáng được

tách ra. Nhưng thành phần phần trăn theo khôi lượng của hàm lượng khoáng tăng

do hàm lượng protein trong phế liệu giảm

52

Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung

dịch acid benzoic. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực

nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục)

đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau.

Bảng 21. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ khử khoáng bằng C6H5COOH

NU1 (nồng độ

C6H5COOH (M))U2

(thời gian (h))X0 X1 X2 Y(%)

1 0,012 4 1 -1 -1 35,21

2 0,018 4 1 1 -1 34,38

3 0,012 10 1 -1 1 25,09

4 0,018 10 1 1 1 18,57

Bảng 22. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH

N0 U1 U2 Y(%)

9 0,015 7 26,05

10 0,015 7 25,14

11 0,015 7 26,23

Phương trình hồi quy của hàm lượng khoáng xác định được như sau:

Y= 26.3125 - 1.8375*X1 - 6.4825*X2 (3)

Quy luật biến đổi của hàm lượng khoáng là khi tăng nồng độ dung dịch acid

benzoic (X1), tăng thời gian khử khoáng (X2) thì hàm lượng khoáng trong phế liệu

tôm (Y) giảm xuống, nhưng thời gian ngâm acid benzoic ảnh hưởng tới hàm lượng

khoáng nhiều hơn . Từ phương trình (3) nếu muốn khử khoáng một cách triệt để ta

phải tăng nồng độ acid benzoic, thời gian khử khoáng; song việc tăng cao nồng độ

acid benzoic, kéo dài thời gian khử khoáng sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của

53

chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan.

Như vậy xuất phát từ mức cơ sở em tiến hành các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc

nhất.

Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóaTên U1(nồng độ M) U2(thời gian) Y(%)

Mức cơ sở 0,015 7Hệ số bj -1,8375 -6,4825Bước chuyển động 3 3Bước làm tròn 0,0006 0,6Thí nghiệm 9 0,0156 7,60 25,01Thí nghiệm 10 0,0162 8,20 22,29Thí nghiệm 11 0,0168 8,80 20,83Thí nghiệm 12 0,0174 9,4 19,02

Hình 20. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm C6H5COOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson.

Nhận xét: Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy khi tăng nồng độ

acid benzoic, thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm dần, khi nồng độ

C6H5COOH 0,0168M, thời gian ngâm 8,8 giờ thì hàm lượng khoáng còn lại là

20,83%. Khi tiếp tục tăng nồng độ benzoic và thời gian khử khoáng thì hàm lượng

khoáng giảm không đáng kể. Do vậy nếu chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khoáng

54

thấp và độ nhớt cao thì ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng

để giảm được nồng độ C6H5COOH và thời gian xử lý C6H5COOH sau này nhằm

đảm bảo được chất lượng của Chitin-Chitosan một cách tốt nhất. Ta có thể chọn các

thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng như sau: nồng độ C6H5COOH là

0,0168M, thời gian ngâm 8,8 giờ.

3.6. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử khoáng bằng HCl:

Phế liệu tôm đã qua khâu xử lý acid benzoic có thành phần hoá học được

trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 23. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử protein bằng enzyme Alcalase, NaOH và C6H5COOH ở điều kiên tối ưu.

STT Thành phần Hàm lượng (%) trong phế liệu tôm

1 Protein 0,962 Khoáng 20,833 Độ ẩm 12,23

Bảng 24. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ khử khoáng bằng HCl

NU1(Nồng độ

HCl(M))

U2

(Thời gian (h))X0 X1 X2 Y(%)

1 0,6 4 1 -1 -1 4,982 0,8 4 1 1 -1 2,243 0,6 10 1 -1 1 2,864 0,8 10 1 1 1 0,73

Bảng 25. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl

N0 U1 U2 Y(%)

9 0,7 7 1,94

10 0,7 7 1,81

55

11 0,7 7 1,79

Phương trình hồi quy của hàm lượng khoáng xác định được như sau:

Y= 2.7025 - 1.2425 * X1 - 0.9325 * X2 (4)

Quy luật biến đổi của hàm lượng khoáng là khi tăng nồng độ dung dịch acid

chlohydric (X1), tăng thời gian khử khoáng (X2) thì hàm lượng khoáng trong phế

liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ HCl ảnh hưởng tới hàm lượng khoáng

nhiều hơn . Từ phương trình (4) nếu muốn khử khoáng một cách triệt để ta phải

tăng nồng độ HCl, thời gian khử khoáng; song việc tăng cao nồng độ HCl, kéo dài

thời gian khử khoáng sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt

mạch polymer từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ

mức cơ sở em tiến hành các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất.

Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóaTên U1(nồng độ %) U2(thời gian) Y

Mức cơ sở 0.7 7Hệ số bj -1.2425 -0.9325Khoảng biến thiên 0.1 3 bj*khoảng biến thiên -0.12425 -2.7975Bước chuyển động 4 4Bước làm tròn 0.02 0.6Thí nghiệm 9 0.72 7.6 1.53Thí nghiệm 10 0.74 8.2 0.98Thí nghiệm 11 0.76 8.8 0.83Thí nghiệm 12 0.78 9.4 0.77

56

0

1

2

3

4

5

6

4 7 7.6 8.2 8.8 9.4 10

Thời gian xử lí HCl (giờ)

Hàm

lượn

g kh

oáng

còn

lại(

%)

0.60%

0.80%

0.70%

0.72%

0.74%

0.76%

0.78%

Hình 21. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm HCl theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson.

Nhận xét: Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy khi tăng nồng độ

acid chlohydric và thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm dần, khi nồng

độ HCl 0,74M, thời gian ngâm 8,2 giờ thì hàm lượng khoáng còn lại là 0,98%. Khi

tiếp tục tăng nồng độ HCl và thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm

không đáng kể, mặt khác, hàm lượng khoáng còn lại cũng đã < 1%. Do vậy nếu

chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khoáng thấp và độ nhớt cao thì ta có thể chọn

các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng để giảm được nồng độ HCl và thời

gian xử lý HCl sau này nhằm đảm bảo được chất lượng của Chitin-Chitosan một

cách tốt nhất. Ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng như sau:

nồng độ HCl là 0,74M, thời gian ngâm 8,2 giờ.

Thảo luận: Từ qui trình đối chứng khử khoáng bằng HCl nồng độ 1,4M và

thời gian ngâm là 16 giờ ở nhiệt độ phòng, không dùng C6H5COOH, ta thu được

Chitin, trong đó hàm lượng khoáng còn lại là 0.78%, còn quy trình dự kiến sản xuất

thì hàm lượng khoáng còn lại 0,98%. Ta thấy, Chitin thu được từ 2 qui trình trên

đều có hàm lượng khoáng còn lại là <1%, nhưng ở qui trình khử khoáng có sử dụng

57

kết hợp với C6H5COOH thì chất lượng Chitin sẽ tốt hơn vì thời gian xử lí HCl ngắn

hơn do đó giảm tác động không có lợi đến mạch polysaccharid của Chitin, acid hữu

cơ có khả năng bảo toàn mạch Chitin. Mặc khác, khi xử lý acid benzoic nó còn làm

yếu liên kết giữa protein-chitin-khoáng, do đó khi xử lý HCl sẽ dễ dàng tách khoáng

ra khỏi phế liệu tôm ở nồng độ thấp (0,74M) và thời gian ngắn hơn (8,2 giờ). Khi

chỉ dùng HCl thôi thì phải dùng ở nồng độ cao hơn (1,2M), thời gian xử lý dài hơn

(16 giờ), vì ở nồng độ và thời gian dài như vậy sẽ làm ảnh hưởng xâu đến mạch

polysaccharid của Chitin. Do đó, việc kết hợp khử khoáng bằng acid hữu cơ và vô

cơ là vấn đề quan trọng cần được nghiên cứu thêm.

58

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

4.1. Kết luận:

1. Đã nghiên cứu được điều kiện khử protein bằng enzyme và NaOH thích hợp để

sản xuất chitin như sau:

- Điều kiện khử protein bằng enzyme Alcalase: Nồng độ enzyme 0,42%,

nhiệt độ 56oC,thời gian là 8.8 giờ,tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:1.

- Điều kiện khử protein bằng NaOH: Nồng độ NaOH 0,24%, nhiệt độ

40oC,thời gian là 12,2 giờ, tỷ lệ 1w/5v.

Khử protein từ phế liệu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng

enzyme Alcalase đã giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường, đồng

thời đã tận dụng nguồn protein từ đầu tôm làm thúc ăn chăn nuôi.

2. Đã nghiên cứu được điều kiện khử khoáng bằng acic benzoic thích hợp: nồng độ

acid benzoic là 0,0168M, thời gian xử lý là 8,8 giờ, ở nhiệt độ phòng.

Tiếp tục khử khoáng bằng acid chlohydric thích hợp là: 0,74M,thời gian

ngâm là 8,2 giờ, ở nhiệt độ phòng.

4.2. Một số đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu:

- Cần tiếp tục nghiên cứu công đoạn deacetyl để hoàn thiện qui trình sản xuất

Chitin-Chitosan theo phương pháp sinh học

- Cần phân tích chất lượng Chitosan từ chitin sản xuất theo qui trình đề xuất

để đánh giá mức độ ảnh hưởng của các thông số công nghệ.

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tài liệu tiếng Việt

1. Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Thuần Anh, Vũ Ngọc Bội –

Phân tích thực phẩm kiểm nghiệm thủy sản – Nhà xuất bản Nông

nghiệp, 2006.

2. Nguyễn Hữu Tào, Lê Văn Liễn, Bùi Văn Chính,Vũ Chí Cương – Viện

chăn nuôi – Kỹ thuật chế biến, bảo quản, và sử dụng nguồn phụ phẩm

nông nghiệp và hải sản làm thức ăn chăn nuôi.

3. Nguyễn Thị Ngọc Tú , 2003,76tr. Nghiên cứu dùng vật liệu Chitosan

làm phụ gia thực phẩm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. [Tên tạp

chí]

4. Trần Thị Luyến, 2004, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp

bộ sản xuất chitin, Chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản, Mã số

B2002-33-01-DA,8-15

5. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, 03/2005, Sản

xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu Thủy sản- NXB Nông

nghiệp.

6. Trần Thị Luyến và cộng sự (2003), Nghiên cứu sản xuất Chitosan từ vỏ

tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm, Tạp

chí KHCN Thủy sản, Đại học Thủy Sản, số 5, 18-20

7. Trần Thị Luyến, (2006), Các phản ứng cơ bản và biến đổi của thực

phẩm trong quá trình công nghệ - NXB Nông nghiệp, 2-17

8. Nguyễn Cảnh (1993), Quy hoạch thực nghiệm, Trường Đại học Bách

Khoa Tp.Hồ Chí Minh, 10-15

9. Phan Hiếu Hiền (2001), Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu

– NXB Nông nghiệp,22-24.

10. M.T.DenSiKov, Nguyễn Văn Đạt, Bùi Huy Thanh (1997), Tận dụng

phế liệu của công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa hoc và Kỹ thuật, Hà

Nội, 60-64

60

11. Roelof Schoemaker, Chuyên gia tư vấn (2005), Tận dụng phế liệu tôm,

Dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu Thủy sản (Seaquip), NXB

Nông nghiệp, 10-15.

12. http://www.casep.com.vn/default.asp?ngng=&dk=22&id=2938

13. http://khcn.ntu.edu.vn/vn/tai_nguyen/danh_muc_tap_chi/20060403/200

702260902082.pdf.

14. Một số đồ án tốt nghiệp trên thư viện.

B. Tài liệu tiếng Anh

15. Adler – Niesen. J.,(1986), Enzyme Hydrosis of Food Proteins, Elsevier

Applied Science Publishers, New York.

16. Asbjorn Gildberg, Even Stenberg., (2000), A new process for advanced

utilisention of shrimp waste, pp.2-7.

17. Birch. G.G., Blakerough. N., and Parker. K.J., (1981), Enzymes and

Food Processing Applied, Science Publishers Ltd, London.

18. Bustos. R.O.,and Michael. H., (1994), Microbial deproteinisation of

waste prawn shell, Institution of Chemical Engineers Symposium

Series, Institution of Chemical Engineers, Rugby, England, pp. 13-15.

19. Dalev. P. G., Simeonova. L.S., (1992), An enzyme biotechnology for

thetotal utilization of leather wastes, Biotechnol Lett Vol. 14, pp.531-

534.

20. Gagne. N. and Simpson. B.K.,(1993), Use of proteolytic enzymes to

facilitate recovery from shrimp wastes, Food Biotechnol,pp. 253-263.

21. Holanda, H. D. D, Netto, F. M., 2006. Recovery of components from

shirmp (Xiphopenaeus kroyeri) processing waste by enzymatic

hydrolysis. Journal of Food Science, 71, 298-303.

22. Nguyen Van Toan, Chuen-How Ng, Kyaw Nyein Aye, Trung Si Trang

and Willem F.Stevens, Production of high-quality chitin and chitosan

from preconditioned shrimp shells, F. Chem Technol Biotechnol

81:1113-1118(1006)

61

ảng

62

PHỤ LỤC

Bảng 26. Kết quả đo OD330nm

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7

Hàm lượng BSA(mg/ml)

0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

OD330nm 0,075 0,148 0,296 0,448 0,594 0,732

Bảng 27. Kết quả đo OD570nm

Ống nghiệm Hàm lượng BSA(mg/ml) OD570

1 2 0,101

2 4 0,201

3 6 0,305

4 8 0,409

5 10 0,506

1) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử

protein từ phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánh giá

vai trò của từng yếu tố là: N = nk

Trong đó:

N : Số thí nghiệm;

n: Số mức, ở đây n = 3

k: Số yếu tố ảnh hưởng; k = 3

vậy N = 23 = 8 thí nghiệm.

Tính các hệ số của phương trình hồi quy:

8

.1

∑==

N

iiij YX

bj

1

Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập.

N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=8

Bảng 28. Bảng bố trí thí nghiệm

N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3Y(%)lượng

protein còn lại

1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183

2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941

3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023

4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233

5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383

6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916

7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975

8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423

Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 12,5298 ; b1 = -1,0145;

b2 = - 0,8808 ; b3= -2,1623

Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là:

=Y 12,5298 – 1,0145 * X1 – 0,8808 * X2 – 2,1623 * X3(1)

Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy.

Bố trí 3 thí nghiệm song song thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase theo

các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau:

Bảng 29.Các thí nghiệm ở tâm phương án

N U1 U2 U3 Y1 03 50 7 12,67

2

2 0,3 50 7 12,7973 0,3 50 7 13,8167

Bảng 30. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase.

N0 01uY 0

1Y01

01 YY u − ( )20

10

1 YY u − A

1 12,67

13,06183

3

1

01

=∑

−uuY

- 0,3912 0,1531

( ) 3081,123

1

01

01 =−∑

−uu YY

2 12,797 - 0,2642 0,0698

3 13,8167 0,6555 0,4296

Ta sẽ được phương sai tái hiện là:

( )3263,0

11 00

3

1

201

01

2 =−

=−

−=

∑−

N

A

N

YYS u

u

th

30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án

Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy:

Cấu trúc:

0:

0:

≠=

ja

iO

H

H

ββ

==bj

j

j S

bt với 2019,0

2

==N

SS th

bj

Trong đó bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j

Tính toán ta có:

to= 62,0449

t1= 5,0237

t2 = 4,3616

t3 = 10,7075

Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2

Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t

Như vậy các hệ số 321 ;; ttt đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng:

1Y =12,5298 – 1,0145*X1 – 0,8808*X2 – 2,1623*X3 (1)

3

Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo

tiêu chuẩn Fisher.

Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( 2thS ) được cho ở bảng sau:

Bảng 31.Các số liệu dùng để tính toán

STTiY iY ii YY ˆ− 2)ii YY −

47,29)ˆ( 2

1

=−∑=

i

N

ii YY1 19,6183 15,7066 3,9117 15,3013

2 11,8941 13,6776 -1,7835 3,18083 13,023 15,7066 -2,6836 7,20184 14,233 13,6776 0,5554 0,30855 11,5383 11,3819 0,1564 0,02446 10,5916 9,3529 1,2387 1,53447 9,9975 11,3819 -1,3844 1,91678 9,3423 9,3529 0,0106 0,0001

Phương sai dư ( )

8936,538

47,29

1

ˆ1

2

2 =−

=−

−=

∑=

N

YYS

N

iii

d

Trong đó: N: Số thí nghiệm

1: Số hệ số có nghĩa

Tiêu chuẩn Fisher: 064,186540,0

5307,122

2

===th

d

S

SF

Tra bảng phân vị phân bố Fisher Fα (f1,f2) với:

α =0,05

f1=N-L=3: Bậc tự do của tử.

f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu.

Tra bảng ta có: F0,05(3,2) = 19,3

Vì F = 18,0641 < F0,05(3,2) = 19,3; nên phương trình tương thích với thực

nghiệm.

Nhìn vào phương trình hồi quy (1), ta có nhận xét:

4

Cả 3 yếu tố nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và tỷ lệ E/S đều có ảnh

hưởng đến mức độ thủy phân nhưng thời gian có ảnh hưởng mạnh nhất.

Các hệ số b1, b2, b3 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng protein

còn lại) đồng biến với X1 (tỷ lệ E/S), X2 (nhiệt độ thủy phân), X3 (thời gian thủy

phân)

Từ phương trình (1) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc

nhất. Chọn bước chuyển động của nhiệt độ thủy phân X1 là 2oC. Các bước chuyển

động của yếu tố X2, X3 được tính theo công thức dưới đây:

58,0

036,0

33

1113

22

1121

=∆∆=

=∆∆=

b

b

b

b

δδ

δδ

Chọn bước nhảy thích hợp với X1 là 0,04.

5

Bảng 32. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein bằng enzyme .

Tên X1 X2 X3 Y

Mức cơ sở 0.3 50 7

Hệ số bj -1.0145 -0.8808 -2.1623

Khoảng biến thiên 0.2 10 3

bj j∆ -0.2029 -8.808 -6.4869

Bước jδ 0.036 2 0.58

Bước làm tròn 0.04 2 0.6

Thí nghiệm 9 0.34 52 7.6 9.451

Thí nghiệm 10 0.38 54 8.2 9.2528

Thí nghiệm 11 0.42 56 8.8 8.0102

Thí nghiệm 12 0.46 58 9.4 8.655

Bảng 33.Các thông số tối ưu.

Các thông số tối ưu Hàm lượng protein (%)

Nồng độ enzyme Alcalase:4,2 %Thời gian: 8,8 giờ

Nhiệt độ: 56oC

8,0102

2) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử

protein từ phế liệu tôm bằng NaOH:

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánh

giá vai trò của từng yếu tố là:

N=nk

Trong đó: N : Số thí nghiệm;

n: Số mức, ở đây n=2

k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2

vậy N= 22 =4 thí nghiệm.

Tính các hệ số của phương trình hồi quy:

6

4

.1

∑==

N

iiij YX

bj

Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập.

N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4

Bảng 34. Bảng bố trí thí nghiệm

N U1(nồng độ %) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng protein còn lại

1 0,1 8 1 -1 -1 1,78

2 0,3 8 1 1 -1 1,04

3 0,1 14 1 -1 1 1,34

4 0,3 14 1 1 1 0,82

Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 1,245 ; b1= -0,315;

b2= -0,165

Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là:

=Y 1.245 - 0.315*X1 - 0.165*X2

Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy.

Bố trí 3 thí nghiệm song song khử protein trong phế liệu tôm bằng NaOH

theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau:

Bảng 35.Các thí nghiệm ở tâm phương án

N0 U1 U2 Y(%)

9 0,2 11 1,1214

10 0,2 11 1,0764

11 0,2 11 1,1319

7

Bảng 36.Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH

N0 01uY 0

1Y01

01 YY u − ( )20

10

1 YY u − A

1 1,1214

=∑

−

3

3

1

01

uuY

1,10990,0115 0,0001

=

−∑−

23

1

01

01

uu YY 0,001

72 1,0764 - 0,0335 0,0011

3 1,1319 0,0220 0,0005

Ta sẽ được phương sai tái hiện là:

( )0009,0

11 00

3

1

201

01

2 =−

=−

−=

∑−

N

A

N

YYS u

u

th

30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án

Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy:

Cấu trúc:

0:

0:

≠=

ja

iO

H

H

ββ

==bj

j

j S

bt với 0147,0

2

==N

SS th

bj

Trong đó bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j

Tính toán ta có:

to= 84,4553

t1= 21,3682

t2 = 11,1929

Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2

Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t

Như vậy các hệ số t1,12 đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có

dạng: 1Y = 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2)

Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo

tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( 2thS ) được cho ở

bảng sau:

8

Bảng 37. Các số liệu dùng để tính toán

STT iY iY ii YY ˆ− 2)ii YY −001,0)ˆ( 2

1

=−∑=

i

N

ii YY

1 1,78 1,7250 0,0550 0,003

2 1,04 1,0950 -0,0550 0,003

3 1,34 1,3950 -0,0550 0,003

4 0,82 0,7650 0,0550 0,003

Phương sai dư ( )

0061,01

ˆ1

2

2 =−

−=

∑=

N

YYS

N

iii

d

Trong đó: N: Số thí nghiệm

1: Số hệ số có nghĩa

Tiêu chuẩn Fisher: 96,60009.0

0061.02

2

===th

d

S

SF

Tra bảng phân vị phân bố Fisher Fα (f1,f2) với:

α =0,05

f1=N-L=2: Bậc tự do của tử.

f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu.

Tra bảng ta có: F0,05(2,2) =18,5

Vì F =6,96 < F0,05(2,2) =18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm.

Nhìn vào phương trình hồi quy (2), ta có nhận xét:

Cả 2 yếu tố nồng độ NaOH, thời gian ngâm đều có ảnh hưởng đến mức độ

khử protein nhưng nồng độ có ảnh hưởng mạnh nhất.

Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng protein còn lại)

đồng biến với X1 (nồng độ NaOH), X2 (thời gian ngâm).

Từ phương trình (2) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc

nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ NaOH là 0,2%. Các bước chuyển động

của yếu tố X2, X3 được tính theo công thức sau hay được chọn theo kinh nghiệm.

607,022

1112 =

∆∆=

b

bδδ

9

Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein bằng

NaOH được ghi trong bảng :

Bảng 38.Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử protein bằng NaOH

Tên X1 X2 Y

Mức cơ sở 0,2 11

Hệ số bj -2,3238 -2,6763

Khoảng biến thiên 0,1 3

bj j∆ -0,3238 -8,0289

Bước jδ 0,2 0,607

Bước làm tròn 0,2 0,6

Thí nghiệm 9 2,2 11,6 1,08

Thí nghiệm 10 2,4 12,2 0,96

Thí nghiệm 11 2,6 12,8 0,91

Thí nghiệm 12 2,8 13,4 0,86

Bảng 39.Các thông số tối ưu

Các thông số tối ưu Hàm lượng protein (%)

Nồng độ NaOH:2,4 %

Thời gian: 12,2 giờTỷ lệ w/v: 1/15

0,96

3) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử

khoáng từ phế liệu tôm bằng C6H5COOH:

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánhgiá vai

trò của từng yếu tố là:

N=nk

Trong đó: N : Số thí nghiệm;

n: Số mức, ở đây n=2

k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2

vậy N = 22 = 4 thí nghiệm.

10

Tính các hệ số của phương trình hồi quy:

4

.1

∑==

N

iiij YX

bj

Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập.

N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4

Bảng 40. Bảng bố trí thí nghiệm

N U1(nồng độ M) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng khoáng còn lại

1 0,012 4 1 -1 -1 35,21

2 0,018 4 1 1 -1 34,38

3 0,012 10 1 -1 1 25,09

4 0,018 10 1 1 1 18,57

Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 26,3125 ; b1= -1,8375;

b2= -6,4825

Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là:

=Y 26,3125 – 1,8375*X1 – 6,4825*X2 (3)Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy.

Bố trí 3 thí nghiệm song song khử khoáng trong phế liệu tôm bằng C6H5COOH

theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau:

Bảng 41. Các thí nghiệm ở tâm phương án

N0 U1 U2 Y(%)

9 0,015 7 26,05

10 0,015 7 25,14

11 0,015 7 26,23

Bảng 42. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH

N0 01uY 0

1Y01

01 YY u − ( )20

10

1 YY u − A

1 26,05 0,2433 0,0592

11

8067,253

3

1

01

=∑

−uuY ( ) 6829,0

23

1

01

01 =−∑

−uu YY

2 25,14 - 0,6667 0,4444

3 26,23 0,4233 0,1792

Ta sẽ được phương sai tái hiện là:

( )3414.0

11 00

3

1

201

01

2 =−

=−

−=

∑−

N

A

N

YYS u

u

th

30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án

Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy:

Cấu trúc:

0:

0:

≠=

ja

iO

H

H

ββ

==bj

j

j S

bt với 2922,0

2

==N

SS th

bj

Trong đó bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j

Tính toán ta có:

to= 96,907

t1= 6,2893

t2 =22,1881

Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2

Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t

Như vậy các hệ số t1,12 đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng:

1Y = 26,3125 – 1,8375*X1 – 6,4825*X2 (3)Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo

tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( 2thS ) được cho ở

bảng sau:

Bảng 43.Các số liệu dùng để tính toán

STT iY iY ii YY ˆ− 2)ii YY −

12

09,8)ˆ( 2

1

=−∑=

i

N

ii YY

1 35,21 36,6325 -1,4225 2,0235

2 34,38 32,9575 1,4225 2,0235

3 25,09 23,6675 1,4225 2,0235

4 18,57 19,9925 -1,4225 2,0235

Phương sai dư ( )

047,41

ˆ1

2

2 =−

−=

∑=

N

YYS

N

iii

d

Trong đó: N: Số thí nghiệm

1: Số hệ số có nghĩa

Tiêu chuẩn Fisher : 853,113414,0

0470,42

2

===th

d

S

SF

Tra bảng phân vị phân bố Fisher Fα (f1,f2) với:

α =0,05

f1=N-L=2: Bậc tự do của tử.

f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu.

Tra bảng ta có: F0,05(2,2) =18,5

Vì F =11,853 < F0,05(2,2)=18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm.

Nhìn vào phương trình hồi quy (3), ta có nhận xét:

Cả 2 yếu tố nồng độ C6H5COOH, thời gian ngâm đều có ảnh hưởng đến mức

độ khử khoáng nhưng thời gian khử khoáng có ảnh hưởng mạnh nhất.

Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng khoáng còn lại)

đồng biến với X1 (nồng độ C6H5COOH), X2 (thời gian ngâm).

Từ phương trình (3) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc

nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ C6H5COOH là 0.0006M. Các bước

chuyển động của yếu tố X1, X2 được tính theo công thức sau hay được chọn theo

kinh nghiệm.

59,022

1112 =

∆∆=

b

bδδ

13

Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử khoáng bằng acid

benzoic được ghi trong bảng :

Bảng 44. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH .

Tên X1 X2 Y

Mức cơ sở 0,015 7

Hệ số bj - 1,8375 -6,4825

Khoảng biến thiên 0,003 3

bj j∆ -0,000945 -1,845

Bước jδ 0,0006 0,59

Bước làm tròn 0,0006 0,6

Thí nghiệm 9 0,0156 7,6 25,01

Thí nghiệm 10 0,0162 8,2 22,29

Thí nghiệm 11 0,0168 8,8 20,83

Thí nghiệm 12 0,0174 9,2 19,02

Bảng 45. Các thông số tối ưu

Các thông số tối ưu Hàm lượng khoáng (%)

Nồng độ C6H5COOH : 0,0168MThời gian: 8,8 giờ

Tỷ lệ w/v: 1/10

20,83

4) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử

khoáng từ phế liệu tôm bằng HCl:

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánhgiá vai

trò của từng yếu tố là:

N=nk

Trong đó: N : Số thí nghiệm;

n: Số mức, ở đây n=2

14

k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2

vậy N = 22 = 4 thí nghiệm.

Tính các hệ số của phương trình hồi quy:

4

.1

∑==

N

iiij YX

bj

Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập.

N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4

Bảng 46. Bảng bố trí thí nghiệm

N U1(nồng độ M) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng khoáng còn lại

1 0,6 4 1 -1 -1 4,98

2 0,8 4 1 1 -1 2,24

3 0,6 10 1 -1 1 2,86

4 0,8 10 1 1 1 0,63

Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 2,7025 ; b1= -1,2425; b2= -0,9325

Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là:

=Y 2,7025 – 1,2425*X1 – 0,9325*X2 (4)

Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy.

Bố trí 3 thí nghiệm song song khử khoáng trong phế liệu tôm bằng C6H5COOH

theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau:

Bảng 47. Các thí nghiệm ở tâm phương án

N0 U1 U2 Y(%)

9 0,7 7 1,94

10 0,7 7 1,81

11 0,7 7 1,79

Bảng 48. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH

15

N0 01uY 0

1Y01

01 YY u − ( )20

10

1 YY u − A

1 1,94

8467,13

3

1

01

=∑

−uuY

0,0933 0,0087 ( ) 0133.023

1

01

01 =−∑

−uu YY

2 1,81 -0,0367 0,0013

3 1,79 -0.0567 0,0032

Ta sẽ được phương sai tái hiện là:

( )0066,0

11 00

3

1

201

01

2 =−

=−

−=

∑−

N

A

N

YYS u

u

th

30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án

Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy:

Cấu trúc:

0:

0:

≠=

ja

iO

H

H

ββ

==bj

j

j S

bt với ==

N

SS th

bj

2

0,0407

Trong đó bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j

Tính toán ta có:

to= 65,7479 ; t1= 30,5113; t2 =22,89

Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2

Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t

Như vậy các hệ số t1,12 đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng:

1Y = 2,7025 – 1,2425*X1 – 0,9325*X2 (4)Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn

Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( 2thS ) được cho ở bảng sau:

Bảng 49. Các số liệu dùng để tính toán

STT iY iY ii YY ˆ− 2)ii YY −

1 4,98 4,8525 0,1275 0,0163

16

07,0)ˆ( 2

1

=−∑=

i

N

ii YY

2 2,24 2,3675 -0,1275 0,0163

3 2,86 2,9875 -0,1275 0,0163

4 0,63 0,5025 0,1275 0,0163

Phương sai dư ( )

0325,01

ˆ1

2

2 =−

−=

∑=

N

YYS

N

iii

d

Trong đó: N: Số thí nghiệm

1: Số hệ số có nghĩa

Tiêu chuẩn Fisher : 9014,43414.0

0470.42

2

===th

d

S

SF

Tra bảng phân vị phân bố Fisher Fα (f1,f2) với:

α =0,05

f1=N-L=2: Bậc tự do của tử.

f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu.

Tra bảng ta có: F0,05(2,2) =18,5

Vì F =4,9014 < F0,05(2,2) =18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm.

Nhìn vào phương trình hồi quy (4), ta có nhận xét:

Cả 2 yếu tố nồng độ HCl, thời gian ngâm đều có ảnh hưởng đến mức độ khử

khoáng nhưng nồng độ có ảnh hưởng mạnh nhất.

Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng khoáng còn lại)

đồng biến với X1 (nồng độ HCl), X2 (thời gian ngâm).

Từ phương trình (4) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc

nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ HCl là 0,02M. Các bước chuyển động

của yếu tố X1, X2 được tính theo công thức sau hay được chọn theo kinh nghiệm.

579,022

1112 =

∆∆=

b

bδδ

Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử khoáng bằng acid

chlohydric được ghi trong bảng :

Bảng 50. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử khoáng bằng HCl.

17

Tên X1 X2 Y

Mức cơ sở 0,7 7

Hệ số bj - 1,2425 -0,9325

Khoảng biến thiên 0,1 3

bj j∆ -0,12425 -2,7975

Bước jδ 0,02 0,579

Bước làm tròn 0,02 0,6

Thí nghiệm 9 0,72 7,6 1,53

Thí nghiệm 10 0,74 8,2 0,98

Thí nghiệm 11 0,76 8,8 0,83

Thí nghiệm 12 0,78 9,2 0,77

Bảng 51. Các thông số tối ưu

Các thông số tối ưu Hàm lượng khoáng (%)

Nồng độ HCl : 0,74MThời gian: 8,2 giờ

Tỷ lệ w/v: 1/10

0,98

5) Một số thiết bị sử dụng trong đề tài:

Hình 22.Thiết bị ổn nhiệt Memmert.

18

Hình 23. Thiết bị đo Uvmini-1240.

Hình 24.Máy li tâm.

Hình 25.Thiết bị Vortex.

19

Hình 26.Sự bắt màu của dung dịch BSA sau khi cho thuốc thử Biuret.

Hình 27. Công thức cấu tạo của Sodium citrate.

Hình 28. Mono Sodium Citrate Anhydrous.

20

Hình 29. Dung dịch protein và thuốc thử Biuret

Hình 30. Thủy phân đầu tôm

Hình 31. Đầu tôm đã được vô hoạt enzyme sau khi thủy phân(dùng nhiệt)

21

Hình 32. Phế liệu tôm sau khi thủy phân

Hình 33. Phế liệu tôm sau khi thủy phân bằng enzyme Alcalase và xử lý NaOH

Hình 34. Phế liệu tôm đã khử protein và khư khoáng lần 1 bằng C6H5COOH

22

Hình 35. Phế liệu tôm(PLT) đã khử protein bằng enzyme(trái), PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH

Hình 36. PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH(trái), PLT đã khử protein và khử khoáng bằng C6H5COOH

23