Luftveisinfeksjoner€¦ · Luftveis PCR –< 2 uker etter symptomdebut (virus) –< 4 uker etter...
Transcript of Luftveisinfeksjoner€¦ · Luftveis PCR –< 2 uker etter symptomdebut (virus) –< 4 uker etter...
Luftveisinfeksjoner - PCR-basert diagnostikk
Anne-Marte Bakken Kran
Overlege, førsteamanuensis
Mikrobiologisk avd. UOS Ullevål
Temaer
• PCR-basert mikrobiologisk diagnostikk
• Klinisk betydning av funn/fravær av funn
• Når teste? For hva?
• Hva med hurtigtester?
Sekvens
Arvemateriale
Mikroorganisme
Dobbeltrådet DNA
Arvemateriale Bakterier, Sopp, parasitter: DNA
Virus: DNA eller RNA Retrovirus: RNA → cDNA
Dobbelttrådet DNA
Hydrogenbindinger
Cytosine (C)
Adenine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
Deoxyribose Fosfatgruppe
Cytosine (C)
Adenine (A)
Thymine (T)
Guanine (G)
Dobbelttrådet DNA
Adenine (A) = Thymine (T)
Guanine (G) = Cytosine (C)
Hydrogenbindinger mellom de komplementære basene:
Bindingen er reversibel, styrken avhengig av:
• Temperatur
• Nukleinsyretrådenes
lengde og basesammensetning
• Komplementaritet
PCR
• Isolering/rensing av DNA/RNA
• Oppformering av et område av DNA med PCR
• Påvisning av PCR-produkt
Primere: Spesifikke for mikroben man skal påvise
• Primersekvensene må være unike for mikroorganismen
• Primere må binde seg til et område av DNA som ikke varierer innen mikroorganismen
PCR
No. No. kopier av syklus målsekvensen
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
PCR syklus
1) DNA-trådene separeres
2) Primere bindes til hver sin målsekvens
3) DNA syntese
4) Påvisning av PCR produkt
Pasientprøver
PCR kurve
Direktepåvisning, PCR
• Amplifikasjon av mikrobens arvemateriale
• Rask diagnostikk
• God spesifisitet
• Bedre sensitivitet enn dyrkning
• Pris ca 100 kr pr analyse (reagenser) ?
• NB Redusert sensitivitet pga:
– Prøve tatt sent i forløpet
– Ikke representativ prøve
Agens påvist med PCR: Klinisk betydning
• Behøver ikke være årsak til sykdom – påviser også latente virus, kolonisering,
bærerskap
• Behøver ikke være smitteførende – påviser også arvematerialet fra døde
mikroorganismer
• Husk: Ett påvist agens utelukker ikke et annet
• Falsk positiv PCR (kontaminasjon: ved prøvetaking / i lab.)
Absence of detection
is NOT
Detection of absence
Negativ PCR utelukker ikke infeksjon
• Prøven
– Valg av prøvemateriale og riktig prøvetaking (Prøven må tas fra der smittestoffet er)
– Tidspunkt i forhold til infeksjonsforløpet (Prøven må tas når smittestoffet er der)
– Prøvevolum
– Oppbevarings-tid og -temperatur (degradering av RNA og DNA)
• Primer-/probesekvenser (eks. ny Chlamydia-variant i
Sverige 2001-2007)
• Hemming av PCR reaksjonen
Hvor dyp er egentlig en dyp neseprøve?
Foto: ArcDia Ltd
PCR ANALYSER VED LUFTVEISINFEKSJON
PCR analyser ved luftveisinfeksjon: Analyser ved mikrobiologisk avd OUS
• Luftveisvirus:
– Influensavirus A, B • subtyping A(H1 el.H3)
– Parainfluensavirus 1, 2, 3, 4
– Respiratorisk syncytialvirus (RS)
– Humant metapneumovirus
– Adenovirus
– Rhinovirus
– (Enterovirus D68)
• Luftveisbakterier:
– Mycoplasma pneumoniae
– Chlamydophila pneumoniae
– Bordetella pertussis
– Legionella (ved RH)
Luftveis PCR – < 2 uker etter symptomdebut (virus)
– < 4 uker etter symptomdebut (bakt)
• Materiale:
– Nasopharynxaspirat eller dyp neseprøve + halspensel (virustransportmedium, UTM)
– Prøve fra nedre luftveier
• Virusinfeksjon: Avtagende sensitivitet av PCR etter 1. sykdomsuke (adenovirus trolig positiv lenger)
Nytteverdi ? Betydningen av positivt PCR-funn?
• Årsak til infeksjon?
• Asymptomatisk bærerskap/lett klinisk ”kolonisering” i perioder, spesielt i sesongen?
• Langvarig utskillelse etter infeksjon?
• Husk: Ett påvist agens utelukker ikke et annet. Ofte påvises flere agens samtidig
Flere ulike agens påvist i samme prøve
• Klinisk betydning?
• Semikvantitativ” PCR:
– Positive funn graderes internt hos oss (sterk, moderat og svak reaksjon)
– Veiledning ved vurdering av flere funn samtidig?
Når er det aktuelt å ta prøve?
• Sykehistorien er kort (< 2 uker)
OG
• Pasienten har luftveissymptomer
OG
• Svaret får klinisk betydning
Når har svaret klinisk betydning?
• Behandlingskonsekvenser?
– Influensa (i sesong), Mycoplasma/chlamydophila (klinikk/målgruppe), Kikhoste
• Risikogrupper?
• Differensialdiagnostisk ?
– Foreskriver man mindre antibiotika hvis virus påvises? Ett agens utelukker ikke et annet…
• Annet?
Kliniske opplysninger på rekvisisjonen er avgjørende for god
diagnostikk
Hvilke agens er av interesse?
• Influensa
• Mycoplasma/chlamydophila
– Svært få tilfeller utenom mini-epidemier
• Kikhoste
• Andre?
Funn luftveissesongen hittil i 2015
Funn luftveissesongen 2014/2015
http://www.oslo-universitetssykehus.no/omoss_/avdelinger_/mikrobiologi_
http://www.oslo-universitetssykehus.no/omoss_/avdelinger_/mikrobiologi_
Hva med hurtigtester??
• Høy spesifisitet, lavere sensitivitet sammenliknet med molekylære metoder/dyrkning
• Relativt dyre
• Egnethet må vurderes mot hvor hyppig den aktuelle infeksjonssykdommen opptrer
Agens Sensitivitet Spesifisitet Materiale
S. pyogenes (GAS) ag. 65 – 80 % > 98% Hals
Pneumokokk ag. 50 – 80% 97 % Urin
Legionella pneumophila ag.
92 % > 99% Urin
Influensavirus ag. 60 – 80 % >95% Nasoph.
RS-virus ag. 50 - 85% 90-98% Nasoph.
Hurtigtester, luftveisagens
• PCR: man finner bare det man leter etter
• Manglende påvisning utelukker ikke infeksjon
• Prøve må tas tidlig i sykdomsforløpet
• Klinisk indikasjon
• K ommunikasjon med laboratoriet (rekvisisjon, telefon, prøvesvar, nettsider)