Loss-of-Function Mutations of the

Rice GAMYB Gene Impair

α-amylase Expression in Aleurone

and Flower Development

Fiorucci Anne-Sophie Simon Marianne

Kaneko et al., janvier 2004

Plan de l’exposé

Introduction

1) Rôle et mode d’action de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB.

2) Problématique.

I- Manipulations et résultats

1) Sélection de mutants OsGAMYB KO.

2) Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase.

3) Phénotypage des mutants.

4) Profil d’expression du gène OsGAMYB.

II- Discussion

1) Contradictions avec d’autres articles.

2) Critiques

Conclusion

Introduction : Rôle de l’acide gibbérellique (GA) lors de la germination

Exemple du caryopse d’Orge

Albumen

Tégument + péricarpe

Couche à aleurone

Scutellum

Embryon

AMIDON

Glucides

simples

GA

α-amylase

Introduction : Mode d’action de l’acide gibbérellique dans la graine.

GA

GAMYB

Activateur transcriptionnel dans les cellules de la couche à aleurone

Induit l’expression de

l’α-amylase

Synthèse dans l’embryon

Migration jusqu’à la couche à

aleurone

GAMYB est un régulateur positif de la voie de signalisation médiée par l’acide gibbérellique (cas de l’orge)

Introduction : Problématique développée

Rôle de GAMYB bien connu dans les caryopses d’Orge

Quelles sont ses fonctions hors de la couche à aleurone ?

Objectifs : par l’observation de mutants, étude du rôle de OsGAMYB

• au cours de la croissance végétative

• lors du développement floral

Protéine étudiée : OsGAMYB, homologue de GAMYB chez le riz

Plan de l’exposé

Introduction

1) Rôle et mode d’action de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB.

2) Problématique.

I- Manipulations et résultats

1) Sélection de mutants OsGAMYB KO.

2) Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase.

3) Phénotypage des mutants.

4) Profil d’expression du gène OsGAMYB.

II- Discussion

1) Contradictions avec d’autres articles.

2) Critiques

Conclusion

I-1) Sélection de mutants OsGAMYB KO

A noter : le riz ne possède qu’un seul gène GAMYB

• criblage par PCR avec des amorces spécifiques du gène et du transposon

Méthode

• utilisation de lignées dont les mutations sont causées par l’insertion d’un rétrotransposon, Tos17

• confirmation de l’insertion de Tos17 dans le gène d’intérêt et de sa transmission à la descendance

Objectif : confirmer que les phénotypes anormaux observés chez le mutant sont dus à l’inactivation de GAMYB

Méthode : introduction du gène OsGAMYB sauvage chez les mutants (utilisation d’un vecteur plasmidique)

Résultat : les plantules retrouvent le phénotype sauvage.

Le phénotype mutant caractérisé est bien causé par l’inactivation de GAMYB

Vérification : Complémentation avec le sauvage

I-2) Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase.

a- 1ère expérience

GA(1µM)

Graine sans embryon issue des lignées mutantes gamyb-2

Agarose + amidon

La présence d’amidon est révélée par du lugol.

S’il y a production d’α-amylase, l’amidon sera hydrolysé. D’où l’apparition de zones claires sur la boîte.

Résultats obtenus :

Témoin : graines sauvages

• zones claires autour de toutes les graines

• activité α-amylasique normale

Graines issues de la lignée mutante

• seules 75% des graines présentent un halo clair, preuve de la sécrétion d’ α-amylase

• les autres sont homozygotes pour l’allèle mutant

b- 2ème expérience : RNA gel blot analysis

[GA]=10-6 M suffit à induire l’expression de l’α-amylase dans

les cellules de la couche à aleurone

Pas d’induction de l’expression de l’α-amylase avec ou sans GA

Les allèles contenant l’insertion Tos17 ont perdu la fonction OsGAMYB.

I- 3) Phénotypage des mutants.

a- Au stade végétatif.

Aucune différence n’est observée.

• développement post germination identique,

plants mutants et sauvages indiscernables.

2 semaines 8 semaines après germination

• une même réponse au GA après la germination.

Élongation des feuilles en fonction de la concentration en GA exogène.

WT

gamyb1

b- Lors du développement floral

• Phase transition (transition du SAM en méristème floral) et passage d’un stade à l’autre à des époques similaires, en jours courts comme en jours longs.

=> osGAMYB non essentiel à la phase transition ni au développement du méristème inflorescentiel.

• Heading time différent.

=> Contribution partielle à la formation du méristème floral.

• élongation des entrenoeuds normale mais longueur finale du 1er entrenoeud inférieure à celle du sauvage. Peut-être la cause du délai de heading time.

WT mutant

• Observation des organes floraux :

Phénotype mild, le plus courant :

- étamines aux anthères rétrécies, sans pollen (plantes « mâle stériles »). Cause cellulaire de cette stérilité : problème au niveau du tapis staminal, les microspores ne s’y attachent pas, se rétrécissent -> les cellules du tapis envahissent toute l’anthère.

- pas de problème au niveau des autres organes, pistil fertile notamment.

carpelle

étamine

sauvage mutant phénotype mild

Coupes longitudinales de fleurs de riz

anthère

filet

WT mutantsÉtamines de fleurs de riz

Certains phénotypes plus sévères (pistil stérile), selon conditions environnementales, et non selon mutant.

I- 4) Profil d’expression du gène OsGAMYB.

a- couplage avec la protéine Gus.

Principe :

ADN plasmidiquePromoteur de

OsGAMYBORF codant la protéine Gus

Transfection dans un cal de riz WT via Agrobacterium tumefaciens.

L’activité β-glucuronidase de GUS peut être détectée in-situ (coloration bleue).

But : vérifier que OsGAMYB est exprimé de manière spécifique dans les tissus ou cellules montrant des phénotypes anormaux dans les plants mutants.

• Observation dans une graine en germination.

Couche à aleurone de l’endosperme

Tégument de l’embryon

2mm

Coupe longitudinale d’une graine de riz, après 24h de réhydratation.

recouvre le patron d’expression de l’α-amylase.

• Observation dans la jeune plantule

2mm

Tissus vasculaires

Couche épithéliale

Coupe longitudinale d’une plantule de 2 semaines.

Aucune expression dans les autres tissus et organes de la plantule.

• Observation dans un plant au stade végétatif.

Racine de riz

1mm

Coupe longitudinale d’un plant de 2 mois

Expression de Gus à l’extrémité des racines

uniquement.

Aucune expression dans les organes aériens au

stade végétatif.

2mm

• Observation dans un plant au stade d’élongation.

SAM

Départs de racines adventives

Coupe longitudinale d’une tige au stade d’élongation.

- Forte expression dans la région apicale dont SAM et primordia foliaires.

- Expression modérée dans la zone d’élongation de l’entrenoeud et les départs de racines.

1cm

• Observation dans les organes floraux.

Très forte expression dans les primordia d’organes floraux.

Organes précis dans lesquels a lieu l’expression non déterminés.

Pour ce faire, utilisation d’une autre technique :

L’hybridation in situ.

b- Hybridation in situ.

Principe :

Sonde : brin antisens de l’extrémité 3’-term de l’ADNc de OsGAMYB, marquée par du digoxigenin-UTP (étiquette fixée par transcription in vitro).

3’3’

5’

5’

Cellule exprimant

OsGAMYB

ARNm

Sondes

Organe fixé et déshydraté

Témoin avec une sonde brin sens : pas de signal d’hybridation, on a bien fixation sur l’ARNm et

non sur un éventuel ADN dénaturé.

• Confirmation d’une donnée de Gus.

Primordia de feuilles

Méristème apical végétatif d’un plant de 2 mois.

SAM

Primordium de bractée

Méristème apical à la transition florale.

- Pas d’hybridation de la sonde donc d’expression dans la zone apicale au stade végétatif.

- Observation d’un léger signal d’hybridation dans le SAM et les primordia au stade transition florale.

• Observation dans les organes floraux.

Primordium d’étamine

Méristème floral en développement.

0,1mm 25µm

Épiderme

Endothélium

Couche intermédiaireTapis staminalCellule mère des microspores

Section d’une anthère en développement.

- Fort signal dans les primordia d’étamines, modéré dans les primordia des autres organes floraux.

- Après différentiation anthère / filament: expression dans les cellules du tapis staminal, jamais dans les cellules mères des microspores.

Remarque : résultats en accords avec ceux observés chez l’Orge.

c- Bilan.

Expression de OsGAMYB spécifiquement dans les organes et cellules présentant un phénotype différent du sauvage dans les

mutants KO :

• Dans les cellules exprimant l’α-amylase.

• Dans les entrenoeuds en élongation.

• Dans les méristèmes apicaux au moment de la transition florale.

• Dans les étamines et plus précisément dans les cellules du tapis staminal.

Donc :

Confirmation d’un rôle de OsGAMYB dans ces cellules ou organes.

Plan de l’exposé

Introduction

1) Rôle et mode d’action de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB.

2) Problématique.

I- Manipulations et résultats

1) Sélection de mutants OsGAMYB KO.

2) Vérification du rôle de l’homologue OsGAMYB dans l’induction de l’α-amylase.

3) Phénotypage des mutants.

4) Profil d’expression du gène OsGAMYB.

II- Discussion

1) Contradictions avec d’autres articles.

2) Critiques

Conclusion

II-1) contradictions avec des articles précédents.

Blàzquez et al (1998):

-Timing de la floraison d’A thaliana régulé par le gène LEAFY.

Blàzquez and Weigel (2000):

- Présence d’un GAMYB Binding Domain dans les séquences cis de LEAFY, nécessaire à son expression normale.

D’où modèle proposé par Gocal et al (2001):

GA+

GAMYB + LEAFY + Floraison

En contradiction avec l’absence de rôle dans le timing de la floraison ici observée chez le riz.

Une différence entre les deux espèces ou…?

II-2) Analyse critique

Point positif de l’article : multiplication des démarches pour vérifier que les phénotypes mutants observés sont bien le résultat de l’inactivation de OsGAMYB.

Ce qui manque peut-être :

• étude quantitative de l’expression de OsGAMYB (Southern Blot)

• faire un lien entre l’expression du gène OsGAMYB dans les différents organes et le GA

réalisation d’une autre expérience avec la protéine Gus, avec ajout de GA, et d’un Southern Blot avec ajout de GA exogène.

Démarche classique de génétique inverse

Conclusion : Rôle de OsGAMYB

D’autres mutants du riz insensibles au GA présentent des défauts de croissance des feuilles et des racines => rôle de GA.

Mais :

signalisation du GA indépendante de OsGAMYB au stade végétatif.

Rôle significatif de GAMYB, non dans la transition florale, mais plus tard, pour le développement du méristème inflorescentiel.

Rôle dans la mise en place des organes floraux : modèle proposé.

Rôle essentiel pour la méiose des cellules mères des microspores, donc pour la formation du pollen.

Rôle indirect (Cf. profil d’expression), via cellules du tapis staminal.

Modèle:

Tapis staminal

Cellule mère des microspores

1- adhésion2- contraction du cytoplasme – 1ere division

Intervention de GAMYB OsGAMYB KO

=> Pas de méiose, dégénérescence de la cellule mère.

Pas d’adhésion

Mutants KO pour GA : développement du pollen bloqué avant ou après la méiose de la cellule mère. => On peut supposer une intervention conjointe de GA et

OsGAMYB dans ce mécanisme.