Lezione del 13/05/2005e 19/05/05

Anno accademico 2004/05

Antiinfiammatori steroidei (Corticosteroidi o glucocorticoidi)

ColesteroloMembrane cellulari

Ormoni steroidei

HO

H3C

H3C

CH3

CH3

CH3

Cortisolo o Idrocortisone

Cholesterol Steroid20 hydroxylase

20-OH-cholesterol P450sccCYPXIA Colesterol Side Chain cleavage enzymePregnenolone Progesterone Aldosterone P45017CYPXVIIA Steroid17 hydroxylase17-OH-pregnenolone Dehydroepiandrosterone 3-HSD 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase17-OH-progesterone Androstenedione Oestrone P45021CYPXXIA Steroid21 hydroxylase11-deoxycortisol Testosterone Oestradiol P45011CYPXIB Steroid11 hydroxylase

Cortisol (hydrocortisone)

Sistema immunitarioLinfociti, neutrofilimonociti/macrofagi

___

IL-1IL-2TNF-

+

+

Cortisolo

• Il cortisolo è sintetizzato dalla zona fascicolata/reticolare del surrene

• La biosintesi e la liberazione è indotta dall’ormone adrenocorticotropo (ACTH), rilasciato dall’ipofisi, a sua volta sotto il controllo dell’ipotalamo via CRH (corticotropin-releasing hormone).

• L’ACTH (via un recettore serpentino, Gs): • 1) aumenta la traslocazione (?) del substrato

nella membrana interna dei mitocondri, dove sono localizzati gli ormoni biosintetici (P450scc)

• 2) aumenta la trascrizione genica degli enzimi biosintetici

Produzione circadiana del cortisolo e dell’aldosterone

Cortisolo Aldosterone

Secrezione giornaliera

10 mg/die 0.125 mg/die

Concentrazione plasma periferico

Ore 8

Ore1616 g/100 ml

4 g/100 ml

0.01 g/100 ml

0.01 g/100 ml

Goodman & Gilman’s, 2001, adapted

Recettori per il cortisolo• I recettori per il cortisolo (GR e GR)

sono recettori intracellulari, membri della famiglia dei recettori steroidei (simili a quelli per mineralcorticoidi, androgeni, estrogeni, progestinici, vit. D, ac. retinoico). Il gene per i GR sono localizzati nel cromosoma 5, nella regione 5q31-q32.

Leung & Bloom, J Allergy Clin Immunol. 111, 3-22, 2003

• Organizzazione genomica del gene GR e la struttura delle proteine codificate. Le isoforme differiscono nella regione carbossiterminale per “splicing” alternativo dell’esone 9.

• La variante non lega il ligando, si trova già traslocato nel nucleo ed occupa il GRE non attivandolo

Struttura-funzione del GR

Leung & Bloom, J Allergy Clin Immunol. 111, 3-22, 2003

Struttura-funzione del GR • Il recettore (~90 kDA) consiste in 3 domini, un

dominio NH2-terminale di attivazione trascrizionale, un piccolo dominio (66 a.a.)per il legame con il DNA (DNA-binging domain, DBD) che contiene due strutture “zinc finger” ed un dominio carbossilico che lega l’ormone (LBD, 135 a.a.). AF-1 e AF-2 sono due domini importanti per l’attivazione della trascrizione, 2 ligando dipendente.

• La traslocazione è dipendente da regioni della proteina del DBD.

• La fosforilazione su residui di Ser del recettore ad opera delle MAP-K può alterare il legame con il ligando.

• La forma legata all’agonista e traslocata nel nucleo è prevalentemente fosforilata su residui di Ser 226, quella non legata e non traslocata su Ser 221 (regolazione posttrascrizionale).

Organizzazione del GR nel citosol

• Nel citosol il GR è legato a formare un complesso eteromerico (~ 300 kDA) con proteine quali il dimero hsp90 (heat shock protein-90), p23, p56 (proteina immunofillina-correlata), che ne impediscono la traslocazione nel nucleo.

• hsp-90 è legata direttamente alla regione LBD e mantiene il recettore in una conformazione ideale per il legame con l’agonista.

• L’agonista lega il recettore…

Leung & Bloom, J Allergy Clin Immunol. 111, 3-22, 2003

Coattivatori della trascrizione genica indotta da GR dimeri

Leung & Bloom, J Allergy Clin Immunol. 111, 3-22, 2003

Attivazione della trascrizione genica

glucocorticoide mediata • Dopo la traslocazione nel nucleo il GR come

omodimero lega sequenze specifiche del DNA (glucocorticoid responsive elements, GREs) ed interagisce così con un complesso trascrizionale (TATA-binding protein, trascription factors TAFs, TFIIs, altre proteine coattivatrici come CBP e SRC ed RNA polimerasi II, POLII). hSWI/SNF ATP-dependent chromatin remodeling factor (idrolisi ATP-dipendente della cromatina).

• Alcuni di questi coattivatori determinano la specificità cellulare della trascrizione GR-indotta.

• CBP e SRC hanno attività istone acetiltranferasica (HAT)

Attivazione della trascrizione genica glucocorticoide mediata (segue)

• Corepressori con attività istone deacetilasica (?) sembrano essere implicati nei meccanismi di switch-off dell’effetto trascrizionale dei GC, ma anche di resistenza ai glucocorticoidi

• Quando il GR si stacca dai GREs l’ormone si libera dal recettore ed il GR può tornare nel citosol (e riorganizzarsi nel complesso eterodimerico) oppure essere degradato.

Glucocorticoid-regulated genes

a) Increased gene trascription• Lipocortin-1 (annexin-1, a PLA2 inhibitor)• 2-adrenoceptor• Secretory leucocyte inhibitory protein • Clara cell protein (CC10, a PLA2 inhibitor)• IL-1R2 (decoy receptor)• IL-1ra (IL-1 receptor antagonist)• IkB- (NF-kB inhibitor)

From: Barnes et al., Ann. Int. Med., 139, 359-370, 2003, adapted

Leung & Bloom, J Allergy Clin Immunol. 111, 3-22, 2003

Repressione della trascrizione genica glucocorticoide mediata

• Dopo la traslocazione nel nucleo il GR come monomero si lega con interazione proteina-proteina a fattore di trascrizione di proteine pro-infiammatorie (NF-kB) e della collagenase (AP-1).

Glucocorticoid-regulated genes

b) Decreased gene transcription• Cytokines (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11,

IL-13, TNF-, GM-CSF, SCF)• Chemokines (RANTES, eotaxin, MIP-1, MIP-1,

MCP-3, MCP-4• Enzymes (iNOS, COX-2, cPLA2, HDC)• Adhesion molecules (ICAM-1, VCAM-1)• Receptors (Bradikynin-2R, Tachykinin NK1R and

NK2R)

From: Barnes et al., Ann. Int. Med., 139, 359-370, 2003, adaptedGM-CSF = Granulocyte-macrophage colony-stimulator factor; SCF = Stem cell factorMIP = Macrophage inflammatory proteinMCP = Monocyte chemoattractan protein

Cellular effect of corticosteroids, Barnes et al., Ann. Int. Med., 139, 359-370, 2003

Goodman & Gilman’s, 2001

Ann.Rev.Pharmacol.Tox. 25, 381-412, 1985,

DNA Binding of the Glucocorticoid Receptor Is Not Essential for

Survival• Transcriptional regulation by the glucocorticoid receptor

(GR) is essential for survival. Since the GR can influence transcription both through DNA-binding-dependent and -independent mechanisms, we attempted to assess their relative importance in vivo. In order to separate these modes of action, we introduced the point mutation A458T into the GR by gene targeting using the Cre/loxP system. This mutation impairs dimerization and therefore GRE-dependent transactivation while functions that require cross-talk with other transcription factors, such as transrepression of AP-1-driven genes, remain intact. In contrast to GR−/− mice, these mutants termed GRdim are viable, revealing the in vivo relevance of DNA-binding-independent activities of the GR.

Reichardt et al., Cell, 93, 531-541, 1998

da Barnes, Nature, 402(S), 1999

Glucocorticoidi

Recettore Glucocorticoidi

GR monomero

Inibizione fattori di trascrizioneNF-kB, AP-1, NF-ATTransrepressione

GR dimero

Transattivazione Trascrizione genicaProteine antiinfiammatorie, ma anche effetti collaterali

a) Increased gene trascriptionLipocortin-1 (annexin-1, a PLA2 inhibitor)2-adrenoceptorSecretory leucocyte inhibitory protein Clara cell protein (CC10, a PLA2 inhibitor)IL-1R2 (decoy receptor)IL-1ra (IL-1 receptor antagonist)IkB- (NF-kB inhibitor)b) Decreased gene transcriptionCytokines (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11, IL-13,

TNF-, GM-CSF, SCF)Chemokines (RANTES, eotaxin, MIP-1a, MIP-1, MCP-3,

MCP-4Enzymes (iNOS, COX-2, cPLA2, HDC)Adhesion molecules (ICAM-1, VCAM-1)Receptors (Bradikynin-2R, Tachykinin NK1R and NK2R)

Goodman & Gilman’s, 2001

Goodman & Gilman’s, 2001

Bledsoe et al., Cell, 110, 93-105, 2002

Structure of the GR/Dex/TIF2 Complex(A)

• Overall arrangement of the GR LBD dimer. The two LBDs are shown in yellow and blue worms; the two TIF2 peptides are in purple ribbon; and the two dexamethasone molecules are in space-filling representation with carbon, oxygen, and hydrogen colored in green, red, and white, respectively. The C2 symmetry axis is shown in red.(B and C) Two 90-degree views of the GR/Dex/TIF2 monomer complex, where helices are colored in yellow and strands are in gold. The AF-2 helix is in red and the lysine residue from helix 3 that forms the charge clamp is in blue. The TIF2 peptides are shown in purple.

• TIF2 = Transcription intermediary factor 2,

Bledsoe et al., Cell, 110, 93-105, 2002

Principali usi terapeutici dei

glucocorticoidi Patologie endocrine

• Terapia sostitutiva dell’insufficienza surrenalica acuta e cronica primaria e secondaria

• Nel 1855 Thomas Addison, Inglese (1793 – 1860) descrisse i sintomi dell’insufficienza corticosurrenalica primaria dovuta a distruzione delle capsule surrenali (morbo di Addison).

• Addison T.- On the Constitutional and Local Effects of Disease of the Suprarenal Capsules. S. Highley, London 1855

Principali usi terapeutici dei GC (segue)

Patologie non endocrine

• Malattie reumatiche (Lupus e. sistemico, poliartrite nodosa, artrite a cellule giganti, osteoartrite, artrite reumatoide, sindromi vasculitiche, miocardite reumatica)

• Malattie renali (Sindrome nefrotica, glomerulonefrite mebranosa e membranoproliferativa)

• Malattie allergiche• Asma bronchiale• Malattie infettive (Polmonite da Pneumocystis carinii,

meningite da H. influenzae tipoB)• Malattie cutanee (Dermatosi su base allergica)

Principali usi terapeutici dei GC (segue)

Patologie non endocrine

• Malattie gastrointestinali (Colite ulcerosa cronica, Malattia di Crohn)

• Malattie epatiche (Epatite cronica su base autoimmune attiva)

• Malattie oculari (uveiti, congiuntiviti virali e batteriche in associazione con antibatterici)

• Malattie neoplastiche (Leucemia linfatica acuta, linfoma)

• Edema cerebrale (Neoplasie, parassiti, traumi e ictus?)

• Altre malattie (Sarcoidiosi, trombocitopenia, anemia emolitica su base autoimmune, stroke e lesioni del m. spinale, trapianti d’organo, shock)

Vie di somministrazione dei glucocorticoidi

• Via orale (per tutte le molecole)• Topica cutanea: desametasone, idrocortisone,

triamcinolone• Topica inalatoria: beclometasone, budesonide,

flunisolide, fluticasone, triamcinolone• Topica nelle malattie infiammatorie del tratto

intestinale: budesonide• Topica nelle malattie oculari: prednisolone• EV e IM: desametasone, betametasone,

idrocortisone, metilprednisone, metilprednisolone

Alcuni parametri farmacocinetici dei glucocorticoidi

• L’assorbimento per via orale è buono.• Alcune molecole (v. diapositiva precedente)

sono somministrate anche per via e.v. o i.m. (anche in forme farmaceutiche a cessione protratta).

• Dopo l’assorbimento, i corticosteroidi si legano (90% c.a.) a proteine plasmatiche (globuline specifiche - CBG- o transcortina ed albumina).

• Sono metabolizzati nel fegato per inserzione di atomi di ossigeno o di idrogeno e quindi coniugazione a formare derivati idrosolubili.

• L’escrezione è prevalentemente renale.

Glucocorticoidi: effetti collateri della terapia a lungo termine

• Obesità e ridistribuzione del grasso nell’organismo (”buffalo hump, “moon facies”, area sopraclavicolare, strie addominali);

• Riduzione dello spessore ed atrofia della cute con difficoltà nella cicatrizzazione delle ferite;

• Riduzione delle masse muscolari e miopatie; • Osteoporosi (inibizione osteoblasti, diminuito

assorbimento calcio ed aumento PTH, attivazione osteoclasti indiretta, difetti nella mineralizzazione), osteonecrosi;

• Modificazioni dell’umore (euforia e psicosi);• Cateratta, glaucoma;

Glucocorticoidi: effetti collateri della terapia a lungo termine (segue)

• Immunosoppressione con diminuzione delle difese naturali contro le infezioni;

• Ritenzione idrosalina ed ipertensione (per effetto mineralcorticoide di alcune molecole ed aumento epatico della sintesi di angiotensinogeno ed aumento delle risposte pressorie catecolaminergiche );

• Ritardo della crescita nei bambini; • Dopo trattamento prolungato, inibizione e soppressione

dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene ed atrofia surrenalica. L’interruzione della somministrazione deve avvenire gradualmente;

• Ulcere peptiche;• Iperglicemia e diabete mellito iatrogeno;

Glucocorticoidi e metabolismo intermedio

Inibizione utilizzo glucosio nei tessuti periferici (t. adiposo, cute, fibroblasti, timociti, PMN)• Meccanismo: translocazione trasportatori del glucosio

dalla membrana plasmatica a sedi intracellulari

Promozione gluconeogenesi (fegato)• Meccanismo: nel fegato induzione della trascrizione

di enzimi coinvolti nel metabolismo degli a.a. e nella gluconeogenesi (fosfoenolpiruvato carbossichinasi, glucosio-6-fosfatasi, fruttosio-2,6-bifosfatasi)

effetti catabolici (atrofia tessuto linfoide, diminuzione masse muscolari, assottigliamento cute, bilancio negativo azoto)

Glucocorticoidi e metabolismo intermedio (segue)

Facilitazione permissiva effetto lipolitico

• di agonisti -adrenergici e GH; induzione della lipolisi negli adipociti ed aumento ac. grassi liberi

Redistribuzione del grasso nell’organismo (ipercorticismo, sindrome di Cushing –”buffalo hump”,“moon facies”, area sopraclavicolare e perdita di grasso alle estremità)

• Cushing HW . - The Pituitary Body and its Disorders (1912), Philadelphia.

• Cushing HW . The basophil adenomas of the pituitary body and their clinical manifestations. Bull. Johns Hopkins Hosp. 50, 137-159, 1932.

• Agli inizi del 1900 un medico di origine tedesca Harvey W Cushing descrisse nei lavori citati pazienti con un quadro clinico di ipersecrezione di glucocorticoidi

• Il quadro clinico da ipersecrezione di glucocorticoidi è da allora definita sindrome di Cushing

Harvey William Cushing (1869-1933)

American physician and neurosurgeon

C.Thiemermann Nature Medicine 8, 453 - 455 (2002)

Proposed mechanisms by which corticosteroids mediate cardioprotection.

• The binding of dexamethasone to the glucocorticoid (GC) receptor results in the stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) and the protein kinase Akt. Activated Akt phosphorylates (P) and thereby activates eNOS, leading to enhanced NO production. Once formed by vascular endothelial cells, NO diffuses to adjacent cells and activates soluble guanylate cyclase, resulting in vasodilation and inhibition of platelet and neutrophil adhesion. In addition to eNOS activation, inhibition of NF- B activation and/or enhanced expression of annexin 1 may also contribute to the cardioprotective effects of glucocorticoids.

Christoph Thiemermann

Nature Medicine 8, 453 - 455 (2002)

Meccanismi di GC resistenza• Tipo 1: indotta o acquisita per aumento nella

produzione di citochine. Solo le cellule coinvolte nell’immunoflogosi resistenti agli effetti terapeutici antiinfiammatori dei GC. In vitro, la somministrazione di IL-2 e IL-4 a T-cell mima questa condizione clinica. Tutte le altre cellule sono sensibili ai GC e clinicamente questi pazienti presentano tutti gli effetti collaterali dei GC. Comprende circa il 95% delle resistenze osservate nell’asma.

• Tipo 2: Probabilmente legato ad una mutazione del gene del GR o di un coattivatore, con insensibilità a tutti gli effetti dei GR (terapeutici e collaterali).

Leung & Bloom, J Allergy Clin Immunol. 111, 3-22, 2003

Meccanismi di GC resistenza

• L’attivazione trascrizionale del GR per traslocazione del complesso nel nucleo potrebbe essere prevenuta nelle T-cells esposte a IL-2 e IL-4 per formazione nel cytosol del complesso con STAT5 fosforilato

• Lo “splicing” alternativo dell’esone 9 è aumentato dal trattamento combinato con IL-2 e IL-4, IL-8 o TNF- per induzione di proteine con attività potenziante questo tipo di “splicing”. Il GR è localizzato nel nucleo, si lega al GRE, ma non trascrive

B.M. Vayssière et al., Mol Endocrinol 1997, 11(9):1245-55

Compounds (100 nM)

Transactivation (%) GRE-tk-CAT

Transrepression (%)

RBA % (Dex = 100) Hela-GR

Coll-CAT

TRE-tk-CAT

Dexamethasone 89.48 ± 2.26 96.63 ± 1.78

97.55 ± 1.55

100

Prednisolone 79.37 ± 1.73 81.41 ± 18.96

63.9 ± 11.04

ND

RU24782 35.21 ± 2.24 57.61 ± 2.46

82.55 ± 6.24

85 ± 6

RU24858 20.76 ± 4.33 71.59 ± 1.82

82.85 ± 0.12

128 ± 15

RU40066 13.35 ± 4.73 77.6 ± 6.42

70.43 ± 5.08

27 ± 3

RU486 4.18 ± 3.8 48.19 ± 1.68

Inactive ND

RU43044 Inactive Inactive Inactive ND

GR Binding, Transactivation, and AP-1 Antagonism by Glucocorticoids

B.M. Vayssière et al., Mol Endocrinol 1997, 11(9):1245-55

The transactivation potential of the endogenous HeLa cell GR in the presence of various ligands (100 nM) was determined from transient transfection experiments with the GRE5-tk-CAT reporter; for the determination of AP-1 repression, HeLa

cells were transfected with the Coll(-517/+63)CAT or the TRE5-tk-CAT reporters and identically exposed to 100 nM of the synthetic glucocorticoids. PolyIIßGal was used as an internal control in all transfection experiments to

normalize for variations in the transfection efficiencies. The results are given as percentage of activation/inhibition, relative to maximal activation/inhibition obtained with 100 nM Dex in each experiment. The results indicated for Dex

treatment are means ± SEM of 15 different experiments, each standardized to 100 nM (note that these mean values do therefore not reveal exactly 100%

activation/inhibition). In vitro binding experiments were performed with the endogenous GR extracted from Hela cells. Note that similar results have been

obtained with human GR expressed in SF9 insect cells from recombinant

baculoviruses (data not shown).

(RBA, Relative binding affinity).

Schacke et al., PNAS U.S.A. 101, 227-231, 2004

Proposed mechanisms of action of theophylline

• Phosphodiesterase inhibition (nonselective)• Adenosine receptor antagonism (A1-, A2A-, A2B-receptors)• Increased interleukin-10 release• Stimulation of catecholamine (epinephrine) release• Mediator inhibition (prostaglandins, TNF-  • Inhibition of intracellular calcium release• Inhibition of nuclear factor-B (nuclear translocation)• Increased apoptosis• Histone deacetylase activity (efficacy of corticosteroids)

Barnes, Am J Resp Crit Care Med, 167, 813-818, 2003.

Proposed mechanisms of action of theophylline

Barnes , Am J Resp Crit Care Med 167, 813-818, 2003

Proposed mechanisms of action of theophylline Peter J. Barnes

American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 167. pp. 813-818, (2003)

• Theophylline directly activates histone deacetylases (HDACs), which deacetylate core histones that have been acetylated by the histone acetyltransferase (HAT) activity of coactivators, such as cyclic AMP response element binding protein (CREB)-binding protein (CBP). This results in suppression of inflammatory genes and proteins, such as granulocyte-macrophage–colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-8 (IL-8) that have been switched on by proinflammatory transcription factors, such as nuclear factor- B (NF- B). Corticosteroids also activate HDACs but through a different mechanism resulting in the recruitment of HDACs to the activated transcriptional complex via activation of the glucocorticoid receptors (GR), which function as a molecular bridge. This predicts that theophylline and corticosteroids may have a synergistic effect in repressing inflammatory gene expression.