Lezione 7 il test all'antiglobulina diretto positivo e aea
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Il test all’antiglogulina diretto (TAD o Coombs diretto) positivo
Prima di iniziare, un’altro
alloanticorpo…
Caso 4
-
3+
2+
-
Caso 4
C
-
-
3+
2+
2+
3+
2+
2+
2+
2+
-
-
Caso 4
C F
- -
- -
3+ 3+
2+ 3+
2+ 3+
3+ 3+
2+ 3+
2+ 3+
2+ 3+
2+ 3+
- -
- -
Caso 4
Caso 4:
Gruppo e fenotipo del
paziente
0 Rh pos, CCDee
La probabile specificità anticorpale
è…….
2+
2+
2+
2+
Caso 5
Complemento
• Il sistema del complemento è costituito da più di 15
componenti la cui attivazione sequenziale e associazione
in elementi funzionale porta a 3 importanti effetti:
• Rilascio di peptidi attivi nell’infiammazione
• Deposito di C3b sulla superficie di membrana, un
sito di attacco per i fagociti (opsonina)
• Lisi cellulare
• Insieme giocano un importante ruolo nei confronti delle
infezioni
• siero: fase fluida
• superficie cellulare: luogo dove
avviene l’attivazione e la
‘costruzione’ delle unità funzionali
• l’attivazione del complemento può
avvenire come conseguenza del
riconoscimento nell’ambito della
immunità adattativa oppure innata
• VIA CLASSICA (adattativa). Iniziata
da una reazione Ag-Ab (IgG1, IgG3 o
IgM) sulla superficie cellulare
• VIA ALTERNATIVA: attivazione delle
componenti del complemento
direttamente da polisaccaridi o PRR sulla
superficie di alcuni batteri
• Ioni calcio e magnesio sono necessari
per alcune fasi dell’attivazione
• funzionamento con il
meccanismo a cascata: un
singolo evento di attivazione
può portare ad una serie di
eventi
• l’attivazione avviene solitamente sulla
superficie cellulare ed è limitata in quanto
i componenti hanno vita breve e sono
presenti inattivatori
• Via classica: Ag-Ab legano C1+C2+C4
• il complesso agisce come ‘convertasi’
che scinde C3
• C3 è l’elemento centrale di tutte le
reazioni del complemento
• C3a (piccolo frammento), C3b
(grande)
• una porzione del C3b si deposita
sulla membrana e funge da attacco
per fagociti
• C2a+C4b+C3b=convertasi per C5
• C5a anafilotossina
• C5b: inizia la costruzione del
complesso C6+C7+C8+C9 che porta
al Membrane Attack Complex
TAD
• Si esegue per determinare se i globuli rossi sono
sensibilizzati in vivo da:
immunoglobuline
complemento
entrambi
Condizioni in cui il TAD può essere +
• autoanticorpi contro i GR
• alloanticorpi contro GR trasfusi
• anticorpi contro farmaci adesi alla membrana dei GR
• anticorpi presenti in emocomponenti trasfusi che aderiscono ai
GR dei riceventi
• anticorpi prodotti da passenger lymphocytes presenti in organi o
tessuti trapiantati
• alloanticorpi materni che attraversano la placenta e aderiscono
alle membrane dei GR fetali
• globuline che aderiscono aspecificamente alla membrana dei GR
• fissazione del complemento sulle emazie che può essere dovuta
all’attivazione del complemento (alloAb, autoAb, farmaci, infezioni)
Il TAD + NON indica
necessariamente che i
GR sensibilizzati hanno
una sopravvivenza
ridotta
• I globuli rossi di soggetti sani hanno
da 5 a 90 molecole IgG adese/GR.
Hanno inoltre da 5 a 40 molecole di
C3d.
• Con questi numeri, il TAD è negativo
poiché il limite di sensibilità del test è
100 a 500 molecole di IgG/GR e 400 a
1.100 di C3d
• Da 1 a 15% dei pazienti ricoverati
in ospedale ha un TAD+
• la maggioranza dei pazienti con
TAD+ non ha segni di emolisi
• alcuni pazienti tuttavia presentano
un aumento della distruzione dei GR
TAD+ è associato a:
• anemia falciforme
• beta talassemia
• nefropatie
• malattie autoimmuni
• mieloma multiplo
• AIDS
TAD: note metodologiche
• campione di sangue in EDTA, per prevenire
la fissazione del complemento in vitro
• iniziare con un siero antiglobuline
polispecifico (AHG) in grado di rilevare sia le
IgG che il C3d
• se si esamina un campione di emazie del
cordone ombelicale è opportuno l’uso del
siero anti-IgG
• se positivo, procedere con reagenti
monospecifici per le IgG e C3d
TAD + : note metodologiche
• procedere con reagenti monospecifici per le IgG e
C3d
• esaminare i siero-plasma per rilevare e
identificare Ab significativi
• esaminare un eluato
• L’eluizione stacca gli Ab legati alle emazie
sensibilizzate che vengono quindi studiati
• quando un eluato reagisce con tutte le emazie del
pannello, si tratta probabilmente di un
autoanticorpo
TAD + : note metodologiche
• quando non sono presenti nel siero anticorpi
inattesi e se il paziente non è stato trasfuso di
recente, non è necessaria alcuna altra indagine
sull’autoanticorpo
TAD+
Informarsi con il curante in merito a:
• diagnosi
• farmaci recenti
• gravidanze in atto
• anamnesi trasfusionale
• segni di anemia emolitica
• trapianti
Emolisi immuno-mediata
• riduzione della sopravvivenza dei GR dovuta a
meccanismi effettori della risposta immune
• se il midollo osseo compensa la distruzione delle
emazie, non si verifica anemia
• non tutte le anemie emolitiche sono di natura
immune
• la diagnosi di anemia emolitica si basa sulla clinica
e su test di laboratorio (Hb-Ht, reticolociti, striscio di
sangue, bilirubina, aptoglobina, LDH) e talvolta su
test di sopravvivenza eritrocitaria
Tipi di emolisi
• INTRAVASCOLARE: rilascia Hb libera nello spazio
intravascolare (emoglobinemia e emoglobinuria)
• EXTRAVASCOLARE: più comune. Aumento della
bilirubinemia ma non c’è emoglobinemia ne
emoglobinuria
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione
Anemia emolitica autoimmune (AEA) da anticorpi caldi 1
• E’ l’AEA più comune, associata ad anticorpi che reagiscono
a 37°C
• TAD con monospecifici: da IgG, da C3d oppure da entrambi
• SIERO:
• gli auto-Ab sono di classe IgG e spesso reagiscono
contro tutte i GR del pannello nel TAI
• se tutto l’Ab è auto-assorbito, nel siero può essere
evidenziato solo un basso titolo anticorpale
• L’auto-Ab diventerà evidente solo dopo aver ‘saturato’
tutti gli antigeni eritrocitari.
Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 2
• ELUATO: solitamente reagisce con tutti i GR del pannello,
con un incremento della reattività quando si utilizzano emazie
pretrattate
• Specificità anticorpali: complesse, frequentemente difficili da
risolvere. Talvolta nell’ambito del sistema Rh. In questo caso
l’Ab non reagisce con i GR D- - o Rh null.
• Sono stati riferiti auto-Ab nei confronti di Ag dei sistemi LW,
Diego, Duffy, Kidd e Kell
• Raramente è necessario determinare la specificità di un
auto-Ab ai fini trasfusionali
Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 3
• TRASFUSIONE:
• i pazienti con sintomi moderati di emolisi tollerano bene
le trasfusioni
• Se l’auto-Ab è presente nel siero, può mascherare la
presenza contemporanea di un ALLO-Ab che è un
rischio aggiuntivo
• La trasfusione può stimolare la produzione di allo-Ab
• Nei pazienti con emolisi attiva, i GR trasfusi possono
essere distrutti più rapidamente dei GR del paziente e
ciò può portare ad una coagulazione intravascolare
disseminata (CID)
Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi 4
IgM
• Esiste una tipologia di AEA caratterizzata da agglutinine
calde di classe IgM che reagiscono a 37°C.
• Sono rare ma molto severe. I pazienti affetti hanno una
prognosi infausta
• difficile eseguire il TAD poiché le emazie tendono ad
agglutinare spontaneamente
• nel siero, IgM abbastanza deboli. Range termico ottimale tra
20 e 30°C
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione
Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 1
• 16-32% delle AEA
• forma acuta secondaria a malattie linfoproliferative o
infezione (Mycoplasma pneumoniae)
• forma acuta=pazienti anziani
• spesso le agglutinine interferiscono con la tipizzazione AB0
ed Rh. Per evitare questi problemi, è necessario tenere i
prelievi in EDTA a 37°C e lavare i GR con soluzione salina a
37°C prima di determinare il gruppo sanguigno
• TAD: in quasi tutti i casi si rileva complemento adeso ai GR
Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 2
• L’autoagglutinina fredda è una IgM che agglutina i GR alle
temperature del circolo periferico e fa aderire C3 e C4
• quando i GR arrivano in aree dove la temperatura è più alta,
le IgM si staccano ma rimane adeso il complemento
• le emazie con adeso il complemento vengono fagocitate dai
macrofagi (che hanno il recettore per il C3b) del fegato
• SIERO: ci sono IgM reattive a freddo che possono provocare
emolisi anche a temperature > 32°C, quindi causano AEA
• ELUATO: non è utile poiché solitamente non ci sono
immunoglobuline adese ai GR
Sindrome da agglutinine fredde (SAF) 3
• Specificità: spesso anti-I, ma non ha un significato
diagnostico
• esami pre-trasfusionale: servono per verificare che non ci sia
un alloanticorpo oltre all’agglutinina
• autoassorbimento a freddo può allontanare gli autoanticorpi
e consentire la determinazione dell’eventuale alloanticorpo
• esiste un test in commercio che rimuove gli autoanticorpi
anti-I mediante l’utilizzo di stromi di coniglio
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione
Anemia emolitica autoimmune (AEA) mista
• AEA da anticorpi caldi+autoagglutinine a freddo.
• Due tipi:
• pazienti con autoanticorpi freddi IgM ad alto titolo con
ampio range termico
• Pazienti con titolo normale ed ampio range termico
• TAD: IgG e C3d positivo
• Siero: IgG reattive a caldo+IgM
• Eluato: dovrebbe evidenziare un IgG reattiva a caldo
• Specificità: anti-I per l’Ab freddo. Difficilmente chiara
specificità per l’Ab caldo
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione
Emoglobinuria parossistica a frigore 1
• Solitamente secondaria ad una infezione virale nell’età
pediatrica
• negli anziani forma cronica
• E’ causata da un auto-Ab IgG che reagisce a freddo e fissa
il complemento. Si comporta come l’IgM fredda, ovvero si
fissa ai GR quando questi circolano nelle zone più fredde del
corpo e poi si stacca quando i GR circolano in zone più calde,
lasciando però fissato il complemento
• TAD: positivo per i complemento (ma se si lavora a freddo, si
può evidenziare anche l’IgG
• Siero: EMOLISINA BIFASICA
Emoglobinuria parossistica a frigore 2
• ELUATO: quasi sempre negativi
• SPECIFICITA’: anti-P
• TRASFUSIONE: più frequente nei bambini. Il sangue P
negativo è rarissimo. Non aspettare la ricerca del sangue
compatibile
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione
Anemia emolitica autoimmune (AEA) TAD negative
• Non si riece ad evidenziare l’auto-An ne sulla
superficie dei GR ne nel siero
• IgA o IgM?
• Ab a bassa affinità si staccano durante il lavaggio
• lavare con soluzione fredda o LISS freddo
• poche molecole anticorpali sulla superficie dei GR
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione
Anemia emolitica da farmaci 1
• la somministrazione di farmaci talvolta induce la formazione
di autoanticorpi verso il farmaco o verso antigeni eritrocitari
intrinseci che possono:
• determinare un TAD +
• distruggere i GR
• Entrambe le situazioni
• gli Ab prodotti possono essere DIPENDENTI dal farmaco o
INDIPENDENTI
Tratto da Anemie emolitiche autoimmuni: diagnosi e terapia. W. Barcellini, M.A.
Villa, N. Revelli, A. Zanella. Inserti Cultura Ortho Diagnostic Systems
Anemia emolitica da farmaci 2
• TAD IgG nel 94% dei casi, IgG+C3 nel 6%
• IgG nell’eluato. Simile alle AEA da Ab caldi.
• Specificità nell’ambito del sistema Rh (spesso)
• A volte è necessario eseguire le ricerche di anticorpi in
presenza del farmaco
• L’elenco dei farmaci descritti come possibili cause di AE è
molto lungo e comprende analgesici, antipiretici,
antiinfiammatori, antitubercolari, antibatterici, antimicotici,
anibiotici, antistaminici, diuretici, antiipertensivi, inibitori
tiroidei, antineoplastici, sedativi, ipnoinduttori, epatoprotettivi,
antiaritmici, antidiabetici, immunosprressori ecc.
Tratto da Anemie emolitiche autoimmuni: diagnosi e terapia. W. Barcellini, M.A.
Villa, N. Revelli, A. Zanella. Inserti Cultura Ortho Diagnostic Systems
Tratto da: Technical manual AABB, 15° edizione