Tfa 11^ lezione 22 aprile le strategie metodologico didattiche
Lezione 17 - 18 mercoledì 27 aprile 2011
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Lezione 17 - 18mercoledì 27 aprile 2011
corso vettori biologici IIBiotec industrialiore 14:00 -16:00 aula 6A
Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti PCR
con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuriTAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.
Esistono in vendita: - plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra l’amplicone ed il plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi
Clonaggio dei prodotti PCR
cerchiamo delle estremità ad un frammento di PCR intersperso all’interno
di una sequenza ignota:
- se ho trovato da Southern un frammento di DNA a sequenza ignota (però conosco la sonda),- una inserzione di un frammento noto in un genoma,- un vettore che si è integrato in una regione ignota, - un virus integrato non sito specifico, - una ricerca “gene trapping”, - la ricerca delle estremità genomiche di un gene noto solo come cDNA
la soluzione è la PCR inversaSi ha un ancoraggio sulla sequenza nota e nient’altro
Si deve amplificare in maniera inversa rispetto ad una PCR normale
Quale stratagemma si usa?
Circolarizzare un frammento dopo analisi di restrizione per Southern utilizzando la sequenza nota come sonda
Il templato può essere un frammento proveniente da una delle possibili analisi precedenti
analisi Southern del frgm
deve essere scelto il frammento da amplificare
sequenza genomica o di Bac o da cui si vuole recuperare la sequenza nota inserita o integrata
digestione con enzimi di restrizione
verde : no buonobleu : no buonogiallo: no buonoviola: troppo lungomarrò: buonorosso: buonogrigio + viola: buono
- tra due buoni si sceglie quello con estremità coesive per la ligasi più efficiente- si evita l’enzima che taglia all’interno del frgm, si otterrebe solo una estremità (diversa strategia)
grigio + viola se dx troppo lungo, estremità compatibili
dopo l’analisi Southern
Dopo l’individuazione del frammento di ampiezza conveniente
- digestione del DNA con l’enzima prescelto- arricchimento del frammento con corsa su gel (opzionale)- ligasi - PCR con primers divergenti - eventualmente seconda PCR con primers “nested” ancora più esterni ai primi, ma interni al frgm lineare
- una PCR produce sempre frgm lineari !!!!
PCR inversaIl nome deriva dal fatto che si usano primers disegnati su una sequenza con direzione divergente, direzione di sequenza dei primers apparentemente non convergente. Analisi Southern
Frammento di DNA
Ligasi per circolarizzare il frammento
A B c dSequenza nota (primers divergenti)
si amplifica il frammento circolarenella regione ignota
BA
Sequenza nota
primers divergentiC D
seq ignote seq ignote
amplificazione di DNA genomico o clonato
al primo ciclo cosa si amplifica ?
la Taq polimerase si ferma sull’amplicone ?
termini dell’amplicone
primer frw la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma
allora ? perchè si amplifica solo l’amplicone ?
primer rev
Orientamento primers PCR inversa
5’3’3’5’
5’ 3’
3’c d
d c
cd
5’ 3’
5’3’
5’
a b
b a
ab
ligasi del sito di restrizione
PCR nested per PCR inversaestremità ignote digerite su DNA genomico e legate
regione nota
I primers dovranno sempre essere complementari ai due diversi filamenti
I coppiadivergente
II primerII primer
I amplicone
II amplicone
I primer I primer
II primer II primer
PCR nested quando si vuole ottenere maggiore specificità
Primo ciclo frgm + lungo
d
d ccd
frammento di restriz legato
c-d sequenza notaI ciclo
II ciclo
d
c
d c
d c
c
possibilità di concatenamero se la taq prosegue
si amplifica solo l’amplicone
dal II ciclo compare il frammento con le estremità corrispondenti al 5’ dei due primers:
primer frw la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma
primer rev
primer rev
primer frw
templato I amplificaz
templato I amplificaz
il prodotto di PCR è sempre lineare
sia nella PCR diretta che inversa con un DNA circolare
provate a farvi uno schema!
Metodo real time
Differenza con PCR standard “end point”
“end point” si intende reazione a termine
Analisi dell’amplificazione in tempo reale
Tramite fluorescenza dei prodotti amplificati
Colorante fluorescente del DNA intercalante CYBRgreen
Marcatura dei primers o doppia sonda: “FRET”; “TaqMan”; “amplifluor”
Principio del funzionamento real-time
Analisi dell’amplificazione ad ogni ciclo lettura laser della fluorescenza (qualunque metodo)
Soglia di superamento rumore di fondo
Inizio crescita log macchina tra 35-40 cicli
Curva sigmoideEffetto inibiz.
10pg5pg
1pg
0.5pg
no DNAdeterminazionedi sensibilitàdel metodo
1 log per 3.3 cicli
Crescita a esponente 2 ogni tre,tre cicli 10 x incremento
n. cicli
fluor.
Intercetta col “cut off” background = punto inizio log phase determinabile
La conc. Misurata con una curva standarddi riferimento x = condizioni
Ascissa n. cicli / ordinata fluorescenza
Ogni genoma ha un certo numero di siti di restrizione per tipo di enzima di restrizione- si digerisce il genoma e ci si legano degli adapters- si disegnano dei primers che contengono l’adapter ed una sequenza random al 3’ con due, tre, quattro, cinque, sei… nucleotidi secondo quanto si vuole essere selettivi; da migliaia di frammenti si passa a meno di cento- Gli oligonucleotidi verso il 3’ oltre l’adapter possono contenere solo certi nucleotidi e allora sono piu’ selettivi e diminuiscono il numero di frammenti specifici rendendo il pattern piu’ semplice da analizzare.
AFLP Amplified restriction fragment lenght polymorphisms
Dagli RFLPs agli AFLPsNuovo metodo di studio dei polimorfismi con approccio globale genomico
Studio dei polimorfismi di frammenti di restrizione non conosciuti con amplificazione tramite PCR selettiva dei frammenti genomici
http://www.dea.gov/programs/forensicsci/microgram/journal071203/mj071203_pg7.html
Approccio globalecon micro-cips
Polimorfismo dei frammenti di restrizione amplificati (AFLP)
•Produzione in multiplex di 50-100 marcatori con un singolo esperimento.
•Produzione contemporanea di bande polimorfiche tra individui (DNA fingerprinting) e di monomorfiche entro e
polimorfiche tra specie (identificazione di specie)•Applicabili al genoma di qualsiasi specie senza bisogno
di informazioni a priori sulle sequenze o di disponibilità di sonde
Schema dei primers
usati
Fasi dell’esperimento
! digestione con Eco RI del genoma in analisi!! digestione della I reazione con Taq I (o altro enzima)!!! ligasi con la miscela dei due adattatori!!!! preamplificazione senza marcatura!!!!! amplificazione con primers marcati!!!!!! corsa su gel di acrilamide 4,5%!!!!!!! rivelazione con autoradiografia o elettroforesi capillare
in alternativa corsa elettroforetica capillare con fluorescenza
Adattatori e PrimersAdattatori secondo il metodo pubblicato da Pieter Vos et al. Nucl.Acid Res. 1995, 23 n.21, 4407-4414 e Paolo Ajmone-Marsan et al. Animal Genetics 1997, 28, 418-426.
adattatore Eco RI
5’ 3’ 5’ 3’ CTGGTAGACTGCGTACC AATTCnnnnnnnnG AATTGGTACGCAGTCTAC
CATCTGACGCATGGTTAA GnnnnnnnnCTTAA CCATGCGTCAGATGGTC 3’ 5’ 3’ 5’
adattatore Eco RIframmento di restrizione
adattatore Taq I
GACGATGAGTCCTGAC CGAnnnnnnnnnnnnnT CGGTCAGGACTCAT TACTCAGGACTGGC TnnnnnnnnnnnnnAGC CAGTCCTGAGTAGCAG
adattatore Taq I
e terza combinazione con adattatori Eco e Taq sui frammenti tagliati regolarmente
Elettroforesi su acrilamide
Ogni lane è un soggettoIl n. di bande presenti costituisce il pattern allelicoAlcuni alleli sono molto frequenti (strisce orizzontali) possono caratterizzare la razza animale
AFLPs gel acrilamidePCR-based screening of BAC DNA pools for SAS-DNA markers using AFLP technology. AFLP templates were prepared from BAC DNA PPs (1-32) and SPs (1-16) and selectively amplified with fluorescent-labeled EcoRI + TGA and MseI + CGG. Labeled products were analyzed on a LI-COR DNA sequencer. AFLP template from genomic DNAs (IS3620C and BTx623) were run as controls and are indicated above the respective lanes. Arrows to the right of the gel show selected SAS DNA markers that were analyzed in the DNA pools. Asterisks to the right of a subset of the markers indicate those SAS DNAs that revealed polymorphisms between BTx623 and IS3620C and could be mapped as AFLPs on the sorghum genetic map. Fluorescent-labeled molecular weight markers (LI-COR) were run in lanes marked M and their sizes (bp) are shown to the left of the gel.
Elettroforesi capillare
cosa è una“Nested” PCRPer aumentare la specificità con PCR ottimizzata e non ulteriormente ottimizzabile con i parametri di reazioneSe si deve avere un prodotto di amplificazione con alta efficienza eliminando altri prodotti indesiderati-a) omologia parziale dei primers già ottimizzati-b) sequenze omologhe, pseudogeni, sequenze duplicatecaso a: trovare una seconda coppia di primers interni al
primo amplicone (probabilità limitata di omologia di entrambe le sequenze in una stessa regione)
caso b: cercare le regioni divergenti dove scegliere altre coppie di primers
primer frw. I
primer rev.I
primer frw. II
primer rev.II
II amplicone interno
PCR nested primo esempioQuando abbiamo un amplicone per esempio di 500 bp
5’
3’ 5’
3’pr frw
pr rev
5’
5’
3’
3’
1° amplicone
5’5’3’3’
II pr frw
II pr rev
2° amplicone nested
il secondo amplicone sarà più breve secondo la posiz. dei primers
esercizio 1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC GGCTGTGCCT TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61 CCCTGCCTTT GCCTCACTTT ACGCAACTTT CCCTAACTTT CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121 CCGTAGCCCC CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA TTCGAACCTT TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG 241 AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA GGTTTTTTTT CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG CTTTATTTTT 361 TTGACCAGTT AACATATTTG AGGGTTATTT TATTTATTTT TCGTTTTTTA ACGGAGGATT 421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT TTGGGATCTG ATATTTTTCT ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481 GTTTGGACAT ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA GGACTTCAAA GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC 601 AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA CTCAGGCAGT CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA GGAAGTGGAC 721 ATGGCAGCGA GTCGAACAGC AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG 781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841 AGAAGGAACG GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA ATATCCTGAT GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA 961 GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA GAGGCAGCTG AAAAAACAAG 1021 AAAAATGGAA ACAGGAACCC TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT GCAGAGAGTG
- Trova i primers per fare una PCR di un frammento di circa 3- 400 bp di questa sequenza,
- trova i primers per una PCR nested. - Trova i primers per una PCR inversa e nested- Trova a che gene appartiene questa sequenza
esecuzione esercizio 1°primer forward: da b.72 a 92 = 21 basi; 10 GC, 11 AT = 40+22 =T melting 62°C
1°primer reverse: da 786 a 767 = 20 basi;10 GC, 10 AT = 40 + 20 = T melting 60°Camplicone = 715 bp (da 72 a 786)
nested: 2° forward: da b. 121 a 140 = 20 basi;14 GC, 6 AT = 56 + 12 = T melting 68°C
2° reverse: da b. 520 a 498 = 23 basi;11 GC, 12 AT = 44 + 24 = T melting 68°C amplicone = 400 bp (da 121 a 520)
Il gene ? andare su nucleotide dalla banca dati:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
esercizio II partePCR inversa: dopo aver analizzato per Southern la regione si sceglie l’enzima di restrizione per avere un frammento di circa 4-6 kb scelta dei primers: 2° e 1° primer forward invertiti (rev. compl.) del 1° amplicone
1° primer rev inv. e 2° da b. 961 a 982
cerca la sequenza in banca dati su sito NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cginucleotide blast: UniGene infoGeoGene info Homo sapiens chromodomain helicase DNA binding protein 2 (CHD2), transcript variant 1, mRNA; Length=9374
segnare i primers
1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC GGCTGTGCCT TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61 CCCTGCCTTT GCCTCACTTT ACGCAACTTT CCCTAACTTT CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121 CCGTAGCCCC CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA TTCGAACCTT TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG 241 AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA GGTTTTTTTT CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG CTTTATTTTT 361 TTGACCAGTT AACATATTTG AGGGTTATTT TATTTATTTT TCGTTTTTTA ACGGAGGATT 421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT TTGGGATCTG ATATTTTTCT ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481 GTTTGGACAT ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA GGACTTCAAA GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC 601 AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA CTCAGGCAGT CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA GGAAGTGGAC 721 ATGGCAGCGA GTCGAACAGC AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG 781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841 AGAAGGAACG GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA ATATCCTGAT GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA 961 GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA GAGGCAGCTG AAAAAACAAG1021 AAAAATGGAA ACAGGAACCC TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT GCAGAGAGTG
1° frw; 2 inv2° frw; 1 inv
2° rev
1° rev; 1° inv
2° inv
inv = primer per PCR inversa che ha due coppie di primers per poter fare una PCR nested, quelli al 5’ della seq. devono essere complementary-reverse e quelli al 3’ sono uguali alla sequenza stampo data
primers con code!
la regione di annealing deve essere efficiente sul 3’
templato3’ 5’
3’la coda verrà inserita e dal ciclo successivo fara parte dell’amplicone
amplicone con coda incorporata
5’
5’ 3’
se i primers hanno la coda
5’ 3’ 3’5’
5’5’3’3’
5’5’3’ 3’
alla polimerase importa solo che il 3’ sia appaiato, però la coda del primer sarà incorporato e farà parte dell’amplicone
è la stessa cosa che succede in una amplificazione aspecifica in cui solo il 3’ del primer (specifico) trova omologia di sequenza e farà amplificare un prodotto non specifico
Per fare avvenire una delezione o inserzione si utilizza il metodo a tre passaggi (esempio per inserzione).
per inserire la sequenza mutata nella sequenza voluta o si seleziona un ricombinante dopo trasfezione o si inserisce direttamente la sequenza mutagenizzata con enzimi di restrizione.
Mutagenesi tramite uso di primers modificati
pr.ext. frw.
pr.int. rev. pr.ext. rev.
pr.int. frw.3’
3’5’5’
a b
pr.ext. frw.
pr. int. rev.
3PCR indipendenti
pr.ext. frw.
pr.ext. rev.
I
III ( )( )
pr.int. frw.
pr.ext. rev.inserzione
II
I e II PCR indipendenti
b
a
a b
Mutagenesi con PCR in tre passaggi
DNA mitocondriale bovino acc. N. V00654, gi 12800 con 16338 bpL8014 (external forward primer) 5’-ACCCATTGTCCTTGAGTTAGT-3’,H8393 (external reverse primer) 5’-GAGGGTTACAAAGCGATTGCT-3’,
H8242 (internal reverse primer) 5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’ and L8283 (internal forward primer) 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’, III PCR per estensione della regione sovrappostaI primers interni L8283 e H8242 hanno una coda al 3’-terminale che è stata usata per introdurre una inserzione di 22 bp (parte sottolineata nella sequenza del primer). La complementarietà sta nell’inserzione tra il 3’ dell’int. frw. primer ed il 5’ dell’int.rev.primerL’inserzione permette di discriminare per peso molecolare la sequenza bovina da quella del nuovo costrutto usato nella PCR competitiva come riferimento con varie diluizioni a partire da una concentrazione nota.Il competitore sintetico è stato clonato nel vettore pBlueScript KS+ della ditta Stratagene (La Jolla, Ca.CA USA).
Complementarietà delle codeH8242 (internal reverse primer) 5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’ and L8283 (internal forward primer) 5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’
5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA- 3’3’…………TTTTATAAGATCCGGACATGCCGTCTAGAG
seq mitoc. spec
seq mitoc. spec
coda per appaiamento
5’
5’3’ int rev pr
templato
int frw pr5’
5’3’
5’ 3’
3’
3’ 5’templato
appaiamento PCR I + II
5’
3’5’
3’ 5’3’3’
5’5’
5’3’
5’
3’XX
3’3’
5’
“elongation” solo di due filamenti
impossible impossible
mission impossible
possiblepossible
di un frammento f in un amplicone (3 steps = 3 passaggi)
inserzione
frw frw
rev reva
f
fb
inserzionefrw
reva fb
ff
annealing di 2 PCR
ab
PCR I = a PCR II=b
x
y
5’
5’
3’
3’ elongation
elongation
primer frw e rev interni sono contigui per poter inserire la sequenza f
di un frammento b da un amplicone
1
1
2
frwfrw
revrev
a b c
delezionea b
a c
1 2 c3’liberooredil 3’
2
1
22
2
1 caannealing II PCR
delezione
primer 1 e 2 interni iniziano e finiscono sui limiti della sequenza da deletere
in un amplicone in 3 passaggi
z 3’
aI cb
z
z
3’5’II
III
annealing III PCRed “extension”
II PCR separate
z
ac
3’5’ 5’
a cz3’5’
3’ 5’
PCR finale
sostituzione 5’
5’
giunzione di due frammenti distanti
la procedura è la stessa di quella della delezione, la differenza consiste nella collocazione del secondo amplicone che si vuole legare al primo che può essere ovunque nel genoma,unica condizione necessaria è la presenza delle code complementari dei primers che è obbligatoria, basta scegliere quale sequenza va al 5’ e quale al 3’ del nuovo amplicone artificiale
x y
x y
quali code sono produttive ?3’ 3’
5’5’
cc
aa
aa
cc
5’ 5’
3’3’
ccx
tt
gg
aagg
tt
y5’aa
cc 3’
5’gg
3’ tt
5’
x3’
5’
cc
aa5’
3’ gg
tt
ordine del prodotto : x - y
ccy 5’
A) code compl. rev
strand +/-
aa
B) code rev. perchè non funge?
3’
cc5’
3’ gg
altre code5’
3’
aa
5’
5’
3’
gg
tt
x ysi
tt
aa
cc
no
5’
3’
5’
3’
gg
tt
yaa
cc5’
3’
x
verso = x - y strand +/+ dirette
aa
cc5’
3’
tt
ggno
si
verso = y - x strand +/- invertite
code = al 3’ e 5’
code invertite al 5’
Questo terzo metodo che abbiamo visto, può essere utilizzato sia per ottenere inserzioni o sostituzioni, ma anche delezioni però con l’inserzione di un nuovo frammento di lunghezza diversa, anche molto diversa per avere una regione di omologia per l’appaiamento ed “elongation”. Dipende da dove si fanno partire i primers interni con la coda. In realtà si possono giuntare anche frammenti non limitrofi per costruire geni di fusione. Si possono legare esoni di geni diversi come per esempio esoni di un gene a cui attaccare la GFP o Lac Z.
Applicazioni dell’ultimo metodo
riepilogo
RT-PCR
nested PCR
mutagenesi