Les chevelus racinaires, une alternative à la production ... · Co-transfert des deux T-DNAs dans...
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« Les chevelus racinaires, une alternative à la
production en champs pour les principes actifs
d’origine végétale »
Professeur Michèle Boitel-Conti
Académie Nationale de Pharmacie
30 septembre 2015
« Les chevelus racinaires, une alternative à la
production en champs pour les principes actifs
d’origine végétale »
Professeur Michèle Boitel-Conti
Académie Nationale de Pharmacie
30 septembre 2015
Membre fondateur
Conseiller scientifique
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
Métabolites
spécialisés
(alkaloïdes, terpenes,
…)
Attraction des insectes pollinisateurs
Répulsion pour des pathogènes
Insecticides, fongicides
Allélopathie
Arômes
Parfums
Insecticides
Principes actifs
Métabolites primaires
(sucres, acides organiques, hormones
…)
Protéines recombinantes
(insuline, lipase gastrique humaine,…)
Système de production hétérologue
Croissance
Energie
Respiration
Morphogenese
Principes actifsINDUSTRIES PHARMACEUTIQUES, DES COSMETIQUES
ArômesINDUSTRIES AGRO-ALIMENTAIRES
- Molécules restreintes à quelques familles
- Généralement à faibles concentrations
- Plantes cultivées au champs
- Importées ou cultures encadrées
- > 500 000 molécules d’intérêt
Aujourd’hui
Papaver somniferum
Datura inoxia
hyoscyamine, scopolamine, …
Catharanthus roseus
vinblastine, vincristine,…
codéine, morphine,…
Marché non couvert Biotechnologies ?
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
Extraction
Culture en fiole d’1 clone
Problématiques
Grande taille
Organes pluricellulaires hétérogènes
Activités métaboliques qui évoluent :
- âge
- sollicitations environnement
Lieux de biosynthèse et de stockage :
- cellules
- organes
- molécules circulantes
- faibles teneurs
Plantes supérieures
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végétale
Biotechnologies ?
Demain
PGM
- Plantes à potentialités bio synthétiques amplifiées,
- Culture en milieu confiné et contrôlé
- Simplification de la « plante »
Datura inoxia
hyoscyamine, scopolamine, …
vinblastine, vincristine,…
Papaver somniferum
codéine, morphine,…
Catharanthus roseus
- Dédifférenciation culture de cellules perte du métabolisme spécialisé
- Transformation génétique culture d’organe
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
Biotechnologies ?
Datura inoxia
hyoscyamine, scopolamine, …
vinblastine, vincristine,…
Papaver somniferum
codéine, morphine,…
Catharanthus roseus
- Transformation génétique culture d’organe
Les chevelus racinaires ou « hairy roots »
Métabolisme spécialisé?
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
Qu’est-ce qu’un chevelu racinaire?
Il est issu d’un évènement naturel
Bactéries en symbiose avec les plantes
au sein de la rhizosphère
transfère certains de ses gènes(blessures mécaniques)
Rhizobium rhizogenes Certaines cellules de racines naturelles
sans avec
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végétale
Au laboratoire
Rhizobium rhizogenes
transfère certains de ses gènes(blessures mécaniques)
Certaines cellules de racines naturelles
Culture in vitro de plantes Culture de R. rhizogenes
Piqure avec
aiguille infectée
Les bactéries sont tuées par
un antibiotique : le céfotaxime
après 10 à 15 jours de co-culture
Racine
transgénique
Les gènes bactériens se sont
insérés dans le génome des
cellules de la plante
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
- On coupe la racine transformée
- On la place sur un milieu de culture solide stérile : sucres et sels minéraux
- Chaque racine donnera un clone racinaire issu d’une seule piqure
6 clones Culture en fiole d’1 clone1 clone
Culture en bioréacteurs de 3, 15 et 20 litres:
milieu confiné et contrôlé
- sans lumière
- entre 20° et 25°
- eau + sucre + sels minéraux
et les molécules d’intérêt ?
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végétale
P. Somniferum produit les alcaloides
benzylisoquinoline
à partir de la L-tyrosine.
codéine thébaine
Morphine (2 cycles arômatiques suppl.)
Anthony G. Millgate et al, 2004, Nature
Voie de biosynthèse
Les alcaloïdes morphiniques ?
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Alcaloides
(contenus en % Poids sec)
Hairy roots
(HR)
Racines
naturelles
Milieu de culture
(HR)
Total 0.46 +/- 0.06 0.32 +/- 0.05
morphine 0.26 +/- 0.04 0.27 +/- 0.05 0.255 +/- 0.03
sanguinarine 0.02 +/- 0 0.05 +/-0 0.014 +/- 0
codeine 0.18 +/- 0.02 0.05 +/- 0
Le Flem-Bonhomme V. et al, 2004, Planta
Les alcaloïdes morphiniques ?
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végétale
stilbènes/ Vitis vinifera:
exploration analytique et développement de procédé
stratégies
Photos BIOPI 2015: Léo-Paul TisserantHairy roots de Vitis vinifera
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resvératrol
stilbènes/ Vitis vinifera:
exploration analytique et développement de procédé
stratégies
Exploration analytique
Elicitation de la
voie de biosynthèseSécrétion de stilbènes totaux :
150 mg. l-1 de milieu de culture
Vin (France) : 5,4 ± 1,2 mg·l1
Grain de raisin sec (Thomson seedless) : 486 mg·kg-1
Renouée du Japon : 10 mg.kg-1
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1
Pics connus ??
?????? ??????
??
??
X 1500
stratégiesIvan Boublik, CRBM UMR 5237 CNRS
Systèmes défaillants:
- diabète/insuline
- croissance/ h-GH
- Immunité/ IFNγ
- Coagulation/ facteur VIII
Extraction tissus humains
Systèmes recombinants
Production de protéines recombinantes :
50 Milliards $ en 1997 300 Milliards $ en 2015
CHO
Insatisfaisant pour les protéines complexes
Organismes transgéniques
Systèmes cellulaires
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Chevelus racinaires :
Alternative aux systèmes microbiens et CHO
pour les protéines complexes ?
Médicaments
(traitements
hormonaux,
antiviraux,
vaccins,…)
Identification
séquençage
gène
Végétaux comestibles
Protéine d’intérêt
thérapeutique
(insuline, anticorps,
vaccins,…)
Génération de racines
porteuses du gène codant la
protéine d’intérêt
Culture de racines
en milieu confiné (bioréacteur)
R. rhizogenes
Sélection /
mise en culture
Transformation
génétique
Extraction /
purification
Pathologie caractérisée
(déficience en une protéine)
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végétale
Chevelus racinaires :
Alternative aux systèmes microbiens et CHO
pour les protéines complexes ?
stratégies
Etude de cas: GFP (I)
Co-transfert des deux T-DNAs dans le génome de la cellule infectée (feuille, tige…)
Génération de racines adventives type « hairy root » porteuses du gène d’intérêt
Brassica rapa rapa
(navet)lumière blanche lumière bleue
Type sauvage GFP Type sauvage GFP
GFP
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LBRB
Prom Term Prom TermSP
Vecteur binaire
RB LB
Prom TermProm TermProm Term
Plasmide pRi
Gène d’intérêt nptII Rol A Rol B Rol C
Directement à partir du milieu de culture et
sans aucune étape de purification
La GFP représente plus de 70% des protéines totales
sécrétées (120 mg/L) 18
Plate forme RhizoProt
Marqueur
Gel acrylamide coloré au
coomassie
Protéines
totales
sécrétées
GFP25 kDa
37 kDa
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Brassica rapa rapa
19
Système historique tabacPlateforme RhizoProt
(Brassicaceae)
Sécrétion GFP 0.8 mg/L* 100 mg/L
Durée de vie de la culture
< 40 jours> 3 mois =>production en
continu
Stabilité des protéines sécrétées
Présence de protéases** stable
Toxicité Alcaloïdes (nicotine…) Végétaux alimentaires
*Medina-Bolivar et al.;
2004
** Pham et al.; 2011 RhizoProt :
Plateforme de production de biomolécules
- innovante
- performante
- sans pathogène,
- à faible coût,
- confiné et contrôlé
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Brevet UPJV 2010
20
Valorisation industrielle:
Développement d’un procédé de production/sécrétion de protéines
recombinantes à partir de chevelu racinaire (brevet WO2011138233A1)
Industrialisation
du procédé
Développement
de candidats
médicaments
Start-up de biotechnologie créée en 2011Exploitant exclusif du brevet et de la
plateforme RhizoProt
3 protéines propriétaires (enzymes humaines) en développement pour le traitement de patients atteints de
maladies rares
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végétale
stratégies
L’équipe et moi-même vous remercions de votre attention
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végétale
stratégies
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
La démarche, les outils, les compétences
Chimie analytique
Génie métabolique
Génie génétique
Génie des bio-procédés
Développement industriel
10 molécules d’intérêt à l’étude
Recherche
fondamentale
Application en
industrie
10 ans
ESSAIS CLINIQUES
1 seule produite
NCH3
HO
O
C
3
2H OH
C1 C2
Systèmes modèles
500 000 molécules découvertes
transfert
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végétale