LC/MS/MSを用いた臨床定量法開発と...

LC/MS/MSを用いた臨床定量法開発とそのバリデーション

第1回 JBFシンポジウム

パネルディスカッション「日本のバイオアナリシスの現状と今後の展望」

3. 製薬メーカーの事例紹介

武田薬品工業株式会社

医薬研究本部薬物動態研究所

米山智城[email protected]

｜｜第1回JBFシンポジウム | 8/10/20111

リード化合物の選択

開発候補化合物の選出

開発候補化合物の非臨床研究

臨床試験Phase I II III

市販後調査剤形変更LCM

新薬開発と生体試料中薬物濃度測定

NDAIND

非臨床探索PK 非臨床早期PK 非臨床後期PK

GLP TKNon-GLP TK

臨床PK

多数の候補化合物スピード＞精度・信頼性

候補化合物数は限定的スピード＜精度・信頼性

申請用データ取得には基本的に定量法バリデーションが必須


定量法バリデーションに関する主なガイダンス等

• 定量法は適切に妥当性の確認された方法をもちいなければならない。

「トキシコキネティクスに関するガイダンスについて」

薬審第443号 1996年7月2日厚生省

• 定量法は、バリデーションによりその真度・精度・特異性・定量限界などが明確にされ、妥当性が確認されたものでなくてはならない。

「医薬品の臨床薬物動態試験について」

医薬審発第796号 2001年6月1日厚生労働省

“Guidance for industry: Bioanalytical Method Validation”May 2001, FDA

“Workshop/Conference Report: Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation”

Feb 2007, The AAPS Journal 2007; 9 (1)

3

定量法の開発から検体測定までの流れ

1• 測定対象物質と内標準物質を決定する

• 測定するマトリックスを決定する（血漿、尿など）

2• 必要な情報を効果的に収集する（化合物の情報、物理化学的性質、薬物

動態学的性質など）

3• 定量法の開発検討を行う（前処理、LC/MS/MS条件の最適化。問題点の

解決）

4• 定量法バリデーション試験を実施する

5

• 検体を測定し濃度値を得る

• 検体測定時の信頼性を保証する


4

定量法の開発から検体測定までの流れ

1• 測定対象物質と内標準物質を決定する

• 測定するマトリックスを決定する（血漿、尿など）

2• 必要な情報を効果的に収集する（化合物の情報、物理化学的性質、薬物

動態学的性質など）

3• 定量法の開発検討を行う（前処理、LC/MS/MS条件の最適化。問題点の

解決）

4• 定量法バリデーション試験を実施する

5• 検体を測定し濃度値を得る

• 検体測定時の信頼性を保証する



化学構造

分子量

塩形

純度

etc. PKプロファイル

線形性

代謝物プロファイリング

タンパク結合率

血球移行率

etc.

pKaLogP(D)溶解性

溶液安定性

光安定性

etc.

化合物の情報

物理化学的性質薬物動態学的性質

②必要な情報の収集


1. イオン化法2. MS条件のチューニング

温度、電圧、ガス圧、その他MSパラメータ3. LC条件

カラム、移動相（有機溶媒比、pH）4. クロストーク5. 前処理法

除タンパク法、固相抽出、液々抽出6. 定量下限、定量範囲7. キャリーオーバー

洗浄溶媒、洗浄メソッド8. マトリックス効果9. 吸着10. 生体試料中安定性11. 測定対象以外の代謝物の影響

③定量法の開発検討

集めた情報を活かして堅牢な分析法を効率的に開発する


③-2 チューニング

[M+H]+

オートチューンによる至適値

[M+H]+

[M+Na]+

イオン化電圧チューニング時の2峰性

オートチューンでは適当なチューニングが行えないケースあり

途中データをきちんと評価することが重要

基本は[M+H]+のイオンで定量法を開発*1

*1: J. Pharm. Biomed. Anal. 30, 299-305 (2002)

251V


±15% of Nominal

脂溶性の高い化合物は、尿中で容器への吸着が問題となることがある

添加剤の検討（Tween 80、Chaps、BSAなど）*2

攪拌時間、超音波処理の検討

容器の検討（PP、PS、PE、ガラスなど）

添加剤後添加での回収の検討*2

③-9 吸着

*2: J. Chromatogr. B 878, 583-589 (2010)

｜｜第1回JBFシンポジウム | 8/10/201110

③-10 生体試料中安定性

生体試料中で不安定な化合物の安定化の手法

低温処理

pH調整（塩酸、ギ酸、炭酸水素ナトリウム、トリスなど）

各種酵素阻害剤の添加*3

遮光

抗凝固剤の選択（EDTA、ヘパリン、クエン酸ナトリウムなど）

マトリックスの選択（全血、血漿、血清、Dried Blood Spot（DBS）など）

誘導体化（反応性化合物の場合） *4 *3: Biomed. Chromatogr. 25, 258-277 (2011)*4: Anal. Chem. 73(22), 5450-5456 (2001)

0

20

40

60

80

100

120

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Acc

urac

y (%

)

Storage Period (month)

EDTA-2KHeparin-NaCitrate-NaSerumDBSDPS

-20ºC保存での安定性

｜｜第1回JBFシンポジウム | 8/10/201111

測定対象の化合物

測定対象ではない代謝物

Rat plasma 6 h after dose

考慮すべき代謝物の例

分子量が同一の構造異性体（E-Z体、ジアステレオマーなど）

In-source fragmentationにより、同一のprecursor ionを生じる代謝物*3*5（抱合体、加水開環体、N-オキサイドなど）

保存中や前処理中に分解して測定対象化合物に変換する代謝物*3

*3: Biomed. Chromatogr. 25, 258-277 (2011)*5: Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 97-106 (1999)

③-11 測定対象以外の代謝物の影響

特異性（Selectivity）

真度・精度（Accuracy, Precision）

回収率（Recovery）

検量線（Calibration curve）

安定性（Stability）

凍結・融解安定性

短期保存安定性（室温、冷蔵、氷冷など）

長期保存安定性（-20℃、-80℃）

溶液中安定性（標準原液、標準溶液、室温、冷蔵）

前処理後試料中安定性

マトリックス効果（Matrix effect）

キャリーオーバー（Carryover）

希釈の妥当性（Dilution integrity）

12

④定量法バリデーション試験の評価項目

適切な事前検討でバリデーション試験中のトラブルを回避

仮に問題が発覚した場合でも迅速な対策が可能


｜｜第1回JBFシンポジウム | 8/10/201113

⑤検体測定とその信頼性保証

検体測定時のパフォーマンスモニタリング

検量線・QC試料

キャリーオーバー

Incurred Sample Reanalysis (ISR)

- 尿でISRが基準を満たさなかったケースあり

- 尿試料の融解、攪拌が不十分であった

｜｜第1回JBFシンポジウム | 8/10/201114

信頼性の高い測定値

LC/MSの適切な管理

定量法開発時の十分な検討

定量法バリデーション

検体測定時の信頼性保証

まとめ

定量分

動態

価

加えて・・・

定量分析と動態評価の知識をバランスよく身につけることも重要

LC/MS/MSを用いた臨床定量法開発と...

Documents

Transcript of LC/MS/MSを用いた臨床定量法開発と...