Laporan Lengkap Isolasi MO Endofit
description
Transcript of Laporan Lengkap Isolasi MO Endofit
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
LAPORAN PRAKTIKUM
ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS FUNGI ENDOFIT
SEBAGAI ANTIMIKROBA
OLEH :
KELOMPOK IV
SONIA RANGGA SALU (N 111 10 111)
ARI KURNIAWATI (N 111 10 134)
EVY MUSTIQAWATI (N 111 10 253)
RUDIARFIANSYAH (N 111 10 261)
NATALIA WIJOYO (N 111 10 286)
HARDIYANTI HARAHAP (N 111 10 302)
SULTAN (N 111 10 303)
GOLONGAN JUMAT PAGI
ASISTEN : SHERWIN ARMANDA
MAKASSAR
2011
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Tanaman dan mikroorganisme mempunyai hubungan yang sangat
erat satu sama lain. Mikroorganisme dapat menyerang tanaman sehingga
menyebabkan penyakit pada tanaman induknya, sementara ada pula
mikroorganisme yang bersimbiosis sangat baik dengan tanaman
induknya. Mikroorganisme pada tanaman terdiri dari 2 jenis yaitu
mikroorganisme yang tinggal di permukaan tanaman disebut epifit
(epiphyte) dan mikroorganisme yang tinggal di dalam tanaman disebut
endofit (endophyte). (1:5)
Studi akhir-akhir ini telah banyak dilakukan para peneliti
menggunakan tanaman tropis. Data menunjukkan bahwa tanaman induk
di daerah tropis kaya akan mikroba endofit yang belum diklasifikasikan
dan kemungkinan mengandung generasi dan spesies baru. Hubungan
antara mikroba endofit dan tanaman dalam menghasilkan metabolit
sekunder sangat menarik dipelajari. (1:5)
Dalam bioteknologi, mikroba endofit ini sangat potensial sebagai
penghasil senyawa-senyawa baru berkhasiat obat, metabolit sekunder,
pengontrol biologi dan berbagai senyawa yang bermanfaat. Dengan
demikian diperlukan pengembangan atau penelitian untuk mempelajari
hubungan antara tanaman dan endofitik pada kondisi tropis. (2:1)
I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud Percobaan
Mengetahui dan memahami cara mengisolasi mikroba endofit dari
suatu sampel dan pengujian aktivitas antimikrobanya.
I.2.2 Tujuan Percobaan
Mengisolasi fungi endofit dari sampel tanaman Tapak Liman
(Elephantopus scaber) dan menentukan kemampuannya dalam
menghambat pertumbuhan dari mikroorganisme tertentu.
I.3 Prinsip Percobaan
1. Pengambilan dan pengolahan sampel
Sampel tanaman Tapak Liman (Elephantopus scaber) dibersihkan,
disterilkan dengan alkohol 70%, NaOCl 25%, dan air steril, dan
dihancurkan sehingga sampel tanaman tersebut dapat dibuat
pengencerannya, mulai dari 10-1 hingga 10-5.
2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit
Tiga tingkat pengenceran terakhir sampel, yaitu pengenceran 10-3,
10-4, dan 10-5 diisolasi menggunakan metode pengenceran ke dalam
medium PDA (Potato Dextrose Agar) dan diinkubasikan selama 2-5
hari pada suhu kamar, kemudian mikroorganisme terpilih yang
tumbuh kembali diinokulasikan ke dalam medium PDA (Potato
Dextrose Agar) yang baru dengan menggunakan metode gores
untuk mendapatkan koloni terpisah dan diinkubasikan selama 1-3
hari pada suhu kamar, kemudian koloni yang tumbuh terpisah
kembali diinokulasikan dengan metode agar miring ke dalam medium
PDA (Potato Dextrose Agar) hingga diperoleh stok kultur murni
setelah diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar.
3. Peremajaan dan pembenihan
Mikroorganisme dari stok kultur murni diinokulasikan kembali
dengan metode agar miring ke dalam medium PDA (Potato Dextrose
Agar) yang baru dan diinkubasikan selama 1-3 hari pada suhu
kamar, kemudian 1-2 ose koloni diinokulasikan ke dalam medium
PDY (Potato Dextrose Yeast) dan diinkubasi selama 3 hari pada
suhu kamar, kemudian seluruhnya diinokulasikan ke dalam medium
produksi dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar sambil
diaerasi pada shaker, lalu sampel diendapkan dengan alat sentrifus
selama 20 menit dengan kecepatan 2500 rpm hingga diperoleh filtrat
dan residunya.
4. Pengujian aktivitas mikroba
Pengujian aktivitas fungi endofit terpilih dari sampel tapak liman
(Elephantopus scaber)dengan menginokulasikan suspensi biakan
Streptococcus mutans dan Escherichia coli ke dalam medium NA
(Nutrient Agar), kemudian filtrat dan residu diuji daya hambatnya ke
dalam medium tersebut dengan paper disk dan diinkubasikan
selama 1 x 24 jam pada suhu 370C, kemudian diamati zona
hambatnya.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Teori Umum
Mikroba endofit (bakteri dan fungi) adalah organisme hidup yang
berukuran mikroskopis yang hidup di dalam jaringan tanaman (xilem dan
floem), daun, akar, buah, dan batang. Mikroba ini hidup bersimbiosis
saling menguntungkan, dalam hal ini mikroba endofitik mendapatkan
nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman
melawan herbivora, serangga atau jaringan yang patogen sedangkan
tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan
selama hidupnya. Mikroba endofit spesifik yang diperoleh dari bagian
dalam tanaman diduga mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif
yang spesifik yang sama dengan senyawa bioaktif tanaman tanpa harus
mengekstraksi bagian tanamannya sehingga kelangsungan hidup
tanaman tidak terganggu. (1:3)
Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit
sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang
sangat besar dan dapat diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Dari
sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-
masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri
dari bakteri dan jamur. (1:6)
Beberapa ahli telah mengisolasi dan meneliti endofit dari berbagai
tanaman diantaranya tanaman obat, tanaman, dan tanaman-tanaman
hutan. Bakteri atau fungi tersebut dapat menghasilkan senyawa metabolit
yang dapat bermanfaat bagi manusia sebagai antibiotika
(antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria,
antioksidan, antiimunosupresif, antiserangga, zat pengatur tumbuh, dan
penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase,
ligninase, dan kitinase. Manfaat dari endofit lainnya juga dalam fiksasi
nitrogen (N2) pada beberapa tanaman. (2:4)
Fungi endofit adalah fungi yang terdapat di dalam sistem jaringan
tumbuhan, seperti daun, bunga, ranting ataupun akar tumbuhan. Fungi ini
menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu dan mampu
menghasilkan mikotoksin, enzim serta antibiotika. (3:16)
Asosiasi fungi endofit dengan tumbuhan inangnya, oleh Carrol
(1988) digolongkan dalam dua kelompok, yaitu mutualisme konstitutif dan
induktif. Mutualisme konstitutif merupakan asosiasi yang erat antara fungi
dengan tumbuhan terutama rumput-rumputan. Pada kelompok ini fungi
endofit menginfeksi ovula (benih) inang, dan penyebarannya melalui benih
serta organ penyerbukan inang. Mutualisme induktif adalah asosiasi
antara fungi dengan tumbuhan inang, yang penyebarannya terjadi secara
bebas melalui air dan udara. Jenis ini hanya menginfeksi bagian vegetatif
inang dan seringkali berada dalam keadaan metabolisme inaktif pada
periode yang cukup lama. (3:16)
Ditinjau dari sisi taksonomi dan ekologi, fungi ini merupakan
organisme yang sangat heterogen. Clay (1988) melaporkan, bahwa fungi
endofit dimasukkan dalam famili Balansiae yang terdiri dari 5 genus yaitu
Atkinsonella, Balansiae, Balansiopsis, Epichloe dan Myriogenospora.
Genus Balansiae umumnya dapat menginfeksi tumbuhan tahunan dan
hidup secara simbiosis mutualistik dengan tumbuhan inangnya. Dalam
simbiosis ini, fungi dapat membantu proses penyerapan unsur hara untuk
proses fotosintesis serta melindungi tumbuhan inang dari serangan
penyakit, dan hasil dari fotosintesis dapat digunakan oleh fungi untuk
mempertahankan kelangsungan hidupnya. (3:17)
Banyak kelompok fungi endofit yang mampu memproduksi
senyawa antibiotika yang aktif melawan bakteri maupun fungi patogenik
terhadap manusia, hewan dan tumbuhan, terutama dari genus
Coniothirum dan Microsphaeropsis. Fungi endofit mampu menghasilkan
siklosporin A, yang berpotensi sebagai antifungal dan bahan
imunosupresif. Siklosporin dihasilkan oleh strain Acremonium luzulae
yang diisolasi dari buah strawberry. (3:18)
Senyawa antibiotika lainnya seperti sefalosporin mulanya
dihasilkan oleh satu strain Cephalosporium. Selanjutnya juga ditemukan
pada fungi Anixiopsis, Arachnomyces,Diheterospora, Paecilomyces,
Scopulariopsis dan Spiroidium. (3:18)
Mikroba endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki
aktivitas yang lebih besar, bahkan dapat memiliki aktivitas yang lebih
besar dibandingkan aktivitas tumbuhan inangnya. Dilihat dari segi
efisiensi, hal ini sangat menguntungkan, karena siklus hidup mikroba
endofit lebih singkat dibandingkan siklus hidup tumbuhan inangnya,
sehingga dapat menghemat waktu yang dibutuhkan untuk
mendapatkan senyawa tersebut, dan jumlah senyawa yang diproduksi
dapat dibuat dalam skala yang besar dengan menggunakan proses
fermentasi. Di samping itu, ada keuntungan lain yang diperoleh,
yaitu menjaga kelestarian tumbuhan-tumbuhan obat, terutama yang
termasuk jenis tumbuhan langka, agar tidak dieksploitasi secara terus
menerus yang akhirnya akan mengakibatkan kepunahan. (2:6)
Metabolit sekunder merupakan senyawa yang disintesis oleh
suatu mikroba, tidak untuk memenuhi kebutuhan primernya (tumbuh dan
berkembang) melainkan untuk mempertahankan eksistensinya dalam
berinteraksi dengan lingkungannya. Metabolit sekunder yang dihasilkan
oleh mikroorganisme endofit merupakan senyawa antibiotik yang mampu
melindungi tanaman dari serangan hama insekta, mikroba patogen, atau
hewan pemangsanya, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai agen
biokontrol. (3:6)
Senyawa ini juga dapat digunakan sebagai alat pemikat bagi
serangga atau hewan lainnya guna membantu penyerbukan atau
menyebarkan bijinya, dan sebagai alat pelindung terhadap kondisi
lingkungan fisik yang ekstrim seperti intensitas ultraviolet yang tinggi dari
sinar matahari, pencemaran lingkungan secara kimiawi, kekeringan yang
berkepanjangan, atau berkurangnya zat makanan pada tempat
tumbuhnya. (3:7)
Ada beberapa macam metode isolasi yang dapat digunakan untuk
mengisolasi suatu mikroba endofit, yaitu:
1. Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode ini adalah mengencerankan mikroorganisme
sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari
organisme lainnya. Setiap koloni yang yang tampak pada cawan tuang
tersebut setelah diinkubasi besaral dari sel tunggal. Namun,
pegenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir
mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan di dalam
cawan.
2. Isolasi Pada Medium Cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme
tidak dapat tumbuh pada cawan (medium padat), tetapi hanya dapat
tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran
dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran,
peluang untuk mendapatkaan satu sel semakin besar.
3. Isolasi Sel Tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel
mikroorganisme yang tidak dapat tumbuh pada agar cawan maupun
medium cair. Sel mikroorganisme dilihat bersamaaan dengan sekitar
100 kalinya kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan
pipet kapiler yang sangat halus ataupun mikro.
II.2 Uraian Bahan
1. Aquadest (4 : 96)
Nama Resmi : Aqua destillata
Nama Lain : Aquadest
RM/BM : H2O/18,02
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berasa, dan
tidak berbau
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai pelarut
2. Alkohol (4 : 65)
Nama Resmi : Aethanolum
Nama Lain : Alkohol
RM/BM : C2H6O/46,00
Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap,
mudah bergerak, bau khas, rasa panas, mudah
terbakar dengan memberikan nyala biru yang
tidak berasap
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari
cahaya, jauh dari nyala api
Kegunaan : Sebagai antiseptik
3. Agar (4 : 74)
Nama Resmi : Agar
Nama Lain : Agar-agar
Pemerian : Berkas potongan memanjang, tipis seperti selaput,
berlekatan, berbentuk keping, serpih atau butiran,
jingga lemah kekuningan, abu-abu kekuningan
sampai kuning pucat, tidak berwarna, tidak
berbau, berlendir jika lembap
Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, larut dalam air
mendidih
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai pengeras medium
4. Dekstrosa (5 : 300)
Nama Resmi : Dextrosum
Nama Lain : Dekstrosa, glukosa
RM/BM : C6H12O6/180,00
Pemerian : Hablur, tidak berwarna, serbuk hablur, butiran
putih, tidak berbau, rasa manis
Kelarutan : Larut dalam air, memberikan larutan berwarna
coklat kekuningan yg bereaksi dengan asam
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai komposisi medium
5. Natrium klorida (4 : 403)
Nama Resmi : Natrii chloridum
Nama Lain : Natrium klorida
RM/BM : NaCl/58,44
Pemerian : Hablur heksahedral, tidak berwarna, atau serbuk
hablur putih, tidak berbau, rasa asin
Kelarutan : Larut dalam 2,8 bagian air, dalam 2,7 bagian air
mendidih, dan dalam lebih kurang 10 bagian
gliserol P, sukar larut dalam etanol (95%) P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai komposisi medium
6. Pepton (5 : 721)
Nama Resmi : Pepton
Pemerian : Serbuk; kuning kemerahan sampai coklat; bau
khas tidak busuk
Kelarutan : Larut dalam air; memberikan larutan berwarna
coklat kekuningan yang bereaksi agak asam;
praktis tidak larut dalam etanol (95%) P dan dalam
eter P
Kegunaan : Sebagai komposisi medium
7. Ekstrak Beef (5 : 1152)
Kaldu daging sapi konsentrat diperoleh dengan
mengekstraksi daging sapi segar tanpa lemak, dengan cara
merebus dalam air dan menguapkan kaldu pada suhu rendah
dalam ruang hampa udara sampai terbentuk residu kental
berbentuk pasta
Pemerian : Massa berbentuk pasta, berwarna coklat
kekuningan sampai coklat tua, bau dan rasa
seperti daging, sedikit asam
Penyimpanan : Wadah tidak tembus cahaya, tertutup rapat
8. Ext. yeast (4 : 671)
Nama resmi : Ekstrak ragi P
Nama lain : Sari ragi P
Pemerian : Serbuk, kuning kemerahan sampai coklat, bau
khas tidak busuk
Kelarutan : Larut dalam air, membentuk larutan kuning
sampai coklat, berisi asam lemah, tidak
mengandung karbohidrat
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
9. Pati terlarut (4 : 720)
Nama resmi : Pati larut P
Nama lain : Pati P
Pemerian : Serbuk hablur, putih
Kelarutan : Larut dalam air panas, membentuk larutan agak
keruh
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
II.3 Uraian Sampel
1. Tapak Liman (Elephantopus scaber) (6)
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Kelas : Angiospermae
Subkelas : Dicotyledoneae
Ordo : Asteridae
Famili : Asterales
Genus : Elephantopus
Spesies : Elephantopus scaber
II.4 Uraian Mikroba
II.4.1 Klasifikasi mikroba
1. Streptococcus mutans (7 : 168)
Kingdom : Protista
Filum : Scotobacteria
Kelas : Bacteria
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Streptococcus
Spesies : Streptococcus mutans
2. Escherichia coli (7 : 174)
Kingdom : Protista
Filum : Protophyta
Kelas : Schyzomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Eubacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
II.4.2 Morfologi mikroba
1. Streptococcus mutans (7 : 168)
Sel berbentuk batang, bersifat aerobik, bergerak dengan flagel,
spesies bersifat parasit, terbawa oleh partikel-partikel debu di
udara, mempunyai habitat pada tanah, air, dan lingkungan
akuatik.
2. Escherichia coli (7 : 174)
Batang lurus, 1,1 – 1,5 μm x 2,0 – 6,0 µm, motil dengan flagelum
peritritikus atau non motil, gram negatif. Tumbuh dengan mudah
pada medium nutrien sederhana. Laktosa difermentasi oleh
sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas.
BAB III
METODE KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah autoklaf,
botol pengencer, cawan petri, enkas, erlenmeyer, handspray, jangka
sorong, jarum inokulum, LAF (Laminar Air Flow), lampu spiritus, lumpang
dan alu, paper disk, pinset, sendok tanduk, sentrifus, shaker, spoit, dan
tabung reaksi.
III.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah alcohol
70%, aluminium foil, aquadest, kapas, kertas label, kertas pembungkus,
korek api, medium NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PDY
(Potato Dextrose Yeast), medium produksi, kloramfenikol 30 ppm, dan
sampel Tapak Liman (Elephantopus scaber).
III.2 Cara Kerja
1. Pengambilan dan pengolahan sampel
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Sampel Tapak Liman (Elephantopus scaber) dibersihkan dan
dipotong-potong kecil
c. Ditimbang sebanyak 10 gram
d. Direndam dalam alkohol selama 20 menit kemudian dibilas dengan
air steril
e. Dihaluskan dalam lumpang dengan alu
f. Dimasukkan ke dalam botol peengencer yang telah terisi 90 mL air
steril hingga diperoleh pengenceran 10-1
g. Diambil 1 mL dari pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam
botol pengencer yang telah terisi 9 mL air steril hingga diperoleh
pengenceran 10-2
h. Diulangi langkah sebelumnya untuk membuat pengenceran 10-3,
10-4, dan 10-5
2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Diambil masing-masing 1 mL dari pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5
kemudian diinokulasikan ke dalam cawan petri
c. Dimasukkan medium PDA (Potato Dextrose Agar) ke dalam
masing-masing cawan petri kemudian dihomogenkan
d. Dibungkus ketiga cawan petri tadi dan diinkubasikan selam 2-5 hari
pada suhu kamar
e. Diamati koloni yang tumbuh dan zona hambatnya
f. Dimasukkan medium PDA (Potato Dextrose Agar) dalam cawan
petri dan ditambahkan kloramfenikol 20 ppm kemudian
dihomogenkan dan dibiarkan memadat
g. Diinokulasikan 1 ose koloni terpilih yang memiliki zona hambat
dengan cara digores pada medium PDA (Potato Dextrose Agar)
yang telah memadat
h. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar
i. Diamati koloni yang tumbuh secara terpisah dari koloni lainnya
j. Dibuat medium PDA (Potato Dextrose Agar) dalam tabung rekasi
dengan metode agar miring
k. Diinokulasikan 1 ose koloni yang terpisah ke dalam medium PDA
(Potato Dextrose Agar) miring yang telah disiapkan
l. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar
m.Diamati pertumbuhan koloninya hingga diperoleh koloni murni
3. Peremajaan dan pembenihan
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Disiapkan 25 mL medium PDY (Potato Dextrose Yeast)
c. Disuspensikan koloni murni yang diperoleh dengan ±2 mL larutan
NaCl fisiologis
d. Dimasukkan suspensi koloni ke dalam medium PDY (Potato
Dextrose Yeast)
e. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar
sambil diaerasi pada shaker
f. Disiapkan 100 mL medium produksi
g. Dimasukkan seluruh medium PDY beserta koloninya ke dalam
medium produksi
h. Dibungkus dan diinkubasikan selama 7 hari pada suhu kamar
sambil diaerasi pada shaker
i. Diendapkan sel fungi dalam medium produksi selama 20 menit
dengan kecepatan 2500 rpm
j. Dipisahkan antara filtrat dengan residu
k. Diukur pH filtrat yang diperoleh
4. Pengujian aktivitas mikroba
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Dimasukkan 20 µL suspensi biakan Streptococcus mutans ke
dalam botol coklat
c. Dimasukkan medium NA (Nutrient Agar) secukupnya ke dalam
botol coklat kemudian dihomogenkan
d. Dituangkan ke dalam cawan petri lalu biarkan memadat
e. Diresapkan 20 µL filtrat, residu, dan kloramfenikol 30 ppm (sebagai
control) ke dalam paper disk
f. Dimasukkan masing-masing paper disk ke dalam cawan petri yang
telah terisi medium NA (Nutrient Agar) yang telah memadat dan
diatur posisinya sedemikian rupa
g. Dibungkus dan diinkubasikan secara terbalik selama 1x24 jam
pada suhu 370C
h. Diulangi seluruh langkah sebelumnya untuk biakan Escherichia coli
i. Diamati dan diukur zona hambat dari filtrat, residu, serta kontrol
kloramfenikol
BAB IV
HASIL PENGAMATAN
IV.1 Data Pengamatan
1. Pengujian daya hambat
No. BiakanDaya hambat (mm)
Kontrol Filtrat Residu
1 Streptococcus mutans 13,638,19 8,56
7,025 7,68
2 Escherichia coli 14,719,25 4,648,65 3,9
IV.2 Perhitungan
1. Kontrol (kloramfenikol 30 ppm)
a. Streptococcus mutans
1) 13 + (3,5 x 0,05) = 13,175 mm
2) 13 + (5,5 x 0,05) = 13,275 mm
3) 14 + (9 x 0,05) = 14,045 mm
4) Rata-rata : (13,175 + 13,275 + 14,45) ÷ 3 = 13,63 mm
b. Escherichia coli
1) 15 + (2 x 0,05) = 15,1 mm
2) 16 + (1 x 0,05) = 16,05 mm
3) 13 + (0 x 0,05) = 13 mm
4) Rata-rata : (15,1 + 16,05 + 13) ÷ 3 = 14,71 mm
2. Filtrat
a. Streptococcus mutans
1) Filtrat I
a) 7 + (5,5 x 0,05) = 7,275 mm
b) 9 + (6 x 0,05) = 9,3 mm
c) 8 + (0 x 0,05) = 8 mm
d) Rata-rata : (7,275 + 9,3 + 8) ÷ 3 = 8,19 mm
2) Filtrat II
a) 6 + (8 x 0,05) = 6,4 mm
b) 7 + (9,5 x 0,05) = 7,475 mm
c) 7 + (4 x 0,05) = 7,2 mm
d) Rata-rata : (6,4 + 7,475 + 7,2) ÷ 3 = 7,025 mm
b. Escherichia coli
1) Filtrat I
a) 8 + (0 x 0,05) = 8 mm
b) 9 + (5 x 0,05) = 9,25 mm
c) 10 + (1 x 0,05) = 10,5 mm
d) Rata-rata : (8 + 9,25 + 10,5) ÷ 3 = 9,25 mm
2) Filtrat II
a) 9 + (8 x 0,05) = 9,4 mm
b) 8 + (4 x 0,05) = 8,2 mm
c) 8 + ( 7 x 0,05) = 8,35 mm
d) Rata-rata : (9,4 + 8,2 + 8,35) ÷ 3 = 0,865 mm
3. Residu
a. Streptococcus mutans
1) Residu I
a) 8 + (2,5 x 0,05) = 8,125 mm
b) 10 + ( 7,5 x 0,05) = 10,375 mm
c) 7 + (3,5 x 0,05) = 7,175 mm
d) Rata-rata : (8,125 + 10,375 + 7,175) ÷ 3 = 8,56 mm
2) Residu II
a) 8 + (7 x 0,05) = 8,35 mm
b) 7 + (7,5 x 0,05) = 7,375 mm
c) 7 + (6,5 x 0,05) = 7,325 mm
d) Rata-rata : (8,35 + 7,375 + 7,325) ÷ 3 = 7,68 mm
b. Escherichia coli
1) Residu I
a) 5 + (2 x 0,05) = 5,1 mm
b) 4 + (7 x 0,05) = 4,35 mm
c) 4 + (9,5 x 0,05) = 4,475 mm
d) Rata-rata : (5,1 + 4,35 + 4,475) ÷ 3 = 4,64 mm
2) Residu II
a) 3 + (6 x 0,05) = 3,3 mm
b) 4 + (3 x 0,05) = 4,15 mm
c) 4 + (5 x 0,05) = 4,25 mm
d) Rata-rata : (3,3 + 4,15 + 4,25) ÷ 3 = 3,9 mm
IV.3 Gambar
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Isolasi sampel 10-3 (anaerob)Medium PDA
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Isolasi sampel 10-4 (anaerob)Medium PDA
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Isolasi sampel 10-5 (anaerob)Medium PDA
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Metode agar miringMedium PDA
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Peremajaan sampelMedium PDY
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Peremajaan sampelMedium produksi
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Pembenihan sampelFiltrat
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Pembenihan sampelResidu
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Uji aktivitas thd S. mutansMedium NA
LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS
Ket : Uji aktivitas thd E. coliMedium NA
BAB V
PEMBAHASAN
Mikroba endofit dapat didefinisikan sebagai mikroorganisme yang
hidup secara berkoloni pada jaringan internal tumbuhan tanpa
menyebabkan efek negatif bagi tumbuhan tersebut. Mikroorganisme
endofit dapat berupa bakteri ataupun jamur dan dinilai menjadi sumber
penting bagi zat berkhasiat. Banyak penelitian mengemukakan bahwa
mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat metabolit sekunder yang
sama dengan tumbuhan inangnya. Banyak peneliti percaya bahwa alasan
mengapa mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat yang sama
dengan tumbuhan inangnya adalah karena rekombinasi genetik yang
terjadi antara mikroorganisme endofit dengan tumbuhan inangnya dalam
waktu yang lama. (1:3)
Keuntungan besar dari fakta tersebut tentunya berefek pada
masalah ekonomi. Masalah penyediaan lahan, lamanya waktu menanam,
standardisasi bahan baku dapat teratasi. Sebagaimana mikroorganisme
lainnya, mikroorganisme endofit tidak memerlukan lahan yang luas untuk
dapat menghasilkan zat kimia yang sama dengan tumbuhan inangnya,
selain itu waktu panennya pun lebih cepat. Pertumbuhan mikroorganisme
endofit yang dikontrol di dalam laboratorium memudahkan
standardisasinya. Efek selanjutnya adalah pada turunnya harga produk
yang dihasilkan nantinya. Namun tentunya tidak semua mikroorganisme
endofit dapat menghasilkan zat metabolit sekunder yang sama dengan
inangnya. Oleh karena itu proses penelitian lebih lanjut pun tetap
diperlukan. (1:7)
Mikroorganisme endofit memiliki potensi yang besar untuk
digunakan sebagai sumber zat kimia bahan alam yang memiliki khasiat
farmakologis maupun mengobati penyakit-penyakit infeksius. Meskipun
jalan menuju pemanfaatannya secara optimal masih panjang namun
secercah cahaya harapan tersebut masih ada. (2:6)
Dalam percobaan yang dilakukan, dipergunakan sampel tanaman
Tapak Liman (Elephantopus scaber), dan akan diisolasi fungi yang
bersifat antimikroba. Dalam proses pengisolasian dan pengujian aktivitas
mikroba endofitnya, dilakukan dalam empat tahap, yaitu :
1. Pengambilan dan pengolahan sampel
2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit
3. Peremajaan dan pembenihan
4. Uji aktivitas antimikroba
Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Pada tahap ini , sampel tanaman Tapak Liman(Elephantopus
scaber) dibersihkan, dipotong-potong kecil, disterilkan, dan dibuat
pengencerannya dari pengenceran 10-1 sampai pengenceran 10-5.
Sampel di sterilisasi permukaan dengan Alkohol dan NaOCl dengan
tujuan memperoleh mikroba yang betul-betul mikroba endofit dan tidak
tercampur mikroba epifit yang berasal dari luar permukaan tumbuhan.
Alasan penambahan alkohol dan natrium hipoklorit (NaOCl):
1. Penambahan alkohol pertama berguna sebagai surfaktan untuk
melarutkan zat-zat yang bersifat hidrofobik pada permukaan daun
2. Penambahan natrium hipoklorit adalah sebagai sterilisasi
permukaannya
3. Penambahan alkohol kedua berguna untuk menghilangkan sisa
natrium hipoklorit dan untuk menghilangkan alkohol sisa dari untuk
menghilangkan natrium hipoklorit digunakan aquadest atau air
suling sehingga diperoleh biakan.
Isolasi dan Pemurnian Mikroba Endofit
Pada tahap ini, 1 mL dari 3 pengenceran terakhir dimasukkan
kedalam cawan petri. Dan ditambahkan medium PDA dan setelah
diinkubasi koloni terpilih yang memiliki zona hambat kembali
diinokulasikan pada medium PDA hingga diperoleh koloni yang terpisah
kemudian yang diinokulasikan kembali medium PDA miring untuk
diperoleh stok koloni murni.
Peremajaan dan Pembenihan
Pada tahap ini, koloni murni yang diperoleh diinokulasikan ke
medium PDY (Potato Dextrose Yeast). Hal ini bertujuan untuk
meremajakan mikroba yang diperoleh.setelah itu, koloni yang tumbuh
dalam medium PDY diinokulasikan ke dalam medium produksi kemudian
diaerasi pada shaker selama tujuh hari. Hal ini bertujuan untuk
membenihkan mikroba sehingga jumlah sel meningkat atau bertambah
banyak. Setelah diinkubasi, medium produksi tersebut diendapkan untuk
memisahkan antara filtrat ( hasil dari sentrifus yang berada di bagian atas
karena memiliki berat jenis yang ringan dibandingkan residu yang
merupakan sel mikroba dan filtrat ini merupakan hasil metabolit
sekundernya ) dan endapan/residu.
Tujuan diinokulasikan terlebih dahulu ke medium PDY kemudian
ke medium produksi adalah untuk meningkatkan jumlah mikroorganisme
yang didapat. Sementara tujuan dari medium PDY dan medium produksi
diinkubasi sambil dishaker adalah untuk membantu mengeluarkan
senyawa-senyawa yang kita butuhkan dari sampel dan untuk aerasi agar
diperoleh O2 pada medium. Dimana medium produksi mengandung
senyawa polimer rantai panjang, yang bertujuan untuk menghasilkan
eksoenzim dari dalam sel mikroorganisme sehingga akan menjadi
prekursor timbulya metabolit sekunder.
Sedangkan pengendapan dilakukan dengan tujuan untuk
memisahkan filtrat (metabolitnya) dan sel mikroba sebagi residunya dan
kemudiaan yang diambil adalah hasil filtratnya yang didalamnya
terkandung meetabolit-metabolit sekunder.
Pengujian Aktifitas Mikroba
Pada tahap ini, digunakan biakan Streptococcus mutans dan
Escherichia coli untuk pengujian aktifitas mikroba endofit yang diperoleh.
Biakan ini dipilih karena merupakan bakteri yang banyak digunakan dalam
pengujian daya antimikroba karena merupakan bakteri yang memiliki
ketahanan lebih tinggi terhadap bahan kimia yang berupa bahan
antimikroba dibandingkan dengan bakteri lainnya. Pada Medium NA yang
telah berisi biakan dimasukkan paper disk yang masing-masing telah
diresapkan dengan 20 µL endapan/residu. Kemudian setelah diinkubasi
selama 1 x 24 jam pada suhu 370C, diamati daya hambat mikroba endofit
terhadap biakan yang ditanam.
Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, ternyata diperoleh
isolat fungi endofit dari sampel tanaman tapak liman (Elephantopus
scaber) berbentuk bulat yang berwarna putih keabu-abuan dengan
permukaan yang melengkung dan hifa vegetatif yang bersepta dan
tersusun teratur. Dan setelah dilakukan uji aktivitas ternyata isolat tersebut
memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan dari
biakanStreptococcus mutans dan biakan Escherichia coli.
Medium produksi berfungsi untuk membenihkan sel-sel mikroba
yang sebelumnya telah diperbanyak pada medium PDY (Potato Dextrose
Yeast). Selanjutnya, metabolit-metabolit yang ada di dalam sel
mikroorganisme dikeluarkan ke dalam medium produksi yang dibantu
dengan adanya aerasi dengan pengocokan.
Pemaksimalan produksi metabolit-metabolit sekunder dapat
dilakukan dengan pengembangan dan perbaikan faktor-faktor yang
mempengaruhi proses fermentasi. Pada prinsipnya kondisi lingkungan
seperti pH, suhu, dan aerasi, kandungan nutrisi dalam medium juga
sangat mempengaruhi pola pertumbuhan dan proses fermentasi.
Salah satu cara peningkatan produksi metabolit adalah dengan
ultrasonifikasi, yaitu proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan
enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Proses
pemecahan sel ini dilakukan dengan cara keras, yaitu menggunakan alat
ultrasonikator dengan kuat getaran 16 rms selama 20 menit. Prinsip dari
alat ultrasonikator adalah menggunakan getaran ultrasonifikasi untuk
memecah sel. Selama proses ini, fungi hasil inkubasi harus diletakkan di
dalam beker gelas yang berisi air dingin, hal ini dilakukan untuk
menstabilkan suhu karena proses pemecahan sel dengan metode ini
dapat menghasilkan panas (kalor) sehingga dikhawatirkan akan merusak
enzim ekstraseluler yang dihasilkan.
Senyawa dari sampel daun tanaman Tapak Liman (Elephantopus
scaber) yang berkhasiat sebagai antibakteri dan antiradang adalah
sesquiterpenoid lactone, utamanya terhadap bakteri Staphylococcus
aureus.
BAB VI
PENUTUP
VI.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa
terdapat satu isolat fungi endofit dari tanaman Tapak Liman
(Elephantopus scaber) yang berbentuk bulat yang berwarna putih keabu-
abuan dengan permukaan yang melengkung dan hifa vegetatif yang
bersepta. Isolat fungi tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans dan Escherichia coli.
VI.2 Saran
Diharapkan kepada asisten agar senantiasa mengawasi praktikan
saat melakukan percobaan.
DAFTAR PUSTAKA
1. Khairani, G. 2010. Isolasi dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit
Penghasil Hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari Akar Tanaman
Jagung (Zea mays). Medan: Universitas Sumatera Utara.
2. Prihatiningtias, W. dan Mae Sri Hartati W. 2010. Prospek Mikroba
Endofit sebagai Sumber Senyawa Bioaktif. Yogyakarta:
Universitas Gadjah Mada.
3. Haniah, M. 2008. Isolasi Jamur Endofit Dari
Daun Sirih (Piper betle L.) Sebagai Antimikroba Terhadap Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, dan Candida albicans. Malang:
Universitas Islam Negeri Malang.
4. Dirjen POM. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta:
Departemen Kesehatan RI.
5. Dirjen POM. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta:
Departemen Kesehatan RI.
6. http://www.plantamor.com
7. Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi, Menguak Dunia Mikroorganisme.
Bandung: Yrama Widya.
LAMPIRAN
I. Komposisi Medium
1. PDA (Potato Dextrose Agar) 4. Medium produksi
Kentang 200 gram Glukosa 20 gram
Dekstrosa 10 gram Dekstrosa 1 gram
Agar 20 gram Pati terlarut 10 gram
Aquadest ad 1000 mL Tepung kedelai 25 gram
2. PDY (Potato Dextrose Yeast) NaCl 2 gram
Kentang 200 gram Extract yeast 1 gram
Dekstrosa 10 gram Aquadest ad 1000 mL
Extract yeast 4 gram
Aquadest ad 1000 mL
3. NA (Nutrient Agar)
Extract beef 3 gram
Pepton 5 gram
Agar 15 gram
Aquadest ad 1000 mL
Dibersihkan, dipotong-potong kecil Disterilkan
Dicelup dlm alkohol 70% selama 1’
Disterilkan
Dicelup dlm NaOCl selama 5’
Disterilkan
Dicelup dlm alkohol 70% selama 30’
Disterilkan
Dicelup dlm alkohol 70% selama 30’
Dihaluskan Ditimbang 10 gram
Dilarutkan dlm 90 mL air steril
Dibuat pengenceran 10-1-10-5
10-1 10-2 10-3 10-4 10-1
Diambil 1 mL dari masing-masing pengenceran
10 mLPDA
Diinkubasi selama 2-5 haripada suhu kamar
Amati koloni dan zona hambat
Diambil 1 ose koloni
10 mLPDA
Diinkubasi selama 3 haripada suhu kamar
Diambil 1 ose koloni terpisah
Agar miring PDA
Diinkubasi selama 3 haripada suhu kamar
Stock koloni murni
II. Skema Kerja
1. Pengambilan dan pengolahan sampel
2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit
Stock koloni murniPDA
1 ose
Diinkubasi selama 3 haripada suhu kamar
25 mL PDY
1-2 ose
Diinkubasi selama 3 haripada suhu kamar (shaker)
Pipet 1 mL
100 mL med. produksi
Diinkubasi selama 7 haripada suhu kamar (shaker)
Sentrifuge
Filtrat Residu
Pipet 20 µL
3. Peremajaan dan pembenihan
4. Pengujian aktivitas mikroba