laporan biokim isolasi DNA kromosom aman's
Click here to load reader
-
Upload
mhd-aliaman -
Category
Documents
-
view
56 -
download
3
description
Transcript of laporan biokim isolasi DNA kromosom aman's
Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Selasa, September 2013
Biokimia Waktu : 09:00-10:40 WIB
PJP : Syaefudin,M.si
Asisten : Lusianawati,S.si
Resti Siti Muthmainah,S.si
ISOLASI DNA KROMOSOM
Kelompok 2
Mhd Ali Aman.Siregar J3L112002
Indryani Rahayu Kuswardhani J3L112080
Emilia Anisa J3L112153
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR
2013
Pendahuluan
Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan
populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen ( Surzycki, 1936 ).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana
dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik
secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi (Zubaidah
2004). Isolasi DNA kromosom secara umum dibagi atas 3 tahap yaitu pemecahan sel atau
jaringan/sel dilisis untuk membebaskan isinya, ekstrak sel diberi perlakuan untuk menghilangkan
semua komponen kecuali DNA,dan pemekatan larutan DNA yang telah diperoleh (Benyamin
1960).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pemecahan dinding sel secara
mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil.
Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair
dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang
berisi DNA (Machmud, 2006).
Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu
fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975).
Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya
dapat diketahui (Miller 2000). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi
terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi
yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisis dari substansi ini berada pada lapisan atas
dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki
bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan
warnanya lebih keruh. Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel
utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk
memisahkan molekul-molekul yang perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul
tersebut seperti molekul protein, DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida
ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan 1.75-1.8 g/Ml (Collen et al 1996).
Tujuan
Percobaan bertujuan menunjukan sifat dan struktur DNA memlalui proses isolasi
Alat dan Bahan
Alat alat yang digunakan yaitu Pipet mikro,corong pisah, mortar,tabung reaksi,gelas piala
100 mL, pisau, Sentrifus kecepatan tinggi, tabung sentrifius, Penangas air.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu Umbi bawang merah, NaCl, Larutan lisis, SDS 10%,
Buffer elusi/buffer TE, dH2O steril, larutan EtOH.
Prosedur percobaan
Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8,0 yang
mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl
pH 8,0 yang mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan disimpan di pendingin.
Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan
menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan 2,5 gram garam dapur digerus
sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan
SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath
selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es
sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian
ditambahkan 0,5 gram protease, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian
larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan
dipindahkan ke dalam 4 tabung baru. EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi
tabung. Kemudian, tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5
menit. DNA kromosom akan mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai
benang-benang putih. DNA kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan
sesedikit mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5
mL. Keempat tabung disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-
hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom. Resuspen
pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi kembali selama
1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah
kering, buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.
Data dan Hasil Percobaan
Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang
Larutan A 280 A koreksi [DNA] [RNA] [DNA/RNA]
Blanko (TE)
Sampel 1
Sampel 2
Pembahasan
. Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom
dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara umum
isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan sel atau pelisisan sel,
menghilangan komponen lain selain DNA kromosom, dan pemekatan larutan DNA yang
diperoleh (David et al. 1983).
Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal
ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk
diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Prinsip dari proses
isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom dari komponen-komponen sel lain.
Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.
Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada
ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase
(yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya
ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 60°C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi
DNA (DNase). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi
dengan air (Brush 1994).
Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada praktikum kali ini.
Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan
umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah
diisolasi. Beberapa pereaksi digunakan dalam proses isolasi DNA kromosom dari umbi bawang
merah, diantaranya garam untuk melarutkan DNA, larutan lisis yang berfungsi melisis dinding
sel, SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan protein
merusak interaksi polar pada membran sel, penambahan alkohol dingin berfungsi untuk
mengikat DNA dan membentuk suatu matriks kental seperti lem putih akibat pemekatan DNA,
dan larutan buffer TE atau dH2O untuk merutkan DNA kromosom.
Garam yang digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat menyebabkan menyebabkan
DNA menjadi larut karena ion Na + mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif
fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu
sama lain sehingga pada saat ion Na + membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal
ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990).
Penambahan alkohol dingin pada ekstrak ekstrak sel melalui dinding tabung akan
membentuk gumpalan putih. Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah
terkumpul kerena pemekatan oleh garam. Hal ini karena kerapatan alkohol lebih kecil
dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi.
Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang
terapung di atas filtrat.
Benang-benang DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan
dalam tabung eppendorf 1.5 ml untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm.
Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein
ataupun RNA. Pemisahan dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA
kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah
disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA
kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril.
Simpulan
Berdasarkan hasil percobaan uji ketengikan menunjukkan hasil positif untuk minyak
kelapa tengik, minyak kelapa,margarin, sedangkan lemak hewan dan margarin menghasilkan
hasil uji yang negative dan ketengikan dipengaruhi oleh oksidasi,kegiatan enzim,dan hidrolisis.
Uji salkowski menunjukkan hasil yang positif terdapat kolestrol, dan uji Lieberman Buchard
menunjukan hasil yang negatif.
Daftar pustaka
Brush A. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia.
David AM, Freyer GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First Course. New York: Laboratory Press.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.
Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow:
Prentice. Hall.
Robinson J.R. 1975. Fundamental Of Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell
Scientific Publication.