56

Lampiran 2

Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Coccinia grandis Roem

Buah Coccinia grandis Roem terlebih dahulu dikumpulkan dan dibersihkan dengan

cara dicuci. Setelah itu dipotong-potong, kemudian ditiriskan dan terlebih dahulu

dikumpulkan dan dibersihkan dengan cara dicuci. Setelah itu dipotong-potong, kemudian

ditiriskan dan dikeringkan dalam incubator dengan suhu 500 selama 2 hari. Kemudian

dihaluskan dalam bentuk serbuk dan ditimbang. Sampel yang telah halus diekstraksi

dengan metode maserasi yaitu dengan cara merendam sampel dengan pelarut etanol. Hasil

ekstraksi dipekatkan dengan rotary evaporator model RV06-ML 1- B (IKA) pada suhu

400 C sampai didapatkan ekstrak yang menyerupai sirup dan ditimbang kembali.

Hasil ekstraksi buah Coccinia grandis RoemSampel Berat Sampel yang dihaluskan Berat ekstrak yang dihasilkan

Coccinia grandis Roem 200 g 11,59 g

Untuk membuat larutan ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem dengan

konsentrasi 1000 µg/mL sebanyak 30mL dibutuhkan buah yang sudah melalui tahap

maserasi sebanyak:

1000 µg1mL

= x µg30 mL

x = 30000 µg

x = 30 mg

Selanjutnya 30 mg buah yang sudah dimaserasi tersebut dilarutkan dalam 30 mL

etanol, maka didapatkan larutan ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem dengan

konsentrasi 1000 µg/mL.

57

Lampiran 3

Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Coccinia grandis Roem

Dosis 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL,750 µg/mL dan 1000 µg/mL

Ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem dosis 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500

µg/mL,750 µg/mL dan 1000 µg/mL dibuat dengan mempersiapkan 30 mg kristal ekstrak

etanol buah Coccinia grandis Roem yang dilarutkan dengan 30 mL etanol, sehingga

didapat ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem dengan konsentrasi 1000 µg/mL.

Selanjutnya ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem dengan konsentrasi 1000

µg/mL tersebut diencerkan dengan buffer fosfat pH 7,4 dengan perbandingan yang sesuai

untuk membuat ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem dosis 100 µg/mL, 250 µg/mL,

500 µg/mL,750 µg/mL dan 1000 µg/mL dengan pelarut buffer fosfat pH 7,4. Dalam tabel

berikut dijelaskan secara rinci penambahan buffer untuk setiap pembuatan dosis ekstrak

etanol buah Coccinia grandis Roem.

EEC 100µg/ml 250µg/ml 500 µg/ml 750 µg/ml 1000µg/ml

EEC konsentrasi 1000 µg /mL

100 µg 250 µg 500 µg 750 µg 1000 µg

Buffer fosfat 900 µL 750 µL 500 µL 250 µL 0 µL

EEC= Ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem

58

Lampiran 4

Pembuatan Larutan Buffer Fosfat pH 7,4

Buffer fosfat pH 7,4 dibuat dengan mempersiapkan 1 M sodium dihydrogen phosphat

dihydrate (NaH2PO4.2H2O) dengan BM 156,01 (stok A) dan 0,2 M disodium hydrogen

phosphat anhydrous (Na2HPO4) dengan BM 141,96 (stok B). kemudian untuk menghitung

massa dalam gram yang dibutuhkan adalah dengan menggunakan rumus:

Berikut hasil perhitungannya:

Gram stok A 0,05 L x 1 M x 156,01 = 7,8 gram NaH2PO4.2H2O untuk 50 mL

aquadeionise

Gram stok B 0,025 L x 0,2 M x 141,96 = 0,71 gram Na2HPO4 untuk 25 mL

aquadeionise

Untuk membuat buffer fosfat pH 7,4 38, 75 mL stok A + 11,25 mL stok B dan 1 L

aquadeionise sehingga pH menjadi 7,4 dengan konsentrasi 50 mL.

Gram=V x M x BM

Keterangan:

V = Volume Aquadeionise (Liter)M = Konsentrasi Larutan (Molar)BM = Berat Molekul

59

Lampiran 5

Pembuatan Vitamin E

Dosis 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL,750 µg/mL dan 1000 µg/mL

Vitamin E dosis 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL,750 µg/mL dan 1000 µg/mL

dibuat dengan menggunakan DL Alpha tocopherol dengan merek MP 100g.

Untuk membuat larutan vitamin E dengan konsentrasi 1000 µg/mL sebanyak 30 mL

dibutuhkan vitamin E sebanyak:

1000 µg1 mL

= x µg30 mL

x = 30000 µg

x = 30 mg

Selanjutnya 30 mg vitamin E tersebut dilarutkan dalam 30 mL etanol, maka

didapatkan larutan vitamin E dengan konsentrasi 1000 µg/mL.

Selanjutnya vitamin E dengan konsentrasi 1000 µg/mL tersebut diencerkan dengan

buffer fosfat pH 7,4 dengan perbandingan yang sesuai untuk membuat vitamin E dosis 100

µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL,750 µg/mL dan 1000 µg/mL dengan pelarut buffer fosfat

pH 7,4. Dalam tabel berikut dijelaskan secara rinci penambahan buffer untuk setiap

pembuatan dosis vitamin E sebagai kontrol positif:

Vitamin E 100µg/ml 250µg/ml 500 µg/ml 750 µg/ml 1000µg/ml

Vit. E konsentrasi 1000 µg /mL

100 µg 250 µg 500 µg 750 µg 1000 µg

Buffer fosfat 900 µL 750 µL 500 µL 250 µL 0 µL

60

Lampiran 6

Pembuatan Larutan FeCl2

Larutan FeCl2 dibuat dengan mempersiapkan FeCl2.4H2O 2 mM dan BM 198,83.

Kemudian untuk menghitung massa dalam gram yang dibutuhkan digunakan rumus:

Berikut hasil perhitungannya:

FeCl2.4H2O 0,1 L x 0,002 M x 198,83 = 0,03977 gram = 39,77 mg

Jadi, diperlukan 39,77 mg FeCl2.4H2O untuk 100 mL pelarut aquadeionise.

Pembuatan Larutan H2O2

Larutan H2O2 dibuat dengan mempersiapkan Perhydrol (H2O2) 10 mM dan BM 34,02.

Kemudian untuk menghitung massa dalam gram yang dibutuhkan digunakan rumus:

Berikut hasil perhitungannya:

H2O2 0,1 L x 0,01 M x 34,02 = 0,03402 gram = 34,02 mg

Jadi, diperlukan 34,02 mg H2O2 untuk 100 mL pelarut aquadeionise.

Lampiran 7

Gram=V x M x BM

Keterangan:

V = Volume Aquadeionise (Liter)M = Konsentrasi Larutan (Molar)BM = Berat Molekul

Gram=V x M x BM

Keterangan:

V = Volume Aquadeionise (Liter)M = Konsentrasi Larutan (Molar)BM = Berat Molekul

61

Pembuatan Larutan TBA-Asetik

Larutan thiobarbiturat acid (TBA) yang digunakan adalah 0,67% dalam asam asetat

50% untuk membuat larutan TBA-asetik.

Dalam penelitian dibutuhkan larutan TBA-asetik sejumlah:

3 mL x 11 tabung x 3 kali pengulangan = 99 mL. Jadi akan dibuat larutan TBA-asetik

sebanyak 100 mL.

100 mL x 0,67% = 0,67 gram TBA

Caranya yaitu dengan menambahkan 0,67 gram TBA tersebut pada 50 mL asam asetat dan

50 mL aquadeionise, maka akan didapatkan 100 mL larutan TBA-asetik 0,67% dalam

pelarut asam asetat 50%.

Lampiran 8

1 mL liver homogenat

0,4 mL FeCl2

10 µL CCl4

3 mL buffer fosfat

Disentrifuge 6000 rpm selama 10 menit

0,4 mL H2O2

3 mL TBA-asetik

Didinginkan dengan air

Diinkubasi dalam inkubator 37oC selama 60 menit

1 mL suspensi

Dimasukkan dalam penangas 100oC selama 60 menit

1 mL suspensi

Dispektrofotometer dengan λ 532 nm

Vortex Vortex

Vortex

Vortex

Vortex

Vortex

Vortex

62

Kerangka Alur Kerja

Disiapkan ekstrak etanol buah Coccinia grandis Roem. (EEC) dan vitamin E

konsentrasi 1000 µg /mL dan buffer fosfat pH 7,4.

EEC I II III IV Vkonsentrasi 1000 µg /mL

EEC100 µg

EEC250 µg

EEC500 µg

EEC750 µg

EEC1000 µg

Buffer fosfat 900 µL 750 µL 500 µL 250 µL 0 µLDosis EMC 100µg/

ml250µg/ml 500 µg/ml 750 µg/ml 1000µg/ml

kontrol (+)Vit.E I II III IV Vkonsentrasi 1000 µg /mL

Vit.E 100 µg

Vit.E 250 µg

Vit.E500 µg

Vit.E750 µg

Vit.E 1000 µg

Buffer fosfat 900 µL 750 µL 500 µL 250 µL 0 µLDosis Vit.E 100µg/

ml250µg/ml 500 µg/ml 750 µg/ml 1000µg/ml

kontrol (-):Buffer Fosfat 1000 µL