Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12...

9
Lack of correlation between NF-kB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist CP55,940 Nina Erlandsson a,1 , Bernd Baumann c,1 , Oliver G. Ro Èssler a , Katrin Kaufmann a , Klaus M. Giehl b , Thomas Wirth c , Gerald Thiel a,* a Department of Medical Biochemistry and Molecular Biology, University of Saarland, Medical Center, Building 44, Homburg D-66421, Germany b Department of Anatomy, University of Saarland Medical Center, Homburg D-66421, Germany c Department of Physiological Chemistry, University of Ulm, Albert-Einstein-Allee 11, Ulm 89081, Germany Received 23 April 2002; accepted 3 June 2002 Abstract NF-kB is a transcriptional regulator that plays a key role in immunity, in¯ammation and programmed cell death. We generated a PC12 cell line termed PC12kBluc that contains an integrated NF-kB-responsive reporter gene to directly measure NF-kB activity. The ``classical'' activators of NF-kB, phorbol 12-O-tetradecanoate-13-acetate and tumor necrosis factor a, strongly induced NF-kB activity in PC12kBluc cells. Activation of NF-kB could be attenuated by preincubating the cells with the cAMP analogue dbcAMP or via expression of the superrepressor IkBaS32A/S36A. PC12kBluc cells were subjected to several apoptotic paradigms, including treatment with 6- hydroxydopamine, H 2 O 2 ,K 2 Cr 2 O 7 , MnCl 2 ,C 2 -ceramide or the cannabinoid receptor-1 agonist CP55,940. A simultaneous measurement of the NF-kB activity revealed that only administration of 6-hydroxydopamine or CP55,940 increased NF-kB activity. Using pharmacological and genetic strategies to attenuate NF-kB transcriptional activity, we demonstrate that the elevation of NF-kB activity by 6-hydroxydopamine and CP55,940 is not an integral part of the apoptotic signaling cascade in PC12 cells. # 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. Keywords: Cannabinoid receptor; 6-Hydroxydopamine; IkB; PC12 cells; Neuronal cell death; NF-kB 1. Introduction NF-kB is an inducible transcriptional regulator that plays a key role in immunity, in¯ammation and pro- grammed cell death [1,2]. NF-kB is a dimer composed of ®ve mammalian family members (Rel/p65, RelB, c-Rel, p105/p50 and p100/p52) in almost any combination. The prototypical NF-kB consists of a heterodimer of p50/p65 that resides in resting cells in the cytoplasm as a complex with one of the three inhibitory proteins (IkBa,IkBb or IkBe). Upon stimulation with a great variety of extracellular signaling molecules including cytokines, phorbol esters, viral infection or ultraviolet irradiation, the IkB proteins become de novo phosphorylated on critical serine residues by the IkB kinase complex. This process targets them for ubiquitination and degradation by the proteasome. The degradation of IkB results in the rapid translocation of NF-kB to the nucleus where NF-kB can stimulate transcrip- tion of NF-kB-responsive target genes. NF-kB represents a focal point for stimulus-transcription coupling, connecting extracellular signals with changes in gene transcription. Originally, NF-kB was identi®ed as a transcription factor speci®c for mature B-cell lines regulating immunoglobulin k light chain gene expression [3]. Subsequently, NF-kB was detected in many cell types including neurons which show either constitutive or signal-induced activation of NF-kB. Biochemical Pharmacology 64 (2002) 487±495 0006-2952/02/$ ± see front matter # 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. PII:S0006-2952(02)01228-5 * Corresponding author. Tel.: 49-6841-1626504; fax: 49-6841-1626500. E-mail address: [email protected] (G. Thiel). 1 These authors contributed equally to the study. Abbreviations: dbcAMP, N,2 0 -O-dibutyryladenosine-3:5-cyclic mono- phosphate; IBMX, isobutyl-1-methylxanthine; MTT, 3-(4,5-dimethylthia- zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; 6-OHDA, 6-hydroxydopamine; TNFa , tumor necrosis factor a; TPA, phorbol 12-O-tetradecanoate-13- acetate; TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase ¯uorescein-dUTP 3 0 - end labeling.

Transcript of Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12...

Page 1: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

���� �� ��������� ����� ����� �������� ��� �������� ������������ �� ���� �� ���� ��������������� ���

����� ��� ������!��������� �� �� ����� ������������ �������� ��""#$%&

���� '���������#�# ����� ��������#�# (���� )* +�,�����# -���� -��������#-��� .* )��� # /����� 0����# )���� /����#1

����������� ��� ��� � ���� ���� ��� �������� � ���� �� ���� �� ��������� ��� ��� ������� �� �� �� ��� ������ ����� !� "������ ���������� #������ �� ���� �� �������� ��� ��� ������� ������ ����� !� "������

����������� $��� �� ��� ���� ����� �� ���� �� ���� #������% ���� ��#���� !!� ��� &'(&!� "������

+������� �2 3��� �&&�4 ������� 2 5��� �&&�

��������

����� �� � ������������ ������� �� ���� � ��� ��� �� �������# ��6������� ��� ���������� �� ����* 0� �������� � ����

�� ��� ����� �������� �� ������� �� �������� ���������������� ������� ���� � ������ ������� ����� ������* /��

77�������88 �������� �� �����# ���� � ���)��������������2������ ��� ���� �������� ����� �# ������ ������� ����� ������ ��

�������� ���* 3������� �� ����� ���� � ������� � ������� ���� �� ��� ��� �� �3.� ������� � �3.� �� � � �!��������

�� �� �������������� 9���:2�3;:2 3* �������� ��� ���� �� <���� � ������ ������� ���������# �������� ������ ��� �

�����!���������# =�(�# -����(># .���# ����������� �� �� ����� ����� ��������� ������ ��""#$%&* 3 ���������� ����������

�� �� ����� ������ ������� �� ��� ������������ �� ������!��������� �� ��""#$%& ��������� ����� ������* ?����

������������� ��� ������ �������� � ������ ����� ������������ ������# �� ��������� �� �� ������� �� ����� ������

� ������!��������� ��� ��""#$%& �� �� �� ������ ��� �� �� ������� �������� ������� �� ���� ���*

� �&&� '������ :������ 9��* 3 ����� ��������*

*��+���, ����� ����� �������4 �=����!���������4 9��4 ���� ���4 ������� �� ����4 �����

� ���� ������

����� �� �� ������ � ������������ ������� ��

���� � ��� ��� �� �������# ��6������� ��� ����

������� �� ���� @�#�A* ����� �� � ����� ��������

�� B�� �������� ����� ��� ��� C+�;� "# +��# ��+�#

��&";�"& ��� ��&&;�"�D �� ���� ��� ��� ������* /��

��������� ����� ������� �� � ���������� �� �"&;� "

�� ������� �� ������ ��� �� �� ������� �� � �����!

��� ��� �� �� ���� ���� ���� ������� C9���# 9��� ��

9���D* ?��� �������� ��� � ���� ������ �� �!�������

�������� ������� �������� ��������# ���� � �����#

���� �������� �� ������� ����������# �� 9�� �������

����� �� �� ������������ �� ������ ������ ��������

� �� 9�� ������ �����!* /��� ������� ����� ��� ���

� �E�������� ��� ���������� � �� ���������* /��

���������� �� 9�� ����� �� �� ����� ���������� ��

����� � �� ������ ����� ����� ��� ������ ���������

��� �� ���������������� ���� �����* ����� ��������� �

���� ���� ��� ������������������ �������# ���������

�!������� ������ ��� ������� �� ���� �����������*

(�������# ����� ��� �����B�� �� � ����������� �����

�����B� ��� ����� ���� ���� �������� �������� ���

� ��� ����� ���� �!�������� @2A* :� ��E����# ��������

������ �� ���� �� ���� �������� ������� ����� ����

����� ��������� �� ������������� �������� �� �����*

���������� ����������� % C�&&�D %F>G%$"

&&& ��$"�;&�;H G ��� ���� ���� � �&&� '������ :������ 9��* 3 ����� ��������*

�99I : & & & � � $ " � C & � D & � � � F � "

1 ������������� �����* /�*I �%$� F%��� � "&%4

��!I �%$� F%��� � "&&*

%��� � �������, ����J����������������*�� C)* /���D*� /���� ������ ����� ��� �E��� � �� ����*

#����� �� ��, � �3.�# -#���)��� ��������������2I"������ �����

��������4 9�.K# ��� ���������!������4 .//# 2�C%#"�����������

L�����D��#"�����������L���� ������4 �(=M3# ������!���������4

/���# ���� �������� ����� �4 /�3# ���� � ���)��������������2�

�����4 /?�'�# ������ ���!��������� ���������� 6�����������?/� 2����� � ����*

Page 2: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

����� ��� ��� ������ �� � ������ �� �������# ��� �

�� ���������� �� ���������� ��� ����!���� �����*

/���# ����� �������� �� �� ����������� �����������

����� @%G A* ���������# �� ������� ������� ���������

�������� � ������ �� ���� @"GFA* 9� ��������# ����� ��

������� �� � ����� ���� �� �����* 9���������# ��������

������ ��� �����B���� ������� �� �"& ������� ����#

��������� �� ����� ���� � �� ������������� ��� ��

���� �������� @>A* /��� ������!��� ������� ������ ���

�� 77� �� ���������� �� ��� ��� ����88 @%A ����� � ����

��������� � ������� �� ������ ������ � �� ��������

����������� � � ����� ��� � ������� �� �������

������ �� �� ������� ����� ����������� �����* /�

������ ������ ������������� �������� �� �����# ���������� � ���� �� ��� ��� �� �������� ��������������� ������� ����* /��� �� ��� ��� ���� � ����

�������� �� ����� � ����!�� ���������* =���# ��

���� �� ���� ���� ������!�� ��������� ����# ��� �

�����!��������� C �(=M3D ��� �� ����� ����� �������

� ������ ��""#$%& ����������� ������� �� ����

��� ������� �����* 0� ������ ������� �������� �� ��

�������� �� ����� �� �� ��������� ��� �(=M3 ��

��""#$%& ������� �� ����*

� ��������� �� ����� �

.!. ����� ��

�#"�M�������#"����L�������������� ��������

������ C��� ����D# 2�C%#"����������L�����D��#"�

����������L���� ������ C.//D# =�(�# ������!����

������ C �(=M3D# ��� ���������!������ C9�.KD#

-����(># .���# ���� � ���)��������������2������

C/�3D# ��� ��������� ���� ��������� ���� :�����

3����� ������ )� =* /���� �������� ����� � C/���D��� ��������� ���� �������* ��""#$%& ��� ���������

���� �� ��������������# )%�F# ����� ��� ������

��� ����������� ���� ���� 9�������� )� =*

. . ���� �������

�������������������� ��+�.9���������������

�� ��� �&N ��� ��������� ����� �����# "N ��� �����

����� ��� ��� �����# �&& ?;�� ��������# �&& ��;��

���������� ��� � �. ������� � 2>� �� "N �(�* ����

��� C�� �& ��� �� ��:D ���� ����������� �� &*% ��

������ C%"& O# �"& ���D ��� �& �� �� ������ 2!������� � �� �� ������ �:O����* ������ 2!���� ������� ������������ ��������� ������� ����������� ��� ����

������ �� ���� ������ �� �� 9���������� ���������

������� �� �� ���� �� /3/3 �! @$A* ���� ��� ����

������ ��� �*& ��;�� ��������� ��� � ����� ����

����� �������� ��� ������ ��� ������ �������* /�

������� ������������� ����� ������ �� �����������# ��� ���� ������ � �� ������ �� �� �&" ���;��

��� ����� ���� �� +�.9 ������ ���������� ���

�&N ��� ��������� ����� �����# "N ��� ���������

��� ��� �����# �&& ?;�� ��������# �&& ��;�� �����

������ ��� � �. �������# ��� ���� ��� ��������*

/�� ��! ���# �� ������ ��� ������� � ����� ���

������ ��������� �&& ?;�� ��������# �&& ?;�� �����

������# � �. ������� ��� �N �����������* /��

��� ���� ���� ��� ��� � ������ �% �� ������# �� ������

��� ������� ��� �� ����� ���� ������ � �� ��� ��

��������* ��� ���� �������� �� ��� ��:# ������ ����

��� �L�� ����� ������� ���� ����� CP 2$>3D ���� ����

���� )� =*

./. 0������ ���� ������

���������� �������� ���� �������� �� ������ �� @�&A*

������ ������������ ���� ��������� ����� �� ��3

����� C������D* ���������� �������� ���� �!������� �� ����

������ ��� ���� ��� �� �� ������* /�� �!�������� ����

���� � ��� ���� ��� ������ ����� � ����� ���� ���*

.�. 0���� ��� ���� �������

/�� �������� ����� ����K @��A ��� � ���� ��� �� 3*

M��� .���# ���� =�������� ������ +������� �����#

:���# ?:3* /�� �!�������� ����� �.O�.3M�2 ������

��� 9���:2�3;:2 3 ��� � ���� ��� �� �* ������� @��A*

/�� 9���:2�3;:2 3 ������ ������ ��� �!����� ���

����� ��� �� =�� 9 ��� �� ����K# ��������� ������

����K�9���:2�3;:2 3* /�� ������!�'�� ���������

�� ��� ��� � ����� ���� )��� ����# :������ ?���

������# ?:3* ��� ���� ��������� ��� �������� ������

��������� � �� ������ �������� � )* ����

C���*�������*���;�����;����;��������*��D ����� ��

������ ������������� ���������* O��� ���������� ����

�������� >� �� ���� ����������# B���� ������ � %" ��B��# ��� ���� � ����� ������ ��� �� �� �������� ��

F ��;�� ��� ���� � 2>�* :�! ����� ��� �� ������ ���

�������# �� ��� ���� ������� ��� ����� ������

������# ��� ������ ��� >� �� ����� ������ �������

������ ��������� &* ��;�� )%�F* .��� ���� �� �� �

���������� ���� ������ ��� ���� ��� � �!�������� ��

����� � ������� �� ����� ��� �� �����B� ���� ������*

.1. ���� ��� ������ ��� ������ � ����� � ���2���

��� ���� ������ �� E���������� � �� ������ ��

�� �&% ���;�� �� $ ��� ���� �� ���������������

������* /���� ���� ����� ���# �� ������ ���

�������# ������� � ����� ��� ������ ���������

�&& ?;�� ��������# �&& ��;�� ����������# � �. ���

����� ��� �N �����������* /�� ��� ���� ���� ���

��� �% �� ��� �� ������ ��� ������� ����� �� �������

��� �� �� ����!�� ���������* /�� ����������� ������

��� ��������� ���� ��������� � E����B����� �� ��

���� �� 2�C%#"����������L�����D��#"�����������L��

%FF -. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1

Page 3: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

��� ������ C.//D �������� � �����L�� ��� ������*

.// ������ C&*" ��;�� B�� �����������;��# ����

����� �� ��:D ��� ����� � ������ ��� ���� ��� ��� % ��

� 2>� �� "N �(�* ��� ���� ��� ��L�� �� �& �. =�

��������� �&N :M:# ��� �� ���� ���� ���� ��� �����

���� � 2>�* 3 ��� ���� ��� E����B�� �� � ���+��

.��� ""& �������� ������# ����� � �� �������� ��

"$" ��* 3��������# �� ������ ��� ������� �������

�� % �� ���� ���� ��� �� .// ������ ��� �&& �� ��

M.:( ��� ����� � ���� ��* /�� �����L�� ��� ������

���� ��� ��L�� ��� �" ��� ��� E����B�� �����������

������� �� ������ ��* .//��������� ��� �!������� �� �

��������� �� ������* 3������ M�3 ����������� ���

��������� � ������ ���!��������� �����������

������� 2������� ��� /.+����� ��� �?/� C/?�'�D

����� �� 77�� ��� �� ���� ������� ��88 C+���� M����

������ )� =D ��������� � �� ������������ ������*

� �������

/.!. �� ����� � -8��� ��� � �� � $�! ���������� �� 9$# ��� 9-8�

/���� ��� ������ ������ � ���� �������� �� �����*.�� ���E����# �� �������� M�3� ������ ������ ��

���� �� �� �������� ��� �� �������� �� �� ������������

������ �� �����* ��������# ������� �� 9�� ���������

����� �� ���������� �� ����� ��� �� ������ ���

��������� ��� � ����� � �������� �� �����* �������������� �� 9��# ���������� �� ����� ��� �� ������ ���

������ �� ����� � �� ������ M�3 ������ ��� ���

�����E������ ��� �� �������� �� �����# � ���� �����

��� �������� ������� �� �������� �� �����* 0� ����

�������� �������� � ���� �� ��� ����� ���������!�������� � ������� �������� ����� ����� �� ���� �������* =����# �������� ������� ���� ����������� �� ����

�� ���� �� �� �������� �� ����� ����� �� ��* /���#

�� ���� � � � ������ ������� ����� ������ �������

���� ���� �� �� ��� ��� �!������� �������� ����

����* /�� ������� ���� �������� ����� � C/���D ��� ������ ������� ���� � ���)��������������2������

C/�3D ��� 77�������88 �������� �� �����* 0� ����

������ /��� ��� /�3 ������� �� �������� �� ������� �������� ���* ��� ���� ������ �� ���������������

������# ��� ������ �� � ��B��� ������ C����� ���

��� �����������D ��� �% ��# ��� ������� ��� /����� /�3 ��� �% ��* �� �!���� ���� �������� ��� ��

������ ������������ ��� ��������� �������� ���������*

���������� �������� ���� ������L�� � �� ������ ����

�������� �� �� �!���� ��� �!������� �� ��� ����;��

������* ���* � ����� �� �������� ��� �� �� ������

���������� ����� �����* 9� ���# /��� C���� ����D

��� /�3 C�� ����D ������ ������� ����� ������

�� �������� ���* /�� �������� ��� �� �� ����� ��

"&����*

/. . :����� � ������� ���� ����� �� ����; �

�������

��������# �������� �� ����� ��� ��� �������� ���

����������� �� �� �� ����������� �������� @%GFA* /�

��������� �� ���������� ���������� ������ ��� ��

����# �������� ��� ���� �� <���� � ������ ����������������# �������� ������ ��� ������!���������

C �(=M3D# =�(�# -����(># .���# ����������� �� ��

��� ������� ������ ��""#$%&* ��� ���� ���� ��� ���

�% �� ��� �� �������� ������������ �� ���� ���������

��� �� ����������� �������� ��������� ���� ��������

����� �� �������� ��.// � �����L�� ��� ������* 9� ���

�����# ������� ���L���� ��� ��� ������� � ��������

���� �3M�C=D��������� �������������� � ���� �

������ ������ ����� �����L�� �� ��� �� ��E����

������ �����������������* /�� ��� ��� �������� ��

���������� � �� ����� �� �����L�� ������ �� ��

� ����� �� �� ����!�� ��������* ���* � ����� �� �

����������� �� "& �. =�(�# 2G" �. -����(># � �. ��

.���# �& �. �� �����������# � �. �� ��""#$%&# ��

�&& �. �� �(=M3���� ������!�� ��� �������� ���*/�3 �� /��� ��� �� �!�� � ����!�� ������ ��

�������� ��� C��� �� �����D*

/./. � ��������� ��� ��� � ���� ����� ��� -8��� � ��)��# � �$11�'�( ������� $�! ����� �����

/�� �������� ���������������� ������� ���� ��

�������� ��� ����� �� � ������ ������� �� ���

�� ������ �� ��� ����� ��� ���� ������!�� ����

������* ��� ���� ���� ��� ��� F �� ��� ���� ����!�

���# �� �!���� ���� �������� ��� �� ������ ���������

�������� ���������* /������ �� �������� ��� �������� �(=M3 �� ��""#$%& ������� �����* /�� ��������� ��� �� �� ����� �� %"� ��� �&����# ����������

C���* 2D* �� �������� �� ����� ��� ������ �������

������ �� �������� ��� ��� =�(�# -����(># .����� ����������� C��� �� �����D*

���* �* /���� �������� ����� � ��� �� ���� ������� /�3 ������

������ ����� �� �������� ���* �������� ��� ���� ������ ��

��������������� ������ ��� ���� ��� ��������* /�� ������ ���

������� � ����� ��� ������ ��������� �� ����������� ��� ��

��� ���� ���� ��� ��� �% ��* /�� ����� ��� ������ ��� ������� ���

�� ��� ���� ������� ��� "& ��;�� /�3 �� �& �. /��� ��� �% ��*

�� �!���� ���� �������� ��� �� ������ ������������ ��� ���������

�������� ���������* ���������� �������� ���� ������L�� � �� ������

����������� �� �� �!���� ��� �!������� �� ��� ����;�� ������*

-. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1 %F$

Page 4: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

/.�. #������� � -8��� ��� � �� �� ��������

������������ �#�$ ��������� ��

��� ����� ��������� .93 ������ ���# �������� ���

�3.� ���� ��� ������� � ���� � ������������ �������

����� �������� @�2A* ��������# ��������� �������

��������� ��� ������� ������� ���������������

���������# �� ���������� �� ��������� �3.� ����

��������# ���� ����� � ���� � �������������� ������������ �� ����� �������� ��� �������� ��� @�%A*

0� ���� ������ �� �������� �� �� ��������� �3.�

����������� ������� ����� ������ �� �������� ���*��� ���� ������� ��� ��� �� �3.� ������� �� ����

�3.� ��� �� ���������������� ���� ��� 9�.K ��� %F ��

��� ��� ������� ��� ����� /�3# /���# �(=M3 ��

��""#$%& ��� F ��* ��� ���� ��������# �� �!����

�������� ��� �� ������ ��������� �������� ���������*

���* %3 ������ �� �� ��� ������ �� � �3.� ���

9�.K ������ ������� /�3 �� /����������� ���

�� ������* ��������# �������� �� ����� � �(=M3

�� ��""#$%& ��� ��B����� ���� ��� � �� �������� �� ��

��������� �3.� ����������� C���* %�D*

/.1. #������� � -8��� ��� � �� �� �;����� �

��� ������������� :����/ #3�/�#

/�� �������� ������� �� ����� ��E����� �����������

��� ��� �� ��E��� ���������� �� 9��* /���# �!���������� � ���������� � ���� �� 9�� ������� ����� ������ �

�������� ����� �� �� �������* /� ������� ����������� �!�������� �� ���������� � 9���:2�3;:2 3������ �� ������� ������ �������� ������ �� �� ������

������ ��������# �� ������� �������� ��� ��� �

����� ���� ��������� �������� 9���:2�3;:2 3# ���

���* �* 9������� �� �� ���� �� �������� ���* �������� ��� ���������� �� ����� ��� ������ ��������� �����������* /�� ��� ����

�!����� � =�(� C3D# -����(> C�D# .��� C�D# ����������� CMD# ���

������� ������ ��""#$%& C'D# �� �(=M3 C�D ��� �% ��* /�� ����!��

������ �� �� ������ ��������� ��� ��������� �����������������

� �� .// �����*

���* 2* 3������� �� ����� �� �������� ��� � �� ����!��

��������� �(=M3 ��� ��""#$%&* �������� ��� ���� ������ ��

��������������� ������ ��� ���� ��� ��������* /�� ������ ���

������� � ����� ��� ������ ��������� ����������� ��� �� ���

���� ���� ��� ��� �% ��* /�� ����� ��� ������ ��� ������� ��� ��

��� ���� ����� ��� F �� ��� ����� "& �� �&& �. �� �(=M3 C��

����D �� � �� � �. �� ��""#$%& C���� ����D* �� �!���� ���� ��������

��� �� ������ ������������ ��� ��������� �������� ���������*

���������� �������� ���� ������L�� � �� ������ ����������� �� ��

�!���� ��� �!������� �� ��� ����;�� ������*

���* %* '����� ��������� �3.� ������������ ���� � ����� ������ ��

�������� ���* �������� ��� ���� ������ �� ����� ��� ������

��������� �����������* ��� ���� ������� ��� ��� %F �� ��� &*� �.

� �3.� ��� &*� �. 9�.K* /�� �������� ��� ��������� ��� "& ��;��

/�3# �& �. /��� C3D# �&& �. �(=M3# �� � �. ��""#$%& C�D ��� F ��*

�� �!���� ���� ��������# �� ������ ������������ ��� �� ���������

�������� ���������# ��� �� ������ ��������� �������� �������*

%$& -. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1

Page 5: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

��������� ���������9���:2�3;:2 3 ���* 3� � ����

��# �������� ��� ���� ������� ��� ����� ����

����������� �������� �� �������� ��������� ����

C������������ ���D* /�� ������� ����� ��

9���:2�3;:2 3 ��� ���� �� ��� ������� ���

/�3 �� /���* ���* "3 C���� ����D ����� �� �!��������

�� �� �������������� ��B����� ����� �� /�3��������

������� �� ����� ������* ��������# /������������������� �� ����� ��� ������� �������* 9� ������#

�������� ��� �!�������� �� �������� ��������� ����

C������������D ������ � ����� �������� �� ������������ �������� �� �� ��� ��� ����� /�3 �� /���C���* "3# �� ����D* .�������# �������� �� ����� �

�(=M3 �� ��""#$%& ��� ��B����� ���� ��� � ��

����� 9��� ������ 9���:2�3;:2 3 C���* "� ��� �D*

/.�. 0�� -8��� ��� ��� � � ��)��# �

�$11�'�( ������ ���� ����� $�! ����� �����

?���� ������������� ��� ������� ���# �� ����

������ �������� �� ����� �� �� ������ ��� �� �(=M3

�� ��""#$%& ������� �� ����* 0� ���� �� ������!��

������ �� �(=M3 ��� ��""#$%& ����� ��������� ��

���������� �����* �������� ��� ���� ���� ��� ���

� �3.� ��� 9�.K ��� %F �� ��� ��� �������� ���

�(=M3 �� ��""#$%& ��� �% ��* /�� ����������� ������

��� ��������� ���� �������� ����� �� .// �����*

���* 3 ������ �� �� ��������� �� ����� ��� ��

���* "* '!�������� �� �� �������������� 9���2�3;:2 3 �� ����������� �������� �������� �� ����� �� �������� ���* ������������C�� ����D ��� ���������9���:2�3;:2 3 ��� C���� ����D ����

������ �� ����� ��� ������ ��������� ����������� ��� �% �� ���

������� ��� ����� "& ��;�� /�3# �& �. /��� C3D# �&& �. �� �

(=M3 C�D# �� � �. �� ��""#$%& C�D ��� F ��* �� �!���� ���� ��������#

�� ������ ������������ ��� �� ��������� �������� ���������# ��� ��

������ ��������� �������� �������*

���* * 3������� �� ����� ������ �� �(=M3 �� ��""#$%& �����

��� ���� �� �������� �� ����������� �������� ���������* C3D

�������� ��� ���� ������ �� ����� ��� ������ ��������� ���

��������* ��� ���� ������� ��� ��� %F �� ��� &*� �. � �3.� ���

&*� �. 9�.K ��� ��� �!����� � �&& �. �� �(=M3 �� � �. ��

��""#$%& ��� �% ��* ����!���� ��� ��������� �����������������

� �� .// �����* C�# �D ������������ C�� �����D ��� ���������9���:2�3;:2 3 ��� C���� �����D ���� ������ �� ����� ��� ������

��������� ����������� ��� �% �� ��� �!����� � �&& �. �� �(=M3

C�D �� � �. �� ��""#$%& C�D ��� �% ��* ����!���� ��� ���������

���������������� � �� .// �����*

-. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1 %$�

Page 6: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

����� �� �� �������* ��������# �� ����������� ������

��� ��������� ���� ������� �� 9���:2�3;:2 3 �!�����

���� ��� �� � ���� �� �(=M3 �� ��""#$%& ������

C���* � ��� �D* 0� ��� �� � ����� �����B��� �����������

�� �� ������!�� �������� �� �(=M3 �� ��""#$%& ��

���� ��� �!�������� ����� �������� �������������� ��

�� 9�� �������������� 9���:2�3;:2 3 C������� ���* �

��� � �� ��� ���� �����D* /���� ����� ������� �� ���

�� �� �� ������� �� �� �������� ������ ������� � �

(=M3 �� ��""#$%& �� ���� � ������� �� ����*

/� ���B�� ���� ���# �� ����L�� �� ����������� ��

�������� �� � ���� �� �� ������!�� ������� �

�(=M3 �� ��""#$%& ����� �� ������ ���!���������

������������������ �?/� 2������� ���� C/?�'�D

�����E��* ��� ���� ������� ��� ��� � �3.� ���

9�.K ��� %F �� ��� ��� �!����� � �(=M3 ��

��""#$%& ��� �" ��* ���* > ����� �� ��������� ��

������ ��� �� �� �������� �� � ����� �� �� ������!��

���������* 9 �� ����� ���� � �� �(=M3 ���

��""#$%& ���� �� ���* /�� ���� ����� ������ ��

/?�'� ������� �� ������ ���* �� �������� ��������

���� ��� ������ �� �� � ����� �� �� ����!�� �����*

/?�'��������� ��� ������� �� � ���� �� �(=M3 ��

��""#$%& ������# ������� �� ���� ���������

������� ������� �� ����* /�� ������� ���� ��

�������� ��� ��� � �3.� ��� 9�.K# �� ����� �

������ ����� ������# ��� �� ������ �� ����� ��

/?�'� ������� ���# ��������� �� �� ��� �� ����������� �� �� �� ��� ��������� �� �(=M3 ��� ��""#$%&

������� �� ����* /���� ��� ���� ���B���� ��

�������� ��� �!�������� �� 9���:2�3;:2 3 ����*

�������� ��� ���� �� � ���� �� �(=M3 �� ��""#$%&

������# ������ �� �!�������� �� 9���:2�3;:2 3C���* F# ���� �����D* 0� ��� �� � ����� � ���������� ��

����� 9���:2�3;:2 3 �� �������� ��������������

�!�������� �������� ���* /���� ������# ���� ���

���� �� �� ������� �� ����� ������ � �(=M3 ��

��""#$%& �� �� ��E����� ��� �� ������� �� ���� ��

�������� ���*

� ����������

/�� �������� �� ����� ��E����� ����� ����* .���

�� ���� ���� ���� �� �� ��� �� ������� � �!������ ��

�������� �� �����# �*�* ������������� �� 9��# ����������� �� ����� ��� �� ������ �� ������ �� ����� � ��

������ M�3 ������ ���* 3 �� ���� �������� ���

���* >* 3������� �� ����� ������ �� �(=M3 �� ��""#$%& �����

�������� ��� � ������ �3.� ����������� ���� �� ���

���������� �� ����* �������� ��� ���� ������ �� ����� ���

������ ��������� �����������* ��� ���� ������� ��� ��� %F �� ���

������ C�� �����D �� &*� �. � �3.� ��� &*� �. 9�.K C���� �����D

��� ��� �!����� � �&& �. �� �(=M3 �� � �. �� ��""#$%& ��� �" �� ��

��������* ����� ��� ��� ����� �� ��* ��� ���� ����L�� ����� ��

/?�'� �����E�� ��� /.+�� ��� ?/�* ����� ������ ��� �������

����� ����������� �� �� ���� ������� ��� �������*

���* F* 3������� �� ����� ������ �� �(=M3 �� ��""#$%& �����

��� � � �!�������� �� �� �������������� 9���:2�3;:2 3 ���� �� ���

���������� �� ����* ������������ C�� �����D ��� ���������9���:2�3;:2 3 ��� C���� �����D ���� ������ �� ����� ��� ������

��������� ����������� ��� �% �� ��� �!����� � ������ C��D# �&& �.�� �(=M3 �� � �. �� ��""#$%& ��� �" �� �� ��������* ��� ����

����L�� ����� �� /?�'� �����E�� ��� /.+�� ��� ?/�* �����

������ ��� ����������� ����������� �� �� ���� ������� ��� �������*

%$� -. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1

Page 7: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

��������� ��� ��E����� ��� � �� ��E��� �������� �� ���

��* ����������# ��� �� �� ���� � ����� �������� �� ��

����������� �� ����� ���������� �����# � ����� ����

���������� �������� �� ����� �������� �� ���� �

�����* 9� �������� �� �������� ������ ������ �� �

����������� ����� � M�3# �������� � �� � � ��

������ �����# ���� �� ���������� ����� �� ��������

������������ �������� ������ �� ��� ������* 0�

������# ��� �!����# � � � �� ������������ �� ��

������� ����� �� �� L��� B���� ����������� ����� '���

� ���� �����B��� � � )������ ��E����� �� �� �������

����� 99 �������# �� �����* =������# �� ���� ���# :��

���� ��� ��� ��� '���� ��� �� ������ � �� ��������

������ �� �� ������ ����� 99 ���� � ������ �����������

@�"A* ��������# �������� ����� ����� � � �� M�3;

������ ������ ������ ��� ����� ������������ �� ����

��� ���� �� ������� ����� ���� ��� ���� ��� �����@� A* /� ������ ������� �� �������� �� �� ������������

�������� ������ �� ����� �� � ���� �� �!������� ��

����!�� ������# �� �������� ���� ��� �������� ��

���������������� ��������� ������� ����* 3 �������

�������� �� �� ����� ������ ��� � ������ �� ���� ���

������� ������ ��� �� 77�������88 ����� ��������

/��� �� ���� � �����*

����� ��� ��� �������� � ������� ����� �� � ����

������� �� �� �� ����������� ������# ��������� � ��

�� ��� ��� �� ������� ��������* /�� �������� �����

�� �������� ����� ���������� �� � " �������� ����*

/���� ������ ���� � ��� �%;�" �� �� ������ �������

���# ��� � ������� �������� �� ��������� @�>A*

3���������# � "���B���� B �� ��� ��� ������� � �

/����������� �� ����# ������� ������� �� ������

����� ��� ��� �������* ��������# �� ���� ���� �� ���

�� � �!�������� �� � ��������������� 9��� ��������� �

������� ��������� � /������������ �� ���� �� �����

���� ������� �� ���� @�F#�$A* 9� �� ������� �����# ��

�������� �� ����� ��� ���E���� ��� �������� ��� ��

�������� ������� ������� @ A* =������# ����� ���#

����� ���� ������������# ��� ������ �� ���� @>A*

0� ���� ���� �� ��� �� ����� �� ������� �� ����

����� ������ ������� ���������# �������� ������

��� �(=M3# =�(�# -����(># .���# ����������� ��

�������� �� �� ����� ����� ��������� � �� ��������

��""#$%&* /�� ����� ������ �� ��� �!������ ��

�������� ��� � �(=M3 �� ��""#$%& ���������

����� ������ ������� � �������� ������� �� ����*

�(=M3 �� � �����!���� ��������� �� ��������# �� ��

������ ����������� �� ������ ��� ���������8� �������

@�&A* �(=M3 ������ � ����� ������� ����������� ��

������������ ������� �� �� �� ����� �����# ���������

�� �(=M3 �� � ������ ��������� ����� �� ��

��������� �� ������������ �������* =���# �� ������

�� �(=M3 ��B����� ������� ������� �� ���� ��

�������� ���* .�������# �� � ������ � �������

�������� �� ����� ������ ������� �!������ ��

�������� ��� � �(=M3* /� ���� �� ������� ���

�� ����� �� ������� �� ����# �� ���� �� ������� ����

�� �� ��� ��� � �3.� ��� 9�.K �� � �� � ������

����� ������* 9� �������# �� ������������� ������

��� ���������� ��� � ������ ������# �� �!��������

�� � ����������� � 9��� ���� �� �������� ���*

/���� �!�������� ����� ���������� �� �� ������

����� ������ �� �� ��������� ��� �(=M3�������� ��

����* 9� ������# �������� �� ����� ��� ��� ��������

� � ������� ��� ���������������� �������� �� ����

��� @��#��A* 9� ��� �� ���� ������# �������# �� ������������� � ����� M�3� ������ �������� ���� ����

����� ��� �� :�"& ������ ��� ���� � �������� ��� ���

�� �������� @��A* /�� ������ :�"&# ������� ���� ��

����� �� ��� �"&# ��� �������� ������ �� �� � ���

������ � ������ �� ����� �� ������ ����L����

��E����� �� ����� ��� ������� �� ���������� � ��

������ @�2A* =������# �� ������ ��� �� � �����B� ���

�����* +����# :�"& ��� ��������� ������ ��� ����

������� �� ��E���� ������ ����������# �*�* �� ����

�������� ������ :/3/# 3��� ��� ��3/ @�%A* 9� �������#

�� :�"& ������ ��� ��� ����� ����� �� ���� ���� ���

�� ������ �� �� �������� ����� C�* '��������# )*

/���# ���� ����� � ���������D* /�� ���� ���� ����

���������� � ���� � ����� �������� @��A* =������#

�� ����� �������� � ����� � � �� M�3� ������

�������� ���� ��������# ������ ����� �� �� ������

� ����� �� � ���������� �!�������� �� 9�� ������

��������� ����� @��A* 9� ������# �� ������ �������� ���

�� �������� � �(=M3 ��� � �� ��������� �� � ����

�� ��� ��������� �� �������� ���������������� �������� ����* ����������# ������ �� ���� �������� ������ � �3.� �� �� � �!�������� �� �� ��������������

9���:2�3;:2 3 ����� ��� ������ �� �������� ��

����� �������� ��� ����� ��� ����� ���� �(=M3�

������� �� ����* /���� ������# �� ������ ��� �� ��

������ � ��� �� ����� �� �� ������� �� ���������

�������� �� ����* +����# �� ��� �� �� ��5��

�������� ������ ������ �� ������� �� �������� �����

�$2 ��� ��� �������� ����� ������� @�"A ������� ��

��5�� ��� � ������� �� ����������������� �� ����*

3������� �� �� ��� ����� ����� ������� � �!������

�� �������� ��� ��� �� �����B� ������ ��""#$%&

������� ������� �� ���� ��� ����������� �������

�����* 3 ����� ������ ����� ����� �������� ���

�� ���� ���� �� � ����������# ��������� �� ��

�������� �� ����� � � �������� �� �� ��� ������� ��

�� ��������� ��� ������� �������� �� ��� �����* 9����

������# ����� ������ ���� ��� ������� � ������ ��5��

�������� ������ ������ ��� �2F �������������� ����

��� ������ @� #�>A# ������ ������� �� ��� ���E����

��������� �� ��� ������� �� ������� ��������* /����

����� ������� �� �������� �� �� ��� ������� ��

�������� ��� �� ������ � ����� �������� �������

�� �� ��* 3 ��������� �� ���� �������� ������� ��

��E����� �� ����� � ������� �� ����� ���� ������ �

�� ����*

-. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1 %$2

Page 8: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

�� �������� �� ����� ��� ������ �� ����������� �!����� � =�(�# -����(># .���# �� �����������*

:��� ������ ���� �������� � ��������� ����� =�(�

�� ����������� ������� �� ���� ��� ��������� ������������� @�FG2�A* =������# ����������� ��� ��������

�������� ���� ������� � ������ ������������� ����

��� ������� �� =�� & ����� ����������� ���# �

����� � ������ ����� @2�A* ��������# ��������� �

��������� ����� � ������ ����� ������ ���������� ��

����� �� ���������� �� 9�� �� 5���� / ���* �������

����# �������� ������ �� �� ��� ���� ��� ���� �

������������ �������� �� �����# ��������� ��# �� ��������# �������� ��� ��������� �� ������� ���� ���

�������� �� ����� @22A* 3 ���������� ������� ��

=�(���������� ����� ��������# ����� 5���� ���#

'�%*�(��� /���� ��� -� �������� ��� ������� ��

=�(� ������� ����� ��� �� 5���� ���# � �� �� ��

�� ���� �� ����* /���� ����� ������� �� �� �������

�!���� ���� �� ����� �������� ��� � �������� �

������ �� ���� @2%A*

/���� ������# �� ���� ���������� �� ��

�������� �� ��� �� ���� ���� � ��� ����� �����

�� ����� �������� �� � ���� �� �������� � �!���

����� �������� ������� �� �!������ � ����!��

�����* .�������# ���� ��� ��� ����� � ������� �� ���

��� �� ����������� �� �����8� ��� �� ���������� ��

����* 3������� ������ ��� �������� ���# �����

������ � �������L� ���� ���� �� �����# �� � ���������� � ��������� ������ ������ ���� �� ����� ���

����� �� ��� ������ ������!�� ��������*

�������� ������

0� ���� �*3* ������� ��� 3* M��� .��� ��� ����

����# )* ���� ��� �� ������!���� ��������� �� ���#

��� �* )������ ��� ������ ������� �� �� ���������* 0�

��� ���� ���� ������ ��� �!���� ������� ���������

�� �� /?�'��������* /��� ���� ��� �������� � ��

M������ ��������������������� CM�)D ������ :��

"2& C/�����<��� �"# � D ��� :�� %$> C/�����<�� ��D*

����������

@�A ��� :Q# ���� )�* ����� � �� ������ +'�� �������� ��� �����

������������* /����� )��� �$$$4�"I��$G2"*

@�A /�� ��# �������� ):* �����I � ��� ��� �� ���������� ��������* 5

��� 9���� �&&�4�&>I>G��*

@2A :�� +# ������� M* .���� ������ ������ ������ ��� �� ���

������ ��� �������� ��E������* �� �$F 4% I>&"G� *

@%A -���� .# ��� 3* ����� � �� ���������� �� ��� ��� ����* ��

9����� �&&�42I���G>*

@"A ����� .# )����� /M* ����� �� �������� � +�;����� ����

�������� ������* (������� �$$$4�FI $�&G�%*

@ A .���� .�# ������ �# Q� R�# �������� :* +��� �� ������ �����

�� �� ������� ������� ��� �������* 5 ��������� �&&&4>%I%%2G" *

@>A :�������� 3# .�����O�� � 3# 0��� �# O��� 5# 0��� /# :�����

������ .* ����� �� ������� ��� ������� �� ���� �� ���� ���� ��

��������* �� .�� �$$$4"I""%G$*

@FA M��� 3# 0��� /# ������� �* ����� ����������� ������I ������

�������� �� ������������ ��� ������� �������* ������� )����

����� +�� �&&&4��I2&2G�&*

@$A -����� 3# -���� �# .��������� +# ����� =# 0��� /# ������� Q*

3 ��� ��� ������ ����� �� ������������� ���������� �� �� 9������* �� )��� �$$ 4�2I%2"G%�*

@�&A /��� )# -������� -# .���� 3# ���L .# ���� -# ������ .* /��

����� ������������ ��������� ������ �3��I �!�������� ��� ���

����� ������* ������� ������� 3�� �&&&4�%$2I�F$G2&�*

@��A .��� 3M# +����� )5* 9������� �������� ������ ��� ���� �������

��� �!��������* ��������E��� �$F$4>I$F&G$&*

@��A /�������� '��.# ��� =�# =���� /# :����� -�# 0�� :# �������

�3* ������������� �� ����� 9���� �� ������� 2� ��� 2 ������

9���� ��������� ��� ����� �������� �� �������� � ������� �����*

'.�( 5 �$$"4�%I�F> GF2*

@�2A -������ �5# 0� .* 9��� ��� �� ������ �������� �������� �

�3.� �������L�� ������������������� ����� �����������������

������������� �!��������* ������� 5 �&&�42" I"�"G2&*

@�%A M����� .# )���� M* O�������� ������� ��������� ��� �������

������� ��������������� ��������� ���� � ������ ����������������� ���� �������� � ����� ���� �� ����� �������� ��

��� /=���* 5 ��� ���� �&&�4�> I2 $GF&*

@�"A �������� M# /��� )* +�� �� L��� ������ ������� :�� ��� L��� F;����

� �� ������������ �������� �� �� ����� ������ ����� 99 ����* '��

5 ������� �$$ 4�2$IF�>G2%*

@� A )���� 55# ���������������� �# ����� �M* ����� ����� ����� ������

��� �� ������ ����� �� ������ �� �>" ������� �� �� �����������

����� �� +��� :�������� ���* 5 ��� ���� �&&&4�>"I>""FG "*

@�>A ��� 33# :�� 0�# ������� +/# )���� :# ������� M* '� ������

����� ��� ���� ����������� �� ���� ������ �� +�3 ��������

�� �����* ����� �$$"42> I� >G>&*

@�FA ��� 33# ������� M* 3� ������� ��� ��� ����� �� ��������� /���

��������� �� ����* :������ �$$ 4�>%I>F�G%*

@�$A O�� 3����� M5# .���� :5# -���� /# )���� M+# O���� 9.* :�������

���� �� /���� ������� �������� � �����* :������ �$$ 4�>%I>F>G$*@�&A )���� Q# )����� .# Q�����.�* .�������� �� ������!���������

������!����* 5 ����� /����� �$$>4"&C:���DI""G *

@��A ���� =# ���L��� 3# M��� M# .����� '# (���� M* 3������� ��

������ ����������� ����� ����� � C�����D �� ������� ��� �����

������������ �������� �� ���� ���* 5 ��������� �&&�4>>I2$�GF*

@��A ��� M# /���� :# ������ .��# O���� 5�.* �=����!����������

������� ������ ����������� � �������� �� ���� ���* �������

�������� �&&�4 �I%>2GF�*

@�2A ��� Q�R# Q�� :Q# O���� +3# /�������� /+# =������ 5* 9��� ���� ��

������ ���������� �� ����������� ����� ����� � � �������

������ ��������� � �� ��� ����������� � ���� ��� ������

����L���� ��E�����* 5 ��� ���� �$$"4�>&I�%�""GF*

@�%A /�������� /+# ������ 3M# M������ 5�# ��� Q�R# =������ 5* +���

����� �� �����# 3���# ��3/# ��� :/3/� ������ ����� �� /

��������� � ����������� ������� �� ������ �������� �� ������

����L���� ��E����� �� ����� �"&* 5 9����� �$$F4� �I &F%G$�*

@�"A ��� Q# ?������ =# 0��� K# 3 � +# +�� ):* M������� �������

�������� ������ �� �!�������������� :3�-;5�- �������� ����

���* 5 ��� ���� �$$F4�>2I2>" G %*

@� A +���� M# )����+����� 9# =��� 3# )�L��S� .* /�� ��� ����� �����

������� �� ������ � �� �������� �� ��<�� �������� ������* .�

�������� �&&&4"FIF�%G�&*

@�>A M���������� �# ����� �# ��������� .# )���� 5�3* ����� ������

������ �2F �������������� ������ ������ ������ ��� ��������

�� �����������* 5 ��������� �&&�4>>I$">G &*

@�FA :������ +# +�� �� �# ������� �3* +������ �!���� ����������� ��

�������� ����� ���� ���������� �� �� �������� �� �� ���������������� ����� ��� =9O��* '.�( 5 �$$�4�&I��%>G"F*

%$% -. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1

Page 9: Lack of correlation between NF-κB activation and induction of programmed cell death in PC12 pheochromocytoma cells treated with 6-hydroxydopamine or the cannabinoid receptor 1-agonist

@�$A M���� 3# =����� :�# =������� /)# ?������ .# M��,�� 0# :����L

.�* =������� ����!����������� �������� �� �M$"�����������

��E����� �� ������ �� ������������������� ������� �!���� �������

��� �� �������� �� �����* (������� �$$$4�FI>%>G">*

@2&A )� 5:# 0��� ��� 35* �������� ������� ������������� ����

���� �������� �� ������� ��������* ����� �� M�� �&&&4>I

%%FG �*

@2�A .���� :-# :�� �-# 3������ ��* ������ ������� ������ �" �� ��

��E����� ��� ���������������� � �� ���� �������� �������������

�������� �� �����# 3���# 5�-# ��� ��������* 5 ��� ����

�&&&4�>"I�2�$>G2& *

@2�A 0������ 5# �������� 3'# M �� � )# =����� Q3# ������� M3*

�������� ������� �� ������������� ������ �������* 5 ��� ����

�$$"4�>&I�� F$G$�*

@22A )����� �5# M �� � ):# ��� �# ( ��� �.# =����� Q3* :������

��������� �� �������� �� ��������������� ��������* ��������

���� �� ���� � ���� �������� �� ������ ����� ��* 5 ��� ����

�$$>4�>�I� %>%GF�*

@2%A ������� �# (8��� �35* '����� �� �!����� ��� ����!����� ��

������ ����� �� �������� �� ���� �������� �� ����I ��������

������ � �������� ��������� �������� �!���� �������* �������

������� 3�� �$$"4�� &I� >G>"*

-. %�������� �� ��. 3 � ���� ��� $��������� �� 4 (( 5 �&67�'1 %$"