Lo studio prenatale dei cromosomi fetali: esame citogeneticoesame citogeneticostandard standard vs arrayarray

Laboratorio di Genetica Medica

standard standard vs arrayarray

Bologna, 06 Giugno 2014

Giorgio Lucci

La citogenetica classicaLa citogenetica classica

Inizio della citogenetica umana moderna

Tjio e Levan, nel1956, stabilirono ilnumero corretto dei cromosomi umani,46,principalmente grazie ai miglioramentitecnici delle procedure di preparazionedeicromosomimetafisici.deicromosomimetafisici.

Ciò permise l’identificazione dei cromosomi individuali el’associazione diparticolari disordini genetici con specifici cromosomi.

La citogenetica classicaLa citogenetica classica

- Duranteil “ periodo trisomico” : attenzione a pazienti con anomalie congenite :si scoprì chepazienti consindrome diDown possedevano un cromosoma 21 addizionale(Lejeune et al.(1959)Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. Compt Rend 248:1721-1722).

- Vennero scoperte altre trisomie, quali la trisomia 13 (sindrome di Patau), la trisomia 18(sindrome di Edwards) e descritte inoltreanomalie numerichecoinvolgenti i cromosomisessualiassociatia specifici fenotipi clinici (45,X0 sindromedi Turner; 47XXY sindromedisessualiassociatia specifici fenotipi clinici (45,X0 sindromedi Turner; 47XXY sindromediKlinefelter).

- Gli ulteriori avanzamenti portarono all’“era del bandeggio”: il pattern di bande orizzontali,con diversa intensità di colorazione, risultano esserespecifiche per ogni cromosoma,permettendone il riconoscimento. Ciò permise di studiareriarrangiamenti strutturaliassociati a specifiche sindromi genetiche.

- Col tempo le tecniche di bandeggio si sono raffinateed è aumentato il livello di risoluzione alquale possono venire studiati i cromosomi.

Il cariotipo standardIl cariotipo standard

Vantaggi:

Visione d’insieme dell’intero genoma

Individua anomalie strutturali bilanciate

Individua anomalie strutturali sbilanciate

Svantaggi:

Risoluzione di circa 10-5 Mb (da 320 bande a 1000 bande)

Le dimensioni delle delezioni/ duplicazioni sono molto varie

Possono esserci perdite o guadagno di materiale genetico ( più o meno importante ) di dimensioni inferiori al limite della risoluzione dell’analisi del cariotipo standard

Variazioni strutturali di dimensioniVariazioni strutturali di dimensioni

Al limite inferiore vi è la delezione o la sostituzione di una singola base nucleotidica in uno specifico gene, che può produrre una alterata espressione dello stesso e patologia, evidenziabile con tecniche di biologia molecolare quali sequenziamento o RdB ecc.

Un avanzamento diagnostico è venuto dall’utilizzo congiunto di tecniche di citogenetica classica con alcune di biologia molecolare

La FISHLa FISH

Sonde alfoidi

Sonde painting

Sonde locus-specifiche

La FISHLa FISH

Vantaggi:

Risoluzione > rispetto all’analisi cromosomica standard (circa 40-150 Kb)

Ha permesso di individuare: sindromi da microdelezione e sindromi dageni contigui e regioni critiche delle sindromi cromosomiche tradizionali

Svantaggi:

Tecnica lunga , laboriosa , costosa

E’ necessario conoscere il bersaglio: evidenzia solo ciò cheil clinico ricerca in base a quanto osservato

Non analizza l’intero genoma (numero di sonde limitato dal numerodi fluorocromi marcatori utilizzabili in una singola analisi)

Comparative Comparative GenomicGenomic HybridizationHybridization (CGH)(CGH)

Vantaggi

Visione dell’insieme del genoma

Non necessario conoscere il bersaglio

Risoluzione nell’ordine di 2-3 Mb

Svantaggi

Comparative Comparative GenomicGenomic HybridizationHybridization (CGH)(CGH)

Svantaggi

Analisi comparativa e non assoluta (DNA di comparazione è di soggetto “sano”)

Tecnica lunga e laboriosa, costosa

Non individua riarrangiamenti cromosomici, come inversioni o traslocazioni, che siano bilanciati

Spesso materiale di partenza non adatto per ottenere buoni preparati metafasici (aborti, tumori solidi..)

Array CGHArray CGH

Principio

Questa tecnologia è stata inizialmente sviluppata utilizzando il principio della CGH convenzionale

1) Nell’arrayCGH, un DNA di riferimento e un DNA di un paziente sono differentemente marcati ( il primo solitamente con un colorante rosso edil secondo inverde) e poi sono coibridati a piccoli frammenti di DNA umano posti in maniera ordinata su un vetrino (Array).

2) La distinzione tra condizione con guadagno, perdita o bilanciamento si basa sul rapporto di fluorescenza verde rispetto a rosso per ciascun frammento di DNA posto ordinatamente sul vetrino

3) Utilizzando strumenti informatici , il rapporto di fluorescenza verde a rosso per ciascun segmento di DNA viene mappato in un punto specifico di un cromosoma, risultando in un profilo dell’array.

Comparative Comparative GenomicGenomic HybridizationHybridization ARRAY (ARRAY (aCGHaCGH))

Array - Cariotipo Molecolare

•circa 4000 cloni

•Cloni spottati in triplo e quadruplo (repliche)

•Controlli positivi e negativi,presenza di •Controlli positivi e negativi,presenza di barcode

• 1Mb risoluzione, backbone (BAC)

• 0,2Mb risoluzione, regioni associate a patologie (Oligo)

Esempio di Array

Estrazione e digestione con ECORI DNA

testDNA

controllo

Protocollo (2-3 gg)e

Controllo digestione e purificazione su colonnina

20 kb

600bp

2 cicli di Marcatura

con controllo su gel

Cy3 ( test)

532nm

Cy5( ctr)

635nm

ibridazione su chip O.N.

unione dei Dna (+ H.cot1) e precipitazione

Lavaggi

Scannerizzazione

analisi

Fase 1: Scannerizzazione

Cy5

Cy3

- Lettura laser 10 u

- Ottenimento di immagini/ file per software analisi

Fase 2:Analisi con software

-file gal (Genepix Array List) info su spot

- Allineamento automatico griglia (file gal)

- Normalizzazione

- Esclusione dati

- Combinazione delle repliche (BAC)

Post processing

Fase 2:Analisi con software

- Combinazione delle repliche (BAC)

File variazioni quantitative genomiche

profili dei cromosomi

Risultato:

log 2 CY3(test)

Cy5( ctr)

Profili cromosomi

Esempio

Ricerca sul database

http://projects.tcag.ca/variation/

Tipologie di Array( in base al tipo di sonda molecolare utilizzata per l’ibridazione)

I più impiegati in passato sono stati i BAC-array cioè: frammenti di DNA umano della dimensione di 100-150 Kbincorporati in cloni BAC ( bacterial artificial chromosome).

Alternativamente sono stati utilizzati i cosiddetti Oligo-arraycioè: le sonde sono piccoli frammenti di Dna di circa 40- 70 basi nucleotidiche(oligonucleotidi).

I segmenti di DNA possono essere “campionati” in tutto il genoma e la loro

frequenza ( cioè la distanza media tra due segmenti tra loro prossimi) è uno dei

parametri che determina la risoluzione dell’Array In pratica più densamente le

sonde coprono una regione cromosomica o l’intero genoma , più alto è il potere

di risoluzione dell’array (vi sono poi altri fattori da cui dipende la risoluzione :

intensità del segnale, rumore di fondo, tipo di algoritmo..)

Risoluzione dell’Array

intensità del segnale, rumore di fondo, tipo di algoritmo..)

i BAC-array hanno almeno una risoluzione di 1 Mb cioè può identificare

guadagni o perdite di Dna di 1 Mb cioè circa di 1/10 di una banda cromosomica

(sino ad essere contigui)

Gli oligo-array disponibili commercialmente comprendenti da 44.000 a

2.000.000 circa oligonucleotidi con una media di distanza tra loro 0,02 - 0,01

Mb cioè con una risoluzione da 500 a 1000 volte più alta rispetto a quella di un

cariotipo standard

A : bandeggio G a bassa risoluzione 350 bandeB: bandeggio a più alta risoluzione 550 bandeC: risoluzione incrementata con l’utilizzo di 10 segmenti DNA distribuiti uniformemente in 15q21D: risoluzione incrementata con l’utilizzo di 500 segmenti DNA distribuiti uniformemente in 15q21

Genome–wide arrayLe sonde coprono, + o – uniformementente, tutto il genoma

Vantaggio:identifica piccoli CNVs in tutto il genoma

Svantaggio:mette in evidenza anche riarrangiamenti di incerto significato patogenetico (VOUS)

Tipologie di Array(in base alle parti del genoma analizzate)

Targeted–arraySono scelte specifiche regioni cromosomiche da analizzare in base alla riconosciuta

associazione con sindromi specifiche (e relativamente frequenti)

Vantaggio: analizza solo regioni riconosciute come patogenetiche

Svantaggio: molti riarrangiamenti mappano al di fuori delle regioni considerate

Esistono tempi definiti e brevi per fornire una risposta diagnostica del cariotipo.

La corrispondenza tra risultato analitico della DP e effetto fenotipico patologico/ non

patologico e le caratteristiche della patologia, in vari casi, èverificabile solo dopo la

Specificità della Diagnosi Prenatale (DP)

patologico e le caratteristiche della patologia, in vari casi, èverificabile solo dopo la

nascita.

Sulla base del risultato analitico e della sua interpretazione in consulenza genetica,

viene usualmente deciso dalla coppia se proseguire o meno la gravidanza.

- Cosa l’Array dà in più , cosa in meno , quale è il grado delle differenze e in che modo utilizzare le metodiche?

Su tali basi si sceglie se gli Array siano attualmente da utilizzare come primo step cioè per tutte le Dp indipendentemente dal grado alto o relativamente basso di rischio fetale di patologia sostituendo di fatto il cariotipo standard oppure solo in caso ci sia dimostrato un rischio elevato

Array VS Cariotipo standard in Diagnostica prenatale

sostituendo di fatto il cariotipo standard oppure solo in caso ci sia dimostrato un rischio elevato cioè secondo step.

(Tecniche eseguite in parallelo Tecniche eseguite in parallelo per verificare pro/contro per alcuni anni in vari centri)

Posizioni attuali (ciascuna porta dati a supporto della propria tesi) :

• conservatrice• avanzata

• intermedia

SIGUPosition paper per microarray (CGH-array e SNP-array) in diagnosi prenatale. (Ultrasound Obstet Gynecol. 2012 Jan 20. doi: 10.1002/uog.11092.)

Svantaggi

- Dati in letteratura ancora limitati

- Presenza di VOUS>o<in base alla piattaforma impiegata:(Targheted 0,4% ; Whole-genome SNP-array 9-12%)

-Non evidenzia riarrangiamenti bilanciati e mosaicismi di basso grado

-CMA come test di 2°livello dopo il cariotipo standard in gruppi selezionati con:

-1 o+ anomalie ecografiche fetali(con cariotipo normale, l’ incidenza dei CNVs patogeni è di circa 6.4%)

- riarrangiamenti cromosomici ”de novo” (anche apparentemente bilanciati)

-Presenza di marker sovrannumerario

Indicazioni cliniche per l’analisi array-CGH in diagnosi prenatale (E.C.A.)

• Due o più anomalie ecografiche compresa IUGR

• Genitori portatori di riarrangiamento cromosomico

• Precedente figlio affetto da anomalia cromosomica

• Caratterizzazione molecolare di un riarrangiamentostruttarale in epoca prenatale

Critiche al position paper SIGU:

- Non ha considerato importanti pubblicazioni (dati su 1000 esami anziché 9000)

- Non vi è aumento di VOUS rispetto citogenetica classica (un caso su 3000 Targeted-array, elevata risoluzione regioni di patologie note e bassa per backbone)

- Da Studio è emerso che: in 17 gravidanze su 2880 a basso rischio (0.6%) ed in 7 su 120 gravidanze ad alto rischio (5.8%), l’array ha permesso di riscontrare anomalie cromosomiche submicroscopiche che sarebbero sfuggite se si fosse effettuato solo il

cariotipo convenzionale.

ESAME DI 1°LIVELLO

- Maggiore risoluzione

- Tempi molto ridotti (minore ansia e possibilità interruzione anticipata)

Critiche al position paper SIGU:

- Riguardo traslocazioni bilanciate è rischio per il feto solo se “de novo”(rarissime e con piccole perdite evidenziabili con CMA, suggerito proprio come approfondimento da

SIGU)

- Molto remoto anche rischio di patologia associata a “effetto posizione”- Molto remoto anche rischio di patologia associata a “effetto posizione”

- Sottolineato limiti del cariotipo tradizionale in DP:• Limiti di risoluzione

•Coltura in vitro può fallire (ripetizione prelievo invasivo)•Coltura tende a eliminare progressivamente mosaici a bassa %

ESAME DI 1°LIVELLO

ACOG (American College of Obstetricians and Gynecologists) December 2013

SMFM (Society for Maternal-Fetal Medicine)

1) Nei casi di gravidanze con anomalie fetali riscontrate all’ecografia ( alto rischio), è raccomandato l’uso il cariotipo molecolare come test di primo livello (cioè è raccomandato il suo impiego diretto), in sostituzione del cariotipo tradizionale;

2) Il cariotipo molecolare può essere utilizzato anche nei casi in cui non vengano riscontrate anomalie fetali all’ecografia, e cioè anche in gravidanze a basso rischio

3) L’uso del cariotipo molecolare non deve essere limitato alle gravidanze con indicazione di età 3) L’uso del cariotipo molecolare non deve essere limitato alle gravidanze con indicazione di età materna avanzata (≥ 35 anni), bensì può essere proposto a tutti i pazienti che si sottopongono a diagnosi prenatale invasiva, poiché le anomalie cromosomiche riscontrabili con questo esame non sono necessariamente associate all’aumento dell’età della paziente.

Sottolinea:• che c’è un’ampia evidenza scientifica che dimostra un maggiore detection rate del cariotipo molecolare in diagnosi prenatale (benefici soprattutto con anomalie ecografiche) e come vi sia la necessità, ormai imprescindibile, di proporre test prenatali la cui risoluzione sia maggiore della citogenetica classica.• l’importanza della consulenza pre e post test

Mercoledì 28 Maggio 2014

CONCLUSIONE

Discussione aperta

(Incremento conoscenze su CNVs)

(Incremento utilizzo Array in DP)

Lo studio prenatale dei cromosomi fetali: esame citogeneticoesame citogeneticostandard standard vs arrayarray

FINEFINE