LAB : PROTEIN CHEMISTRY MAY 28th, 2013

VANASARIN MAITREEMIT, M.D. WANNAPORN DEETIPPRASERT, M.D.

ASSOCIATE PROFESSOR NEDNAPIS TIRAWANCHAI, Ph.D.

วตถประสงค

Amino acid Peptides & proteins

เพอทดสอบกรดอะมโนและโปรตนโดยอาศยคณสมบตทางเคมทจ าเพาะ

เพอศกษาคณสมบตโปรตน เชน การละลาย, Isoelectric point และ การเสยสภาพธรรมชาต

การทดลองท 1

การทดสอบกรดอะมโนและโปรตนในสารตวอยาง

1.1 การทดสอบ Ninhydrin

1.2 การทดสอบ Biuret

1.1 การทดสอบ Ninhydrin

Ninhydrin เปนสารไมมส ท าปฏกรยากบสารทมกลม อะมโนเสร ไดเปนสารสมวง

สารทใหผลบวก :

NH-CH-COOHl

R2

ll

ll O

O

=N-

ll O

lO-

ll

ll O

O

OH

OH+

R-CHll

O

CO2

2H O2

H+

+ +

+ +

PURPLE

ninhydrin

free amino group of amino acid or protein

NH-CH-COOHl

R2

ll

ll O

O

=N-

ll O

lO-

ll

ll O

O

OH

OH+

R-CHll

O

CO2

2H O2

H+

+ +

+ +

PURPLE

NH-CH-COOHl

R2

ll

ll O

O

=N-

ll O

lO-

ll

ll O

O

OH

OH+

R-CHll

O

CO2

2H O2

H+

+ +

+ +

PURPLE

amino acid, protein, amine

1.1 การทดสอบ Ninhydrin

การแปลผล : ผลบวกจะไดสารละลายสมวง

แตถาเปน proline หรอ hydroxyproline (2 o amine) จะไดสารละลายสเหลอง

amino acid “Proline”

“ Hydroxyproline”

Negative Positive Positive (proline)

1.1 การทดสอบ Ninhydrin

Fingerprints: using Ninhydrin

1.1 การทดสอบ Ninhydrin

สารตวอยาง 15 หยด + Ninhydrin 2 หยด

ผสมใหเขากน แลวแชในน าเดอด 2 นาท

Distilled water

Glycine Proline Albumin Globulin

ลกษณะของ สารละลาย

1.2 การทดสอบ Biuret

น ายา biuret ประกอบดวย Cu2+ ในสารละลายทเปนดาง เมอท าปฏกรยากบสารทม peptide bond ในอณ ตงแต 2 bonds ขนไปจะได complex สมวง

Peptide bond

Biuret reagent (Cu++ in alkaline

solution)

+

polypeptide

1.2 การทดสอบ Biuret

สารตวอยาง 5 หยด + น ายา Biuret 1 mL

ผสมใหเขากน แลวสงเกตสของสารละลาย

Distilled water

Glycine Proline Albumin Globulin

ลกษณะของ สารละลาย

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

• โปรตนเปนสารทมขนาดอณใหญและละลายอยในรปของ Colloid

• การละลายของโปรตนมความส าคญและจ าเปนตอการท างานของ

โปรตน

• การละลายของโปรตนในสารละลายทเปนน าขนกบปจจยหลายชนด

เชน pH ของสารละลาย, อณหภม, ประจสทธของโปรตน หรอ ชนด

ของโปรตนซงจะมจ านวนหมทมความสมพรรค (affinity) กบน า

(เชน -NH3+, -COO-, -SH, =N+H-, -OH) แตกตางกน

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

ในการทดลองนนกศกษาจะไดทดลองเกยวกบปจจยตางๆทมผลตอ

การละลายของโปรตน

2.1 การปรบ pH ไปท isoelectric point 2.2 การตกตะกอนดวย ammonium sulfate

2.3 การแขงเปนลมดวยความรอน 2.4 การตกตะกอนดวย protein precipitating agents

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.1 การปรบ pH ไปท isoelectric point

ประจของโปรตนสวนใหญมาจากสายขางทแตกตวไดของ amino acid residues และ ปลาย amino/carboxyl group

NH3

+

COO -

NH3

+

NH3

+

COO - H

COO -

NH3

+

N-TERMINAL

C-TERMINAL

IONIZABLE GROUP

OF SIDE CHAIN

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.1 การปรบ pH ไปท isoelectric point

NH3

+

COO -

NH3

+

NH3

+

COO - H

COO -

NH3

+

N-TERMINAL

C-TERMINAL

IONIZABLE GROUP

OF SIDE CHAIN

เนองจากโปรตนจะมประจสทธเปน 0 ท าใหแรงผลก (electrostatic) ระหวางโมเลกลหมดไป โปรตนจงละลายไดนอยทสดและตกตะกอนไดงายท pI

ท pH = pI (isoelectric point) NET CHARGE = 0

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.1 การปรบ pH ไปท isoelectric point

Demonstration ใหสงเกตการตกตะกอนของ casein ท pH ตางๆ

หลอดท 1, pH 3.5

หลอดท 2, pH 4.1

หลอดท 3, pH 4.7

หลอดท 4, pH 5.4

หลอดท 5, pH 6.0

ผลการทดลอง

pI ของ casein คอ …………………

- แสดงวาสารละลายไมขน/ไมเกดตะกอน

+, ++,+++ แสดงความขนจากนอยไปมาก

x, xx, xxx แสดงปรมาณตะกอนจากนอยไปมาก

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.1 การปรบ pH ไปท isoelectric point

วธการทดสอบ 0.011 N acetic acid 4.5 mL + โปรตน casein 0.5 mL

ผสมใหเขากน (pH ~ 4.7)

ตงทงไวประมาณ 1 นาท สงเกตผลการทดลอง

1 N NaOH 0.5 mL ผสมใหเขากน (pH ~ 7.5)

ตงทงไวประมาณ 1 นาท สงเกตผลการทดลอง

เปรยบเทยบกบการทดลองท 2.3

ตอบค าถามทายการทดลองขอ 3

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.2 การตกตะกอนดวยเกลอ ammonium sulfate (salting out)

โปรตนทม hydration shells หนา ละลายน าไดด

+

-

-

+

Adding salts ions ของเกลอจะแยงจบกบน าท าให hydration shell ของ

โปรตนบางลง

โปรตนมโอกาสเขาใกลกนมากขนและรวมตวตกตะกอน

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.2 การตกตะกอนดวยเกลอ ammonium sulfate (salting out)

ตงทงไว 1 นาท และสงเกตผลการทดลอง เปรยบเทยบผลการทดลองกบการทดลองท 2.3

น าละลายไขขาว 2 mL + saturated ammonium sulfate 2 mL (100% saturation)

เขยาใหเขากน

สงเกตผลการทดลอง

Distilled water 4 mL ปดปากหลอดดวย parafilm ผสมใหเขากน

ตอบค าถามทายการทดลองขอ 1

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.3 การตกตะกอนโปรตนดวยความรอน (heat coagulation)

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.3 การตกตะกอนโปรตนดวยความรอน (heat coagulation)

HYDROPHOBIC INTERACTION

Protein folding • Hydrophobic side chains สวนใหญจะรวมกนอย ภายในโมเลกลของโปรตน หางจากสารละลายทเปนน า

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.3 การตกตะกอนโปรตนดวยความรอน (heat coagulation)

HYDROPHOBIC INTERACTION

Protein folding • Hydrophilic side chains (polar or charged) สวนใหญจะอยท surface ของโมเลกลของโปรตน

ELECTROSTATIC INTERACTION

HYDROGEN BOND

COVALENT BOND

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.3 การตกตะกอนโปรตนดวยความรอน (heat coagulation)

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.3 การตกตะกอนโปรตนดวยความรอน (heat coagulation)

น าละลายไขขาว 2 mL + Distilled water 2 mL

ผสมใหเขากน

สงเกตผลการทดลอง เปรยบเทยบกบขอ 2.1 & 2.2 ตะกอนโปรตนกลบไปละลายใหมหรอไม

10% acetic acid 5 หยด

น าไปแชในน าเดอด 5 นาท แลวตงทงไวใหเยน สงเกตผลการทดลอง

Distilled water 4 mL ปดปากหลอดดวย parafilm ผสมใหเขากน ตงทงไว 1 นาท

ตอบค าถามทายการทดลองขอ 2

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.4 การตกตะกอนดวย protein precipitating agents

สารบางอยาง เชน เกลอของโลหะหนก (Hg2+, Pb2+, Cu2+) หรอ Alkaloidal reagents สามารถท าใหโปรตนตกตะกอนได โดยเขาจบกบโปรตนทมประจตรงขาม ท าใหโปรตนตกตะกอน

Hg2+

- charged protein

+ charged protein

Hg2+ - charged protein

- charged protein

Hg2+

Hg2+

Hg2+

- charged acid + charged

protein

+ charged protein

+ charged protein

- charged acid

- charged acid

- charged acid

Protein precipitation

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.4 การตกตะกอนดวย protein precipitating agents

หยดน าละลายไขขาว 1 หยดลงบนสไลด จ านวน 5 แหง หยดน ายาตอไปนอยางละ 1 หยด ลงในน าละลายไขขาว

1. Saturated mercuric chloride (HgCl2)

2. Saturated picric acid

3. 10% trichloracetic acid

4. 2% tannic acid

วธการทดสอบ

5. control (ไมตองหยดน ายาใดๆ)

การทดลองท 2 - การตกตะกอนโปรตน

2.4 การตกตะกอนดวย protein precipitating agents

สงเกตตะกอน หรอ ความขนโดยดบนกระดาษสเขม

Protein precipitating agents ปรมาณและลกษณะตะกอน

Saturated mercuric chloride

Saturated picric acid

10% trichloroacetic acid

2% tannic acid

+, ++,+++,++++ แสดงความขนจากนอยไปมาก หรอ ปรมาณตะกอนทเกดขน