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La transdifférenciation
Séverine Létuvé
21 novembre 2011
M1 Santé/ UE7 ‘Biologie moléculaire’
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La transdifférenciation: définition
Cellule polarisée Acquisition d’un nouveau phénotype
Environnement
Plasticité cellulaire impliquant une modification
- de morphologie
- de fonction
Phénomène
- Direct
- impliquant une dédifférentiation
- nécessitant le passage par un intermédiaire (cellule souche)
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Transdifférenciation = conversion d’une cellule différenciée en un autre
type cellulaire
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Mise en évidence historique d’une transition de phénotype:
apparition du sillon primitif au cours de l’embryogenèse
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4
Implication de la transition de phénotype en
pathologie humaine (1)
Implication en pathologie humaine
• Conversion des cellules endothéliales et des fibroblastes en
cellules musculaires vasculaires et myofibroblastes ( SMA+):
hypertension pulmonaire artérielle
• Conversion des cellules étoilées du foie en myofibroblastes
Application en thérapie cellulaire
• Conversion des cellules du pancréas (glucagon +) en cellules
(insuline +): régénération tissulaire en réponse à la disparition
massive des cellules (modèle de diabète type I)
• Plasticité des cellules souches mésenchymateuses: différenciation
en cellules d’autres lignages (cellules , neurones, cellules
musculaires cardiaques…)
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Exemples de transition de phénotype (2)
• Transition épithélio-mésenchymateuse (TEM= Epithelial- mesenchymal
transition, EMT/ métaplasie):
Génération de cellules capables de migrer à partir de cellules épithéliales
- différenciation en cellules mésenchymateuses, fibroblastes
- acquisition de propriétés de cellules souches
• Mésenchymal- epithelial transition (MET): phénomène inverse de la TEM
Ex: formation des somites/embryogenèse
• Endothelial- mesenchymal transition (EndoMT): acquisition d’un
phénotype mésenchymateux par les cellules endothéliales
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Polarité apico-basale
Phénotype statique
Jonctions
adhérentes + serrées
E-cadhérine
Cytokératines
Absence de polarité
Extensions membranaires
Réorganisation du
cytosquelette
Cytokératines
Vimentine
-caténine nucléaire
Polarité ‘avant-arrière’
Phénotype migratoire
Absence de jonctions
intercellulaires
Production de matrice
extracellulaire
et médiateurs fibrogéniques
Phénotype épithélial Phénotype métastable
Phénotype mésenchymateux
Cas particulier de la transition épithélio-mésenchymateuse
(TEM)
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La TEM:
Implication en physiologie humaine/ physiopathologie
• Initialement décrite dans le cadre de l’embryogenèse
TEM de type I
• Mise en évidence dans les phénomènes de réparation tissulaire et les
pathologies à composante fibrotique (rejet de greffe, fibrose rénale,
fibrose pulmonaire idiopathique…)
TEM de type II
• Impliquée dans la dissémination des cellules épithéliales tumorales
(métastases)
TEM de type III
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Stimuli inducteurs de TEM
• Facteurs solubles (facteurs embryogéniques, médiateurs
inflammatoires: TGF-, PDGF, EGF, FGF-2, IGF-BP5)
• Réarrangements matriciels (ex: matrice fibrillaire vs. Laminine)
• Agression épithéliale (ex: protéases, lésion)
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Signalisation intracellulaire de la TEM
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Rôle clé de Snail au cours de la TEM
Marqueurs épithéliaux Marqueurs
mésenchymateux
Remaniements
du cytosquelette
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Les marqueurs de TEM (1)
Les plus fréquemment utilisés, liés à une:
• Altération de l’expression de protéines membranaires:
– Adhérence cellule-cellule switch E-cadhérine/ N-cadhérine
– Adhérence à la matrice
5 intégrine, discoidin domain receptor tyrosine kinase 2 (= kinase
spécifique au récepteur du collagène)
– Forme de la cellule
cytosquelette: switch cytokératine/ vimentine
• Modification de la fonction cellulaire:
– Migration
protéines du cytosquelette: FSP-1 ± -SMA, métallo-protéases
matricielles
– Synthèse de protéines matricielles
fibronectine, collagène I
– Resistance à l’anoikis
+ Néo-expression de facteurs de transcription et translocation nucléaire de la -
caténine
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Les marqueurs de TEM (2)
Nom Type de TEM Nom Type de TEM
Marqueurs induits Marqueurs réprimés
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Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs (1)
• Petits ARN (19-22 nts) simple-brins
non-codants
• Répriment l’expression de gènes de
façon post-transcriptionnelle:
fixation par complémentarité totale ou
partielle avec séquence 3’UTR des
ARNm cibles
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Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs (2)
• Expression
- tissu-spécifique
Ex: miR-122/ foie; miR-1/ muscle squelettique; miR-133/
muscle cardiaque; miR-375/ îlots de Langerhans
- temporelle
Ex: gastrulation/ développement
- modulée par l’environnement tissulaire chez l’adulte
Ex: miR-21/ inflammation allergique des voies aériennes (IL-13 Tg);
miR-155/ fibrogenèse pulmonaire
• Fonctions (entre autres!)
- régulent la différenciation
Ex: famille miR-200/ phénotype épithélial;
miR-145/ conversion fibroblastes-cellules musculaires lisses
- régulent la prolifération
Ex: miR-203/ différenciation des kératinocytes: cellules basales
(proliférantes) vers supra-basales (différenciées)
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La machinerie des miRNAs et la transdifférenciation
• Induction de conversion de phénotype sans retour à un état pluripotent
(régulation épigénétique: inactivation par hyperméthylation de l’ADN)
• Expression réduite de Dicer associée avec un état moins différencié des
cellules (moindre maturation des miRNAs)
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a: Ségrégation des membres de la famille miR-200 en fonction de leur séquence ‘seed’
b: Sites de fixation des miR-200s au niveau des régions 3’UTR régions of de l’ARNm des ZEBs
c: Boucle de rétro-régulation négative impliquant les miR-200s et les ZEBs au cours de la TEM
NAT: Natural Antisense Transcript
Autres acteurs de la TEM: les ZEBs
Facteurs de transcription de la famille ZEB : répression de l’E-cadhérin et des miRNAs
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Mise en évidence de la transdifférenciation
But: mettre en évidence l’apparition d’un nouveau phénotype
différencié
bien caractériser le phénotype initial (type de cellule, mais
également type de tissu! Exemple: cellule épithéliale bronchique
vs. alvéolaire)
définir si mise en évidence précoce? (facteurs de transcription,
nouveau phénotype transitoire)
ou détection plus tardive (maladie chronique: nouveau phénotype
stable)
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Outils de mise en évidence de la transdifférenciation
• Etude morphologique: microscopie classique
• Caractérisation et distribution cellulaire des marqueurs de phénotype + facteurs
de transcription (Immunocytochimie ± fluorescence et microscopie confocale)
• Quantification de l’expression à l’échelle protéique (Western Blot) et
transcriptionnelle (PCR, puces à ADN)
! Attention !
- choix du modèle cellulaire déterminant pour les marqueurs à étudier (origine
tissulaire) et la ‘facilité’ de mise en évidence de la TEM (cellules immortalisées >
cellules primaires)
- choix du mode de préparation des échantillons: ex. analyse des miRNAs/ ne pas
éliminer les petits ARNs…
- et du mode de culture (effet de la matrice sur le phénotype des cellules/ culture
en interface air-liquide pour différenciation épithéliale…)
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Exemple: Mise en évidence in vitro de la TEM
• Morphologie ‘allongée’ (spindle-shape) avec perte de polarité et
réorganisation des fibres de stress
• Disparition des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, cytokératine, ZO-1)
• Néo-expression de marqueurs mésenchymateux (N-cadhérine, FSP-1)
• Induction de Snail/ Slug/ Twist
• Translocation de la -caténine
• Augmentation de l’expression de collagène/ vimentine/ HSP-47
• Augmentation de la capacité migratoire
• Augmentation de l’expression de MMPs
• Résistance à l’apoptose/ anoïkis
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Mise en évidence in vitro de la TEM: chambre de
Boyden
• Détection d’une capacité migratoire accrue
Collagène
Migration de ‘fibroblastes’
suite à l’induction de TEM?
TGF-1
Cellules épithéliales
(différentiées?)
21
21
Vimentine
E-cadhérine
Milieu TGF-1
(3 j)
TEM de cellules bronchiques immortalisées (BEAS-2B)…
22
22
E-cadhérine /
Vimentine
Milieu TGF-1
…vs. TEM de cellules bronchiques primaires (NHBE)
(6 j)
23
23
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3j 6j 10j
E-c
ad
h�rine/-a
ctin
e
0
10
20
30
40
50
60
70
3j 6j 10j
N-c
adh�rine/-a
ctin
e
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
3j 6j 10jV
imentin
e/
-actin
e
E-cadhérine N-cadhérine Vimentine
TGF-1 Milieu
E-cadhérine
Vimentine
-actine
6 3 10
TGF-1 - + - +
Jours
- +
N-cadhérine
Expression des marqueurs de TEM au niveau des cellules
épithéliales bronchiques humaines: Western-Blot
24
24
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
3 6 18 24 72
Temps (h)
AR
Nm
vim
en
tin
e / H
PR
T
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3 6 18 24 72
Temps (h)
AR
Nm
cad
hˇr
ine
E / H
PR
T
TGF-1 Milieu
E-cadhérine Vimentine
0,E+00
2,E-03
4,E-03
6,E-03
8,E-03
1,E-02
1,E-02
3 18 72
mR
NA
pro
coll
Ia1
/UB
C
Temps (h)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
3 18 72
mR
NA
FN
/UB
C
Temps (h)
0,E+00
1,E-01
2,E-01
3,E-01
4,E-01
5,E-01
6,E-01
3 18 72
mR
NA
MM
P-9
/UB
C
Temps (h)
Procollagène I1 Fibronectine MMP-9
Expression des marqueurs de TEM au niveau des cellules
épithéliales bronchiques humaines: qPCR
25
25
P Smad3
-actine
TGF-1 (3h) - + - +
Dexa Milieu
- + - +
Salm MeOH
Smad3 T
0
5
10
15
20
ratio
Psm
ad
3/T
sm
ad
3
TGF-1 Milieu
Milieu Dexa MeOH Salm
Signalisation intracellulaire de la TEM au niveau des cellules
épithéliales bronchiques humaines
Effet des traitements
de l’asthme
(Dex: dexaméthasone;
Salm: salmétérol)
26
26
Implication des facteurs de transcription Snail et ZEB1 dans la
TEM des cellules épithéliales bronchiques
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
3h 18h 72hZ
EB
1/ U
BC
Temps (h)
HCl
TGF
3 18 72
Temps (h)
Sn
ail
/UB
C
0
2
4
6
8 HCl
TGF-1
27
27
Outils de détection in vivo de la transdifférenciation
• Phénomène souvent rare!
• Localisation préférentielle selon origine de la stimulation?
(ex: détection de marqueurs de TEM au voisinage d’une lésion épithéliale
ou d’une rupture de la membrane basale)
• Mise en évidence de cellules exprimant de façon concomitante des
marqueurs du phénotype originel et du nouveau phénotype
(voir marqueurs in vitro)
- Echelle protéique: Immunohistochimie/Immunofluorescence ±
microscopie confocale
- Echelle transcriptionnelle: hybridation in situ
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28
Ex: implication de la TEM dans le remodelage
des voies aériennes
Réparation
anormale
Remodelage bronchique
et alvéolaire Inflammation
Trouble ventilatoire obstructif
(asthme, BPCO)
Agressions répétées des
voies aériennes
Eosinophile Macrophage
(accumulation,
activation)
Synthèse de médiateurs inflammatoires,
fibrogéniques et MMPs
(activation, prolifération,
différenciation en myofibroblaste)
Fibroblaste
Epithélium
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Indices de TEM dans l’asthme?
• Activation de la voie du TGF-1 au niveau
des cellules épithéliales bronchiques :
- Augmentation de l’expression de
phospho-Smad-2
- Diminution de l’expression de
Smad-7 (augmentation de la
sensibilité au TGF-1 ?)
• Augmentation de l’expression de TGF-1 (et corrélation avec épaisseur
lame basale et hyperéactivité bronchique)
• Altération de la barrière épithéliale ( E-cadhérine/ ZO-1, cohésion)
• Accumulation de (myo)fibroblastes au niveau sous-épithélial
30
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Pan-Cytokératine
Vimentine
Recherche de TEM dans l’asthme (1)
Problème: Marquage avec anticorps
anti-Pan-cytokératine =
non spécifique des cellules
épithéliales!
(marque les cellules endothéliales et
cellules musculaires)
31
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CK5
Vimentine
Implication de la TEM dans l’asthme (2)
Ajuster en fonction du tissu:
Cytokératine 5 = spécifique des
cellules épithéliales bronchiques
basales
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TEM et fibrose pulmonaire idiopathique
(Willis et coll., Am J Pathol 2005)
-SMA
TTF-1
Pro-SP-B
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TEM et rejet de greffe pulmonaire
(Borthwick et coll., Thorax 2009)
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Mise en évidence in vivo de la transdifférenciation:
modèles animaux
± Tag du phénotype originel
pour suivi au niveau tissulaire
(ex: cellules épithéliales/
promoteur SPC)
Inhibition de la signalisation
intracellulaire
(ex: voie TGF-1/Smad-3 KO,
Administration de BMP-7)
Marqueurs de transdifférentiation
‘Read-out’ du modèle: conséquence tissulaire
- Induction du phénomène recherché? (ex: fibrose)
- Altération de la fonction tissulaire? (ex: obstruction bronchique)
Stress tissulaire/
surexpression cellule-spécifique de
facteurs de transcription
(ex: Expression épithéliale
de Snail sous promoteur CC-10)
35
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Ex: TEM dans un modèle murin de fibrose rénale
Tag des hépatocytes:
Gène reporter LacZ sous promoteur de l’albumine
‘pistage’ au niveau des tissus fibrosés
30% des fibroblastes issus de l’épithélium!
+ Réversion par l’antagoniste du TGF-1: BMP-7
(Zeiberg et coll., J Biol Chem 2007)
36
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Ex: Conversion des cellules en cellules du pancréas
Tag des cellules :
Gène reporter YFP ‘pistage’ au cours de la régénération de cellules
(Thorel et coll., Nature 2010)
65% des cellules insuline + sont YFP+ (90% sont co-expriment le glucagon)
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La transdifférenciation sur la toile
The EMT International Association:
http://www.mtci.com.au/TEMTIA/TEMT-Assn.html
Congrès bis-annuel, 10-13 octobre 2011: Singapour
- Série de revues sur la TEM: J. Clin. Invest. Juin 2009: 119(6) (Kalluri R. EMT: when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells
Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition
Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M, Nieto MA. Epithelial-mesenchymal
transitions: the importance of changing cell state in development and disease
Zeisberg M, Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions)
- Revue sur la régénération tissulaire: Nature Reviews - Genetics.
Octobre 2010: 11
Poss KD. Advances in understanding tissue regenerative capacity and
mechanisms in animals