1 Programmation dapplications BD WEB : un tutoriel Bruno Defude GET-INT Evry defude.
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La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour l’imagerie du vivant
Exemples d’applications à l’étude du développement végétal
Biologie Cellulaire
François Roudier
Equipe Différenciation et Identité Cellulaire
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Aequorea victoria : ”l’inventeur” de la GFP
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La GFP : une protéine fluorescente par transfert d’énergie
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La GFP : une structure en lanterne et un fluorophore protéique auto-catalytique
- 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles
- Forte stabilité : résiste à 65C, à pH entre 5,5-12,2, 8M urée, 1% SDS, protéases (2j)
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De la GFP sauvage à la GFP “améliorée”
Un outil versatile pour l’étude du vivant…
Plusieurs mutations ont été introduites pour :
- Optimiser l’expression de la protéineUsage optimal des codons et élimination d’un intron cryptique (20X plus de protéine)Maturation du fluorophore (4X plus vite)
- Modifier les propriétés spectrales de la protéinePic d’excitation unique à 490 nmBrillance (X6)
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La GFP : une protéine non toxique pour des méthodes de visualisation non invasives
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Variants de la GFP et autres protéines fluorescentes
CFP GFP YFP (DsRED) RFP
Discosoma striata
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Des protéines fluorescentes avec différentes propriétés spectrales
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Une plante modèle: Arabidopsis thaliana
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Embryon
Adulte
Zygote
PlanteAnimal
Le développement végétal est essentiellement post-embryonnaire et résulte de l’activité constante des méristèmes
Organogenèse et Croissance indéterminée
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L1L2L3MMZPZPfeuilleprimordiumZCméristème
plantuleArabidopsis
adulte
Méristème apical
Méristème racinaire
Les méristèmes contiennent les cellules souches et sont organisés en domaines fonctionnels
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Exemples d’application de la technologie GFP à l’étude du développement des plantes
- Profil d’expression d’un gène
Localisation subcellulaire
Interaction protéine-protéine (FRET)
pPromoteur:GFP (fusion transcriptionnelle)
- Etude fonctionnelle d’une protéine pPromoteur:CDS::GFP(fusion traductionnelle)
Mouvement
- Biosenseurs
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Cell types in the Arabidopsis root meristem
lateral root cap
columella
cortexepidermis
stele endodermis
quiescent center (QC) cortex/
endodermis initial
Division asymétrique
Le méristème racinaire : une organisation dépendante de divisions stéréotypées des cellules souches
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Wild type
corend
scarecrow(scr)
cor+end
short-root(shr)
cor
Deux mutants déficients dans la mise en place et la différenciation de l’endoderme
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Expression de SCR dans la racine
GFP gene
Promoteur SCR
ARN GFP
Protéine GFP
GFPpSCR
QC
endodermis
cortex
c/e initiale
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Localisation de la protéine de fusion SCR::GFP
SCR gene
ARN
SCR::GFP
Promoteur SCR
GFP
QC
endodermis
cortex
c/e initiale
pSCRGFPSCR
(Complémentation du mutant scr)
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QC
endodermis
cortex
c/e initialeQC
endodermis
cortex
c/e initiale
SCR est nécessaire pour la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine
pSCRGFPSCRGFP
pSCR
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GFPpSHR
GFPSHRpSHR
st
en
coep
inqc
st
en
coep
inqc
SHR contrôle la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine de façon non cellule-autonome …
… La protéine SHR bouge de la stèle vers l’endoderme !
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pSCR:GFPPlantules in vitro
Récolte pointe racinaire (15000)
Digestionparoi
Triage par fluorescence des protoplastes GFP+
Extraction ARNAmplification
Marquage des sondes
Hybridation
Puce Affymetrix ATH125K gene arrays
Analyse du transcriptome de l’endoderme racinaire
300 000 protoplastes
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Collection de marqueurs spécifique d’un type cellulaire
Pericycle
Endo-dermis
Lateral rootcap
Epidermis
QC
Endo+Cortex
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Le méristème apical caulinaire
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Le méristème apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle pour la croissance, l’organogenèse et auto-maintien
ZC
ZM ZMZM
Auto maintien
Tige
Organes latéraux
Feuille
Jeune feuille
Primordium
P
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Le méristème apical caulinaireUne organogenèse dynamique et structurée
QuickTime™ et undécompresseur TIFF
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Vue d’avion
Cinétique sur 65h
Acquisition toutes les 2h30
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SHOOT MERISTEMLESS LEAFYAINTEGUMENTA
CLAVATA3 ATML1
CLAVATA1 CUP-SHAPED COTYLEDONSWUSCHEL
Marqueurs moléculaires des zones fonctionnelles et identités cellulaires du MAC
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pANT:GFP, un marqueur de l’initiation et de la mise en place des primordia foliaires
pANT:GFP
Coloration vitale + pANT::GFP
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Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération
T = 0h
T = 48h
pANT:GFP
T = 24h
T = 32h
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après le recrutement : prolifération cellulaire
Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération
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P7P4
P5P3
P6P2
P1
Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D
P0Une disposition en spirale prédictible
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Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
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Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
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Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
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L’auxine, une phytohormone transportée de façon polarisée,
est impliquée dans le contrôle de la phyllotaxie
Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs
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AIA-H++
Sen
s d
u
TP
A
AIAH
PINPIN
AIAH
AUXAUX
Transporteur d’influx(membrane apicale)
Transport polarisé de l’auxine (AIA): Localisation des transporteurs à l’aide de FPs
pAUX1:AUX1::YFPAUX1::YFP
pPIN1:PIN1::GFP
Transporteur d’efflux(membrane basale)
1
2
3
1
2
3
1
2
3
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Auxine
Modèle du contrôle de la phyllotaxie par PIN1 et des flux d’auxine (DR5:GFP)
(pDR5 : 9 x AuxREs)
pDR5:GFP Un senseur transcriptionnel de l’auxine
P0
P1P2
P3
Gradients locaux d’auxine par pompage
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Interaction entre deux protéines
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D AAD
1- Compatibilité spectrale des fluorochromes
2- Proximité moléculaire des fluorochromes
Mesure de l’interaction entre deux protéines par"Fluorescence Resonance Energy Transfert » (FRET)
GFP RFP
Co-localisation de deux protéines…
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Application de la technology FRET au vivant :la protéine caméléon, un biosenseur du calcium
Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans
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Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans
[Ca2+] forte
[Ca2+] faible
YFP/CFP élevé
(FRET max)
YFP/CFP faible
(peu de FRET)
[Ca2+] nulle
CFP séparée de YFP
(pas de FRET)
Excitation 440 nm
QuickTime™ et undécompresseur Video
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Exemples d’application de la technologie GFP
- Profil d’expression de gènesLocalisation subcellulaire
Interaction protéine-protéine(FRET)
- Etude fonctionnelle de protéines Mouvement
- Biosenseurs
Limites :- Sensibilité (difficile de détecter les gènes faiblement exprimés)- Ajout d’une protéine (encombrement, environnement bio)- Panoplie de FPs encore limitée
Quelques limites
LHP1::GFP
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QuickTime™ et undécompresseur Video
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Début de floraisonTransformation de la lignée
germinale
Sélection des transformants à partir des graines
Principe de transformation génétique stable chez les plantes
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Eta
pes
de
déve
lopp
emen
t
Assises cellulaires
In situ “digitale” des différents types cellulaires de la racine