LỜI MỞ ĐẦU

Từ rất lâu, con người đã biêt nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp. Từ cách gieo

hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng ,gọi là giâm cành ,chiết

cành…Hay chắp nối những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành. Những ưu

điểm vượt trội của nó rất được ứng dụng rộng rãi. Cùng một lúc chúng ta có thể nhân giống

cây lên hàng lọạt mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt ,chờ cho cây con lớn. Bên cạnh

đó người ta lại có một công nghệ hiện đại hơn, gọi là công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Cùng

với sự phát triển của khoa hoc kỹ thuật, nền công nghệ này đã và đang ứng dụng rộng rãi

trong cây trồng…Cùng một lúc nó cũng tạo ra hàng vạn cây trồng mới, nhanh chóng mà

không nhất thiết phải là từ các hạt của cây mà có thể lấy bất kỳ mô bào nào , trừ những mô

tế bào đã hoá gỗ. Tuy nhiên nền công nghệ này đòi hỏi khá tốn kém, kiên nhẫn và khéo léo.

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau trong

nuôi cấy in vitro như: nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast. Việc ra đời của các kỹ

thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hướng mới cho nghiên cứu thực vật, nó

nhanh chóng giành được một vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản

xuất và cải thiện giống cây trồng. Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

rõ nhất là trong lĩnh vực nhân giống và phục tráng cây trồng. Trong giai đoạn hiện nay,

nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân

giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di truyền ở thực

vật bậc cao. Kỹ thuật nhân giống in vitro không những cho hiệu quả kinh tế cao trong việc

nhân nhanh tạo ra một số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh mà còn giữ được những

tính trạng quý của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vô

trùng cho mọi thí nghiệm chọn dòng tế bào vào thời điểm bất kì trong năm.

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh chóng đi vào

thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật được bao hàm trong ứng dụng của Công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và nhân nhanh giống, sản

xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên

cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus …

Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm

những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào.

Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ nhu mô lá,

tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật, kết quả thu được là không thành công. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào ông đã đề

xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.

Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu

gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong thí nghiệm minh chứng tính toàn

năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh. Một nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực

vật còn rất hạn chế nên ông đã không tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích cho sự phân chia của tế bào. Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành công

để minh chứng cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nỗi bật là các công trình sau:

Năm 1922, Kotte và cs. đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo và đã tạo được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sau một thời gian ngắn thì hệ rễ này sinh

trưởng chậm dần và ngừng lại. Đến năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài

đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trên một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men.

Năm 1937, ông phát hiện tầm quan trọng của các vitamin thuộc nhóm B là B1, B6 và PP để thay thế cho dịch chiết nấm men và thấy rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp. Từ đó

việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cùng lúc với White, Gautheret cũng đã thu được kết quả phân chia các tế bào của tầng sinh gỗ ở

cây liễu. Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong

thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) bằng cách cấy chuyền đều đặn 6 tuần một lần. Lúc này, White đã thành công tương tự với cây thuốc lá. Kỹ thuật nuôi cấy mô

thực vật được khai sinh từ đó. Năm 1951, Nitsch đã khắc phục được tính không giao hợp tiền giao tử khi nghiên cứu và

thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dưa chuột và lần đầu tiên tạo được hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức sống). Sau này có rất nhiều nhà

khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn, các quá trình sinh trưởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in vitro.

Năm 1958, Reinert và Steward tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch.

Năm 1966, Morel hoàn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi Cymbidium. Ý

tưởng của ông được thai nghén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên quan sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi ngọn cây hoa lan trong lúc cố tìm cách để làm sạch bệnh cây hoa lan

giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .

Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi cấy

protoplast của lá cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ thuật protoplast đã được thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các loài, một

việc không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp cho sự nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, giúp cho việc

nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung hợp protoplast đã thu được 104 trường hợp

lai, bao gồm con lai trong loài, con lai giữa các loài, con lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến 1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn tạo giống.

Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gene thực vật. Sau khi đưa được gene ngoại lai vào tế bào người ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực

vật để nuôi cấy các tế bào đã được chuyển nạp. Sau đó cho tái sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đặc tính sinh học mới. Chúng sinh trưởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình

thường và được coi như một giống cây trồng mới. Lĩnh vực công nghệ gene đã có những thành công to lớn không chỉ trên đối tượng thực vật mà còn thành công trên đối tượng động

vật và vi sinh vật. Đối với thực vật, theo thống kê của Tạp chí Sinh học, thuộc mạng lưới

Công nghệ Sinh học Châu Á – Thái Bình Dương, tính đến tháng 12/1995 đã có hơn 50 giống cây trồng khác nhau được chuyển các gene quý như chống chịu sâu bệnh, virus và cỏ

dại, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, gene giữ cho quả chậm chín để vận chuyển, gene giúp cho hoa quả chống lại sự hư hại và các hạt trở nên mẩy hơn, đầy dinh

dưỡng và như vậy mang lại lợi ích kinh tế phong phú hơn.

II. Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên

liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.

Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong

điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture). Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant

(mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt).Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các

loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative or somatic regeneration) cơ bản trong nhân giống in vitro và nuôi cấy mô.

2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

như sau

2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi bất bất định

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và

mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng

khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp,… Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát

triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở

thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường.

Nuôi cấy chồi bất định

Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Đỉnh chồi bất định mới có

thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Một số loại mẫu vật được dùng như sau:

- Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải… - Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao…

- Cuống lá, hoa: thủy tiên, cúc… - Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mì, thuốc lá… - Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hoá của tế

bào đã phân hoá. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường

không có chất kích thích tạo mô sẹo.

2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn

được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch.

Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi trên môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin – auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

2.2.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích

hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung

hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.

2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.

2.3 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển

những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định:

- Đó là tính toàn thế của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ

sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng.

- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các

giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt).

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực

nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,...).

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi

Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm.

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng

đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo.

- Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.

- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.

- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai.

- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa.

- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất

tính toàn thế của tế bào. Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật.

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể

thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế. Hai nhiệm vụ lớn

của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010 là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và

nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995).

2.4 Các giai đoạn ( bước) nhân giống in vitro

2.4.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc cây mẹ và khử trùng mô nuôi cấy

Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ

sâu bệnh hiêu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau

để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là

đoạn thân, mảnh lá.

Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro

Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)

Khoai tây: mầm (Morel, 1952)

Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)

Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)

Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)

Khử trùng mô nuôi cấy : đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa

vào nuôi cấy in vitro. Cẫn xác định chế độ khử trùng mẫu thích hợp, thường sử dụng các hợp chất : HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-

20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br…

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên

trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.

2.4.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại

sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các

mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái

sinh chồi.

2.4.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc

cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin,

Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.

Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyển hợp lý ,bởi vì nếu số lần cấy chuyền quá lớn thì sẽ dẫn tới hiện tượng cây bị thoái hoá và sinh trưởng kém ,có thể mất đi những đặc tính ban

đầu của cây bố mẹ.

2.4.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang

môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy

các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.

2.4.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản

xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá

thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất.

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

2.5.1 Mẫu nuôi cấy

Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho thấy một số nhân

tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.

- Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy

sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon

esculentum Mill.

- Chọn cơ quan: Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả

năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi

mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt.

- Tuổi và sinh lý : Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi

cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau vế ảnh hƣởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi

nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.

- Mẫu in vitro : Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro

có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al. (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng.

. - Sức sống của mẫu: Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất

những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây

bệnh được nhân lên.

2.5.2 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 270C, nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh

trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.

Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ với các loài, có loài

chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002).

Quang kỳ và chất lượng ánh sáng

+ Thời gian chiếu sáng : Ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.

+ Chất lượng ánh sáng: Ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ

dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro.

+ Các chất khí: Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây

in vitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô mẫu

nuôi cấy.

2.6 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)

Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác dụng điều tiết các quá

trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các chất ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó

không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng. Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm. Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các chất ĐHSTTV làm việc như

chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất. Tác dụng của chất ĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng

tổng hợp enzyme trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA. Mỗi một chất ĐHSTTV đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều

khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thương không phải là một mà là vài chất. Tuỳ mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất

này có khác nhau, có hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberellin và ethylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan.

2.6.1 Auxin

Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân

giải chúng. Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật. Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành

khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:

- Indol acetic acid (IAA)

- Naphthyl acetic acid (NAA).

- 2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D).

- Indol butyric acid (IBA).

2.6.2 Cytokinin

Bao gồm các nhóm chất:

- 6-Benzylaaminopurin (BAP).

- Kinetin (Ki)

- Zeatin (Z).

- Thidiazuron (TDZ).

Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân

bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy.

Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ lệ giữa cytokinin

và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ. Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA và protein, kích

thích quá trình trao đổi chất.

2.6.3 Gibberellin

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa(1920) khi nghiên cứu bệnh mạ lúa do Gibberellin Fujikuroi gây ra. Năm 1939 Gibberellin được tách

chiết và gọi là Gibberellin A. Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là than và lá, vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn khiến các cây này có thể khôi phục bình thường. Về

sau, các nghiên cứu khám phá ra là trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng. Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3,

A4… Do Gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh turowngr và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hòa sinh trưởng khác

2.6.4 Ethylen

Ethylen là chất điều hòa sinh trưởng dạng khí. Ethylen có rất nhiều tác dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai trò của Ethylen đối với việc làm tăng

hô hấp trong thời gian quả chin đã được ứng dụng rất nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét ứng dụng của Ethylen lên sự kéo dài than rễ và kích thích tế bào phát triển vè bề

ngang, kích thích nảy mầm, tạo long, rễ , ức chế vẫn chuyển ngang và xuống của auxin.

2.7 Ưu, nhược điểm nhân giống in vitro

2.7.1 Ưu điểm

- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây

giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng

một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm.

- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị nhiễm

bệnh từ môi trường bên ngoài

- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus

- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo ý muốn

- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian ngắn.

Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36 – 1012 /nă m, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.

- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh của thời vụ.

- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian

dài ở điều kiện in vitro

2.7.2 Nhược điểm

- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn

- Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng

trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện in vivo cần phải trải qua giai

đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh.

- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.

- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống

+ Tính bất định về mặt di truyền

+ Sự nhiễm mẫu

+ Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy

+ Hiện tượng thuỷ tinh hoá

Quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật - Process of tissue culture - Choicay.com.mp4

PHẦN II:

KỸ THUẬT THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT: NUÔI CẤY

HOA CÚC

I. Sơ lược về hoa cúc

Cây hoa Cúc có tên khoa học la Chrysanthemum, được định nghĩa từChiysos (vàng) và themum (hoa) bởi Linne năm 1973. Hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và

một số nước Châu Âu.

Hoa Cúc được du nhập vào Việt Nam từ thế kỷ 15, đến đầu thế kỷ 19 đã hình thành một số vùng chuyên nhỏ cung cấp cho dân. Một phần để chơi, một phần phục vụ việc cúng lễ.

Hiện nay hoa Cúc được trồng khắp nước ta nó có mặt ở mọi nơi từ núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị.

Đặc điểm thực vật học

1. Rễ: Thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang phân bố ở tầng đất mặt từ 5-20cm, số lượng rễ lớn nên có khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh.

2. Thân: Cúc là cây thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gãy nên khi cây lớn phải làm

giàn để đỡ cây khỏi đổ.

3. Lá: Thường là lá đơn, mỗi giống Cúc có đặc điểm khác nhau: hình dạng lá xẻ thùy nông hay sâu, phiến lá dày hay mỏng và màu sắc là khác nhau.

4. Hoa: Hoa Cúc chủ yếu có 2 dạng.

+ Hoa lưỡng tính ( có cả nhị đực và nhị cái)

+ Hoa đơn tính (Chỉ có nhị đực hoặc nhị cái)

Hoa cúc chính gồm nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa. Tùy theo mục đích sử dụng mà có thể để một bông hay nhiều bông trên cành.

Tùy theo cách sắp xếp cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa kép(có nhiều vòng hoa sắp xếp/bông) va hoa đơn (chỉ có một vòng hoa/bông). Hiện nay người ta sử dụng

loại hoa kép là chủ yếu. Hoa kép nhiều hơn hoa đơn và thường mọc nhiều hoa trên một cành phát sinh từ nách lá.

Hoa có nhiều màu sắc khác nhau (trắng, vàng, đỏ, tím, xanh…). Những cánh hoa ở phía ngoài thường có màu sắc đậm hơn xếp thành nhiều tầng, sẽ chặt hay lỏng tùy theo từng giống. Cánh có nhiều hình dáng khác nhau, cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn đều, có loại

dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong.

Đường kính bông hoa phụ thuộc vào giống:

+ Giống hoa to: Đường kính 10-12cm (Pha lê, Đại Đóa…)

+ Giống hoa trung bình: Đường kính 5-7cm (Thọ đỏ, Đỏ nhung…)

+ Giống hoa nhỏ: Đường kính 1-2cm ( Chi trắng, chi vàng…).

Yêu cầu ngoại cảnh hoa cúc

1. Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp đối với đa phần các dòng hoa cúc là từ 20-250C.

2. Ánh sáng

- Ánh sáng có sự ảnh hưởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây hoa Cúc.

Tuy nhiên ở mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triển cây có yêu cầu ánh sáng khác nhau:

+ Thời kỳ cây con: Khi mới ra rễ cây cần ít ánh sáng vì lúc này cây non còn sử dụng các

chất dinh dưỡng dự trữ.

+ Thời kỳ chuẩn bị phân cành: Cây cần nhiều ánh sáng để quang hợp tạo các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của cây.

- Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn: thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ

chiếu sáng trên ngày với nhiệt độ là 20-250C.

- Thời gian chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trưởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất lượng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa

sớm: cây ngắn, chất lượng hoa kém.

3. Ẩm độ

- Độ ẩm thích hợp nhất cho cây sinh trưởng phát triển là độ ẩm đất 60-70%, độ ẩm không

khí 60-65%. Nếu độ ẩm trên dưới 80% cây sinh trưởng mạnh nhưng dễ phát sinh sâu bệnh làm ảnh hưởng năng suất, chất lượng hoa.

4. Các chất dinh dưỡng

- Các yếu tố N, P, K và vi lượng như Ca, Mg, Mn có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng

và phát triển, năng suất phẩm chất các loài

+ Đạm(N): Có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Cúc và ảnh hưởng đến thời kỳ phát triển. Thiếu đạm cây cằn cỗi, lá úa vàng, hoa nhỏ xấu. Nếu thừa đạm cây sinh trưởng

mạnh, thân mập, lá xoăn dày, giòn, cành nhánh nhiều có thể không ra hoa được. Cây Cúc cần nhiều đạm trong gia đoạn phát triển sinh trưởng sinh dưỡng.

+ Lân(P): Có tác dụng làm cho bộ rễ phát triển mạnh, thân cứng, hoa bền, màu sắc đẹp,

nhanh ra hoa, giúp cây hút nhiều đạm và tăng khả năng chống rét cho cây. Thiếu lân, bộ rễ phát triển kém, cành nhánh ít, hoa chóng tàn, màu nhợt nhạt, hoa ra muộn.

+ Kali(K): Giúp cho cây tổng hợp, vận chuyển các chất đường bột trong cây, giúp cây chịu hạn, chịu rét, chống chịu sâu bệnh. Thiếu K màu sắc hoa không tươi thắm, mau tàn. Cúc cần K nhiều nhất vào thời kỳ phân hóa mầm hoa.

Các nguyên tố vi lượng: Cây cần ít nhưng không thể thiếu và không thể dư như Ca, Mg, B, Mn… Thiếu các nguyên tố vi lượng này thì lá sẽ bị vàng làm ảnh hưởng tới quá trình quang hợp, màu sắc hoa sẽ bị nhợt nhạt…

II. Tiến hành thực hành

Chuẩn bị môi trường

1. Pha dung dịch mẹ

Ký hiệu Thành phần Nồng độ (mg/l) Dung dịch stock (mg/l)

Số ml dung dịch cần thiết để pha

500ml môi trường cấy

MS1 ( 20X) KNO3

KH2PO4

NH4NO3

MgSO4.7H2O

MS2( 20X) CaCl2.2H2O

MS3 (200X) H3PO4

MnSO4.4H2O

CuSO4

ZnSO4

NaMo04.2H2O

KI

MS4 (40X) FeSO4.7H2O

Na2-EDTA

100X Myo-inositol

B1

B6

Acide nicotinic

Glycine

Sau khi cân hoá chất xong cho vào lọ thuỷ tinh và cho 500 ml nước cất vào ,đặt lên máy

khuấy tan rồi đổ vào bình có ghi tên từng loại dung dịch.

2.Pha môi trường:

Đối với 1lit môi trường:

Sau đó cho nước cất vào đầy 1 lít dung dịch, đo độ pH cho thích hợp rồi cho vào nồi khuấy

trên máy khuấy, đem đun sôi, rót vào chai thuỷ tinh, dùng nút bông đậy lại và trên mặt có giấy bảo vệ đã khử trùng , sau đó đem hấp.

II. CHUẨN BỊ MẪU CẤY

Mẫu hoa cúc : Cúc được nuôi cấy từ tràng hoa.

- Lựa chọn những cúc to khẻo, không bị bệnh.

- Tách từng tràng hoa ra, có thể để lại lớp ngoài cùng.

- Rửa bằng nước xà phòng loãng, sau đó rửa lại bằng nước sạch

- Lần cuối lấy nước cất tráng lại.

- Khử trùng bằng cồn 700 trong 30 giây.

- Khử trùng bằng nước Javen NaOCl với tỷ lệ 1 NaOCl : 9 H2O trong 15 phút.

- Rửa lại bằng nước vô trùng.

III.QUY TRÌNH CẤY MẪU:

1. Các thao tác trong phòng thí nghiệm trước khi cấy mẫu:

- Khử trùng tủ cấy bằng tia cực tím trong 20-30 phút. Lau chùi bằng cồn 700. Bật đèn và

máy khử trùng lên.

- Khử trùng dụng cụ cấy bằng cách đốt dưới cồn 900

- Khử trùng tay bằng cồn 700 khi vào buồng cấy.

- Khử trùng các dụng cụ chứa môi trưòng nuôi cấy bằng cách xịt cồn vào, lau sạch khi đưa

vào cấy mẫu hoặc có thể hơ trên ngọn lửa đèn cồn.

2. Cấy mẫu :

Chú ý :

• Khi cấy không được chạm tay vào mặt bàn cấy.

• Tay phải hơi nghiêng .

• Thao tác cấy xong phải lau chùi giao và que gắp rồi găm vào máy khử trùng.

• Sau khi cấy xong phải đậy môi trường có mẫu cấy lại như ban đầu.

Gắp mẫu ra bằng que gắp ,đặt lên giấy (đã khử trùng).

Dùng dao cắt bỏ hai đầu chỉ lấy phần cuống của tràng hoa (phần có màu xanh).

Dùng que gắp cấy vào môi trường .

Mỗi lọ môi trường cấy khoảng 5 mẫu.(giàn trải đều mẫu trong môi trường).

IV. CẤY CHUYỂN

Thao tác khử trùng và cấy giống như trên. Nhưng cấy chuyển,nguyên liệu ở đây là : mẫu đã

phát triển thành dạng cây non. Vì vậy cần đòi hỏi thao tác nhẹ nhàng và khéo léo.

- Dùng que lấy mẫu ra khỏi lọ môi trường cũ .Đặt lên giấy cấy.

- Dùng dao cắt, chia từng cây ra, vẫn giữ nguyên cây.

-Đưa vào môi trường nuôi cấy mới. Chú ý mật độ không quá dày ,khoảng 4-5 cây trong

một lọ môi trường là được.

V.CHUYỂN RA NGOÀI MÔI TRƯỜNG ĐẤT

Như chúng ta cũng đã biết ,cây con từ trong môi trường nuôi cấy ban đầu mà chuyển ra môi

trường đất thì rất là khó khăn. Thứ nhất do sự thay đổi môi trường sống , môi trường dinh

dưỡng. Thứ hai cây phải chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Khi cây đuợc khoảng

2 – 3 lá mầm thì đưa ra môi trường.

1.Chuẩn bị cây và môi trường đất:

- Cây được lấy từ trong các lọ đã đủ tiêu chuẩn cấy .

- Rửa bằng nước sạch , sao cho hết phần thạch , không cho dính lại ở cây dù là rất nhỏ.

- Phân loại ra thành các dạng đã ghi rõ trong lọ cấy.

- Nhúng trong dung dịch chống nấm , rồi vớt ra ngoài

+ Đất được lấy ở đây là đất cát nhỏ, không lẫn các hạt sạn lớn.

+ Được trải trong sọt một lớp khoảng 4-5cm.

+ Phun nước vừa ướt đất.

2. Cấy cây:

Tất cả các thao tác đều dùng găng tay .

Dùng que chọc lỗ dưới lớp đất vừa chuẩn bị, đặt cât xuống và lắp lớp đất lại.

3. Đưa vào môi trường chăm sóc:

Sau khi cấy xong , sọt chứa phải được đặt trong môi trường ổn định. Luôn giữ ẩm cho đất,

bề mặt luôn ướt và tránh ánh sáng mặt trời mạnh cũng như nhiệt độ cao .

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ NHẬN XÉT