Kullanılan RT-PCR kitleri

Bio-Speedy Kiti

• Bioeksen / HSGM (RdRp hedef) – R1/R2 solüsyonu kullanan versiyon

• R1: Lizis (Guanidin tiyosiyanat, deterjan, ..)

• R2: İnhibisyonu önlemek, PCR enhancer (BSA, PEG, … )

• Örnek 1/4 dilüe ediliyor

– VNAT kullanan versiyon • İnaktivasyon ve lizis (Organik amonyum

bileşikleri, ….) • Örnek 1/2 dilüe ediliyor

– VNAT içeren taşıma sıvıları + Copan eküvyon • Vorteksle ve mikse ekle.. • Örnek dilüe olmayacak. • Analitik duyarlılık 4 kat iyileşecek

100 ul örnek + 100 ul R1

15 sn vorteks

5 dk inkübasyon

3 dk santrifüj

25 ul süpernatan + 25 ul R2

5 ul RT-PCR’a girer (Toplam hacim: 20 ul)

100 ul örnek + 100 ul VNAT

5 ul RT-PCR’a girer

Coyote Kiti • İki hedef bölge

– ORF1ab (FAM)

– N (ROX) • Pozitiflik için ikisinin de

pozitif olması gerekli

• Tek bölge pozitif ise test tekrarlanır

• İnternal kontrol (HEX)

15 ul örnek + 15 ul tampon

15 ul RT-PCR’a girer

(Toplam hacim: 50 ul)

PCR Laboratuvarı Tasarımı ve Kullanımında Ana Prensipler,

Öneriler

Örnek kabul BGK - KKE

Ekstraksiyon BGK - KKE

Miks hazırlama

Aktarım BGK

Amplifikasyon

Örneklerin Kabulü ve Ekstraksiyon

• Örnekler ile istem eşleştirilir – Örneklerin barkodlu olması

gerekir

• Örnekler ekstraksiyon odasına taşınır.

• Örnekler vortekslenir. • 10 dk beklenir. • Kapakları tek tek açılır.

DİKKAT !!

• Odada sadece gerekli kişiler ve ekipman bulunmalı

• BGK içinde çalışılmalı ve KKE giymelidir (N95 maske)

• Pudrasız eldiven

• Filtreli pipet ucu

• Vorteks sonrası mutlaka 10 dk beklemek

• Eldiven değiştirme

Temiz Oda

• R1 / R2 dağıtımları, temiz odada yapılır.

• Çalışılan örnek sayısı ve kontroller kadar PCR tüpü hazırlanır.

• Yetecek miktarda PCR miks hazırlanır. (vorteks, spin, ..)

• Miks tüplere dağıtılır. • PCR tüpleri soğuk blok üzerinde

aktarım birimine taşınır.

DİKKAT !!

• Odaya ait önlük

– Cerrahi maske

– Pudrasız eldiven

– Pipetör, fitreli pipet ucu

• Bu odaya örnek / kontrol/ekstrakt asla girmez.

• Örnekler ile temas eden hiçbir cihaz, pipetör, vb bu odaya girmez.

• Mümkünse ayrı personel

Aktarım ve Amplifikasyon

• Soğuk blok üzerinde miks içeren tüplere ekstraktlar aktarılır.

• Tüpler amplifikasyon cihazına yerleştirilir, program başlatılır.

• Sonuçlar değerlendirilir.

• Sisteme girilir.

DİKKAT !!

• Soğuk blok dezenfekte edilir.

• Amplifikasyon sonrası tüpler asla açılmaz.

• İşi biten tüpler kapaklı bir atığa atılır.

• Kullanım sonrası tüm kabinlerin ve yüzeylerin temizliği yapılır ve UV açılır.

Amplifikasyon Eğrilerinin Değerlendirilmesi

RotorGene cihazı, Bio-Speedy kiti

İnternal Kontrol HEX (Sarı)

SARS-CoV-2 FAM (Yeşil)

“Dynamic tube” ve “slope correct “ seçilecek

Sonuç: NEGATİF

Sonuç: POZİTİF

İnternal kontrol çalışmamış Sonuç: TEKRAR

Zayıf Reaktifler ?

Pozitifler – Ham Veri

Ham veriden kuvvetli pozitiflerin çıkarılması

Ham veride zayıf reaktiflere odaklanma “auto-scale”

Zayıf reaktiflerin değerlendirilmesi

Zayıf reaktiflerin değerlendirilmesi - 2

“Outlier removal” %5 (gerçek pozitifleri silebilme riski var !)

Zayıf reaktifler • Yeni örnek ile test

tekrarı

– Birden fazla anatomik bölgeden (alt SY, vb) örnek alarak test tekrarı

• Örneği -20/-80 C’de dondurup çözerek test etmek

• Başka ekstraksiyon ve/veya amplifikasyon yönteminiz varsa örneği alternatif yöntem ile test etmek

• Örnek içindeki viral yük az olabilir. • Örnek iyi alınmamış olabilir (internal kontrolde de zayıf sinyal) • Kısmi inhibisyon olabilir (internal kontrolde kısmi baskılanma) • Non-spesifik ışıma olabilir. • Kontaminasyon olabilir (NK sayısını arttırın)

SARS-CoV-2 RT-PCR Test Performansını Etkileyen

Faktörler

RT-PCR Testi Yalancı Negatiflik

• Örnek alımı – Yetersiz materyal alımı

• Örnek transferi – +4 C’de 72 saat

• Örneğe ait faktörler – ÜSY / ASY

– Virüs miktarı • Testin analitik duyarlılığı

• Teknik sorunlar

Yalancı Pozitiflik

• Kontaminasyon

• Diğer yakın virüsler (SARS) ile çapraz reaksiyon

PCR Testi – Preanalitik Faktörler

• Preanalitik evrenin standardizasyonu

– Örnek alımı • Eküvyon tipine bağlı

örnek kalitesi

• Taşıma sıvısı

– Örnek transportu

Değişiklikler konusunda kapsamlı bilgilendirmenin tek merkezden ve tüm kullanıcılara ulaşacak şekilde yapılması

Örnek Seçimi / Alımı • İlk değerlendirme için

– Öncelik NP sürüntü

– Orofarenjiyal sürüntü alınıyorsa NP sürüntü ile birleştirilmesi önerilir

• ASY enfeksiyonu varsa

– Trakeal aspirat, balgam, BAL

– ASY örneği > ÜSY örneği

Zou, NEJM, 2020 HSGM, COVID 19 rehberi CDC, 2019-nCoV-Clinical Specimens Guidelines WHO, Laboratory testing for COVID-19, 2020

Gözünden yaş gelmeli !

RT-PCR Testi – Pozitiflik Süreleri • SY örneklerinde RT-PCR pozitifliği

– Semptomlardan 1-2 gün önce başlar.

• Semptomların ilk haftasında farenkste virüs miktarı

• 4. günde 7x108 kopya

• Hastalığın ileriki dönemlerinde virüs ASY’da daha fazla

– Orta dereceli hastalarda 7-12 gün, ağır vakalarda 2 haftaya kadar pozitif saptanır.

– 24 güne dek uzayabilir.

– Asemptomatik, PCR (+) 14 güne dek bulaştırıcı

www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/COVID-19-Discharge-criteria.pdf Wu Y, Lancet Gastroenterol Hepatol, 2020 Wölfel R, medRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.05.20030502

Test Tekrarı

Kuvvetli klinik şüphe var ama test sonucu (-) ise:

• Yeni bir örnek ile test tekrarı

• Farklı bir anatomik bölgeden/birden çok bölgeden örnek alımı

Asemptomatik / hafif seyirli olgular atlanabilir.

Virüs, enfeksiyonun hangi aşamasında, hangi bölgede/örnekte, ne miktarda bulunur?

Negatif test sonucu enfeksiyonu dışlamaz !

COVID-19 Hızlı Antikor Testi

SARS-CoV-2 Antikor Testi

IgM : • Enfeksiyonun 7-10. günü • Semptomların 3-4. günü

IgG : Enfeksiyonun 11-14. günü

Serokonversiyon >7. gün: %50

Wolfel R, 2020. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 579.

Antikor Testi Olgu 1

Klinik (+), NP PCR (-)

IgM (+) IgG (+)

Trakeal aspirat PCR (+)

Olgu 2

Klinik (+) NP PCR (-)

IgM (+) IgG(-) IgM (+) IgG (+)

Antikor Testi

• PCR (-) semptomlu hastada tanıya destek

• Temaslı sağlık çalışanı değerlendirmesi

– Sağlık Bakanlığı’nın rehber/şemalarında 12.04.2020 tarihli değişiklik ile antikor testinin kullanımı algoritmadan çıkarılmıştır.

Antikor Testleri

• Coronavirüs Laboratuvarları İl Koordinatörlüğü sorumluluğunda,

• Yetkilendirilmiş laboratuvarda PCR ile birlikte uygulanacak,

– Başka bir laboratuvar ve uzman tarafından yapılmayacak,

• Sonuçlar HSYS’ye girilecek