Kombinatorne strategije razvoja fluorescentnih proba · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno...
Transcript of Kombinatorne strategije razvoja fluorescentnih proba · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno...
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno matematički fakultet
Doktorski studij kemije
Kombinatorne strategije razvoja fluorescentnih
proba
4.10.2017.
Moris Mihovilović
Sadržaj
1. Uvod .................................................................................................................................... 3
2. Baze senzora zasnovanih na meti........................................................................................ 4
2.1. Probe za metale ............................................................................................................ 4
2.1.1. Baze nukleinskih kiselina ..................................................................................... 4
2.1.2. Baze peptida ......................................................................................................... 5
2.1.3. Baze malih molekula ............................................................................................ 6
2.1.4. Baze polimera ....................................................................................................... 7
2.2. Baze fluorescentnih senzora za saharide ..................................................................... 8
2.3. Baze fluorescentnih senzora za ATP i peptide ............................................................ 9
2.4. Baze fluorescentnih senzora za hlapljive analite ....................................................... 10
3. Baze senzora zasnovane na raznolikosti ........................................................................... 10
3.1. Kombinatorna derivatizacija poznatih fluorescentnih okosnica ................................ 11
3.1.1. Paladijem-katalizirani coupling .......................................................................... 11
3.1.2. Huisgenova 1,3-dipolarna cikloadicija ............................................................... 12
3.1.3. Knoevenagel kondenzacija, stvaranje amida i nukleofilna supstitucija ............. 13
3.2. De novo konstrukcija fluorescentnih okosnica .......................................................... 14
3.3. Kruto-fazne baze fluorescentnih senzora temeljena na raznolikosti ......................... 14
3.3.1. Baze malih molekula .......................................................................................... 15
3.3.2. Baze peptida i nukleinskih kiselina .................................................................... 15
4. Trendovi i perspektive ...................................................................................................... 17
4.1. Izazov identifikacije mete .......................................................................................... 17
4.2. Dizajn novih kemijskih arhitektura ........................................................................... 17
4.2.1. Višebojne i višemodalne probe .......................................................................... 17
4.2.2. Dinamičke kombinatorne baze senzora .............................................................. 18
5. Zaključci ........................................................................................................................... 18
6. Literatura ........................................................................................................................... 20
3
1. Uvod
Potreba za razumijevanjem osnovnih događaja prepoznavanja u kemiji i biologiji je
usmjerila značajan trud prema razvoju kemijskih probi. Fluorescentne probe su privlačni i
svestrani alati za analitičke senzore zbog svoje visoke osjetljivosti, brzog odziva i tehničke
jednostavnosti. Međutim, mehanizmi koji reguliraju njihovu interakciju s metama često su
slabo poznati, stoga je sposobnost predviđanja strukturnih potreba i dizajna novih
fluorescentnih senzora korištenjem računalnih izračuna ograničena.
Kombinatorni pristupi, prvo korišteni u području pronalaska lijekova pri sintezi velikog
broja strukturno sličnih kandidata, nedavno su poboljšali pripravu i optimizaciju
fluorescentnih probi, posebice u slučaju kompleksnih znanstvenih problema koji ostaju
nedefinirani na razini molekulskog prepoznavanja. Kombinatorne strategije postale su
alternativa racionalnom dizajnu i proširile opseg fluorescentnih senzora na mete koje
prethodno nisu bile dostupne (stanični fenotipovi, makrostrukture i sl.)
Nekoliko revijalnih radova opisalo je efikasnost fluorescentnih proba za razne primjene
(unutarstanični pH indikatori, senzori za reaktivne kisikove i dušikove specije, senzori za
metale, dijagnostički alati) i mehanizme, kao i njihovu sintezu iz određenih kemijskih
struktura (peptidi, aptameri, biomolekulski građevni blokovi, senzorski materijali, DNA-
multikromofori). Jedno od najbrže rastućih područja je upotreba kombinatorne kemije na
fluorescentnim okosnicama te brzi automatizirani screening čijom kombinacijom dolazi do
otkrića velikog broja potencijalnih senzora.1
4
2. Baze senzora zasnovanih na meti
Konvencionalni rad priprave baze fluorescentnih proba baziranih na meti započinje
odabirom analita koji će biti meta. Sljedeći korak je pretraga receptora i elemenata na koji bi
se proba trebala vezati i njihov odnos sa odašiljačima koji provode signal. Takav se signal
može manifestirati različitim mehanizmima kao što su fluorescentno quenchanje, transfer
fluorescentne rezonantne energije, fluorescentna anizotropija, fotoinducirani transfer
elektrona, kelacijom pojačana fluorescencija, osjetljivost na okolinu, metal-bazirana
fluorescencija i drugi. Receptor pojedinog analita može biti unaprijed poznat pa je zadatak
strategije razvoja probe optimirati odašiljač ili mehanizam prijenosa informacije. Češći je
slučaj da receptor reagira na čitavu klasu analita pa se baze senzora grade s ciljem poboljšanja
receptora koji selektivno veže analit od interesa. Kombinatorne strategije mogu nadvladati
ograničenja racionalnog dizajna kad je malo informacija o molekularnom prepoznavanju
dostupno. Mnoge fluorescentne probe razvijene su iz baza senzora baziranim na metama, a u
sljedećim poglavljima biti će svrstane u grupama prema molekulskoj strukturi.1
2.1. Probe za metale
2.1.1. Baze nukleinskih kiselina
Probe za metale su od dugotrajnog interesa zbog njihove biološke i ekološke važnosti.
Potencijal kombinatornih strategija dobro se može prikazati primjenom nukleinskih kiselina
zbog njihove iznimne modulacije, kompatibilnosti sa PCR (polimerazna lančana reakcija)
metodom i automatizirane sinteze koja je dovela do vrlo brojnih baza nukleinskih kiselina, do
1014
u broju specija.1
Jedan od takvih senzora je katalitički senzor za olovo razvijen je baziran na prvom DNA
enzimu u području (slika 1). Takav je senzor mnogo selektivniji za metalne ione, oko 40000
puta od prethodno objavljenih senzora za Pb2+
ione koji su također bazirani na DNA
enzimima.2
5
Slika 1. DNA enzim za selektivno vezivanje Pb2+
kationa
Takav je pristup korištenja DNA enzima primijenjen i na metalne katione Ca2+
i Zn2+
.
Glavni izazov tog područja je pronaći senzor spozoban za specifično i snažno vezanje metala.
Prednost kombinatorne strategije očitala se u korištenju tehnike in vitro odabira koja je
olakšala nalaženje katalitičke DNA koja može vezati željeni metalni ion specifično i snažno.
Nova strategija dala je usavršene rezultate, a riječ je o „negativnom odabiru“ pomoću koje se
odbacuje DNA koja veže metale koji su u kompeticiji za vezanje traženog analita.
Označavanjem probrane katalitičke DNA parom fluorofor/quencher, pronađena je nova klasa
DNA biosenzora za metalne ione.3
2.1.2. Baze peptida
Porast broja peptidnih senzora također se može pripisati mogućnosti modificiranja
strukture i automatizaciji njihove sinteze. Peptidi i proteini sastavljeni su od velikog broja
aminokiselina stoga su njihove baze podosta velike i često uz veću raznolikost nego što je
slučaj kod nukelinskih kiselina.1
Jedan od primjera peptidnih senzora su peptidi koji imaju uklopljen fluorofor 8-hidroksi-
5-(N,N-dimetilsulfonamido)-2-metilkinolin u svoju strukturu za mogućnost in vitro
dijagnostiku Zn2+
iona (slika 2). Kvantna iskorištenja takvih derivata mnogo su bolja od
sličnih kinolinskih proba objavljenih u literaturi. Afiniteti takvih jednostavnih specija prema
cinku čine ih korisnim probama staničnih zbivanja povezanima s visokim razinama cinka.
Spomenuti derivati su dobri kandidati za kasniju inkorporaciju u dizajne senzora sa
proširenim superstrukturama za osjetljivu i selektivnu detekciju cinka u biološke i ekološke
svrhe.4
6
Slika 2. Poznati fluorofor za Zn+ koji je korišten u kombinaciji s peptidima
2.1.3. Baze malih molekula
Smanjena kompleksnost i veličina malih molekula često su najveće prednosti njihovog
korištenja kao proba. Vrlo su korisne kao in vivo fluorescentne probe zbog niske molekulske
mase, visoke kemijske stabilnosti i relativno dobre stanične permeabilnosti. S druge strane,
njihova ograničena mogućnost modifikacije i nedostatak automatizacije sinteze za posljedicu
ima smanjenu veličinu baza takvih probi u odnosu na prethodno spomenute klase.1
Korištenje kombinatorne strategije kao nadogradnja rezultata postignutih racionalnim
dizajnom može se prikazati sljedećim primjerom. Probe za Hg2+
ione razvijene dodatkom na
fluorescentnu jezgru postignute su kombinatornom strategijom koja je uključila
funkcionalizaciju tioureom i selektivno prepoznavanje analita (slika 3). Do konačne strukture
grupa je došla obrnutim redoslijedom nalaska proba, korištenjem fluorescencije postojećih
struktura za nalaženje vezivnih mjesta i konstrukcijom kemosenzorske baze koja koristi novi
mehanizam signalizacije, ograničenu biarilnu torziju fluorofora.5
7
Slika 3. Senzor dobiven kombinacijom racionalnog dizajna i kombinatorne varijacije
2.1.4. Baze polimera
Fluorescentni sintetski polimeri odličan su izvor okolišnih senzora zbog svoje stabilnosti u
grubim uvjetima mogućnosti korištenja u dugotrajnim eksperimentima. Jedinstven način
njihove primjene leži i u pripremi krutih materijala ili membrana koji mogu biti integrirani u
instrumente za detekciju ili optička vlakna. Konjugirani fluorescentni polimeri pokazali su
pojačanu osjetljivost zbog mogućnosti korištenja kao transportni medij, a i zahvaljujući
kolektivnom sistemskom odazivu. Polimerni senzori kompatibilni su s kombinatornom
kemijom zbog mnogih varijabli koje definiraju njihova svojstva, međutim, njihova
manipulacija može biti komplicirana čak i kod primjene sofisticirane automatizacije, stoga
njihove baze znaju biti manje od dosad spomenutih klasa spojeva.1
Primjer sinteze polimernih senzora su fenolni polimeri pripravljeni katalizom
peroksidaznim enzimom soje koji su korišteni kao komponente senzora za metale u nizu
polimera. Polimerni nizovi za Fe3+
, Cu2+
Co2+
i Ni2+
razvijeni su sadržavajući 15 fenolnih
homopolimera i kopolimera generiranih iz pet fenolnih monomera peroksidazom
kataliziranom polimerizacijom. Signalizacija je bazirana na promjeni intrinzične
fluorescencije polifenola uslijed dodavanja metalnog iona ili smjese vodenoj otopini
polifenola. Odaziv kopolimera u nekim se slučajevima drastično razlikovao od odaziva
homopolimera i ovisio je o omjeru konstituirajućih monomera. Takav rezultat potvrđuje da je
velik broj nizova senzora moguće pripraviti iz malog broja fenolnih monomera. Identifikacija
8
određenih metalnih iona izvodi se očitavanjem rezultata i usporedbom sa histogramima
konstuiranim statističkom analizom provedenih eksperimenata.6
2.2. Baze fluorescentnih senzora za saharide
Brojnost bioloških procesa koji uključuju saharide potaknula je intenzivno istraživanje
prema razvoju senzora za ove biomolekule. Dizajn proba visoke specifičnosti i selektivnosti
ostaje zahtjevan zadatak najviše zbog ograničenog broja funkcionalnih skupina, nedostatka
ionske nabijenosti i dinamičkih konfomacijskih stanja. Nadalje, velik broj prisutnih
hidroksilnih skupina ograničava mehanizme prepoznavanja na vodikove veze, što je uvelike
ugroženo od strane kompeticije molekulama vode.1
Jedan od primjera koji je nadvladao izazov vezivanja u vodenim otopinama je korištenje
boronskih estera. Vodikova veza zamijenjena je reverzibilnom kovalentnom, odnosno
stvaranjem cikličkih estera iz diola u bazičnom vodenom mediju (slika 4). Saharidi su odličan
kontinuirani niz cikličkih alkohola što je učinilo strategiju vrlo primijenjivom. Definirajuće
svojstvo ovakvih sustava je ovisnost prisutne specije o pH medija što za uzrok ima i promjenu
odaziva. Korištenje spomenute strategije dalo je značajan doprinos razvoju senzora za
saharide.7
Slika 4. Korištenje boronskih kiselina za vezivanje na saharide
9
2.3. Baze fluorescentnih senzora za ATP i peptide
Svestranost molekule ATP-a i njegova ključna uloga u mnogim metaboličkim
mehanizmima kao i visoka sličnost molekuli GTP-a čine ga zahtjevnim analitom u razvoju
proba. Mnogi radovi u području razvoja ovakvih senzora koriste se SELEX metodologijom
koja predstavlja tehniku kombinatorne kemije koja proizvodi oligonukleotide ili dijelove
RNA ili DNA za selektivno vezivanje za određeno aktivno mjesto.1
Slično nukleotidima, mali peptidi predstavljaju ključnu ulogu u većini staničnih sustava.
Njihova molekulska sličnost izazvala je korištenje kombinatorne kemije kao glavni pristup
otkrivanju novih senzora za takve molekule.1 Kao jedan od primjera mogu se navesti senzori
bazirani na kaliksarenima koji su kombinatornim pristupom sintetizirani za pronalazak proba
za peptide. S obje strane kaliks[4]arena vezani su nizovi aminokiselina koji čine
peptidokaliksarene (slika 5). Nakon pretrage velikog broja pripravljenih kaliksarena (153)
odabrani su oni koji su selektivno vezali peptid koji je odabran kao analit na sebe. Oni s
najznačajnijim rezultatima izdvojeni su i okarakterizirani s ciljem daljnje optimizacije.8
Slika 5. Kaliksarenska okosnica i aminokiselinski lanci kao senzori za peptide
10
2.4. Baze fluorescentnih senzora za hlapljive analite
Hlapljivi analiti predstavljaju izazov zbog mogućeg utjecaja na stabilnost kemijskih proba.
Zbog spomenutog razloga, za senzore takvih specija najčešće se koriste polimeri.1
Jedan od primjera je serija pripravljenih π-konjugiranih polimera od fenilenvinilenskih,
fenilenetinilenskih, fluorenskih i tiofenskih derivata sa bipiridil ili terpiridilnim supstituentima
unutar ili na strani π-konjugirane okosnice (slika 6). Takvi ligandno modificirani kopolimeri
služe kao makromolekularne osnove za vodljive metalopolimere, a u konkretnom slučaju
istražena su optička i fotoluminiscentna svojstva polimera i odgovarajućih bakrovih
metalopolimera. Takav metalopolimer reducira se iz Cu2+
stanja u Cu+ stanje reakcijom s
dušičnim oksidom uz velike emisijske promjene koje variraju od 50% smanjenja do 320%
povećanja. Najbolji su rezultati uočeni pri metalopolimerima koji su imali Cu2+
vezanu na
bipiridilne jedinice unutar okosnice što predstavlja najbolje kandidate za senzore dušičnog
oksida.9
Slika 6. Senzor za dušični oksid na bazi metalopolimera
3. Baze senzora zasnovane na raznolikosti
Uspjeh baza senzora temeljenih na metama ovisi o uključenju afiniteta probe prema meti
(receptorski elementi i molekulske interakcije) kao i o prilagodbi mehanizama koji prevode
događaj prepoznavanja u fluorescentni signal. S ciljem promjene metodologije i povećanog
11
broja pronalazaka efikasnih senzora, baze zasnovane na raznolikosti koriste kombinatornu
kemiju za generiranje baza molekula koje imaju obje uloge, receptorsku i odašiljačku. Takav
pristup nudi nekoliko prednosti: širi opseg uporabe i korištenje bez prethodnog znanja o
strukturi mete i nedostatak potrebe za dodatnim mehanizmom odašiljanja. S druge strane,
manjkavost tog sustava leži u potrebi za pretraživanjem mnogo većeg opsega modifikacija na
postojeće i otkriće novih struktura kako bi se otkrili pouzdani senzori. Grana kojoj ovaj
pristup najviše pogoduje je kombinatorna kemija malih molekula, originalno korištena u
okviru pronalaska lijekova. Dva su glavna pristupa, derivatizacija poznatih fluorescentnih
okosnica komercijalno dostupnim materijalima i konvencionalnim metodama sinteze ili
sinteza višekomponentnim, „one-pot“ ili tandemskim reakcijama kojima se pristupa de novo
fluorescentnim strukturama.1
Slika 7. Poznate okosnice korištene kao fluorescentni senzori
3.1. Kombinatorna derivatizacija poznatih fluorescentnih okosnica
3.1.1. Paladijem-katalizirani coupling
Jedan od prvih primjera baze su dobivene derivatizacijom kumarinske okosnice
paladijem-kataliziranim couplingom. Takve su reakcije kompatibilne sa raznim
funkcionalnim skupinama (alkeni, alkini, boronske kiseline) stoga su korisne u okviru
kombinatorne strategije.1
12
Jedan od zapaženijih radova u području je iskoristio mogućnosti couplinga
derivatizacijom 3-bromokumarina Heck, Sonogashira i Suzuki reakcijom (slika 8). Dobiveni
produkti produljili su π-sustav postojećeg kromofora i dali obećavajuće rezultate. Efikasnost
kombinatornog pristupa ovisila je o kompatibilnosti komponenata couplinga i mogućnost
korištenja u sličnim reakcijskim uvjetima. Koristeći spomenute reakcije, na osnovnu strukturu
uvedeni su arenski, etinilenski i etenilenski elementi. Pročišćenim specijama dobivene baze
ispitana su spektroskopska svojstva i dobiveni rezultati apsorpcijskih maksimuma (314 – 430
nm) i emisijskih maksimuma (400 – 569 nm) vrlo su širokog raspona. Količina prikupljenih
podataka je dovoljna za detaljnu analizu korelacije geometrijskih i elektronskih struktura
dobivenih molekula što omogućuje olakšani racionalni dizajn molekula sličnih svojstava koja
mogu sadržavati planirano željene karakteristike.10
Slika 8. Defivati kumarina dobiveni paladijem kataliziranim couplingom
3.1.2. Huisgenova 1,3-dipolarna cikloadicija
Kao jedan od prototipova „klik-kemije“ Huisgenova cikloadicija može se pohvaliti
jednostavnošću, visokom efikasnošću i blagim reakcijskim uvjetima. Zbog svega se
navedenog vrlo često koristi u bazama senzora temeljenih na raznolikosti.1
Primjer korištenja kombinatorne strategije u ovom kontekstu ponovo uključuje
kumarinske produkte sintetizirane u velikim količinama. Visoka reaktivnost aromatskih azida
također korištenih u sintezi omogućila je laku pripravu brojnih različitih produkata koji mogu
biti vezani na biomolekule, polimere, nanočestice i razne druge površine. Takve dobivene
boje prve su koje koriste kombinatornu azido-alkinsku sintezu. Blagi reakcijski uvjeti i
13
jednostavna obrada olakšali su paralelnu sintezu čime je dobiven veliki broj molekula širokog
raspona apsorpcijskih i emisijskih maksimuma. Količina prikupljenih podataka korisna je i za
analizu odnosa strukture i spektroskopskih svojstava.11
Slika 9. Derivati kumarina dobiveni 1,3-Huisgenovom dipolarnom cikloadicijom
3.1.3. Knoevenagel kondenzacija, stvaranje amida i nukleofilna supstitucija
Knoevenagelove kondenzacije imaju poseban značaj u kombinatornoj fluorescentnoj
kemiji zbog couplinga aromatskih aldehida koji obično rezultira produženom π-konjugacijom
koja uzrokuje crveni pomak emisijskih valnih duljina fluorescentnih okosnica.1
Spomenutom kondenzacijom sintetizirana je prva baza BODIPY spojeva reakcijom
dimetil-BODIPY okosnice sa 160 različitih benzaldehida (slika 10). Korištenjem dobivenih
molekula, obavljen je screening različitih staničnih linija i pronađena je specija nazvana
Glucagon Yellow koja je selektivno označavala AlphaTC1 stanice. Selektivnost je potvrđena
in vitro usporedbom promjene intenziteta fluorescencije u prisutsnoti 19 različitih biološki
relevantnih analita. Rezultati su pokazali potencijalnu upotrebu kao agens za označavanje u
živim stanicama i tkivima.12
Slika 10. Derivati BODIPY spojeva s benzaldehidima
14
3.2. De novo konstrukcija fluorescentnih okosnica
S obzirom na ograničen broj fluorescentnih okosnica koje se mogu smatrati sintetski
fleksibilnima, više je istraživačkih grupa krenulo u konstrukciju novih fluorescentnih specija s
ciljem razlikovnosti.1
Jedan od uspješnih pokušaja je sinteza dihidropirolo[3,4-β]indolizin-3-ona koji je pokazao
odlična svostva i primijenjivost. Promjenom suspstituenata emisijski maksimumi dobivenih
produkata potpuno su podesivi kroz cijeli spektar vidljivog zračenja (slika 11). Supstituenti se
razlikuju po elektronskim svojstvima, a dobiveni su „one-pot“ reakcijama koje su vrlo
efikasno generirale kompleksnost iz jednostavnog skeleta. Novootkriveni fluorofori imaju
odlična fotofizička i fotokemijska svojstva, zadovoljavajuća kvantna iskorištenja, neovisnost
o pH medija, velike Stokes-ove pomake, visoku lipofilnost i permeabilnost membrana.13
Slika 11. Nova fluorescentna okosnica s podesivim odzivima
3.3. Kruto-fazne baze fluorescentnih senzora temeljena na raznolikosti
Korištenje krute faze u konstrukciji baza senzora komplementira kemiju razvijenu u
otopinskoj fazi. Dobro je ustanovljena sinteza nukleinskih kiselina i peptida u krutoj fazi, a
screening na zrncima (on-bead screening) predstavlja najpraktičniji i direktniji način procjene
takvih baza. Mali molekulni senzori na zrncima nailaze na prepreke u obliku smetnji krute
površine u događaju prepoznavanja, pa optimizacija takvih sustava zahtijeva mnogo više
vremena. Umjesto toga, male molekule pripremljene u krutoj fazi usmjerene su prema
povećanju kemijske raznolikosti proba i pojednostavljenju postupka njihovog pročišćavanja.1
15
3.3.1. Baze malih molekula
Napredak u polju baza malih molekula pristupom kruto-fazne kemije učinjen je sintezom
benzopiranilnih derivata. Cilj istraživanja bio je povećanje molekulske raznolikosti u
paralelnoj kruto-faznoj sintezi korištenjem pristupa „od baze do baze“. Modifikacija skeleta
efikasno je postignuta raznim kemijskim transformacijama ključnih intermedijera, vinilnih
trilfata. Primjeri navode Suzuki arilaciju, Stille vinilaciju i kasniju dijastereoselektivnu Diels-
Alderovu reakciju, Negishi alkinilaciju koju slijedi Huisgenova cikloadicija. Navedenim
reakcijama pripravljena su tri temeljna skeleta čija je daljnja funkcionalizacija kruto-faznom
paralelnom sintezom omogućila više od 400 specija za analizu bioloških i spektroskopskih
svojstava.14
Slika 12. Derivati malih molekula vezani na krute nosače
3.3.2. Baze peptida i nukleinskih kiselina
Konvencionalne metodologije za kruto-faznu sintezu peptida i nukleinskih kiselina
pogodovale su njihovom screeningu kao čvrste platforme. Smetnje nosača u procesu
prepoznavanja u slučaju peptida i nukleinskih kiselina su najčešće zanemarive jer su probe
obično velike makromolekule. Za razliku of fluorofora ili sintetski konjugiranih polimera,
16
peptidi i nukleinske kiseline inače ne fluoresciraju i više je strategija prema njihovoj
funkcionalizaciji u tom smjeru. Jedna od strategija je screening na zrncima prema
fluorescentnim metama kako bi rezultirajuća fluorescentna zrnca mogla biti sortirana i
analizirana nakon pranja viška supstrata. Takav je pristup primijenjiv na brojne mete: male
molekule, antibiotike, proteine i stanice. Kao alternativa, nudi se označavanje baza peptida na
zrncima.1
Jedni od senzora izgrađenih od nukleinskih kiselina su oligodeoksifluorozidi, kratki
oligomeri nalik DNA u kojem su nukleotidne bae zamijenjene fluoroforima. Neke od takvih
sekvenci mogu reagirati na male organske molekule u plinovitoj fazi, praćene uz promjenu
fluorescencije. Baza od više od 2 tisuće različitih tetramera sintetizirana je kombinatornom
metodom i obavljen je screening za 10 različitih hlapljivih organskih spojeva raznolikih
funkcionalnih skupina, kiselina, baza, aromatskih i alifatskih. Izdvojeni su najbolje reagirajući
senzori i dodatno karakterizirani. Neki od senzora fluorescirali su u prisutnosti osam od 10
analita i dali različite odzive za svaki od njih uz vrlo jaki signal, čak i za vrlo slične analite
poput akroleina i akrilonitrila.15
Slika 13. Oligomerni senzori za hlapljive spojeve
17
4. Trendovi i perspektive
4.1. Izazov identifikacije mete
Nakon uspješnog otkrića fluorescentnih proba za organele, fenotipove ili stanična stanja,
istraživači su pred zahtjevnim zadatkom identifikacije makromolekula koje se vežu za te
probe i odgovorne su za njihovu selektivnost. Identifikacija mete ostaje jedna od
najdugotrajnijih faza kemijske genetike. Taj se izazov odnosi i na kemijske fluorescentne
probe, s jedinom prednošću što njihova intrinzična fluorescencija podržava i izolaciju
proteina. Iako postoje mnogi alati (probe bazirane na aktivnostima, afinitetna kromatografija,
fotocross-linking reagensi i bioortogonalna klik kemija) koji mogu ubrzati taj proces,
kemijske modifikacije koje kompromitiraju selektivnost fluorescentnih proba su obično
potrebne za identifikaciju molekularne mete. Baze molekula temeljene na raznolikosti koje
razmatraju inkorporaciju kemijskih alata za identifikaciju mete u svojem dizajnu mogle bi
ponuditi brži prijelaz iz automatiziranog screeninga na velikom broju meta do otkrića meta
vezivanja.1
4.2. Dizajn novih kemijskih arhitektura
4.2.1. Višebojne i višemodalne probe
Rastući interes u razvijanju alata za snimanje aktivirao je primjenu fluorescentnih proba u
vizualizaciji kompleksnih molekulskih događaja in vivo. Višebojni alati omogućavaju
istovremeno praćenje nekoliko (do 5) bioloških procesa. Peptidima funkcionalizirane kvantne
točke za višebojno označavanje pojedinih stanica i NIR-označeni dendrimeri za in vivo
vizualizaciju limfnih čvorova su reprezentativni primjeri. Budući kombinatorni primjeri mogli
bi uključiti više spektralnih mogućnosti fluorescentnih molekula ili njihovu kombinaciju sa
sličnim svojstvima (Raman raspršivanje) za pripravu proba poboljšane selektivnosti i
osjetljivosti.1
Još jedan rastući trend u in vivo snimanju tiče se konstrukcije višemodalnih probi koje
kombiniraju optičko snimanje s anatomskim informacijama (magnetska rezonancija, pozitron-
emisijska tomografija, ili komputirana tomografija). Iako postoje objavljene višemodalne
probe koje kombiniraju fluorofore, kvantne točke, nanočestice željezovog oksida, materijale
18
na bazi gadolinija ili radioizotope, njihova prilagodba kombinatornoj sintezi ili
automatiziranom screeningu još zahtijeva značajnu optimizaciju.1
4.2.2. Dinamičke kombinatorne baze senzora
Dinamičke baze senzora otvorile su pristup novim fluorescentnim arhitekturama koje
rijetko mogu biti dostignute ostalim kombinatornim srategijama. Takve su baze konstruirane
iz građevnih blokova koji su reverzibilno vezani iminskim, hidrazonskim, acetalnim ili
disulfidnim poveznicama. Takvi blokovi asociraju se u kompleksnije ravnotežne smjese
spojeva s koncentracijama koje odgovaraju njihovoj ravnotežnoj stabilnosti. Nakon što se
analit izloži takvoj smjesi, uspostavlja se novo globalno stanje ravnoteže koje odgovara
komponentama s najvišim afinitetom za analit (Slika 14).1
Slika 14. Uspostavljanje ravnoteže dinamička kombinatorna baza senzora
5. Zaključci
Primjena kombinatorne kemije u razvoju fluorescentnih senzora doživjela je značajni
porast u posljednjih 5-10 godina. Nekoliko je ciljeva ispunjeno: prilagodba okosnica malih
molekula paralelnoj sintezi, inkorporacija fluorescentnih elemenata u automatiziranu pripravu
nukleinskih kiselina i peptida, integracija profiliranih i evolucijom baziranih strategija s
ciljem poboljšanja selektivnosti i osjetljivosti senzora kao i značajna tehnološka dostignuća u
području automatiziranog snimanja i prikupljanja podataka. Navedenim napretkom,
konvencionalne baze temeljene na meti proširene su prema onima temeljenim na raznolikosti
i proširile opseg pronalaska fluorescentnih senzora. Takve su nove baze uspješne u
19
identifikaciji novih strukturnih motiva vezivanja, posebno za mete koje prethodno nisu mogle
biti proučavane.
Porast de novo konstrukcije fluorescentnih okosnica i dinamičke kombinatorne kemije su
dobri primjeri priprave novih i kompleksnih senzora. Baze potencijalnih probi također moraju
uzeti u obzir izazov prepoznavanja mete od početnog dizajna zbog kemijskih modifikacija
koje se događaju nakon uspješnog porepoznavanja koje mogu narušiti njihovu selektivnost i
usporiti proces identifikacije.1
Rastući broj tehnoloških napredaka u području, brzine obavljenih mjerenja, a i sinteze
samih potencijalnih senzora obećava još efikasniju pretragu i veći broj pronalazaka takvih
molekula u bliskoj budućnosti.
20
6. Literatura
1. M. Vendrell, D. Zhai, J. C. Er, Y. Chang, Chem. Rev. 112 (2012) 4391–4420.
2. T. Lan, K. Furuya, Y. Lu, Chem. Commun. 46 (2010) 10466.
3. Y. Lu, J. Liu, J. Li, P. J. Bruesehoff, C. M. B. Pavot, A. K. Brown, Biosens.
Bioelectron. 18 (2003) 529.
4. D. A. Pearce, N. Jotterand, I. S. Carrico, B. Imperiali, J. Am. Chem. Soc. 123 (2001)
5160-5161.
5. J. V. Mello, N.S. Finney, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 10124-10125 6. X. Wu, J. Kim, J. S. Dordick, Biotechnol. Prog. 16 (2000) 513. 7. T. D. James, K. R. A. S. Sandanayake, S. Shinkai, Angew. Chem. Int. Ed. 35 (1996)
1910. 8. H. Hioki, M. Kubo, H. Yoshida, M. Bando, Y. Ohnishi, M. Kodama, Tetrahedron
Lett. 43 (2002) 7949. 9. R. C. Smith, A. G. Tennyson, A. C. Won, S. J. Lippard, Inorg. Chem. 45 (2006) 9367. 10. M. Schiedel, C. A. Briehn, P. Bäuerle, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 4024-4680. 11. K. Sivakumar, F. Xie, B. M. Cash, S. Long, H. N. Barnhill, Q. Wang, Org. Lett. 6
(2004) 4603-4606. 12. J.Lee, N. Kang, Y. K. Kim, A. Samanta, S. Feng, H. K. Kim, M. Vendrell, J. H. Park,
Y. Chang, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 10077–10082. 13. E. Kim, M. Koh, J. Ryu, S. B. Park, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 12206–12207. 14. S. Oh, H. J. Jang, S. K. Ko, Y. Ko, S. B. Park, J. Comb. Chem. 12 (2010) 548–558. 15. F. Samain, N. Dai, E. T. Kool, Chem. Eur. J. 17 (2011) 174 – 183.