KIT CMV BRITE TURBO

Antigenemia para CMVpor Imunofluorescência

Características do Kit

. Resultados em até 2 horas

. Requer de 1 a 2 ml de amostra

. Kit completo

. Procedimento simples

. Fácil interpretação do resultado

. Recomendado para diagnóstico e

. Registrado na Anvisa e FDA (EUA)

monitoramento de infecções por CMV

Apresentação da Técnica

I. Preparação da suspensão de leucócitos

. Diluir a solução de lise 1:10 em água destilada (4oC).. Misturar 1ml de sangue e completar para 15 ml com a solução de lise e incubar por 15 min a 4oC. . Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante. . Repetir a lise se a primeira for insuficiente, por 5 min. . Ressuspender o pellet em 5 ml de PBS.

. Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante. . Ressuspender o pellet em 0,5 ml de PBS (em pacientes com neutropenia severa pode-se suspender am até 0,2 ml).

II. Contagem e Concentração Celular

. Utilizar hemocitômetro, contador automático celular ou câmara de Neubauer . Ajustar a concentração em 2x106 células por ml com PBS (ou a critério da instituição).

III. Preparação de lâminas de Citocentrifugado

. Centrifugar 100 μl da suspensão celular a 600 rpm por 4 minutos em lâminas de vidro na citocentrífuga. . Preparar pelo menos 2 lâminas por amostra de cada paciente (1 p/ o teste e outra p/ reserva técnica). . Secar as lâminas por 20 minutos.

. Circundar o citocentrifugado c/ caneta hidrofóbica.Obs: As lâminas podem permanecer overnight antes da fixação

IV. Fixação e Permeabilização

. Diluir o fixador (reag. B) 1:5 em PBS em frasco escuro antes de usar. . Diluir a solução de permeabilização (reag. C) 1:5 em PBS em frasco escuro antes de usar. Não reutilize. . Imergir as lâminas no fixador diluído por 5 min atemperatura ambiente em câmara escura.

. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-lasimersas por 3 min.

. Imergir as lâminas na sol. de permeabilização diluída por 1 min a temperatura ambiente em câmara escura. . Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira,

deixá-lasimersas por 5 min. Não ultrapassar 60 min.

V. Armazenamento de lâminas (congelamento)

. Secar com ventilador por 20 minutos.

. Embalar em papel laminado e estocar a 4o C ou congelar a -20o C.

Obs: Quando for utilizar, rehidratar por 5 min com PBS.

VI. Coloração por Imunofluorescência

. Não deixar que as lâminas sequem durante a coloração. . Rehidratar as lâminas e o controle em PBS por 1 a 2 min.. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e secar cuidadosamente a área do citocentrifugado.

. Aplicar 35 μl do anticorpo monoclonal primárioe incubar por 20 min a 37o em câmara úmida e escura.

. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-lasimersas por 3 min.

VI. Coloração por Imunofluorescência (cont.)

. Lavar 2 vezes em PBS e retirar o excesso batendo a Lâmina em papel absorvente.

. Aplicar 35 μl do anticorpo conjugado e incubar por20 min a 37o em câmara úmida e escura.

. Montar com glicerina tamponada diluída e cobrir com lamínula.

. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e secar cuidadosamente a área do citocentrifugado.

VII. Leitura das lâminas

. Ler toda a lâmina. Células positivas mostram coloração verde-amarelada no núcleo polilobulado da célula.

. Utilizar microscópio de fluorescência usando aumentode 400x. O aumento de 1000x pode ser usado para

. Realizar a leitura assim que possível. As lâminas podem ser estocadas a 4o C em câmara fechada para minimizar a perda da fluorescência.

aumentar a resolução e tirar dúvidas.

VIII. Controle de Qualidade

relada. Se os controles não apresentarem estes resul-

. Lâminas controle negativas e positivas devem ser coradasEm paralelo com as amostras para demonstrar colora- ção apropriada. O controle positivo mostra coloração homogênea verde-amarelada ao redor do núcleo. O controle negativo não apresenta coloração verde-ama-

tados a coloração deve ser considerada inválida.

Controle Positivo