Az izocitrt-dehidrogenz (ICDH) s az izocitrt-liz (ICL) hatsa a carbon fluxus sztvlasztsra az izocitrt csompontnl E. coli acetton trtn nvekedse esetn(esettanulmny)Ksztette: Fleki Lilla

Mirl is lesz sz?Acetton val nvekedse sorn az E. colinak szksge van a glioxalt ciklusra is kiegsztknt bioszintetikus prekurzorok ellltsra. Kzvetlen verseny a glioxalt-ciklus izocitrt enzime (ICL) s a Krebs-ciklus izocitrt dehidrogenz enzime (ICDH) kztt.Izocitrtra: affinitsICDH > affinitsICL, de: magas intracellulris izocitrt koncentrci+az ICDH rszleges inaktivlsva az ICL-nek s MS-nak (malt-szintetz) kedvez (br nem talltk mg meg azt az in vivo szignlt, ami felersti a glioxalt utat, s az is biztos, hogy nem az acett az (El-Mansi 1998).

V1V2V6V7V4V5V8V3

Walsh s Koshland (1984): mennyisgileg meghatrozta a kt g carbon fluxus arnyt az izocitrt csompontnl (radioaktvan jellt izotpos vizsglat+NMR spektroszkpia)Cl: ICDH, ICL, (MS) enzimek relatv hozzjrulsnak meghatrozsa a carbon fluxus tlagos elosztshoz a kp-i metabolizmus klnbz enzimei kztt.MetaModel szoftvercsomaggal meghatroztk:-steady-state fluxusokat s a klnbz metabolitok koncentrciit-elasztikus koefficiensek mtrixt-kontroll s vlasz koefficiensek klnbz steady-state-ek alatt Adatok elemzse: Kacsers MCA terija s a sebessgmeghatroz lps koncepci alapjn.

A modellMetaModel 2.1 (Cornish-Bowden s Hofmeyr 1991) szoftver: az sszes vltoz vltozst kpes mrni s szimullni; s ennek alapjn kalkullni a fluxus, metabolit koncentrci s koefficiens vltozsokat.A metabolit koncentrci vltozsokat differencil egyenletek rjk le:-sszesen 8 klnbz reakci: ezek kzl a 6. s a 7. talakulsi sebessgei az ICL s MS lineris kapcsolata miatt azonosak.-Steady-state llapotban a vltozs mrtke minden metabolitnl 0, azaz a kpzdsi sebessg nett rtke megegyezik a fogyaszts temvel.-A ciklusban vannak n. metabolit-poolok: melyek 3 klnbz reakciban is rszt vehetnek.

A skeleton modell egyenslyi egyenletei

Egyenslyi egyenletFlux kapcsolatok0=V1-V2-V6 (izocitrt)>V1=V2+V60= V2-V4-V3 (L-ketoglutart)>V2=V3+V4>V3=V2-V40= V4+V6-V5 (szukcint)>V5=V4+V6>V4=V5-V60=V6-V7 (glioxalt)>V6=V70=V5+V7-V8-V1 (oxl acett)>V1+V8=V5+V7>V8=V5-V2

Az enzimatikus reakcik felrsnak alapjul egy Michaelis-Menten tpus egyenlet szolglt:v=(VfS/Ks-VrP/Kp)/(1+S/Ks+P/Kp)ahol:Vf s Vr : Vmax rtkek az oda- s visszafel jtszd reakcikbanS: szubsztrtP: termkKs, Kp: Michaelis-Menten konstansok (vagyis adott metabolitra vett Km rtkek)

Az egyenletek vgigkvetik a vltozs mrtkt s az sszes szubsztrt koncentrci vltozst az acetil-CoA belpst kveten.Figyelembe veszik az ICDH s ICL eltr aktivitst.Walsh s Koshland (1984): az ICDH reverzibilis inaktivlsa a fluxus 1/3-nak az ICL-on keresztli ramlst eredmnyezi (vagyis 2,6:1-hez az ICDH javra) ezrt 0,388 a modellben az ICL(E6) koncentrci, mg a tbbi enzim 1.Illetve az acetil-KoA, glutamt s a PEP (mint kls metabolitok) intracellulris koncentrcii: 56; 1,06; 1,69 mM-nak lettek rgztve ezek mutatjk, hogy az E. coli 1 gramm biomassza szrazanyag bioszintzishez ilyen bemeneti acetil-KoA s ilyen kimeneti glutmt s oxlacett mennyisg szksges (El-Mansi s mtsai 1994).

(A sebessgek mmolelfogyasztott szubsztrt /perc/ 10 ml sejttrfogat-ban kifejezve.)

EnzimSebessgMetabolitok (mM)Sebessg[E1]=1,00001,1117[x]=56,0000 (Ac-KoA input)rgztett[E2] =1,00000,8008[OAA]=0,2236vltoz[E3] =1,00000,0468[ISO]=0,1174vltoz

[E4] =1,00000,7540[KET]=0,1551vltoz

[E5] =1,00001,0469[Y]=1,0600 (GLU output)rgztett

[E6]=0,3880 (ICL)0,3109[SUC]=0,3880vltoz

[E7] =1,00000,3109[GLY]=0,0322vltoz

[E8] =1,00000,2642[Z]=1,6900 (PEP output)rgztett

Eredmnyek I.7.5 bra:Ahogy az ICDH-n keresztli carbon fluxus lecskkent az izocitrt intracellulris koncentrcija megemelkedett olyan szintre, ami fenntartja az ICL-n keresztli fluxust (annak gyengbb affinitsa ellenre).

A tovbbi adatok azt mutattk, hogy brmilyen cskkens az ICDH koncentrcijban a carbon fluxus ICL-en (s MS-en) keresztli megnvekedst eredmnyezi.Ez feltlti elsdleges kztitermkekkel s bioszintetikus prekurzorokkal a kzponti anyagcsereutat.

Az ICDH-n keresztli fluxus hatssal van a kzponti anyagcsere t tbbi enzimjre is:Az sszegzsi ttel alapjn (Kacser s Burns 1973) az enzimek fluxus kontroll koefficienseinek sszege (JICDH-ra) 1.

Ismtls:fluxus kontroll koefficiens: adott anyagcseret adott enzimn keresztli fluxus relatv vltozsnak mrtke vlaszul az enzim (sajt)koncentrcijnak kis mrtk vltozsra.elaszticits koefficiens: a szubsztrt vagy az adott ko-faktor koncentrcijnak kis mrtk vltozsbl add relatv fluxus vltozs mrtke.

ICDHICDHICLICLMSMS

A fluxus kontroll koefficiens:-Rendszerjellemz-rtke nem teljesen fggetlen az anyagcseret tbbi enzimtl.-A tbbi enzim fluxus kontroll koefficiens rtkeivel val kapcsolatot az sszegz ttel adja meg. -Az elaszticitsi koefficienssel val kapcsolatt a konnektivitsi ttel rja le ami figyelembe veszi a kinetikai tulajdonsgait az sszes anyagcseretban rsztvev enzimnek.Vlasz koefficiens: a externlis effektorok hatsa a metabolikus fluxusra.Nagy mrtkben fgg az enzim elaszticitsi s a fluxus kontroll koefficienseitl (az effektorra vonatkozan). Hogy az effektor a fluxusra hatni tudjon, ezen rtkeknek elg magasnak kell lennie.

Eredmnyek II.7.4, 7.5, 7.6 brk:Az ICDH koncentrcijnak 1 fltti nvekedse mr sem az enzimen keresztli fluxust, sem az enzim fluxus kontroll koefficienst nem nveli.Msrszt brmilyen cskkens a ICDH intracellulris aktivitsban jelents hatssal van az enzim carbon fluxusra s fluxus kontroll koefficiensre. Vagyis: ha az ICDH aktivitst 20%-ra, vagy annl kisebbre cskkentjk, az ICDH fluxus kontroll koefficiense nvekszik (s ez az enzim carbon fluxusban is ltszdik).Teht az ICDH-n keresztli fluxus acetton val nvekedskor meghaladja a cellulris ignyeket, gy nem lehet sebessg-meghatroz.

7.7 braICL aktivitsnak kzvetlen vltoztatsa az enzimkoncentrci szisztematikus nvelsvel egy bizonyos kszbrtket elrve a 2 ciklus sszehangoltan mkdik, s tbb nem gond a fluxus megoszlsa ICL s ICDH kztt.Ha nveljk ICL koncentrcijt: az ICDH-n s az ICL-n keresztli fluxus is nni kezd az intracellulris izocitrt koncentrci rovsra (ami csak 0,271 mM-ig emelkedik).Ha 100-ra nveljk az ICL koncentrcit: ICDH-n keresztli carbon fluxus 115 mmol/min, ICL pedig 378 mmol/min-re emelkedik.

sszefoglals:

Az ICDH koncentrci nvelse egy vad-tpusban megfigyelt kszbrtk felett nem jr egytt ICDH-n keresztli fluxus nvekedssel sem nmagban, sem az egsz kzponti anyagcseret esetn. Csak az izocitrt pool kimerlst okozza, s gy cskkenti a glioxalt ton keresztli fluxust.ltalnossgban: Egyetlenegy enzim aktivitsnak fokozsa/koncentrci nvelse nem megfelel megolds arra, hogy egy adott anyagcsereutat felerstsnk, produktivitst nveljk.(De ez nem vonatkozik katalitikus aktivits cskkentsre!)

Egy, az anyagcseretban minden enzimet aktivl effektor koncentrcijnak nvelse szlelhet nvekeds okoz a fluxusban (s a hozamban) fleg akkor, ha az rintett enzimek relatv magas fluxus kontroll koefficienssel rendelkeznek.E. coli acetton val nvekedse sorn az ICL-n keresztli fluxus esszencilis. (nem csak kiptolja a kzponti anyagcsereutat prekurzorokkal, hanem fenntartja a magas intracellulris izocitrt koncentrcit)Egy bizonyos ICL koncentrci kszbrtk felett a Krebs ciklus s a glioxalt mellkt sszehangoltan mkdik.

Krdsek:Mi az ICDH, ICL s az MS? Milyen kapcsolat ll fent az ICDH s az ICL kztt?Mi az a MetaModel?Az enzimatikus reakcik felrsnak alapjul szolgl Michaelis-Menten tpus egyenletMi trtnik, ha nveljk az ICL aktivitst? Mi a kvetkezmnye az ICDH koncentrci emelsnek? Mit mutat meg az elaszticitsi koefficiens s a fluxus kontroll koefficiens?Mitl fgg a vlasz koefficiens rtke, s hogyan?Mi trtnik, ha ICDH aktivitst 20%-ra, illetve az al visszk?Hogyan hat egy effektor a hozamra?Mit llapthatunk meg vgeredmnyben az ICL-en keresztli fluxusrl, illetve a glioxalt anyagcseretrl?

Ksznm a figyelmet!