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KARINA MUNHOZ DE PAULA ALVES COELHO
AVALIAO DA EXPRESSO DOS GENES CADM1, TWIST1 e CDH1 POR
IMUNO-HISTOQUMICA EM LESES MELANOCTICAS
JOINVILLE
2017
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KARINA MUNHOZ DE PAULA ALVES COELHO
AVALIAO DA EXPRESSO DOS GENES CADM1, TWIST1 e CDH1 POR
IMUNO-HISTOQUMICA EM LESES MELANOCTICAS
Dissertao de mestrado apresentada como
requisito parcial para a obteno do ttulo de
mestre em Sade e Meio Ambiente, na
Universidade da Regio de Joinville.
Orientador: Professor Dr. Paulo Henrique
Condeixa de Frana.
JOINVILLE
2017
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AGRADECIMENTO
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela
concesso de bolsa (modalidade parcial) por meio do Programa de Suporte Ps-
Graduao de Instituies de Ensino Particulares.
Ao orientador Prof. Dr. Paulo Henrique Condeixa de Frana pelo grande
conhecimento transmitido. Sempre paciente, disponvel e disposto a ajudar.
Ao Dr. Herclio Fronza Jnior que participou de todas as etapas da construo deste
estudo contribuindo com seu conhecimento e entusiasmo pelo desenvolvimento
cientfico e pela pesquisa.
Aos membros da banca de avaliao, Dr. Caio Maurcio Mendes de Crdova e Dr.
Edson Sydney de Campos, que disponibilizaram do seu tempo para contribuir com
seus conhecimentos para a concluso deste estudo.
Ao Centro de Diagnsticos Antomo-Patolgicos (CEDAP) que contribuiu com as
amostras, estrutura e com o financiamento dos reagentes necessrios a este estudo.
A todos os membros da equipe do CEDAP que contriburam em diferentes fases
deste estudo.
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RESUMO
Introduo: O melanoma maligno uma doena agressiva e sua incidncia est
aumentando no mundo. A predisposio gentica e a exposio a fatores
ambientais, principalmente a luz solar, so fatores de risco. A distino
histopatolgica entre nevos e melanomas pode ser difcil. Prev-se que a avaliao
da expresso imuno-histoqumica de alguns genes poderia contribuir para o
diagnstico diferencial de leses histogicamente questionveis. Objetivo: Investigar
se a avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e
CDH1 (E-caderina), que participam dos mecanismos de adeso celular e transio
epitelial-mesenquimal, contribui para o diagnstico diferencial das leses
melanocticas de difcil diagnstico. Metodologia: Estudo transversal retrospectivo
baseado na avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1,
TWIST1 e CDH1 por imuno-histoqumica em amostras de 30 nevos compostos
displsicos, 30 melanomas com menos de 1,0 mm de espessura e 30 melanomas
com mais de 1,0 mm de espessura, diagnosticados no perodo de 2013 a 2016, em
Joinville/SC. Foi utilizado um score que avaliou a intensidade da colorao e a
proporo de clulas coradas. Resultados: Em comparao aos nevos melanocticos
compostos displsicos, observou-se reduo significativa da expresso dos genes
CADM1 e CDH1 nos melanomas (abaixo e acima de 1,0 mm de espessura) e nos
melanomas de mais de 1,0 mm de espessura, respectivamente. Tambm se
verificou menor expresso dos genes CADM1 e CDH1 nos melanomas com mais de
1,0 mm de espessura em relao aos melanomas com menos 1,0 mm. O gene
TWIST1 no apresentou diferena significativa da expresso entre os grupos.
Concluso: Estes achados permitem concluir que a expresso imuno-histoqumica
do CADM1 tem potencial para contribuir como ferramenta auxiliar ao diagnsico
diferencial entre nevos melanocticos compostos displsicos e melanomas.
Palavras chave: Imuno-histoqumica, CADM1, TWIST, CDH1, melanoma, nevo
displsico.
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ABSTRACT
Introduction: Malignant melanoma is an aggressive disease and its incidence is
increasing worldwide. Genetic predisposition and exposure to environmental factors,
especially sunlight, are risk factors. Histopathologic distinction between nevi and
melanoma can be difficult. It is anticipated that the evaluation of the
immunohistochemical expression of some genes could contribute to the differential
diagnosis of questionable histologically lesions. Objective: To investigate wether the
evaluation of the immunohistochemical expression of genes CADM1, TWIST1 and
CDH1 (E-cadherin), that take part in mechanisms of cell adhesion and epithelial-
mesenchymal transition, contributes to the differential diagnosis of melanocytic
lesions difficult to diagnose. Methodology: Retrospective cross-sectional study based
on immunohistochemical expression evaluation of genes CADM1, CDH1 and
TWIST1 in samples of 30 dysplastic compound nevus, 30 melanomas with less than
1.0 mm thick and melanomas with more than 1.0 mm thick, diagnosed between 2013
and 2016, in Joinville/SC. A score was used to evaluate color intensity and proportion
of cells stained. Results: There was a significant reduction in the expression of the
genes CADM1 and CDH1 in melanomas (below and above 1.0 mm thick) and in
melanomas of more than 1.0 mm in thickness, respectively, compared to dysplastic
melanocytic nevi. There was also lower expression of the genes CADM1 and CDH1
genes in melanomas greater than 1.0 mm thick compared to melanomas less than
1.0 mm. The gene TWIST1 showed no significant difference in expression between
groups. Conclusion: These findings allow us to conclude that the
immunohistochemical expression of CADM1 has the potential to contribute as an
auxiliary tool to the differential diagnosis between dysplastic compound nevus and
melanoma.
Key-words: immunohistochemstry, CADM1, TWIST, CDH1, cutaneous melanoma,
dysplastic nevus.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Melancitos humanos confinados camada basal da epiderme.
..........................................................................................................
20
Figura 2: Variao geogrfica da incidncia do melanoma no mundo.por
100.000 habitantes. .........................................................................
21
Figura 3: Nevo melanoctico juncional. Proliferao de clulas nvicas na
juno dermo-epidrmica. ...............................................................
22
Figura 4: Nevo melanoctico composto. Proliferao de clulas nvicas na
juno dermo-epidrmica e na derme. ............................................
23
Figura 5: Nevo melanoctico intradrmico. Proliferao de clulas nvicas
na derme..........................................................................................
23
Figura 6: Nevo melanoctico juncional displsico. Presena de atipias
celulares, hiperplasia melanoctica, fibrose lamelar, juno dos
cones epidrmicos...........................................................................
24
Figura 7: Melanoma de disseminao superficial. Presena de clulas
frequentemente migrando para a superfcie....................................
25
Figura 8: Leso assimtrica com bordas irregulares e pigmentao
variegada..........................................................................................
26
Figura 9: Fatores genticos e ambientais que contribuem para o
desenvolvimento do melanoma.......................................................
26
Figura 10: Paciente com mltiplos nevos displsicos. ..................................... 27
Figura 11: Radiao UV associada ao risco de melanoma pelo aumento
miR21...............................................................................................
29
Figura 12: Vias de controle da proliferao celular e
apoptose...........................................................................................
30
Figura 13: Vias de crescimento celular e de sobrevida..................................... 31
Figura 14: Aberraes moleculares na progresso do melanoma.................... 33
Figura 15: Via ERK durante a melanognese que impacta na expresso
fenotpica dos melanomas malignos................................................
36
Figura 16: Fatores de transcrio que controlam o mecanismo de transio
epitelial-mesenquimal -TEM (EMT) .................................................
37
Figura 17: Representao da expresso imuno-histoqumica dos nveis de
-
CADM1. Barra 1: melanoma cutneo; Barra 2: nevo displsico;
Barra 3: pele normal. Os melanomas mostram nveis mais baixos
de expresso de CADM1.................................................................
39
Figura 18: TWIST inibe a E-caderina que fundamental para o mecanismo
de TEM (EMT). ................................................................................
42
Figura 19: Modelo da via ERK1/2TWIST1MMP-1 na cascata do
melanoma. A ativao do ERK1/2 leva a um aumento na
transcrio do TWIST1.....................................................................
43
Figura 20: (A e B) Ausncia de expresso nuclear do TWIST1 em nevos
melanocticos intradrmicos. (C e D) Metstase de melanoma em
linfonodo mostrando imunorreatividade para TWIST1.....................
44
Figura 21: Aumento da expresso da N-caderina e diminuio da E-caderina
no melanoma invasivo. ....................................................................
46
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AJCC American Joint Committee on
Cancer
Comit Americano Conjunto sobre
Cncer
Akt Serine/threonine kinase 1 Serina/treonina quinase 1
BAD BCL2-associated agonist of
cell death
Agonista de BCL2 associado
morte celular
BCL2 B-cell lymphoma 2 Linfoma de clulas B 2
BRAF Rapidly accelerated
fibrosarcoma kinase B
Quinase B do fibrossarcoma
rapidamente acelerado
CADM1
CAPES
Cell adhesion molecule 1 Molcula de adeso celular 1
Coordenao de Aperfeioamento
de Pessoal de Nvel Superior
CCND1 Cyclin D1 Ciclina D1
CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 Ciclina dependente de quinase 4
CDK6 Cyclin-dependent kinase 6 Ciclina dependente de quinase 6
CDKN2A Cyclin-dependent kinase
inhibitor 2
Inibidor de ciclina dependente de
quinase 2
CEDAP Centro de Diagnsticos Antomo-
Patolgicos
CEP Comit de tica em Pesquisa
CGH Comparative genomic
hybridization
Hibridizao genmica
comparativa
CNS Conselho Nacional de Sade
CONEP Comisso Nacional de tica em
Pesquisa
DNA Deoxyribonucleic acid cido desoxirribonucleico
FT-TEM Fatores indutores da transio
epitelial-mesenquimal
ErbB2 Receptor tyrosine kinase 2 Receptor de tirosina quinase 2
ErbB3 Receptor tyrosine kinase 3 Receptor de tirosina quinase 3
ERK Extracellular signalregulated Quinase regulada por sinal
https://cancerstaging.org/references-tools/deskreferences/pages/default.aspxhttps://cancerstaging.org/references-tools/deskreferences/pages/default.aspxhttps://en.wikipedia.org/wiki/Comparative_genomic_hybridizationhttps://en.wikipedia.org/wiki/Comparative_genomic_hybridizationhttp://conselho.saude.gov.br/
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kinase extracelular
FISH Fluorescent in situ
hybridization
Hibridizao in situ fluorescente
GSK1120212 Trametinib
HDM2 Human double minute 2 Duplo minuto 2 humano
HGNC HUGO Gene Nomenclature Nomenclatura de genes HUGO
HRAS Harvey rat sarcoma viral
oncogene
Oncogene Viral do Sarcoma do
Rato Harvey
IGSF4A Immunoglobulin superfamily,
member 4c
Membro 4c da superfamlia de
imunoglobulina
IL-6 Interleukin 6 Interleucina 6
INCA Instituto Nacional do Cncer
KRAS Kirsten rat sarcoma viral
oncogene
Oncogene viral de sarcoma de rato
Kirsten
MAPK Mitogen activated kinase-like
protein
Protena tipo quinase ativada por
mitgenos
MDM2 Murine double minute 2 Duplo minuto 2 murino
MEK MAP kinase-ERK kinase MAP quinase-ERK quinase
Mel-CAM Melanoma cell adhesion
molecule
Molcula de adeso celular de
melanoma
microRNA Micro ribonucleic acid Micro cido ribonucleico
miR-21 Micro ribonucleic acid 21 Micro cido ribonucleico 21
MITF Microphthalmia-associated
transcription
Fator de transcrio associado
microftalmia
MMP2 Matrix metalloproteinase-2 Matriz metaloproteinase-2
MMP9 Matrix metalloproteinase-9 Matriz metaloproteinase-9
NADH Nicotinamide adenine
dinucleotide
Dinucletdeo de nicotinamida e
adenina
NADPH Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate
Fosfato de dinucleotdeo de
nicotinamida e adenina
NIH National Institutes of Health Institutos Nacionais de Sade
NRAS Neuroblastoma RAS viral
oncogene homolog
Homlogo do oncogene viral RAS
do neuroblastoma
http://www.lookformedical.com/definitions.php?q=Fator+de+Transcri%C3%A7%C3%A3o+Associado+%C3%A0+Microftalmia&lang=3http://www.lookformedical.com/definitions.php?q=Fator+de+Transcri%C3%A7%C3%A3o+Associado+%C3%A0+Microftalmia&lang=3https://en.wikipedia.org/wiki/Nicotinamide_adenine_dinucleotide_phosphatehttps://en.wikipedia.org/wiki/Nicotinamide_adenine_dinucleotide_phosphatehttps://www.nih.gov/
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OMS Organizao Mundial da Sade
p14ARF Alternate reading frame protein
14
Protena 14 de fase de leitura
alternada
PI3K Phosphoinositide 3-kinase Fosfatidilinositol 3-quinase
p16INK4a Kinase a inhibitor 16 protein Protena 16 inibidora da quinase a
PCR Polymerase Chain Reaction Reao em Cadeia da Polimerase
PLX4032 Vemurafenib
PTEN Phosphatase and tensin
homolog
Homlogo de tensina e fosfatase
RAF Proto-oncogene,
serine/threonine kinase
Proto-oncogene, serina/treonina
quinase
SNAIL1 Snail family transcriptional
repressor 1
Repressor transcripcional 1 da
famlia caracol
SNAIL2 Snail family transcriptional
repressor 2
Repressor transcripcional 2 da
famlia caracol
SPSS Statistical Package for the
Social Sciences
Pacote Estatstico para as
Cincias Sociais
SYNCAM Synaptic adhesion molecule Molcula de adeso sinptica
TSLC1 Tumor suppressor in lung
cancer 1
Supressor de tumor 1 no cncer
de pulmo
TWIST1 Twist Family Basic helix-loop-
helix Transcription Factor 1
Fator 1 de transcrio bsico
hlice-ala-hlice da famlia
TWIST
TWIST2 Twist Family Basic helix-loop-
helix Transcription Factor 2
Fator 2 de transcrio bsico
hlice-ala-hlice da famlia
TWIST
UNIVILLE Universidade da Regio de
Joinville
UV Ultravioleta
UVA Ultravioleta A
UVB Ultravioleta B
UVC Ultravioleta C
ZEB1 Zinc Finger E-Box Binding Ligao dedo de zinco E-Box
https://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helixhttps://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helixhttps://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helixhttps://en.wikipedia.org/wiki/Basic_helix-loop-helix
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Homeobox 1 Homeobox 1
ZEB2 Zinc Finger E-Box Binding
Homeobox 2
Ligao dedo de zinco E-Box
Homeobox 2
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SUMRIO
1 INTRODUO 15
2 OBJETIVOS 18
2.1 OBJETIVO GERAL 18
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 18
3 REVISO DE LITERATURA 19
3.1 LESES MELANOCTICAS 19
3.1.1 Conceito 19
3.1.2 Epidemiologia 19
3.1.3 Classificao 22
3.1.3.1 Nevos 22
3.1.3.2 Melanomas 24
3.1.4 Fatores de risco 26
3.1.4.1 Fatores de risco genticos 26
3.1.4.2 Fatores de risco ambientais 27
3.1.5 Patologia molecular 29
3.1.5.1 Patologia molecular dos melanomas 29
3.1.5.2 Patologia molecular dos nevos 32
3.1.5.3 Molculas de adeso celular 34
3.1.5.4 Mecanismo de transio epitelial-mesenquimal 34
3.2 DIAGNSTICO DAS LESES MELANOCTICAS 37
3.2.1 Patologia molecular como auxiliar no diagnstico 38
3.2.2 Marcadores de imuno-histoqumica 38
3.2.2.1 CADM1 39
3.2.2.2 TWIST1 41
3.2.2.3 CDH1 45
4 METODOLOGIA 47
4.1 TIPO DE ESTUDO 47
4.2 LOCAL DE ESTUDO 47
4.3 PERODO DO ESTUDO 47
4.4 AMOSTRAS E CRITRIOS DE INCLUSO 47
4.5 PROCEDIMENTOS METODOLGICOS 48
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4.5.1 TCNICA DE IMUNO-HISTOQUMICA 48
4.5.2 LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULATDOS 50
4.6 ANLISE ESTATSTICA 50
4.7 ASPECTOS TICOS 51
5 RESULTADOS E DISCUSSO 52
6 CONCLUSO 67
REFERNCIAS 68
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15
1. INTRODUO
O melanoma maligno uma das doenas mais agressivas nos seres
humanos. O nmero estimado de mortes por melanoma de 48.000 por ano, em
todo o mundo (ZHANG; LI, 2012) e h um aumento na incidncia nas populaes
caucasianas (KISZNER et al., 2014).
O melanoma muito resistente quimioterapia convencional e apenas em
torno de 14% de pacientes com doena metasttica sobrevivem por 5 anos
(ZHANG; LI, 2012). A remoo cirrgica da leso primria, antes das metstases,
o principal tratamento e o mais eficaz, embora a abordagem teraputica do
melanoma metasttico j tenha terapias alvo (UGUEN et al., 2015).
A predisposio gentica e a exposio a fatores ambientais aumentam o
risco para melanoma. Indivduos com histrico familiar comprovado tem risco
significativamente maior para o desenvolvimento desta malignidade (JHAPPAN;
NOONAN; MERLINO, 2003). A exposio ocupacional, o estilo nutricional e
principalmente a exposio a luz solar so fatores ambientais relacionados ao
desenvolvimento do melanoma cutneo. Mudanas significativas na expresso de
micro cido ribonucleico (microRNA) em resposta exposio ambiental tm sido
relatadas (MELNIK, 2015).
A preciso do diagnstico do melanoma crtica para a conteno da
malignidade. Portanto, se pacientes com melanoma forem subdiagnosticados, eles
podem ser inadequadamente tratados e estarem em risco potencial para a
disseminao regional ou sistmica da doena (ZHANG; LI, 2012).
O exame histopatolgico permanece atualmente como "padro ouro" para o
diagnstico de leses melanocticas. No entanto, a distino histopatolgica
definitiva entre as leses benignas e as malignas, em alguns casos, pode ser difcil
(UGUEN et al., 2015). Apesar de vrias caractersticas histolgicas do melanoma
terem sido descritas, muitos critrios se sobrepem aos dos nevos displsicos e de
outras formas de nevos benignos, como os nevos de Spitz. Portanto, o nvel de
discordncia no diagnstico de certas leses melanocticas pode ser elevado,
mesmo quando examinados por patologistas experientes (KASHANI-SABET et al.,
2009). descrita uma discordncia interobservador relativa ao diagnstico de nevo
e melanoma variando de 2,3 a 25% das leses (UGUEN et al., 2015).
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16
A expresso gnica pode ser til para a classificao de neoplasias, definio
de prognstico e ainda como um marcador preditivo para terapia (KASHANI-SABET
et al., 2009). Marcadores moleculares podem ser utilizados como ferramentas
diagnsticas nas leses melanocticas uma vez que nevos e melanomas diferem
pela ausncia ou presena de aberraes cromossmicas (UGUEN et al., 2015). As
vias de sinalizao celular, controle do ciclo celular e de apoptose, dentre outras,
tm sido implicadas no desenvolvimento do melanoma. Porm, h evidncia que
nevos benignos podem ser clonais e conter alteraes genticas predisponentes
para o melanoma, como exemplo a mutao BRAF-V600E (quinase B do
fibrossarcoma rapidamente acelerado, V600E). (KISZNER et al., 2014).
Ferramentas citogenticas, tais como hibridizao genmica comparativa
(CGH) e a hibridizao in situ por fluorescncia (FISH) foram desenvolvidas para
ajudar na classificao de leses melanocticas ambguas. No entanto, estes
mtodos moleculares requerem equipamentos apropriados e patologistas
qualificados, portanto, no so utilizados rotineiramente na maioria dos laboratrios
(KASHANI-SABET et al., 2009).
Ao contrrio, a imuno-histoqumica difundida e utilizada na maioria dos
centros de patologia. No entanto, nenhum dos marcadores isolados, ou mesmo um
conjunto deles, at o momento, suficiente para classificar inequivocamente uma
leso melanoctica como nevo ou melanoma (UGUEN et al., 2015).
Molculas de adeso celular, incluindo as caderinas, integrinas e as da
superfamlia das imunoglobulinas esto envolvidas em um ou mltiplos passos da
cascata de metstase (MCGARY; LEV; BAR-ELI, 2002). A E-caderina e a Molcula
de adeso celular 1 (CADM1) so molculas de adeso que tem demonstrado sua
expresso anormal nos melanomas (REES, 2012).
A perda da E-caderina representa a marca da transio epitelial mesenquimal
em tumores epiteliais e tambm evidente nos estgios tardios do melanoma,
especialmente em metstases nodais (CARAMEL et al., 2013).
A perda da expresso imuno-histoqumica do CADM1, que frequentemente
ocorre nos melanomas, indica que esta molcula de adeso poderia servir como um
marcador de melanoma em leses histologicamente questionveis (YOU; ZHANG;
ZHENG, 2012).
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17
descrito que os nveis de CADM1 so inversamente relacionados aos nveis
de expresso do gene do fator 1 de transcrio hlice-ala-hlice bsico da famlia
Twist (TWIST1) que responsvel por regular genes envolvidos na adeso celular
(HARTSOUGH et al., 2015).
O TWIST1 est envolvido no processo de transio epitelial mesenquimal
(TEM) (KHAN et al., 2013) que um processo onde as clulas perdem as
propriedades de adeso e adquirem critrios mesenquimais, permitindo sua invaso
e migrao (BECK et al., 2015).
Portando, avaliar a expresso imuno-histoqumica em conjunto dos genes
CADM1, TWIST1 e CDH1 (E-caderina) em nevos e melanomas importante para
determinar se estas molculas podem auxiliar no diagnstico diferencial das leses
melanocticas.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099
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18
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e CDH1
em leses melanocticas.
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Investigar se a expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e
CDH1, nas leses melanocticas pode contribuir para o diagnstico diferencial entre
nevos melanocticos compostos displsicos e melanomas;
Analisar a expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e
CDH1, em relao a espessura dos melanomas;
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19
3. REVISO DA LITERATURA
3.1 LESES MELANOCTICAS
3.1.1 Conceito
As leses melanocticas caracterizam-se pela proliferao de melancitos que
so clulas derivadas da crista neural (GRANT-KELS, 2007). Os melanancitos
esto na camada basal da epiderme ao lado de queratincitos na proporo de 1:30
(Figura 1). A principal funo dos melancitos proteger o cido desoxirribonucleico
(DNA) da radiao solar atravs da produo do pigmento melanina
(PAPADOGEORGAKIS, 2013).
As leses benignas da linhagem melanoctica so denominadas de nevos
melanocticos e as leses malignas de melanomas (BASTIAN, 2014). Os nevos
displsicos so descritos como sendo um continum entre nevo e melanoma porque
eles so morfologicamente e biologicamente intermedirios entre estas duas
entidades (GOLDSTEIN; TUCKER, 2013)
O diagnstico de nevo e melanoma comum na prtica anatomopatolgica.
Ainda assim, a familiaridade de tais proliferaes nem sempre est ligada ao
conforto interpretativo na determinao de suas propriedades biolgicas (WICK;
PATTERSON, 2005). O diagnstico diferencial entre nevo, nevo displsico e
melanoma, em muitos casos, pode ser desafiador (ZEMBOWICZ; PRIETO, 2010).
3.1.2 Epidemiologia
Os nevos so alteraes melanocticas cutneas comuns, tendo em mdia
entre 10 a 40 nevos por pessoa. Em contrapartida, o melanoma muito menos
frequente (MAGAA, 1994).
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20
Figura 1. Melancitos humanos confinados camada basal da epiderme. Fonte: Adaptada de
PAPADOGEORGAKIS, 2013.
Os nevos displsicos so relativamente comuns na populao geral. Autores
tm descrito uma prevalncia variando de 2 a 53% em diferentes estudos,
dependendo do critrio diagnstico (clnico e histolgico). Uma estimativa mais
acurada considera estar presente entre 2 a 8% dos caucasianos, apresentando-se
frequentemente em indivduos com menos do que 30 a 40 anos de idade. A
frequncia de nevo displsico em pacientes com histria de melanoma muito mais
alta chegando a 59% (SILVA et al., 2011).
Apesar do melanoma no ser to frequente quanto os carcinomas de pele, ele
tem alta taxa de mortalidade, com mais de 2.000 mortes no Reino Unido, em 2011.
Na Irlanda do Norte, o nmero de melanomas aumentou de 103 casos por ano entre
1984-1992 para 258 casos por ano entre 2004-2009 (MCCOURT; DOLAN;
GORMLEY, 2014).
A American Cancer Society estima que para 2016, nos Estados Unidos da
Amrica (EUA), aproximadamente 87.110 novos melanomas sero diagnosticados,
sendo 52.170 em homens e 34.940 em mulheres (AMERICAN CANCER SOCIETY,
2017)
O melanoma cutneo representa aproximadamente 4% de todos os tumores
malignos da pele e sua frequncia est aumentando no Brasil e em muitos outros
pases (MINISTRIO DA SADE, 2016).
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21
A distribuio global do melanoma demonstra a importncia da radiao
ultravioleta (UV) na patogenese desta doena. Pases que esto localizados em
latitudes mais perto da linha do Equador tem maiores taxas de melanoma em
pessoas de pele clara. Altitude elevada tambm um factor de risco para o
desenvolvimento de melanoma, presumivelmente, porque a radiao UV maior
devido a uma menor interferncia entre a energia solar e material particulado
presente na atmosfera. Embora a latitude e a altitude possuam um papel
fundamental para desenvolvimento do melanoma, o fototipo tambm um
componente importante para explicar as variaes na incidncia de melanoma em
todo o mundo. A Amrica Central, apesar de estar mais perto do equador do que a
Amrica do Norte, tem uma taxa de incidncia mais baixa presumivelmente devido o
predomnio de pele mais escura (Figura 2) (HAWRYLUK; FISHER, 2011)
Figura. 2 Variao geogrfica da incidncia de melanoma no mundo por 100.000 habitantes
Fonte: Adaptada de HAWRYLUK; FISHER, 2011.
Conforme estimativa do Instituto Nacional do Cncer (INCA), em 2016 no
Brasil, o melanoma afetar de 4 a 6 pessoas por 100.000 habitantes e com
incidncia mais alta nas regies sul e sudeste (COSTA; FERNANDES; BORGES,
2015).
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22
Um estudo que avaliou as caractersticas dos melanomas em Joinville/SC, no
perodo de 2003 a 2014, encontrou uma incidncia elevada em comparao aos
ndices do Brasil. Uma das explicaes para esse achado que Joinville habitada
predominantemente por populao de pele clara que vive prximo ao litoral onde,
muitas vezes, tem atividades recreativas com exposio solar de modo intermitente,
numa rea com relativa rarefao da camada de oznio e com alto ndice de
radiao UV (STEGLISH, 2015).
3.1.3 Classificao
Os nevos so leses melanocticas benignas e os melanomas leses
melanocticas malignas (BASTIAN, 2014). O melanoma in situ e o lentigo maligno
so consideradas leses pr-malignas (MCCOURT; DOLAN; GORMLEY, 2014) e os
nevos displsicos so descritos como sendo leses intermedirias entre nevo e
melanoma (GOLDSTEIN; TUCKER, 2013).
3.1.3.1 Nevos
Os nevos podem ser adquiridos, que so os mais comuns e possuem trs
estgios histolgicos: juncional (Figura 3), composto (Figura 4) e intradrmico
(Figura 5). Os nevos podem ser congnitos que so aqueles presentes ao
nascimento e correspondem em torno de 1% de todos os nevos. H nevos
melanocticos fusiformes que se encontram na derme entre os feixes de colgenos e
excepcionalmente se associam com melanoma (MAGAA, 1994).
Figura 3. Nevo melanoctico juncional. Proliferao de clulas nvicas na juno dermo-
epidrmica. Fonte: MACKEE, 2012.
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23
Figura. 4. Nevo melanoctico composto. Proliferao de clulas nvicas na juno dermo-
epidrmica e na derme. Fonte: MACKEE, 2012.
Figura. 5. Nevo melanoctico intradrmico. Proliferao de clulas nvicas na derme. Fonte:
MACKEE, 2012.
Os nevos ainda so classificados como displsicos baseados em
caractristcas clnicas e histopatolgicas (DUFFY; GROSSMAN, 2012a).
Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS) e o National Institutes of
Health (NIH), o diagnstico histopatolgico de nevos displsicos baseado em
critrios maiores (mandatrios) e critrios menores (pelo menos dois precisam estar
presentes). Os critrios maiores so hiperplasia melanoctica contgua ou lentiginosa
e atipia focal melanoctica. Os critrios menores so fenmeno de ombro, fuso
epitelial dos cones, fibrose lamelar concntrica subepidrmica e infiltrado
inflamatrio linfoctico perivascular superficial (Figura 6) (SILVA et al., 2011).
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24
Figura 6. Nevo melanoctico juncional displsico. Presena de atipias celulares, hiperplasia
melanoctica, fibrose lamelar, juno dos cones epidrmicos. Fonte: MACKEE, 2012.
A presena de 100 ou mais nevos com pelo menos um nevo com dimetro
maior do que 8 mm e um nevo com caractersticas clnicas de atipia, em pacientes
com antecedente familiar de melanoma cutneo, caracteriza a sndrome do nevo
atpico clssica, descrita por Clark (CLARK et al., 1978). No entanto, a definio
dessa sndrome controversa. Em 1992 o NHI definiu esta sndrome como sendo a
ocorrncia de melanoma em pelo menos um parente de primeiro ou segundo grau,
grande quantidade de nevos (mais de 50), sendo alguns clinicamente atpicos e com
caractersticas histolgicas distintas (REZZE; LEON; DUPRAT, 2010).
3.1.3.2 Melanomas
O melanoma compreende subtipos relacionados a diferentes caractersticas
clnicas, histolgicas e a localizaes anatmicas. A OMS baseia-se na classificao
proposta por Clark h quase 30 anos que utiliza aspectos morfolgicos para
diferenci-lo em quatro tipos principais: melanoma de disseminao superficial, o
mais frequente (Figura 7), lentigo maligno melanoma, melanoma nodular e
melanoma acral lentiginoso (BASTIAN, 2014).
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25
Figura 7. Melanoma de disseminao superficial. Presena de clulas frequentemente
migrando para a superfcie. Fonte: WEEDON, 2010.
O Colgio Americano de Patologistas utiliza a classificao da OMS
modificada, que inclui os seguintes subtipos: melanoma de disseminao superficial,
melanoma nodular, lentigo maligno melanoma, melanoma lentiginoso acral,
melanoma lentiginoso de mucosa, melanoma desmoplsico neurotrpico, melanoma
com origem em nevo azul, melanoma com origem em nevo congnito gigante,
melanoma da infncia, melanoma nevoide, melanoma sem outra classificao
(FRISHBERG et al., 2009) (LAGA; MURPHY, 2010).
Os melanomas so caracterizados clinicamente pela presena de mcula
hipercrmica com variao na colorao e bordas irregulares (COSTA;
FERNANDES; BORGES, 2015). As leses pigmentadas so avaliadas pelo
mnemnico ABCDE (Figura 8) que inclui assimetria, irregularidade nos bordos,
variao na cor, dimetro maior que 5 mm e evoluo (SHIRAZI et al., 2015). A
sensibilidade do diagnstico clnico dos melanomas para dermatologistas
experientes relatada em torno de 70% (GARBE et al., 2012). A associao da
dermatoscopia pode aumentar a sensibilidade para 90% e apresentar com
especificidade de 50% (BOURNE et al., 2012).
Os critrios que formam a base do esquema de estadiamento incluem
espessura do tumor primrio, ulcerao, mitoses, metstases. A classificao T
baseia-se na espessura do tumor: menor ou igual a 1 mm, maior que 1 a 2 mm,
maior que 2 a 4 mm e superior a 4 mm (DUNCAN, 2009).
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26
Figura 8. Leso assimtrica com bordas irregulares e pigmentao variegada. Fonte: MCCOURT; DOLAN; GORMLEY, 2014.
3.1.4 Fatores de risco
O risco significativo para o desenvolvimento de melanoma em humanos est
associado predisposio gentica e a exposio a fatores ambientais (Figura 9)
(JHAPPAN; NOONAN; MERLINO, 2003).
Figura 9. Fatores genticos e ambientais que contribuem para o desenvolvimento do melanoma. Fonte: PSATY et al., 2010.
3.1.4.1 Fatores de risco genticos
Em 1820, Norris descreveu o que atualmente considerado predisposio
familiar ao melanoma. Em 1978, Clark, relatou um aumento da incidncia de
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27
melanoma cutneo em famlias com mltiplas leses melanocticas (Figura 10),
introduzindo o modelo de progresso do tumor de melanoma a partir de nevo
melanoctico. Na poca, Clark usou o termo sndrome B-K usando as iniciais dos
sobrenomes de pacientes. Atualmente, os termos sndrome do nevo displsico e
sndrome familiar do nevo displsico/melanoma tem sido utilizado. Em 1985, Elder
estendeu a teoria do nevo-melanoma'' para nevos displsicos espordicos como um
possvel precursor de melanoma espordico (SILVA et al., 2011).
Figura 10. Paciente com mltiplos nevos displsicos. Fonte: (PSATY et al., 2010)
Pode-se argumentar que o melanoma tem um componente gentico, uma vez
que os fatores de risco hereditrios, como caractersticas fsicas tais como pele
clara, cabelos ruivos, olhos azuis e a sndrome familiar do nevo displsico-
melanoma so determinados geneticamente (TSAO et al., 2012). Alm disso, a
histria pessoal de melanoma aumenta o risco para um segundo melanoma. Sabe-
se que de 1 a 8%, ou mais, dos pacientes com histria prvia de melanoma vo
desenvolver mltiplos melanomas primrios e o risco de um segundo melanoma
primrio aumenta para 19% entre pacientes com histria familiar positiva (PSATY et
al., 2010).
3.1.4.2 Fatores de risco ambientais
Dos fatores de risco ambientais para o desenvolvimento do melanoma, a luz
solar considerada a principal causa (BRESSAC-DE-PAILLERETS et al., 2002).
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28
A radiao UV, que est associada ao desenvolvimento do melanoma, pode
ser classificada em UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). A
UVC e a maioria dos comprimentos de onda UVB so bloqueados pela camada de
oznio e apenas uma frao de UVB e UVA atinge a superfcie da Terra
(MCCOURT; DOLAN; GORMLEY, 2014).
O aumento dos melanomas que ocorreu nos ltimos anos foi associado com a
depleo da camada de oznio, que resulta em maior radiao UVB alcanando a
Terra. No entanto, estudos afirmam que a maioria dos melanomas, em torno de
92%, so decorrentes de danos indiretos ao DNA, causados pela radiao UVA,
supondo-se que a depleo da camada de oznio no a responsvel pelo
aumento radical dos melanomas nos ltimos anos (VOLKOVOVA et al., 2012).
Na leso direta ao DNA, a radiao UVB faz com que haja a formao de
ligaes covalentes entre os pares de bases de citosina e timina no DNA e forma
dmeros de pirimidina (dmero de ciclobutano). Na leso indireta ao DNA, h
absoro da radiao UVA por molculas fotossensibilizadoras que transferem
energia para molculas de oxignio que se transformam em oxignio singleto, que
altamente reativo (VOLKOVOVA et al., 2012). Diversas so as molculas
fotossensibilizadoras, dentre elas o dinucletdeo de nicotinamida e adenina (NADH)
e dinucleotdeo fosfato de nicotinamida adenina (NADPH), cido urocnico e
esteris (ANNA et al., 2007).
A eficcia dos protetores solares que agem somente contra a radiao UVB
discutida, uma vez que por evitar a queimadura, eles proporcionam maior tempo de
exposio solar aos raios UVA (WOODHEAD; SETLOW; TANAKA, 1999).
Fatores ambientais que aumentam o risco de melanoma, tais como a
radiao, esto associados com o aumento do micro cido ribonucleico (21miR-21)
que um oncomiR. O aumento da expresso de miR-21 tem sido observado durante
a transio de uma leso melanoctica benigna para o melanoma maligno. Mutaes
comuns no melanoma como genes BRAF e o homlogo do oncogene viral RAS do
neuroblastoma (NRAS) esto associadas ao aumento da expresso de miR-21, que
afeta genes alvo resultando em proliferao, diminuio da apoptose, instabilidade
gentica, aumento do estresse oxidativo, angiognese, invaso e metstase (Figura
11) (MELNIK, 2015).
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29
Figura 11. Radiao UV associada ao risco de melanoma pelo aumento
miR21. Fonte: Adaptada de MELNIK, 2015.
3.1.5 Patologia molecular
3.1.5.1 Patologia molecular dos melanomas
Os mecanismos patognicos do desenvolvimento do melanoma no esto
totalmente estabelecidos, mas sabe-se que vrios genes e vias metablicas esto
ativados (PALMIERI et al., 2009).
A progresso do melanoma est associada com ativao de oncogenes e
com eventos epigenticos (YAJIMA et al., 2012). A ativao dos oncogenes pode
ocorrer por mutao gentica, deleo, amplificao ou translocao. Os eventos
epigenticos, que so mudanas reversveis e no provocam alteraes na
sequncia de DNA, geralmente resultam da modulao transcripcional por metilao
de DNA e/ou por alteraes na cromatina, como a modificao das histonas
(PALMIERI et al., 2009).
Os melanomas no mostram o mesmo cenrio primrio de eventos clonais,
mas alguns destes eventos so mais comuns do que outros. Algumas vias de
sinalizao so mais conhecidas e geralmente controlam a proliferao celular, a
apoptose e a senescncia celular (BENNETT, 2008).
A via proteno-quinase ativada por mitognio/quinase regulada por sinal
extracelular (MAPK/ERK) participa do controle da proliferao celular (PALMIERI et
al., 2009). Esta via de sinalizao regulada pelos receptores da tirosina quinase,
citocinas e receptores acoplados protena G (MOZURAITIENE et al., 2015).
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30
A protena G RAS (HRAS, KRAS e NRAS) est localizada na membrana
plasmtica e ativa o RAF formando um complexo que leva fosforilao da protena
quinase ativada por mitognio (MAPK tambm conhecida como ERK) via ativao
da MEK. ERK, quando fosforilada, entra no ncleo e afeta a expresso de genes.
Isto conduz a mudanas que controlam a proliferao celular (Figura 12) (YAJIMA et
al., 2012).
Figura 12. Vias de controle da proliferao celular e apoptose. Fonte: PALMIERI et al., 2009.
ERK est hiperativada em 90% dos melanomas humanos por fatores de
crescimento e por alteraes genticas de fatores a montante, protenas RAS e
RAF. Os genes NRAS e BRAF esto mutados em 15 a 30% e em 50 a 70% dos
melanomas humanos, respectivamente (YAJIMA et al., 2012).
Na via de proliferao celular MAPK-ERK tem sido observado que os
melanomas possuem mutaes ou do NRAS ou do BRAF, mas no de ambos, alm
disso, aqueles com aumento do nmero de cpias de ciclina D1 (CCND1)
geralmente no apresentam as ativaes de NRAS e nem BRAF (BENNETT, 2008).
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31
A ativao da via fosfatidilinositol 3-quinases (PI3K) desempenha um papel
significativo no melanoma, frequentemente em um cenrio da ativao concorrente
da via de sinalizao RAS/RAF/MEK/ERK (MOZURAITIENE et al., 2015).
O gene supressor de tumor homlogo de tensina e fosfatase (PTEN) codifica
um lipdeo e uma protena fosfatase que regulam o crescimento celular e a
sobrevida atravs da sinalizao do fosfatidilinositol 3-quinase/serina/treonina
quinase (PI3K/AKT). AKT um gene que envia sinais inibitrios que promovem o
crescimento e a sobrevida celular. No melanoma, nveis elevados de fosfo-AKT
podem correlacionar adversamente com a sobrevida do paciente (TSAO et al.,
2012). PTEN, contendo um domnio fosfatase, est inativado em 12% dos
melanomas atravs de mutao ou metilao (YAJIMA et al., 2012).
Figura 13. Vias de crescimento celular e de sobrevida. Fonte: (TSAO et al., 2012).
A senescncia celular, que uma barreira para o desenvolvimento do
melanoma, corresponde a uma interrupo irreversvel da proliferao de clulas
somticas que induzida por encurtamento dos telmeros e estresse oncognico
(BENNETT, 2008).
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32
A reduo no comprimento dos telmeros parece exercer danos a
sinalizao do DNA pela ativao de protena p16CDKN2A. Portanto, os melanomas
no podem crescer indefinidamente sem um mecanismo para reduzir os telmeros.
A expresso e a atividade das telomerases de fato inibida na progresso do
melanoma (PALMIERI et al., 2009).
A via de supresso de tumor do inibidor da ciclina dependente de quinase 2A
(CDKN2A), gene envolvido na patognese do melanoma, codifica duas protenas,
p16INK4a e p14ARF. A perda da funo da p16INK4a promove ativao da ciclina
dependente de quinase (CDK4) e ciclina dependente de quinase 6 (CDK6)
resultando em hiperfosforilao da protena do retinoblastoma promovendo a
proliferao celular (Figura 12). A perda da funo no locus CDKN2A a anomalia
gentica mais frequente no melanoma familiar, cerca de 40% dos casos, e nos
pacientes sem histria ocorre em cerca de 8,2% dos indivduos (MOZURAITIENE et
al., 2015).
Nos melanomas a inativao da via de p53 supressora de tumor ocorre mais
frequentemente pela via CDKN2A devido a perda da funo de seu produto p14ARF
que previne a degradao da p53 pela protena E3 ubiquitina ligase MDM2 (Figura
12) (MOZURAITIENE et al., 2015). As mutaes diretas em p53 so infrequentes
nos melanomas; uma meta-anlise com 645 espcimes de melanoma revelou
mutao direta em apenas 85 dos casos (13,2%) (TSAO et al., 2012).
Os melanomas comumente resistem induo de apoptose e parecem estar
protegidos por mltiplos mecanismos que incluem a ativao das vias MAPK e
PI3K/AKT. No melanoma, a via MAPK antagoniza a apoptose por mltiplos
mecanismos que incluem a expresso anti-apopttica do BCL2 (B-cell lymphoma 2),
atravs do fator de transcrio associado microftalmia (MITF) e da supresso da
protena proapottica agonista de BCL2 da morte celular (BAD) (Figura 13) (TSAO
et al., 2012).
3.1.5.2 Patologia molecular dos nevos
Estudos relatam que existe clonalidade em 81% de nevos, sendo que destes
25% so displsicos. No entanto, a demonstrao de clonalidade no informa se o
nevo displsico se originou de novo ou de um nevo comum pr-existente, uma vez
http://www.lookformedical.com/definitions.php?q=Fator+de+Transcri%C3%A7%C3%A3o+Associado+%C3%A0+Microftalmia&lang=3
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33
que em ambas as circuntncias as clulas se originariam a partir de uma nica
progenitora (Figura 14) (DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012a).
Figura 14. Aberraes moleculares na progresso do melanoma. Fonte: Adapatada de
MOZURAITIENE et al., 2015)
As mutaes BRAF ocorrem em mais de 80% dos nevos melanocticos,
sugerindo que estas alteraes somticas possam ocorrer cedo na melanognese
(MOZURAITIENE et al., 2015).
A mutao BRAF tem sido detectada em torno de 62 a 67% dos nevos
displsicos. No entanto, no h correlao entre mutao BRAF e a ativao da
MAPK (DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012b). A mutao V600E que prevalente
no melanoma, no cncer colorretal e no cancer de tireoide, no identificada com a
mesma frequncia nos nevos (TSAO et al., 2012).
Em contraste com os nevos congnitos, que comumente possuem a mutao
RAS, esta mutao raramente est presente nos nevos displsicos, sendo
identificada em apenas 1 de 19 casos e 1 de 18 casos, em dois estudos realizados
(DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012b).
Alguns nevos displsicos exibem alteraes em p16 ou p53. Um estudo
encontrou trs nevos displsicos com mutaes de p16 entre doze nevos
examinados. Diferenas significativas entre nevos displsicos e nevos comuns no
so observadas (DUFFY; GROSSMAN; TANAKA, 2012b). A mutaes no gene
Tp53 muito menor nos nevos displsicos do que nos melanomas. O acmulo da
protena p53 nos nevos displsicos tem sido reportado com uma frequncia muito
menor que nos melanomas, em torno de 5% a 15% (HUSSEIN; WOOD, 2002).
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34
Na sndrome familiar do nevo displsico-melanoma as mutaes em CDKN2A
assim como CDK4 e ARF, tem sido demonstradas por participar do desenvolvimento
da doena (PSATY et al., 2010).
3.1.5.3 Molculas de adeso celular
As molculas de adeso celular participam de processos biolgicos
importantes como a diferenciao, crescimento, proliferao e migrao celular
(REES, 2012). As molculas de adeso celular como as caderinas, as integrinas e
as da superfamlia de imunoglobulinas participam dos processos de crescimento e
metstase do melanoma maligno (MCGARY; LEV; BAR-ELI, 2002).
A molcula de adeso clular do melanoma (Mel-CAM) pertence
superfamlia das imunoglobulinas. Mel-CAM no expressa em melancitos
normais, mas expressa em nevos benignos e em melanomas. A interao entre
Mel-CAM e seus receptores pode induzir sinais celulares necessrios para a
progresso do tumor. No entanto, a molcula de adeso celular do melanoma no
til na distino entre leses melanocticas benignas e malignas (FIGUEIREDO et
al., 2003).
Integrinas so protenas transmembrana que funcionam principalmente pela
migrao e aderncia a clulas na matriz extracelular, bem como a outras clulas. A
integrina avb3 esta associada com a progresso do melanoma e pode ser usada no
diagnstico para distinguir nevo benigno do melanoma maligno (FIGUEIREDO et al.,
2003).
A E-caderina uma molcula de adeso celular que est envolvida nas
interaes queratincito-melancito. A perda da expresso da E-caderina tem sido
relatada na progresso e metstase dos melanomas cutneos (ANNA et al., 2007).
A molcula de adeso celular 1 (CADM1) uma protena de adeso que tem
sido demonstrada estar reprimida em tecidos tumorignicos e sua expresso imuno-
histoqumica anormal tem sido relatada nos melanomas (REES, 2012).
3.1.5.4 Mecanismo de transio epitelial mesenquimal
Transio epitelial-mesenquimal (TEM) um termo que se refere a eventos
de desenvolvimento como os que ocorrem na gastrulao e na segregao da crista
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35
neural quando as clulas emergem de um epitlio e se tornam isoladas (fibroblastos-
like) (BENNETT, 2008).
Este processo biolgico permite que uma clula epitelial, que interage com a
membrana basal, submeta-se a mltiplas alteraes bioqumicas que lhe permitam
assumir fentipo celular mesenquimal, que inclui aumento na capacidade migratria
e de invaso, resistncia apoptose e maior produo de componentes da matriz
extracelular (KALLURI; WEINBERG, 2009).
O mecanismo de TEM est associado capacidade de invasividade dos
cnceres, incluindo a do melanoma (BENNETT, 2008). No entanto, fundamental
entender que o mecanismo de TEM clssico, como descrito nos carcinomas e no
desenvolvimento embrionrio, no existe nos melanomas (PAPADOGEORGAKIS,
2013).
A linhagem melanoctica evolui a partir da crista neural com clulas
embrionrias reguladas pela TEM (CARAMEL et al., 2013) (TULCHINSKY et al.,
2013). Nas leses melanocticas o mecanismo de TEM refere-se transformao de
melancitos em vez de clulas epiteliais. Os melancitos transformados adquirem
um nmero muito grande de modificaes moleculares, incluindo a perda gradual de
molculas de adeso celular como as caderinas (PAPADOGEORGAKIS, 2013).
Uma das caractersticas do mecanismo de TEM, nas clulas epiteliais, a
regulao negativa da E-caderina que est relacionada ao aumento da expresso de
caderina mesenquimal neuronal (N-caderina), o que resulta em alterao da adeso
celular, onde as clulas epiteliais adquirem afinidade por clulas mesenquimais
atravs de interaes com N-caderina (LAMOUILLE; XU; DERYNCK, 2014).
Um paradoxo que os melancitos adquirem um fentipo que tanto a E-
caderina, um marcador de clulas epiteliais, como a vimentina, uma protena de
filamento intermedirio sintetizado principalmente por clulas de origem
mesenquimal, so fortemente expressas. Portanto, os melancitos no so nem
clulas epiteliais nem mesenquimais e podem ser melhor classificados como um tipo
de clula mista exibindo propriedades de ambas (PAPADOGEORGAKIS, 2013).
O mecanismo de TEM controlado por vrios fatores de transcrio, incluindo
TWIST1, TWIST2, o repressor transcripcional 1 da famlia snail (SNAIL1), repressor
transcripcional 2 da famlia snail (SNAIL2) e ligao dedo de zinco E-Box homeobox
-
36
1 (ZEB1) e ligao dedo de zinco E-Box homeobox 2 (ZEB2) (Figura. 15)
(TULCHINSKY et al., 2013).
A regulao das funes dos fatores indutores de transcrio da transio
epitelial-mesenquimal (FT-TEM) nos melanomas malignos diferente do epitlio
(CARAMEL et al., 2013). Estudos mostram que os melancitos normais so
positivos para SNAIL2 e ZEB2, mas negativos para ZEB1 e TWIST1 (TULCHINSKY
et al., 2013). SNAIL2 e ZEB2 se comportam como protenas supressoras de tumores
atravs da ativao de uma via de diferenciao de melancitos dependente de
MITF (Figura. 15) (CARAMEL et al., 2013).
Figura 15. Via ERK durante a melanognese que impacta na expresso fenotpica dos
melanomas malignos. Fonte: Adapatada de TULCHINSKY et al., 2013.
Ativao de NRAS/BRAF media a TEM em um estgio tardio do melanoma
(MOZURAITIENE et al., 2015). Em resposta a ativao de NRAS/BRAF, a TEM
sofre uma reorganizao em favor de TWIST1. Esta chave reversvel coopera com
BRAF na promoo da desdiferenciao e transformao neoplsica dos
melancitos. Esta chave resulta em perda de E-caderina e constitui um fator de mau
prognstico em pacientes com melanoma (Figura 16) (CARAMEL et al., 2013).
As alteraes das interaes de clulas com a matriz extracelular so
essenciais para a iniciao e progresso da TME. As alteraes nas integrinas
durante TME correlacionam-se com a expresso aumentada das proteases, tais
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37
como metaloproteinase 2 (MMP2) e metaloproteinase (MMP9) (LAMOUILLE; XU;
DERYNCK, 2014).
Figura 16. Fatores de transcrio que controlam o mecanismo de transio epitelial-
mesenquimal -TEM (EMT). Fonte: Adapatada de (BENNETT, 2008).
3.2 DIAGNSTICO DE LESES MELANOCTICAS
O diagnstico histolgico das proliferaes melanocticas inerentemente
difcil, necessitando de integrao de mltiplos critrios arquiteturais e citolgicos.
Nenhum critrio isolado diagnstico desta entidade particular uma vez que critrios
similares podem ser encontrados em nevos benignos e melanomas. Estudos
-
38
complementares tem potencial para auxiliar na categorizao dos tumores
melanocticos (ZEMBOWICZ; SCOLYER, 2011).
3.2.1 Patologia molecular como auxiliar no diagnstico
A anlise histopatolgica dos tecidos corados por hematoxilina e eosina, em
correlao com o contexto clnico, o padro ouro para o diagnstico de melanoma.
No entanto, h um subgrupo de leses com achados histopatolgicos conflitantes.
Por este motivo, patologistas tem explorado tcnicas complementares para
aumentar a acurcia diagnstica das leses melanocticas. Mtodos citogenticos
podem ser usados para a distino entre nevos e melanomas, dentre eles o FISH e
o CGH (BUSAM, 2013).
Alm dos mtodos citogenticos, a imuno-histoqumica tem um papel
importante no diagnstico de leses melanocticas. No entanto, no h um nico
marcador, ou a combino deles que estabelea um diagnstico preciso de
melanoma ou nevo (PRIETO; SHEA, 2011).
3.2.2 Marcadores de imuno-histoqumica
Nas leses em que os critrios clnicos e histopatolgicos de melanoma
sobrepem aos do nevo, a imuno-histoqumica pode ser sugerida para auxiliar na
diferenciao destes casos de difcil diagnstico. (PALIT; INAMADAR, 2011).
Dentre os marcadores utilizados para a distino entre nevo e melanoma, o
HMB-45 e o Ki-67 tem sido descritos como sendo os mais teis. Quando o padro
de expresso intraepitelial ou periepitelial e quase completamente ausente na
derme profunda, estas leses so mais consistentes com nevo que com melanoma.
O Ki-67, que expressa o ndice proliferativo, geralmente menor que 1% nos nevos
e maior que 10% nos melanomas (PRIETO; SHEA, 2011).
Estudos tem mostrado que a perda da expresso imuno-histoqumica do
CADM1 frequentemente ocorre nos melanomas e pode servir como um marcador
para o diagnstico diferencial das leses melanocticas histologicamente
questinveis (YOU et al., 2012). H evidncias que o CADM1 regulado
negativamente pelo TWIST1 que pode agir como um supressor da invaso do
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39
melanoma (HARTSOUGH et al, 2015). Na progresso do melanoma ocorre a perda
da funo de E-caderina e ganho na expresso de N-caderina (FERNANDES,
2011).
3.2.2.1 CADM1
O CADM1, um gene localizado no cromossomo 11q23.2, recebeu o nome
oficial de cell adhesion molecule 1 (CADM1) pelo Human Genome Organization
Gene Nomenclature Committee (LIANG et al., 2011) No entanto, este gene
conhecido tambm como: membro 4c da muperfamlia de imunoglobulina (IGSF4);
gene supressor de tumor 1, no cncer de pulmo (TSLC1); molcula de adeso
sinptica (SYNCAM) (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY
INFORMATION, 2017).
A perda ou a reduo da expresso do CADM1 est envolvida na progresso
e metstase de diferentes tipos de neoplasias, incluindo o carcinoma de pulmo,
estmago, ovrio, pncreas, mama e leucemia de clulas T (YOU et al., 2014). No
melanoma descrita a sua expresso diminuda pelo mtodo de imuno-histoqumica
(Figura 17) (REES, 2012).
Figura 17. Representao da expresso imuno-histoqumica dos nveis de CADM1. Barra 1:
melanoma cutneo; Barra 2: nevo displsico; Barra 3: pele normal. Os melanomas mostram nveis
mais baixos de expresso de CADM1. Fonte: Adaptada de YOU et al., 2012
A CADM1 faz parte de uma ampla categoria de molculas de adeso celular
que facilitam as ligaes clula a clula e clula matriz extracelular. Elas so
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capazes tambm de transmitir sinais mecnicos e qumicos atravs da membrana. A
sinalizao mediada pelas molculas de adeso importante na regulao de
muitos processos celulares incluindo a diferenciao, a proliferao e a migrao
celular (REES, 2012).
O CADM1 uma glicoprotena transmembrana com 442 aminocidos,
composta por um domnio extracelular do tipo imunoglobulina e um domnio
intracelular citoplasmtico (LIANG et al., 2011).
O domnio extracelular homlogo a outros da superfamlia das
imunoglobulinas de molculas de adeso celular (CAM) e funcionalmente serve
como mediador para a formao de homodmeros de CADM1 ou de heterodmeros
de outros membros das molculas de adeso celular. Estudos demonstraram que o
CADM1 est envolvido na adeso celular atravs de interaes homoflicas,
independentes de clcio e magnsio. Portanto, provvel que o CADM1 seja um
supressor de tumor pelo seu domnio extracelular melhorando a adeso entre
clulas, suprimindo a invaso e metstase (LIANG et al., 2011).
No entanto, existem evidncias que o domnio intracelular do CADM1 tambm
desempenha um papel importante na supresso tumoral, interagindo com protenas
citoplasmticas (LIANG et al., 2011). Acredita-se que CADM1 possa estar
relacionado com a actina do citoesqueleto citoplasmtico para uma ligao estvel
entre as clulas (YOU et al., 2010).
Os mecanismos exatos do CADM1 associados a supresso do crescimento
tumoral e de metstases no melanoma ainda permanecem elusivos (YOU et al.,
2014). Sabe-se que a perda da expresso do CADM1, tem como principal
mecanismo subjacente a hipermetilao do gene promotor ou a perda da
heterozigose, que frequentemente se correlaciona com pior prognstico das
neoplasias (VAN DER WEYDEN et al., 2012).
A perda da funo do CADM1 presumivelmente conduz a rompimentos na
adeso clula a clula e clula matriz extracelular, levando a uma proliferao
celular descontrolada e a distoro progressiva da arquitetura normal do tecido,
transformando nevos displsicos de um fentipo benigno para maligno (YOU et al.,
2012).
O CADM1 pode executar a funo supressora de tumores por desencadear a
resposta imunolgica citotxica dos linfcitos NK e T CD8 (MURAKAMI, 2005). Os
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41
mecanismos pelos quais as clulas tumorais interagem com o sistema imunolgico
permanecem pouco compreendidos. Um estudo observou que os efeitos
supressores do CADM1 estavam ausentes em camundongos sem imunidade
mediada por linfcitos T. Portanto, os dados deste estudo sugerem que a funo do
CADM1 na supresso de metstases acontece pelos mecanismos de vigilncia
imunolgica (FARAJI et al., 2012).
O CADM1 inibe a ligao do receptor de tirosina quinase 2 com receptor de
tirosina quinase 3 (2ErbB2/ErbB3), sinalizando a morte celular, suprimindo o tumor.
O miR-214 suprime o CADM1 e aumenta a ligao ErbB2/ErbB3, observado no
cncer colorretal (MOMOSE et al., 2013).
Observou-se, em um estudo in vitro, que o CADM1 inibe a invaso de clulas
de melanoma atravs da supresso da matriz metaloproteinase. A degradao da
matriz extracelular e da membrana basal pode ser facilitada pelas metaloproteinases
que so enzimas proteolticas associadas invaso tumoral por facilitarem a
migrao de clulas tumorais atravs da matriz extracelular (YOU et al., 2014).
Os nveis de CADM1 so inversamente relacionados aos nveis de TWIST1,
que responsvel por regular genes envolvidos na adeso celular. Demonstrou-se
que o TWIST1 interage fisicamente com o promotor de CADM1 reduzindo seus
nveis, sugerindo que o CADM1 negativamente regulado pelo TWIST1
(HARTSOUGH et al, 2015).
A perda da funo de uma molcula de adeso celular como a CADM1 pode
induzir invaso e metstase, em clulas cancerosas, atravs da interveno no
mecanismo de transio epitelial-mesenquimal (EMT) (NATIONAL CANCER
CENTER RESEARCH INSTITUTE JAPAN, 2017).
Sabe-se que h perda da expresso do CADM1 no citoplasma de melanomas
e que esta perda est associada com estgios tardios do tumor e com o decrscimo
na sobrevida dos pacientes, apesar de nenhum mecanismo exato ainda ter sido
determinado (REES, 2012). Portanto, o CADM1 pode constituir um marcador
prognstico importante e um potencial alvo para o desenvolvimento de novas
terapias (YOU et al., 2014).
3.2.2.2 TWIST1
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42
O gene TWIST1 est localizado no cromossomo 7p21.2 e conhecido
tambm como TWIST ou fator de transcrio TWIST (ONLINE MENDELIAN
INHERITANCE IN MAN, 2017). Ele um fator de transcrio basic helix-loop-helix
(bHLH) que forma tanto homodmeros quanto heterodmeros com outras protenas
bHLH para a construo de uma sequncia core E-box na regio do promotor de
genes alvo (SINGH; GRAMOLINI, 2009).
O TWIST um regulador nuclear na morfognese embriolgica (QIANG et al.,
2014) e participa do desenvolvimento da mesoderme, da miognese, da neurognse
e tambm age como um regulador de metstases (SINGH; GRAMOLINI, 2009).
conhecida a superexpresso do TWIST em tumores de diferentes origens,
como sarcomas, gliomas, carcinomas de clulas escamosas, carcinomas da mama e
melanoma (BECK et al., 2015). Esta superexpresso tem sido associada ao
aumento da migrao celular, invaso e metstase de neoplasias. O TWIST1 est
ativado na maioria dos melanomas e este achado correlaciona-se com pior
sobrevida dos pacientes (WEISS et al., 2012).
O TWIST est envolvido no processo de transio epitelial mesenquimal
(TEM) que desencadeia uma funo essencial nas metstases dos cnceres
(KHAN et al., 2013). Na TEM as clulas epiteliais perdem as propriedades de
adeso e adquirem critrios mesenquimais permitindo sua migrao e invaso
(BECK et al., 2015). O TWIST ativa a N-caderina e inibe a E-caderina que so
importantes para a TEM (Figura 18) (KHAN et al., 2013).
Figura 18. TWIST inibe a E-caderina que fundamental para o mecanismo de TEM (EMT).
Fonte: Adaptada de WANG; ZHOU, 2011.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099https://www.researchgate.net/profile/Yifan_Wang7https://www.researchgate.net/researcher/39645975_Binhua_P_Zhou
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Existem evidencias que a IL-6 induza a TEM e aumente a capacidade de
invaso das clulas tumorais de origem epitelial. No entanto, no se sabe se a IL-6
afeta tumores mesenquimais. Um estudo examinou os efeitos da IL-6 nas clulas de
melanoma e encontrou que a IL-6 pode aumentar seu potencial metasttico por
regular a expresso do TWIST e N-caderina (NA; LEE; SEOK, 2013).
Encontrou-se que RAS-RAF-MEK-ERK (via ERK1/2) sinaliza o aumento da
expresso de TWIST1 que aumenta as propriedades de invaso na derme e, pelo
menos em parte, eleva os nveis da matriz metaloproteinase (Figura 19)
(HARTSOUGH, et al, 2015). A hiperativao desta via comum em mltiplos tipos
de cncer, especialmente no melanoma, onde mutaes N-RAS ou B-RAF so
prevalentes (WEISS et al., 2012).
Figura 19. Modelo da via ERK1/2TWIST1MMP-1 na cascata do melanoma. A ativao do ERK1/2 leva a um aumento na transcrio do TWIST1. Fonte: Adapatada de (WEISS et al., 2012)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Na%20YR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24051540http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Na%20YR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24051540http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Seok%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24051540
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44
A superexpresso do TWIST tambm protege as clulas de cncer da morte
por apoptose (KHAN et al., 2013) atravs da inibio da p53 (BECK et al., 2015). O
TWIST pode afetar indiretamente a p53 atravs da modulao da via ARF/MDM/p53
(MAESTRO et al., 1999).
A associao da expresso do TWIST1 em leses metastticas de
melanoma, incluindo metstases nodais e a distncia, foi relatada. Observou-se
tambm que a colorao forte nuclear do TWIST est presente na maioria dos
melanomas primrios, enquanto que a expresso do TWIST geralmente negativa
em leses benignas (Figura 20) (PAPADOGEORGAKIS, 2013).
Figura 20. (A e B) Ausncia de expresso nuclear do TWIST1 em nevos melanocticos
intradrmicos. (C e D) Metstase de melanoma em linfonodo mostrando imunorreatividade para
TWIST1. (PAPADOGEORGAKIS, 2013).
Um estudo mostrou que (TGF) beta-1 se combinado com PLX4032, um
inibidor de BRAF, ou GSK1120212, um inibidor de MEK, aumenta substancialmente
a morte celular em linhagens de clulas de melanoma com mutao BRAF. Este
estudo sugere que o TWIST desempenha uma funo crucial mediando resistncia
s drogas inibidoras moleculares de BRAF e MEK (MENON et al., 2013). O
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Menon%20DR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23848983
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45
desenvolvimento de terapias alvo envolvendo o TWIST tem uma grande promessa
na teraputica do cncer (KHAN et al., 2013).
3.2.2.3 CDH1 (E-caderina)
O gene CDH1 tem o nome oficial de cadherin 1, pelo HGNC e sinnimo de E-
cadherin (HUGO GENE NOMENCLATURE COMMITTEE, 2017). Este gene est
presente no cromossomo 16 e codifica uma caderina clssica da superfamlia das
caderinas. Esta uma protena de adeso clula-clula que contm regio
extrecelular, transmembrana e citoplasmtica. A perda da funo deste gene
contribui para progresso, invaso e/ou metstases (NATIONAL CENTER FOR
BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2017).
Caderinas so glicoprotenas transmembrana clcio dependentes que
mediam a adeso clula-clula. A E-caderina est envolvida nas interaes
queratincito-melancito. A perda da expresso da E-caderina tem sido relatada na
progresso e metstase dos melanomas cutneos. A protena -catenina se liga a
E-caderina no citoesqueleto desempenhando um papel importante na adeso celular
(ANNA et al., 2007).
O TWIST1 suprime a E-caderina. (PAPADOGEORGAKIS, 2013). A perda da
E-caderina representa a marca da TEM em tumores epiteliais e tambm evidente
nos estgios tardios do melanoma, especialmente em metstases nodais
(CARAMEL et al., 2013). O mecanismo de transio epitelial mesenquimal (TEM)
nas clulas de melanoma ocorre pela modulao de genes especficos, reprimindo a
E-caderina e induzindo a N-caderina e proteases (BENNETT, 2008). Na progresso
do melanoma ocorre a perda da funo de E-caderina e ganho na expresso de N-
caderina (Figura 21) (FERNANDES, 2011).
A expresso de N-caderina facilita a ligao de clulas melanocticas com
fibroblastos e com clulas endoteliais, facilitando o extravasamento das clulas de
melanoma para a circulao. A E-caderina ativada retarda o crescimento e pode
reverter o fentipo invasivo de clulas do melanoma. Porm, no existem evidncias
de que a diminuio de E-caderina funcione como um promotor do melanoma
FERNANDES, 2011).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khan%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23873099
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Figura 21. Aumento da expresso da N-caderina e diminuio da E-caderina no melanoma
invasivo. Fonte: Adapatada de MCGARY; LEV; BAR-ELI, 2002
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4. METODOLOGIA
4.1 TIPO DE ESTUDO
Estudo transversal retrospectivo para a investigao da expresso imuno-
histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e CDH1.
4.2 LOCAL DO ESTUDO
O estudo foi realizado no Centro de Diagnsticos Antomo-Patolgicos
(CEDAP), Laboratrio de Anatomia Patolgica, localizado na cidade de Joinville em
Santa Catarina, credenciado pelo Colgio Americano de Patologistas e pela
Organizao Nacional de Acreditao. Possui uma equipe com 10 patologistas e 70
colaboradores e atua na rea de anatomia patolgica, incluindo a citopatologia,
histopatologia, imuno-histoqumica, imunofluorescncia e patologia molecular.
Atende pacientes principalmente da regio norte do estado, sendo que
aproximadamente metade so provenientes da rede pblica de sade. Devido a sua
abrangncia de atendimento, o CEDAP constitui um local apropriado para estudos
de leses melanocticas, inclundo os melanomas, que so prevalentes na regio
norte (STEGLISH, 2015).
4.3 PERODO DO ESTUDO
O estudo foi realizado em amostras coletadas nos anos de 2013, 2014, 2015
e 2016. A reavaliao histolgica e as anlises imuno-histoqumicas foram
realizadas no perodo de maio de 2016 a janeiro de 2017.
4.4 AMOSTRAS E CRITRIOS DE INCLUSO E EXCLUSO
Foram selecionadas amostras a partir dos diagnsticos registrados no banco
de dados do CEDAP. Os pacientes eram provenientes da rede pblica e privada e
todos tinham indicao clnica para a realizao do procedimento.
Inicialmente foram selecionadas 120 amostras consecutivas, todas com
acordo diagnstico de dois patologistas, sendo 40 amostras de melanomas com
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48
menos de 1,0 mm de espessura, 40 melanomas com mais de 1,0 mm de espessura
e 40 nevos melanocticos compostos displsicos, com atipias moderadas. Foram
excludas as amostras que no apresentavam material suficiente para as anlises
subsequentes e as amostras que na reavaliao histolgica apresentaram critrios
diagnsticos duvidosos, totalizando 18 excluses (9 amostras de melanomas com
menos de 1,0 mm de espessura, 4 de melanomas com mais de 1,0 mm de
espessura e 5 de nevos melanocticos). Por fim, para fins do estudo foram includas
as 30 amostras consecutivas com diagnsticos mais recentes de cada grupo
Dentre os melanomas com menos de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade
foi 51 17 anos. Conforme a classificao histolgica do Colgio Americano de
Patologistas, 27 eram de disseminao superficial e 3 melanomas sem outra
classificao. A mdia da espessura foi de 0,5 mm 0,3 mm. Dentre os melanomas
com mais de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade foi 60 14 anos. Dez eram do
tipo histolgico de disseminao superficial, 14 do tipo nodular, 1 melanoma acral, 1
melanoma nevoide e 4 melanomas, sem outra classificao. A mdia da espessura
foi de 3,9 mm 3,8 mm. Dentre os nevos melanocticos compostos displsicos, com
atipias moderadas, a mdia de idade foi 40 13 anos e todos tinham a informao
clnica ou de anlise macroscpica de dimetro maior que 5,0 mm.
4.5 PROCEDIMENTOS METODOLGICOS
As lminas das amostras selecionadas, coradas por hematoxilina e eosina
foram reanalisadas microscopicamente para a confirmao do diagnstico
histolgico. Os blocos de parafina correspondentes foram analisados
macroscopicamente para avaliao da quantidade de material presente.
4.5.1 Tcnica de imuno-histoqumica
As amostras foram previamente fixadas em formalina a 10% e dispostas em
blocos de parafina. Foram realizados cortes com espessura de 4 micrmetros e
dispostos em lminas silanizadas e deixadas overnight em estufa a 60C para que
o material do corte aderisse lmina. A recuperao antignica foi feita no
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49
equipamento PT-Link (Dako, Glostrup, Dinamarca) em soluo de recuperao
antignica em pH 9.0 (EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH (50x),
Dako). O processo de recuperao antignica foi realizado durante 20 minutos a
95C. Aps esta etapa e em todas as etapas subsequentes, as lminas foram
lavadas em tampo EnVision FLEX Wash Buffer (Dako), diludo 1:200 em gua
destilada, por 5 minutos. Os cortes foram demarcados com caneta hidrofbica. Para
todos os anticorpos a diluio utilizada foi determinada em testes em amostras
prvias.
Para a investigao da expresso do gene CADM1 foi realizado bloqueio por
20 minutos com 100 L de perxido de hidrognio a 3% (Dako). Foram adicionados
100 L do anticorpo CADM1, diludo 1:600 na soluo EnVision FLEX Antibody
Diluent (Dako), por 16 horas overnight. O anticorpo anti-CADM1 conjugado,
policlonal isotipo Ig de coelho, que reage na regio N-terminal da protena CADM1
(SynCAM humano) (ABBIOTEC, Le Plessis Robinson, Frana).
Para a investigao da expresso do gene TWIST1 foi realizado bloqueio por
20 minutos com 100 L de perxido de hidrognio a 3% (Dako). Foram adicionados
100 L do anticorpo monoclonal, diludo 1:3000 na soluo EnVision FLEX Antibody
Diluent (Dako), por 16 horas overnight. O anticorpo anti-TWIST1 conjugado,
monoclonal (clone 10E4E6, Genetex, Irvine, Estados Unidos da Amrica) e
reconhece a regio entre os aminocidos 9 e 74 da protena TWIST1 humano.
Para a investigao da expresso do gene CDH1 (E-caderina) foi realizado
bloqueio por 5 minutos com 100 L de perxido de hidrognio a 3% (Dako). A
seguir, foram adicionados 100 L do anticorpo pronto para uso (Dako) e incubado
durante 20 minutos. O anticorpo anti-CDH1 monoclonal derivado de camundongo
(clone NCH-38, anti-humano) e reconhece os fragmentos de E-caderina de 120 KDa
e de 82 kDa. Na sequncia, foi adicionado o anticorpo secundrio EnVision FLEX
Mouse LINKER (Dako) e incubado por 15 minutos.
Aps estas etapas, em todas as reaes foram adicionados 100 L de
polmero EnVision FLEX/HRP (Dako), seguido de incubao durante 20 minutos.
Na sequncia, foram adicionados 100 L da soluo de cromgeno de
diaminobenzidina (EnVision FLEX DAB Cromgeno, Dako), com incubao
durante 20 minutos. As lminas foram contracoradas com hematoxilina de Gill e
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50
montadas com meio de montagem (Dako), sendo identificadas com etiquetas com
cdigo de barras.
4.5.2 Leitura e interpretao dos resultados
A expresso do CADM1 e do CDH1 (E-caderina) foi avaliada no citoplasma e
na membrana celular. A expresso do TWIST1 foi avaliada no ncleo celular. As
lminas de imuno-histoqumica foram analisadas de modo cego, por dois
patologistas experientes, em relao aos dados clnicos e histolgicos dos
pacientes. O mtodo de leitura, interpretao dos resultados e definio dos scores
foi baseado em You et al. (2012). Foram analisadas a porcentagem de clulas
positivas e a intensidade da colorao em cada amostra.
Para a definio da porcentagem de clulas positivas, utilizou-se uma escala
de 0 a 4: 0 a 10% de clulas coradas classificou-se como 0; 11 a 25% como 1; 26 a
50% como 2; 51 a 75% como 3 e 76 a 100% como 4. A intensidade da colorao foi
graduada em uma escala de 0 a 3: resultado negativo foi classificado como 0; fraco
como 1; moderado como 2 e forte como 3. O score final foi obtido multiplicando-se o
resultado da porcentagem de clulas coradas pelo resultado da intensidade da
colorao. Na anlise final, um score menor do que 3 foi considerado negativo e
scores iguais ou superiores a 3 foram considerados positivos.
4.6 Anlise estatstica
A anlise estatstica para o clculo da diferena dos resultados
interobservadores foi realizada atravs do ndice de Kappa utilizando o programa
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS).
A avaliao da significncia estatstica para cada marcador, TWIST1, CADM1
e CDH1, entre os grupos dos melanomas com menos de 1,0 mm de espessura, dos
melanomas com mais de 1,0 mm de espessura e dos nevos compostos displsicos
foi realizada atravs do teste Mann-Whitney com o Social Science Statistics
(http://www.socscistatistics.com). Valores de p menores que 0,05 foram
considerados estatisticamente significativos.
http://www.socscistatistics.com/
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51
4.7 Aspectos ticos
O projeto de pesquisa foi avaliado e aprovado pelo Comit de tica em
Pesquisa (CEP) da Universidade da Regio de Joinville (UNIVILLE), conforme
diretrizes estabelecidas na Resoluo 466/2012 do Conselho Nacional de Sade
(CNS) e complementares, sob o parecer nmero 1.282.268.
As amostras selecionadas foram utilizadas exclusivamente para os fins
previstos na pesquisa. Aps a realizao do estudo, os blocos histolgicos foram
devolvidos ao biobanco CEDAP, onde permanecero armazenados por no mnimo
20 anos a partir do cadastro inicial do paciente, possibilitando que novos estudos
sejam realizados a medida que as tcnicas analticas evoluam e novos marcadores
moleculares surjam. Aps os 20 anos o descarte do material ser realizado, se
necessrio, conforme as normas do biobanco CEDAP, que foi aprovado pela
Comisso Nacional de tica em Pesquisa (CONEP) por meio do parecer 016/2016.
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5. RESULTADOS E DISCUSSO
Conforme as normas do Programa de Ps-Graduao em Mestrado em
Sade e Meio Ambiente da UNIVILLE, este captulo ser apresentado na forma de
artigo cientfico, encaminhado para publicao no peridico Pathology - Research
and Practice (editora Elsevier; ISSN: 0344-0338).
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53
AVALIAO DA EXPRESSO DOS GENES CADM1, TWIST1 E CDH1 POR
IMUNO-HISTOQUMICA EM LESES MELANOCTICAS
Resumo Introduo: O melanoma maligno uma doena agressiva e sua incidncia est
aumentando no mundo. A predisposio gentica e a exposio a fatores
ambientais, principalmente a luz solar, so fatores de risco. A distino
histopatolgica entre nevos e melanomas pode ser difcil. Prev-se que a avaliao
da expresso imuno-histoqumica de alguns genes poderia contribuir para o
diagnstico diferencial de leses histogicamente questionveis. Objetivo: Investigar
se a avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e
CDH1 (E-caderina), que participam dos mecanismos de adeso celular e transio
epitelial-mesenquimal, contribui para o diagnstico diferencial das leses
melanocticas de difcil diagnstico. Metodologia: Estudo transversal retrospectivo
baseado na avaliao da expresso imuno-histoqumica dos genes CADM1,
TWIST1 e CDH1 por imuno-histoqumica em amostras de 30 nevos compostos
displsicos, 30 melanomas com menos de 1,0 mm de espessura e 30 melanomas
com mais de 1,0 mm de espessura, diagnosticados no perodo de 2013 a 2016, em
Joinville/SC. Foi utilizado um score que avaliou a intensidade da colorao e a
proporo de clulas coradas. Resultados: Em comparao aos nevos melanocticos
compostos displsicos, observou-se reduo significativa da expresso dos genes
CADM1 e CDH1 nos melanomas (abaixo e acima de 1,0 mm de espessura) e nos
melanomas de mais de 1,0 mm de espessura, respectivamente. Tambm se
verificou menor expresso dos genes CADM1 e CDH1 nos melanomas com mais de
1,0 mm de espessura em relao aos melanomas com menos 1,0 mm. O gene
TWIST1 no apresentou diferena significativa da expresso entre os grupos.
Concluso: Estes achados permitem concluir que a expresso imuno-histoqumica
do CADM1 tem potencial para contribuir como ferramenta auxiliar ao diagnsico
diferencial entre nevos melanocticos compostos displsicos e melanomas.
Palavras chave: Imuno-histoqumica, CADM1, TWIST, CDH1, melanoma, nevo
displsico
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54
EVALUATION OF EXPRESSION OF GENES CADM1, TWIST1 AND CDH1 BY
IMMUNOHISTOCHEMISTRY IN MELANOCYTIC LESIONS
Abstract
Introduction: Malignant melanoma is an aggressive disease and its incidence is
increasing worldwide. Genetic predisposition and exposure to environmental factors,
especially sunlight, are risk factors. Histopathologic distinction between nevi and
melanoma can be difficult. It is anticipated that the evaluation of the
immunohistochemical expression of some genes could contribute to the differential
diagnosis of questionable histologically lesions. Objective: To investigate wether the
evaluation of the immunohistochemical expression of genes CADM1, TWIST1 and
CDH1 (E-cadherin), that take part in mechanisms of cell adhesion and epithelial-
mesenchymal transition, contributes to the differential diagnosis of melanocytic
lesions difficult to diagnose. Methodology: Retrospective cross-sectional study based
on immunohistochemical expression evaluation of genes CADM1, CDH1 and
TWIST1 in samples of 30 dysplastic compound nevus, 30 melanomas with less than
1.0 mm thick and melanomas with more than 1.0 mm thick, diagnosed between 2013
and 2016, in Joinville/SC. A score was used to evaluate color intensity and proportion
of cells stained. Results: There was a significant reduction in the expression of the
genes CADM1 and CDH1 in melanomas (below and above 1.0 mm thick) and in
melanomas of more than 1.0 mm in thickness, respectively, compared to dysplastic
melanocytic nevi. There was also lower expression of the genes CADM1 and CDH1
genes in melanomas greater than 1.0 mm thick compared to melanomas less than
1.0 mm. The gene TWIST1 showed no significant difference in expression between
groups. Conclusion: These findings allow us to conclude that the
immunohistochemical expression of CADM1 has the potential to contribute as an
auxiliary tool to the differential diagnosis between dysplastic compound nevus and
melanoma.
Key-words: immunohistochemIstry, CADM1, TWIST, CDH1, cutaneous melanoma,
dysplastic nevus.
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Introduo
O melanoma maligno uma das neoplasias mais agressivas nos seres
humanos. O nmero estimado de mortes por melanoma de 48.000 por ano, em
todo o mundo [1], e vem sendo relatado um aumento na incidncia nas populaes
caucasianas [2].
A determinao das causas para o desenvolvimento do melanoma
complexa, com fatores de genticos e ambientais influenciando o risco individual [3].
A exposio ocupacional, o estilo nutricional e principalmente a exposio luz solar
so fatores ambientais relacionados ao desenvolvimento do melanoma cutneo.
Mudanas significativas na expresso de microRNA em resposta exposio
ambiental tm sido relatadas [4].
A preciso do diagnstico do melanoma crtica para a conteno da
malignidade [1]. O exame histopatolgico o "padro ouro" para o diagnstico de
leses melanocticas. No entanto, a distino histopatolgica definitiva entre as
leses benignas e as malignas, em alguns casos, pode ser difcil. descrita uma
discordncia interobservador relativa ao diagnstico de nevos e melanomas
variando de 2,3 a 25% das leses [5].
Marcadores moleculares podem ser utilizados como ferramentas auxiliares ao
diagnstico das leses melanocticas [5]. Ferramentas citogenticas, tais como
Comparative Genomic Hybridization e Fluorescence in situ Hybridization, foram
desenvolvidas para ajudar na classificao de leses melanocticas ambguas. No
entanto, estes mtodos moleculares requerem equipamentos e patologistas
qualificados, portanto, no so utilizados rotineiramente [6]. Ao contrrio, a imuno-
histoqumica utilizada na maioria dos centros de patologia. Porm, apesar de
muitos marcadores terem sido estudados, apenas poucos deles parecem servir
como ferramentas auxiliares para o diagnstico diferencial de nevo e melanoma e,
at o momento, nenhum deles suficiente para distinguir inequivocamente uma
leso melanoctica [5].
descrito que a perda da expresso imuno-histoqumica do gene CADM1,
que ocorre nos melanomas, poderia servir como um marcador de melanoma em
leses histologicamente questionveis [7]. Os nveis de CADM1 so inversamente
relacionados aos nveis de TWIST1, que responsvel por regular genes envolvidos
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na adeso celular [8]. O TWIST1 participa do processo de transio epitelial
mesenquimal (EMT) [9], que um processo em que clulas perdem as propriedades
de adeso e adquirem critrios mesenquimais permitindo a invaso e migrao [10].
Por sua vez, a perda da expresso da E-caderina tem sido relatada na progresso e
metstase dos melanomas cutneos [11].
O objetivo deste estudo foi avaliar se a anlise em conjunto da expresso
imuno-histoqumica dos genes CADM1, TWIST1 e CDH1 (E-caderina) pode
contribuir para o diagnstico diferencial de leses melanocticas.
Mtodos Tipo, local e perodo do estudo
Estudo transversal retrospectivo realizado no Centro de Diagnsticos
Antomo-Patolgicos (CEDAP), laboratrio de anatomia patolgica, localizado na
cidade de Joinville em Santa Catarina, Brasil. O estudo foi realizado em amostras
coletadas nos anos de 2013, 2014, 2015 e 2016. A reavaliao histolgica e as
anlises imuno-histoqumicas foram realizadas no perodo de maio de 2016 a janeiro
de 2017.
Amostras e critrios de incluso e excluso
Foram selecionadas amostras a partir dos diagnsticos registrados no banco
de dados do CEDAP. Os pacientes eram provenientes da rede pblica e privada e
todos tinham indicao clnica para a realizao do procedimento.
Inicialmente foram selecionadas 120 amostras consecutivas, todas com
acordo diagnstico de dois patologistas, sendo 40 amostras de melanomas com
menos de 1,0 mm de espessura, 40 melanomas com mais de 1,0 mm de espessura
e 40 nevos melanocticos compostos displsicos, com atipias moderadas. Foram
excludas as amostras que no apresentavam material suficiente para as anlises
subsequentes e as amostras que na reavaliao histolgica apresentaram critrios
diagnsticos duvidosos, totalizando 18 excluses (9 amostras de melanomas com
menos de 1,0 mm de espessura, 4 de melanomas com mais de 1,0 mm de
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espessura e 5 de nevos melanocticos). Por fim, para fins do estudo foram includas
as 30 amostras consecutivas com diagnsticos mais recentes de cada grupo
Dentre os melanomas com menos de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade
foi 51 17 anos. Conforme a classificao histolgica do Colgio Americano de
Patologistas, 27 eram de disseminao superficial e 3 melanomas sem outra
classificao. A mdia da espessura foi de 0,5 mm 0,3 mm. Dentre os melanomas
com mais de 1,0 mm de espessura, a mdia de idade foi 60 14 anos. Dez eram do
tipo histolgico de disseminao superficial, 14 do tipo nodular, 1 melanoma acral, 1
melanoma nevoide e 4 melanomas, sem outra classificao. A mdia da espessura
foi de 3,9 mm 3,8 mm. Dentre os nevos melanocticos compostos displsicos, com
atipias moderadas, a mdia de idade foi 40 13 anos e todos tinham a informao
clnica ou de anlise macroscpica de dimetro maior que 5,0 mm.
Imuno-histoqumica
As amostras foram previamente fixadas em formalina a 10% e dispostas em
blocos de parafina. Foram realizados cortes com espessura de 4 micrmetros e
dispostos em lminas silanizadas e deixadas overnight em estufa a 60C para que
o material do corte aderisse lmina. A recuperao antignica foi feita no
equipamento PT-Link (Dako, Glostrup, Dinamarca) em soluo de recuperao
antignica em pH 9.0 (EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH (50x),
Dako). O processo de recuperao antignica foi realizado durante 20 minutos a
95C. Aps esta etapa e em todas as etapas subsequentes, as lminas foram
lavadas em tampo EnVision FLEX Wash Buffer (Dako), diludo 1:200 em gua
destilada, por 5 minutos. Os cortes foram demarcados com caneta hidrofbica. Para
todos os anticorpos a diluio utilizada foi determinada em testes em amostras
prvias.
Para a investigao da expresso do gene CADM1 foi realizado bloqueio por
20 minutos com 100 L de perxido de hidrognio a 3% (Dako). Foram adicionados