Examensarbete

Jämförelse av genexpression mellan isolat

av Dokdonia MED134 som tillvuxit i

konstant ljus kontra konstant mörker med

qPCR

Författare: Marcus Stening

Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Nivå: Grundnivå

Jämförelse av genexpression mellan isolat av Dokdonia MED134 som

tillvuxit i konstant ljus kontra konstant mörker med qPCR

Marcus Stening

Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15hp

Filosofie Kandidatexamen

Handledare: Professor Jarone Pinhassi, LNU institutionen för biologi och miljö, KSL

Kalmar

Examinator: Professor Michael Lindberg, LNU institutionen för kemi och biomedicin,

Norrgård Kalmar

Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinska analytikerprogrammet 180hp

Sammanfattning

Marina bakterier fyller en viktig roll i havens näringscykler. Cirka hälften av alla

havsytelevande bakterier kan nyttja ljus som energikälla, förutom organiska

kolföreningar, vilket är viktigt för överlevnad då haven blir sura och näringsfattiga på

grund av förändrat klimat. Flavobacteriaceae är en viktig bakterieart som deltar i

nedbrytningsfasen av komplexa organiska föreningar i naturligt klimat. Dokdonia

donghaensis MED134 tillhör familjen Flavobacteriaceae och nyttjar både kemotrofi

och fototrofi som energikälla. För sin fototrofiska förmåga nyttjar bakterien

proteorhodopsin, vilket är en membranbunden protonpump. Detta tillåter bakterien att

överleva och tillväxa i näringsfattiga miljöer. Syftet med arbetet var att undersöka med

qPCR om det finns en skillnad i genutryck för proteorhodopsin och

isocitratdehydrogenas i Dokdonia donghaensis MED134 beroende på om bakterierna

fått tillväxa i konstant ljus eller mörker. Analys med qPCR visade på ett signifikant

större genuttryck för proteorhodopsin i de bakterier som fått tillväxa i konstant ljus

under sju dagar jämfört med de som fått tillväxa i konstant ljus under tre och fyra dagar

och de som fått tillväxa i konstant mörker. Ingen signifikant skillnad kunde påvisas i

genuttryck för isocitratdehydrogenas. Detta tyder på att Dokdonia donghaensis

MED134 vid näringsbrist kan nyttja ljus som energikälla för överlevnad och vidare

tillväxt. Genom att med simulerad klimatförändring påvisa en anpassningsförmåga

genom ökat genuttryck kan en vidare förståelse för bakteriernas roll i det marina

ekosystemet fås och vidare forskning kan utföras då den marina klimatfrågan blir mer

aktuell.

Abstract

Marine bacteria play an important role in the marine nutrition cycles. About half of all

sea-living bacteria can use light as an energy source, in addition to organic carbon

compounds, which is important for survival as the seas becomes acidic and low in

nutrition due to changing climate. The Flavobacteriaceae is a bacterial family that plays

an important role in the degradation of complex organic compounds in natural

environments. Dokdonia donghaensis MED134 belongs to the Flavobacteriaceae

family and use both chemotrophy and phototrophy as a source of energy. For its

phototrophic ability, the bacteria use proteorhodopsin, which is a membrane-bound

proton pump. This allows the bacteria to survive and grow in nutrient-poor

environments. The purpose of the study was to investigate with qPCR if there was a

difference in gene expression for proteorhodopsin and isocitrate dehydrogenase in

Dokdonia donghaensis MED134 depending on whether the bacteria had grown in

constant light or darkness. Analysis with qPCR showed a significantly greater gene

expression for proteorhodopsin in the bacteria grown in constant light for seven days,

compared to those grown in constant light for three and four days and those grown in

constant darkness. No significant difference could be demonstrated in gene expression

for isocitrate dehydrogenase. This indicates that Dokdonia donghaensis MED134 in

nutritional deficiency can use light as a source of energy for survival and further

growth. By simulating climate change an adaptability could be seen through increased

gene expression. Through this, further understanding of the role of bacteria in the

marine ecosystem can be obtained and further research can be conducted as the marine

climate issue becomes more relevant.

Nyckelord qPCR, PCR, Dokdonia MED134, Proteorhodopsin, isocitratdehydrogenas

Förkortningar

PCR – Polymerase chain reaction

dNTP – Deoxynukleotidtrifosfat

RT-PCR – Reverse transcription polymerase chain reaction

qPCR – Quantitative polymerase chain reaction

PR – Proteorhodopsin

IsoD – Isocitratdehydrogenas

RpoD – Gen som kodar för RNA-polymeras subenhet D

RecA – Gen som kodar för Rekombinas A

NADP+ - Nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat

TCA-cykeln – Trikarboxylsyracykeln

Innehållsförteckning

1 INTRODUKTION _________________________________________________ - 1 - 1.1 Marina bakterier ________________________________________________ - 1 - 1.2 Dokdonia donghaenis MED134 ____________________________________ - 1 -

1.3 Proteorhodopsin ________________________________________________ - 1 - 1.4 Isocitratdehydrogenas ____________________________________________ - 2 -

1.5 RNA extraktion_________________________________________________ - 3 - 1.6 DNAse behandling ______________________________________________ - 4 -

1.7 PCR __________________________________________________________ - 4 - 1.7.1 RT-PCR ___________________________________________________ - 4 -

1.7.2 qPCR _____________________________________________________ - 5 -

1.8 Prober ________________________________________________________ - 5 - 1.9 StepOnePlus ___________________________________________________ - 5 -

1.10 Syfte ________________________________________________________ - 6 -

2 MATERIAL OCH METOD _________________________________________ - 6 - 2.1 Tillredning av marinagar _________________________________________ - 6 - 2.2 Odling av bakterier ______________________________________________ - 6 -

2.3 RNA-extraktion ________________________________________________ - 7 - 2.3.1 RNAprotect Cell Reagent______________________________________ - 8 -

2.3.2 RNeasy Plus Mini Kit ________________________________________ - 8 -

2.4 DNAsebehandling ______________________________________________ - 8 -

2.5 Kvantifiering och kvalitetskontroll av total-RNA ______________________ - 9 - 2.5.1 Kontroll av DNAsebehandling med PCR och gel ___________________ - 9 -

2.6 qPCR ________________________________________________________ - 10 -

2.7 Statistik och beräkningar ________________________________________ - 10 -

3 RESULTAT _____________________________________________________ - 11 - 3.1 Bakterieväxt __________________________________________________ - 11 - 3.2 Kvantifiering och kvalitetskontroll av extraherat RNA samt renhetskontroll av

DNAsebehandling ________________________________________________ - 12 - 3.3 qPCR med statistisk jämförelse av ΔΔCt med One Way ANOVA ________ - 14 -

4 DISKUSSION____________________________________________________ - 17 -

5 Slutsats _________________________________________________________ - 18 -

6 Tack____________________________________________________________ - 19 -

7 REFERENSER __________________________________________________ - 20 - Bilaga A Material _________________________________________________ - 22 -

- 1 -

1 INTRODUKTION

1.1 Marina bakterier

Marina bakterier är en viktig del av marina biogeokemiska näringscykler och

energiflöden (1). Det finns flera arter av marina havsytelevande bakterier varav cirka

hälften kan nyttja ljus som energikälla för överlevnad och tillväxt, förutom att nyttja

föreningar av organiskt kol (1-3). En av de vanligt förekommande släktena av marina

bakterier är Flavobacterium som är gramnegativa, motila, icke sporbildande

stavformade bakterier vilka bildar gula glansiga runda kolonier på fast medium (4).

Flavobacterium spelar en viktig roll i det marina ekosystemet då den deltar i den initiala

nedbrytningsfasen av komplexa organiska föreningar (5). Då klimatet förändras och

havsmiljön blir surare och förlorar näring i form av kolföreningar måste bakterierna

anpassa sig (1). Därför är det viktigt att studera bakterier under simulerade

klimatförändringar för att få en större förståelse för dess funktion i ekosystemet (1).

1.2 Dokdonia donghaenis MED134

Dokdonia donghaensis MED134 är en marin bakterie tillhörande familjen

Flavobacteriaceae och är en fakultativt dubbelmixotrof bakterie vilket innebär att den

nyttjar både kemotrofi och fototrofi som energikälla, det vill säga den kan ta upp

kolföreningar ur vattnet eller använda ljus till att skapa energi (2). För sin fototrofiska

förmåga använder bakterien proteorhodopsin vilket återfinns i cellmembranet och

fungerar som ljusdriven protonpump (2, 6, 7). Genom att nyttja fototrofi som

energikälla kan bakterien fortsätta tillväxa även när det är ont om näring i omgivningen

(1).

1.3 Proteorhodopsin

Proteorhodopsin är en membranbunden protonpump (Figur 1) som återfinns i ett flertal

marina ytlevande bakterier och plankton över hela världen på både RNA- och

proteinnivå (1, 2, 6, 7). Studier har visat att proteorhodopsin har bidragit med tillräcklig

näringsupptag för fortsatt tillväxt och överlevnad hos ett flertal marina bakterier, bland

andra Dokdonia donghaensis MED134 (2).

- 2 -

Figur 1. Vid exponering för ljus pumpar proteorhodopsin H+

över membranet där det kan användas av ATP-syntas för

syntes av ATP (2). (Egen bild, Marcus Stening, 2018).

1.4 Isocitratdehydrogenas

Isocitratdehydrogenas är ett nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP+)-beroende

enzym som katalyserar den oxidativa dekarboxyleringen av isocitrat till 2-oxoglutarat

och koldioxid länkat till reduktionen av NADP+

i cellens metabola trikarboxylcyracykel

(TCA-cykel) (2) (Figur 2). Därigenom kontrolleras det metaboliska flödet mellan TCA-

cykeln och glyoxylatshunten. Därför spelar isocitratdehydrogenas en viktig roll i den

cellullära metabolismen (8, 9).

Ljus

ATP-

syntas

- 3 -

Figur 2. TCA-cykeln i vilken isocitratdehydrogenas är aktiv och spjälkar isocitrat till 2-oxoglutarat där

NADP+ tar upp H+ och bildar NADPH och CO2. (Egen bild, Marcus Stening, 2018).

1.5 RNA extraktion

Vid RNA-extraktion kan kommersiella kit användas. Vid denna studie användes

RNeasy Protect Cell (QIAGEN, Hilden, Tyskland) som ger en lösning för att stabilisera

och rena totalRNA från celler. RNA stabiliseras direkt vid användning av RNeasy

Protect Cell. Omedelbar stabilisering av RNA i celler är generellt ett krav för pålitlig

analys av genuttryck vid användning av RT-PCR eller annan nukleinsyrabaserad

teknologi (13).

Vid extraktion av RNA användes RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland)

som selektivt avlägsnar dubbelsträngat DNA. Celler som stabiliserats i RNAprotect Cell

Reagent (QIAGEN, Hilden, Tyskland) centrifugeras och resultatet blir en lyserad och

- 4 -

homogeniserad pellet av genetiskt material vilken förvaras i en starkt denaturerande

buffert som i sin tur omedelbart inaktiverar RNaser för att säkerställa isolering av intakt

RNA. Etanol tillsätts till lösningen för att ge optimala förhållanden för bindning av

RNA. Proverna centrifugeras i en RNeasy spinkolonn där total-RNA binder till

membranet och eventuella kontaminationer tvättas bort. Högkvalitativt RNA elueras

sedan med RNAsefritt vatten (13).

1.6 DNAse behandling

Vid DNAsebehandling av extraherat RNA användes InvitrogenTM

TURBO DNA-free

Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA). Kitet är designat för

att ta bort kontaminerande DNA från extraherat RNA genom en patentskyddad metod

(14).

1.7 PCR

Polymerase chain reaction (PCR) är en molekylärbiologisk metod som används för att

amplifiera och undersöka RNA- och DNA-sekvenser (templat) som finns inuti celler,

cellkärnor och virus (10, 11). För att komma åt och extrahera det genetiska materialet

lyseras cellerna eller viruskapslar (10). Efter lysering av cellen extraheras det genetiska

materialet vilket renas upp och blandas med en mix av DNA-polymeras,

deoxynukleotidtrifosfat (dNTP), primers, prober och buffert (10). PCR-reaktionen sker i

tre steg; denaturering där provet hettas upp till över 90ºC och dubbelsträngat DNA

klyvs, annealing där temperaturen sjunker till mellan 40-60ºC och primers binder in till

sina specifika platser i det kluvna DNA’t, samt elongering där temperaturen höjs till

72ºC och DNA-polymeras bygger upp dubbelsträngat DNA med de tillgängliga dNTP

som finns utifrån de primers som bundit in (10). Dessa steg ingår i en cykel som

repeteras 30-40 gånger (10). PCR kan utföras antingen enligt singleplex-princip där

endast ett templat används vilket resulterar i en enda produkt, eller multiplex-principen

där flera olika templat används i samma prov vilket resulterar i flera produkter i samma

prov (4). Till denna studie har singleplex-principen använts.

1.7.1 RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) är en PCR-metod som

tillåter amplifiering av RNA genom att skapa komplementärt DNA (cDNA) från RNA

- 5 -

som sedan används som templat för PCR-reaktionen (10). Under RT-PCR utförs samma

cykel som under PCR fast med lägre temperaturer och med ett reverse transcriptase-

enzym, alternativt med vissa termostabila DNA-polymeraser som under särskilda

omständigheter har reverse transcriptions-aktivitet (10). RT-PCR kan användas som

antingen enstegs RT-PCR eller tvåstegs RT-PCR. Under enstegs RT-PCR utförs RT-

PCR och PCR under samma program där PCR-instrumentet börjar med en RT-PCR-

cykel för att bilda cDNA och fortsätter därefter med 30-40 cykler PCR-reaktion (12).

Under tvåstegs RT-PCR utförs först RT-PCR enligt ett program för att bilda cDNA.

Därefter utförs en vanlig PCR-reaktion enligt ett annat program, det krävs alltså två

separata PCR-analyser (4). Till denna studie har enstegs RT-PCR använts.

1.7.2 qPCR

Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) är en PCR-reaktion där kvantitativ

mätning av PCR-produkten sker mellan varje cykel (realtids-PCR) eller efteråt och

jämförs med ett ickevarierande normalprov, exempelvis PCR-produkt av

housekeepinggener, det vill säga gener som krävs för cellens basala funktioner och

alltid finns i cellen, exempelvis RpoD som kodar för RNA-polymeras subenhet D och

RecA som kodar för rekombinas A (2). Kvantitativ mätning av PCR-produkt är möjlig

genom tillsats av prober som binder in till PCR-produkten och avger fluoroscens vilken

kan mätas (10).

1.8 Prober

Prober är korta sekvenser av oligonukleotider eller DNA-kopior vilka är inmärkta med

fluorokromer (10). Exempel på vanliga prober är SYBR-green och TaqMan. SYBR-

green är en ickespecifik prob som binder in till den stora gängan i dubbelsträngat DNA

och fluoroscerar vilket möjliggör ljusdetektion. Begränsningen med SYBR-green är

dock att den binder in till samtliga dubbelsträngade DNA-molekyler vilket inte lämpar

sig för multiplex-PCR (10).

1.9 StepOnePlus

StepOnePlus (Applied Biosystems, ThermoFisher SCIENTIFICS, Waltham,

Massachusetts, USA) är ett realtids-PCR-instrument som nyttjar 96-håls provplattor och

- 6 -

mäter produkt genom fluoroscens (12). StepOnePlus kan utföra kvantitativa mätningar

(qPCR) före (pre-PCR), under (realtids-PCR) eller efter (post-PCR) PCR-reaktionen

(12). Det är även möjligt att nyttja både enstegs eller tvåstegs RT-PCR (12).

StepOnePlus använder främst metoder med standardkurva, relativ standardkurva samt

jämförelse av Ct-värden för att beräkna kvantitet av PCR-produkt (12).

1.10 Syfte

Syftet med arbetet var att undersöka med qPCR om det finns en skillnad i genutryck för

proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas i Dokdonia donghaensis MED134 beroende

på om bakterierna fått tillväxa i konstant ljus eller mörker.

2 MATERIAL OCH METOD

Allt laborativt arbete utfördes med sterilteknik.

2.1 Tillredning av marinagar

Av DifcoTM

Marine Agar vägdes 55.1g upp och blandades med Milli-Q-vatten till

slutvolym 1L. Agarlösningen värmdes på kokplatta upp till 150ºC under 30 minuter

under magnetomrörning. Efter att pulvret löst sig autoklaverades lösningen under tre

timmar (uppvärmning till 121ºC varefter avsvalning). Den flytande agarn portionerades

sedan upp i petriskålar och fick stelna och torka under tre dygn i rumstemperatur

varefter de sattes in i kylskåp (2-8°C) för förvaring.

2.2 Odling av bakterier

En koloni av isolat från Dokdonia donghaensis MED134 (Tabell I) togs från DifcoTM

Marine Agar 2216 med bakterieväxt och ympades i 1mL DifcoTM

Marine Broth 2216

(Bilaga A) och löstes upp genom blandning med pipett och vortexblandning.

Spädningar med DifcoTM

Marine Broth 2216 gjordes från den uppslammade kolonin

upp till 106. Från spädningarna överfördes med automatpipett 50µL och ströks ut på

DifcoTM

Marine Agar 2216 (två plattor/spädningsgrad) och inkuberades i aerob miljö

(22°C, 18-19 lux ljus, alternativt mörkt) (Tabell I). Tillväxt kontrollerades varje dag och

kolonistorlek mättes med skjutmått.

- 7 -

Tabell I. Grupper av isolat från Dokdonia donghaensis MED134 med kollaborerande provnummer,

generations-ID samt tillväxtklimat.

Grupp Provnummer Generation Tillväxtmiljö

Mörkt 3-4 M1 t154A Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M2 t145B Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M3 t154C Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M4 t145D Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M5 t154E Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M6 t145F Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M7 t154G Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M8 t145H Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M9 t154I Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M10 t145J Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M31 t155A Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M32 t155E Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M33 t155G Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

Ljust 3-4

M11 t154A Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M12 t145B Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M13 t154C Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M14 t145D Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M15 t154E Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M16 t145F Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M17 t154G Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M18 t145H Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M19 t154I Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M20 t145J Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M34 t146B Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M35 t146H Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

M36 t155A Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar

Mörkt 7

M41 t76A Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M42 t73B Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M43 t76C Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M44 t73D Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M45 t76E Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M46 t73F Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M47 t76G Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M48 t73H Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M49 t76I Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M50 t73J Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

Ljust 7

M51 t77A Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M52 t73B Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M53 t77C Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M54 t73D Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M55 t77E Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M56 t73F Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M57 t77G Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M58 t73H Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M59 t77I Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

M60 t73J Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar

2.3 RNA-extraktion

- 8 -

2.3.1 RNAprotect Cell Reagent

Bakteriekolonier Dokdonia donghaensis MED134 (Tabell I) togs efter tre respektive

fyra dagars tillväxt på DifcoTM

Marine Agar 2216 med 1µL plastplatinös och

slammades upp i 1,5mL märkta eppendorfrör innehållande 1mL RNAprotect Cell

Reagent (QIAGEN, Hilden, Tyskland) (Bilaga B) genom blandning med pipett och

vortexblandning. Rören centrifugerades vid 3260xg under fem minuter varefter

supernatanten avlägsnades och pelletarna frystes i -80ºC.

2.3.2 RNeasy Plus Mini Kit

Pelletarna togs ur frysförvaring och tinades på is. Då pelletarna tinat lösgjordes de från

rören genom fingerknackningar och löstes upp med 600µL Buffer RLT Plus

innehållande 1% β-merkaptoetanol (QIAGEN, Hilden, Tyskland) genom blandning med

automatpipett och vortexblandning. Etanol (70%, 600µL) tillsattes till RNA-lösningen

och blandades väl varefter av RNA-lösningen fördes till RNeasy spinkolonn (QIAGEN,

Hilden, Tyskland) som centrifugerades i 15 sekunder vid 8000xg. Till kolonnen

applicerades 700µL Buffer RW1 för tvätt av kolonnmembranet (QIAGEN, Hilden,

Tyskland) varefter kolonnen centrifugerades i 15 sekunder vid 8000xg. Därefter

applicerades 500µL Buffer RPE (QIAGEN, Hilden Tyskland) för tvätt av RNA varefter

kolonnen centrifugerades i 15 sekunder vid 8000xg. Detta steg utfördes en gång till men

då med centrifugering vid 8000xg under två minuter. Kolonnen centrifugerades därefter

vid maxhastighet under en minut för att med säkerhet få bort all Buffer RPE. RNeasy

spinkolonnen placerades sedan i ett 1,5mL uppsamlingsrör (QIAGEN, Hilden,

Tyskland) och 50µL RNasefritt vatten applicerades direkt på membranet. Efter en

minuts inkubering i rumstemperatur centrifugerades kolonnen under en minut vid

8000xg för att eluera RNA. Detta steg utfördes därefter igen med ytterligare 50µL

RNasefritt vatten för att med säkerhet få med allt RNA.

2.4 DNAsebehandling

DNAsebehandling utfördes med InvitrogenTM

AmbionTM

TURBO DNA-free kit

(ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham Massachusetts, USA). Från extraherat RNA

överfördes med automatpipett 60µL till ett 0,2mL PCR-rör. Till röret tillsattes 6µL 10x

DNase I Buffer och 1µL DNase I varefter röret inkuberades under 30 minuter i 37ºC.

Efter inkuberingen vortexblandades inaktiveringsreagenset innan 6µL applicerades till

- 9 -

det inkuberade röret som därefter inkuberades under 5 minuter i rumstemperatur med

stundvis omblandning. Efter inkubering i rumstemperatur centrifugerades röret i 90

sekunder i 10000xg varefter DNasebehandlat RNA överfördes till ett sterilt 1,5mL

eppendorfrör.

2.5 Kvantifiering och kvalitetskontroll av total-RNA

Kvantifiering av DNAsebehandlat RNA utfördes på InvitrogenTM

Qubit 2.0

Fluorometer (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA) genom att

tillreda reagenslösning till vilken RNA applicerades. Lösningen tillreddes genom att

blanda 199µL Qubit RNA HS Buffer och 1µL Qubit RNA HS Reagens per prov som

skulle analyseras. Lösningen vortexblandades. Av den tillredda reagenslösningen togs

198µL till rör passande InvitrogenTM

Qubit 2.0 till vilket 2µL extraherat RNA tillsattes.

Efter vortexblandning och inkubering under två minuter i rumstemperatur analyserades

extraherat RNA mot en standardkurva med InvitrogenTM

Qubit 2.0. Resultatet visades i

ng/mL vilket fick konverteras till ng/µL.

Kvantifiering och kvalitetskontroll av RNA utfördes med NanoDrop 2000

Spectrophotometer (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA).

Genom att applicera 2µL extraherat RNA på mätplattan gavs ett värde på kvantitet ut i

ng/µL och ett kvalitetsvärde genom jämförelse av våglängder A260/280nm varav

optimalt värde låg runt 1,80-2,20.

2.5.1 Kontroll av DNAsebehandling med PCR och gel

För att säkerställa att DNAsebehandlingen fungerat utfördes PCR för DNA för genen

16S. Detta genom att tillreda en mastermix innehållande 23µL Milli-Q-vatten, 0,5µL

primer 27F (10pmol/µL) och 0,5µL primer 1492R (10pmol/µL) per prov som skulle

kontrolleras. Mastermixen tillsattes till 0,2mL PCR-rör illustra PuReTaq Ready-To-Go

PCR beads (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA). Slutligen tillsattes 1µL extraherat

RNA till mastermixen och PCR utfördes med Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler

(Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) enligt program 95ºC under 2

minuter, 40 cykler 95ºC i 30 sekunder, 50ºC under 30 sekunder och 72ºC under 45

sekunder. Programmet avslutades med 72ºC under 7 minuter för att till sist sjunka till

4ºC. Därefter blandades 5µL PCR-produkt med 2µL loading dye (Bilaga A) per prov

- 10 -

och 5µL av PCR-produktblandningen applicerades på en 1% agarosgel (Bilaga A) per

gel. I brunnar på gelen applicerades 5µL GeneRuler 1 kb DNA Ladder 0,1µg/µL

(ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA) positiv och negativ

kontroll samt upp till nio prover från PCR. Elektroforesen gick under 40 minuter i 89V.

Efter avslutad elektrofores lades gelen i etidiumbromid under cirka 20 minuter innan

den fotograferades i UV-ljus med Quantity One (BIO-RAD Laboratories, Hercules,

Kalifornien, USA).

2.6 qPCR

Inför qPCR förbereddes PCR-platta (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien,

USA) genom applicering av 9µL mastermix (Bilaga A) innehållande forward och

reverse primers (Tabell II) till samtliga av de brunnar som skulle användas samt

applicering av prover som skulle analyseras (1µL per brunn). Som positiv kontroll

användes en pool av samtliga 26 prover och som negativ kontroll RNasefritt vatten.

qPCR utfördes på StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster

City, Kalifornien, USA) med singleplex-princip och enstegs RT-PCR enligt

programmering 48ºC under 30 sekunder för reverse transkription, 95ºC under 10

minuter för enzymaktivering, 40 cykler av 95ºC under 15sekunder för denaturering och

60ºC under. 60 sekunder för annealing och elongering samt plattavläsning.

Tabell II. Sekvenser över forward och reverse primers för proteorhodopsin, isocitratdehydrogenas, RpoD

och RecA.

Gen Forward primer Reverse primer

Proteorhodopsin AACCGGATACATAGGCGAAG ACAGCTCCACCTGCCCTTAC

Isocitratdehydrogenas AGTATGGGTGCTTGGAGTGC CGTATGTTGCCTGCCTCTTT

RpoD CACGGTCAGGGTTAGGTGAT TGCAAAGGAGCTGGATATGA

RecA ACTCAAAAATGGGGCTTCAC CCCGTAGTAGTCTCTGGGTTTC

2.7 Statistik och beräkningar

Analysresultatet analyserades med hjälp av SPSS (version 24). Då analysresultatet

bygger på jämförelser mellan fyra grupper (ljus tre-fyra dagar, mörk tre-fyra dagar, ljus

sju dagar och mörk sju dagar) valdes analysen baserad på One way ANOVA och

presenteras i resultatet som medelvärde och standardeviation. Utifrån multipla grupper

- 11 -

användes Tukey Post Hoc-test i jämförelse mellan grupperna. Statistisk signifikansnivå

var satt till 0.05 (15). De Ct-värden som gavs utifrån analys med qPCR jämfördes mot

Ct-värden från housekeepinggener RpoD och RecA för att få ΔCt. De olika ΔCt

jämfördes därefter mot varandra för att få ΔΔCt (2).

3 RESULTAT

3.1 Bakterieväxt

Isolat från Dokdonia donghaensis MED134 som odlats på DifcoTM

Marine Agar 2216

kunde synligt observeras efter ett dygns tillväxt och tillväxte därefter med upp till

0,7mm/dygn (Tabell III). Både koloniernas diameter och area visade på att bakterierna

var i exponentiell tillväxtfas efter tre och fyra dagar då material togs inför RNA-

extraktion (Figur 3 och 4).

Tabell III. Medelvärden från uppmätt diameter och area från bakteriekolonier från isolat Dokdonia

donghaensis MED134 som fått tillväxa under fem dagar på DifcoTM Marine Agar 2216 i

aerob miljö i konstant ljus eller mörker vid 22°C.

MED134 ljust 3-4 MED134 mörkt 3-4

Tid

(dagar) Diameter (mm) Area (mm2) Diameter (mm) Area (mm2)

0 0 0 0 0

1 0,2 0,13 0,2 0,13

2 0,8 2,01 0,8 2,01

3 1,5 7,07 1,5 7,07

4 2,1 13,85 2,3 16,61

5 2,8 24,62 2,9 26,41

- 12 -

Figur 3. Graf över bakteriekoloniernas medelvärden för tillväxt i diameter (mm) över fem dagars tillväxt

på DifcoTM Marine Agar 2216. Pilarna visar på den tid material togs inför RNA-extraktion.

Figur 4. Graf över koloniernas medelvärde för tillväxt i area (mm2) över fem dagars tillväxt på DifcoTM

Marine Agar 2216. Pilarna visar på den tid material togs inför RNA-extraktion.

3.2 Kvantifiering och kvalitetskontroll av extraherat RNA samt renhetskontroll av DNAsebehandling

Kvantifiering av extraherat RNA med Qubit 2.0 och NanoDrop 2000 visade att RNA-

extraktionen fungerat och att kvaliteten på RNA var godkänt (önskvärda värden för

A260/280 = 1,80-2,20) (Tabell IV). Vid kontroll av DNAsebehandling utfördes PCR på

16S-genen för extraherat RNA för samtliga isolat från Dokdonia donghaensis MED134

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 1 2 3 4 5 6

Dia

me

ter

(mm

)

Tid (dagar)

Light

Dark

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6

Are

a (m

m2)

Tid (dagar)

Light

Dark

Ljus

Mörk

Ljus

Mörk

- 13 -

och gelelektroforesen visade på orenhet hos åtta prover innehållande extraherat RNA,

då ett band kunde ses likt det på kontrollstegen (Figur 5). Dessa prover

DNAsebehandlades en gång till (Figur 6) och omkontrollerades på gel (Tabell IV).

Figur 5. Färgad gel från PCR för 16S-genen efter elektrofores. Band av DNA är synliga

(grön pil) och kan jämföras mot DNA-stegen.

Figur 6. Färgad gel från PCR för 16S-genen efter elektrofores

efter andra DNAsebehandlingen. Inga band av DNA är längre

synliga för de åtta proverna som DNAsebehandlades igen.

- 14 -

Tabell IV. Uppmätta RNA-koncentrationer för samtliga RNA-extraherade isolat från Dokdonia

donghaensis MED134 med InvitrogenTM Qubit 2.0 Fluorometer samt kvalitetskontroll genom

våglängderna 260/280 på NanoDrop 2000.

3.3 qPCR med statistisk jämförelse av ΔΔCt med One Way ANOVA

Smältkurva över amplifieringen under qPCR visade på produkt av generna

proteorhodopsin, isocitratdehydrogenas samt housekeepinggenerna RpoD och RecA

(Figur 7-10). Smältkurva visade även på eventuell primerdimer för proteorhodopsin på

första och andra körningen (Figur 9). One Way ANOVA med Tukey Post HOC-test (p

2:a DNAsebehandlingen

Provnummer

Koncentration

Qubit ng/µL

Koncentration

Nanodrop ng/µL A260/280

Koncentration

Qubit

Koncentration

Nanodrop A260/280

M1 16,9 26,3 1,74

M2 34,3 45,5 1,95 29,8 39,1 1,76

M3 18,3 25,6 1,78

M4 26,8 39,8 1,85 23,8 34,5 1,75

M5 48,0 79,2 1,95 39,9 64,8 1,88

M6 25,7 51,3 1,87 25 44,7 1,74

M7 23,8 41,3 1,87 20,7 35 1,71

M8 41,5 60,5 1,92 30,8 51,4 1,77

M9 24,5 31,3 1,85

M10 42,4 68,5 1,90

M11 20,9 30,1 1,80

M12 23,9 37,3 1,78

M13 16,0 24,0 1,68

M14 8,44 11,8 1,53

M15 16,4 27,9 1,73

M16 28,0 46,5 1,82

M17 32,7 64,1 1,75

M18 35,1 67,6 1,8

M19 24,8 38,2 1,81

M20 35,3 50,7 1,86

M31 30,2 76,6 1,77 27,8 59,2 1,73

M32 33,2 58,8 1,86 30 55,2 1,71

M33 27,5 58,8 1,75

M34 24,7 54,7 1,79

M35 12,3 19 1,56

M36 28,7 53 1,79

- 15 -

= 0,05) visade på en signifikant skillnad i genuttryck för proteorhodopsin hos de isolat

av Dokdonia donghaensis MED134 som fått tillväxa i ljus under sju dagar då de hade

ett större uttryck jämfört med de isolat som fått tillväxa en kortare tid i ljus och de isolat

som fått tillväxa i mörker (Figur 12). Ingen signifikant skillnad kunde påvisas för

genuttryck av isocitratdehydrogenas hos någon grupp av isolat (Figur 13).

Figur 7. Smältkurva för qPCR-produkt av proteorhodopsingenen vid 78,74°C.

Figur 8. Smältkurva för qPCR-produkt av isocitratdehydrogenasgenen vid 78,74°C.

Figur 9. Smältkurva för qPCR-produkt av RpoD-genen vid 74,39°C.

Figur 10. Smältkurva för qPCR-produkt av RecA-genen vid 76,50°C.

- 16 -

Figur 11. Smältkurva för qPCR-produkt med primerdimer eller kontamination av proteorhodopsingenen.

Figur 12. ANOVA boxplot för isolat av Dokdonia donghaensis MED134 med jämförelse

av ΔΔCt-värde för genuttryck av proteorhodopsin mellan de fyra grupperna.

- 17 -

Figur 13. ANOVA boxplot för isolat av Dokdonia donghaensis MED134 med jämförelse

av ΔΔCt-värde för genuttryck av isocitratdehydrogenas mellan de fyra grupperna.

4 DISKUSSION

Syftet med arbetet var att undersöka med qPCR om det finns en skillnad i genutryck för

proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas i Dokdonia donghaensis MED134 beroende

på om bakterierna fått tillväxa i konstant ljus eller mörker.

Följandet av isolatens tillväxt på DifcoTM

Marine Agar visade att isolaten fortfarande

var under tillväxtstadiet då material togs till RNA-extraktion vilken var av intresse för

det relativa genuttrycket av proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas för isolat

tillväxande i mörker jämfört med isolat tillväxande i ljus. Kvantifiering av extraherat

RNA visade att tillräckliga mängder extraherats och kvalitetskontrollen med NanoDrop

2000 visade att extraherat RNA var av tillräcklig renhet för utförande av qPCR. Genom

den extra kvalitetskontrollen med PCR för 16S-genen och gelelektrofores upptäcktes

kvarvarande DNA i åtta av isolaten vilka genom ytterligare en DNAsebehandling

uppnådde tillräcklig renhet för qPCR. Analys med qPCR visade på amplifiering av de

- 18 -

sökta målgenerna för proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas och för de båda

referensgenerna RpoD och RecA. Dock visade smältkurvan för analysen amplifiering

av annan produkt än proteorhodopsin för ett flertal av proverna på de två första

körningarna vilket misstänktes bero på primerdimerer eller mer sannolikt kontamination

(Figur 9). Detta bekräftades genom PCR-analys och gelelektrofores för kontroll av

DNA för proteorhodopsin i isolaten samt byte av primerstock. PCR och gelelektrofores

visade på intakt DNA utan mutationer och smältkurvan visade efter primerbytet på

amplifiering av den sökta produkten (Figur 5). Genom utförandet av One Way ANOVA

med Tukey Post HOC-test (p = 0,05) påvisades att det var en signifikant skillnad i

genuttryck för proteorhodopsin mellan isolat som tillväxt sju dagar i ljus jämfört med de

isolat som tillväxt i tre respektive fyra dagar i ljus och signifikant de isolat som tillväxt i

mörker. Detta är mest troligt för att näringen i tillväxtmediumet begränsas efter längre

tillväxt än fyra till sju dagar och bakterierna måste då anpasa sig vilket de kan med hjälp

av proteorhodopsinet vid tillgång till ljus, men inte i mörker. Dock påvisades ingen

signifikant skillnad för genuttryck av isocitratdehydrogenas mellan de olika

isolatgrupperna, detta mest troligt för att TCA-cykeln drivs normalt och ingen faktor har

påverkat isolaten annorlunda och kunnat triggat igång en förändring i genuttryck för

isocitratdehydrogenas.

5 Slutsats

Slutsatsen för denna studie blev att isolat av Dokdonia donghaensis MED134

som fått tillväxa i konstant ljus vid 22°C under sju dagar åt gången visade på ett större

genuttryck för proteorhodopsin jämfört med de isolat som fått tillväxa i tre respektive

fyra dagar åt gången och de isolat som fått tillväxa i mörker. Detta tyder på att

Dokdonia donghaensis MED134 vid näringsbrist i sin omgivning kan anpassa sig och

nyttja ljus som energikälla för fortsatt tillväxt och överlevnad. Ingen signifikant skillnad

kunde påvisas i genuttrycket för isocitratdehydrogenas mellan de olika isolatgrupperna,

då ingen faktor kunnat påverka genuttrycket. Genom att med simulerad

klimatförändring påvisa en anpassningsförmåga genom ökat genuttryck för

proteorhodopsin kan en vidare förståelse för bakteriernas roll i det marina ekosystemet

fås och vidare forskning kan utföras då den marina klimatfrågan blir mer och mer

aktuell.

- 19 -

6 Tack

Ett stort tack till min handledare professor Jarone Pinhassi för gott handledande, bra

stöd och för möjligheten att få utföra examensarbetet, även ett stort tack till doktorand

Carina Bunse och labtekniker Camilla Karlsson för god upplärning, laborativt stöd och

gott handledande. Tack till labtekniker Sabina Arnautovic, doktorand Benjamin

Pontiller och doktorand Christofer Karlsson för god upplärning och laborativt stöd.

Också ett stort tack till samtliga forskare på KSL för den goda stämning och trevliga

arbetsmiljön som råder!

- 20 -

7 REFERENSER

1. Bunse C, Lundin D, Karlsson CMG, Akram N, Vila-Costa M, Palovaara J,

et al. Response of marine bacterioplankton pHhomeostasis gene

expression to elevated CO22016; 6:[483-7 pp.].

2. Palovaara J, Akram N, Baltar F, Bunse C, Forsberg J, Pedrós-Alió C, et al.

Stimulation of growth by proteorhodopsin phototrophy involves regulation

of central metabolic pathways in marine planktonic bacteria. Proc Natl

Acad Sci U S A. 2014;111(35):E3650-8. Epub 2014/08/18.

3. Muthusamy S, Baltar F, González JM, Pinhassi J. Dynamics of metabolic

activities and gene expression in the Roseobacter clade bacterium

Phaeobacter sp. strain MED193 during growth with thiosulfate. Appl

Environ Microbiol. 2014;80(22):6933-42. Epub 2014/08/29.

4. Bernardet J-F, Segers P, Vancanneyt M, Berthe F, Kersters K, Vandamme

P. Cutting a Gordian Knot: Emended Classification and Description of

the Genus Flavobacterium, Emended Description of the Family

Flavobacteriaceae, and Proposal of Flavobacterium hydatis

norn. nov. (Basonym, Cytophaga aquatilisStrohl and Tait 1978).

Int J Syst Bacteriol. 1996;46(1):128-48.

5. Hahnke RL, Harder J. Phylogenetic diversity of Flavobacteria isolated

from the North Sea on solid media. Syst Appl Microbiol. 2013;36(7):497-

504. Epub 2013/08/16.

6. Kwon YM, Kim SY, Jung KH, Kim SJ. Diversity and functional analysis

of light-driven pumping rhodopsins in marine Flavobacteria.

Microbiologyopen. 2016;5(2):212-23. Epub 2015/12/13.

7. Bamann C, Bamberg E, Wachtveitl J, Glaubitz C. Proteorhodopsin.

Biochim Biophys Acta. 2014;1837(5):614-25. Epub 2013/09/20.

8. Hirota R, Tsubouchi K, Takada Y. NADP. Extremophiles.

2017;21(4):711-21. Epub 2017/04/26.

9. Romkina AY, Kiriukhin MY. Biochemical and molecular

characterization of the isocitrate dehydrogenase with dual coenzyme

specificity from the obligate methylotroph Methylobacillus Flagellatus.

PLoS One. 2017;12(4):e0176056. Epub 2017/04/19.

10. Wilson K, Walker JM. Principles and Techniques of Biochemistry and

Molecular Biology. 7th ed. Cambridge: Cambridge University Press;

2010. xvi, 744 s. p.

11. Bauman RW, Machunis-Masuoka E. Microbiology : with diseases by

taxonomy. 4th ed. San Francisco, Calif.: Benjamin-Cummings; 2013. xxiv,

912 s. p.

- 21 -

12. ThermoFisherSCIENTIFIC. Applied Biosystems StepOne and

StepOnePlus Real-Time PCR Systems - Relative Standard Curve and

Comparative CT Experiments.

http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4376600

13. QIAGEN. RNAprotect Cell Reagent Handbook. 3 ed: QIAGEN; 2014. p.

8-21.

14. SCIENTIFIC T. Invitrogen TURBO DNA-free Kit. ThermoFisher

SCIENTIFIC; 2018.

15. Wahlgren L. SPSS - steg för steg. Lund: Studentlitteratur AB; 2011. 188 p.

- 22 -

Bilagor Bilaga A Material

DifcoTM

Marine Agar 2216

Pepton 5.0g/L

jästextrakt 1.0g/L

ferricitrat 0.1g/L

natriumklorid 19.45g/L

magnesiumklorid 8.8g/L

natriumsulfat 3.24g/L

kalciumklorid 1.8g/L

kaliumklorid 0.55g/L

natriumbikarbonat 0.16g/L

kaliumbromid 0.08g/L

agar 15.0g/L

strontiumklorid 34.0mg/L

borsyra 22.0mg/L

natriumsilikat 4.0mg/L

natriumfluorid 2.4mg/L

ammoniumnitrat 1.6mg/L

dinatriumfosfat 8.0mg/L

DifcoTM

Marine Broth 2216

Pepton 5.0g/L

jästextrakt 1.0g/L

ferricitrat 0.1g/L

natriumklorid 19.45g/L

magnesiumklorid 5.9g/L

magnesiumsulfat 3.24g/L

kalciumklorid 1.8g/L

kaliumklorid 0.55g/L

natriumbikarbonat 0.16g/L

kaliumbromid 0.08g/L

strontiumklorid 34.0mg/L

borsyra 22.0mg/L

natriumsilikat 4.0mg/L

natriumfluorid 2.4mg/L

ammoniumnitrat 1.6mg/L

dinatriumfosfat 8.0mg/L

Loading dye

0,0625g OrangeG

10g sackaros löst i 25mL Milli-Q-vatten

Agarosgel 1%

0,5g SeaKem LE Agarose

50mL 1xTAE buffer (242g TRIS, 57,1mL ättiksyra, 100mL 0,5M EDTA pH 8,0 löst i

1000mL Milli-Q-vatten ger 50xTAE. 200mL 50xTAE spädes till 10L med avjoniserat

vatten för 1xTAE buffer)

- 23 -

PCR Mastermix

3,02µL RNasefritt vatten

5µL Power SYBR Green RT-qPCR mix (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien,

USA)

0,45µL forward primer (10pmol/µL)

0,45µL reverse primer (10pmol/µL)

0,8µL RT enzyme (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA)

Linnéuniversitetet Kalmar Växjö

Lnu.se