Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn
description
Transcript of Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn
![Page 1: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/1.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 1
Jan-Philipp Stier
Marc Matuszewska
Wendelin Wolf
Lars Lüdicke
Thomas Horn
Molekulare BiotechnologieRuprecht-Karls-Universität Heidelberg
![Page 2: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/2.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 2
GliederungI. Begriff und Geschichte der PCR
II. Ablauf der PCR allgemein
III. Mathematische Beschreibung der PCR
IV. mathematische Problemstellungen der
PCR
V. Quantitative PCR
VI. RT-PCR
VII. Real Time PCR
VIII. Beispiele
![Page 3: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/3.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 3
I. Begriff und Geschichte
PCR (Polymerase Chain Reaction)„Polymerase-Kettenreaktion“ zur
Vervielfältigung von Nukleinsäuren
Erfinder: Kary Mullis (1985)
PCR eröffnet in fast allen Bereichen der
Naturwissenschaft zahlreiche neue
Möglichkeiten
Nobelpreis für Mullis 1993
![Page 4: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/4.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 4
II. Ablauf der PCR allgemein I
Benötigte Reagenzien (Master Mix)Nukleotide (dNTP): dATP, dGTP, dTTP, dCTP
Taq DNA-Polymerase: Enzym repliziert DNA
Enzym-Cofaktor: Mg2+
Enzym, welches Kontaminationen abbaut
Puffer: Erhaltung pH-Wert, Salzkonzentration
spezifische Primer (20-30 Basen: sense-,
antisense)
zu amplifizierende DNA
![Page 5: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/5.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 5
II. Ablauf der PCR allgemein IIPCR ist 3-Schritt-Prozess (Zyklus)
1. Denaturierung (T>90°C): ein dsDNA Molekül in zwei ssDNA Moleküle
2. Annealing (Anlagerung: 40°C<T<65°C): Bindung spezifischer Primer an Zielsequenz
3. Extension (Verlängerung: T≈72°C): Synthese (5‘-3‘) zwei ssDNA zu zwei dsDNA
![Page 6: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/6.jpg)
6
zu vermehrenderDNA-Abschnitt
5’3’5’
3’
5’
3’5’
3’
Denaturierung (T>90°C)
5’
5’ 5’
3’5’
3’
3’
3’
Annealing (40 – 65 °C)
3’
5’3’
5’ 5’
3’5’
3’
DNA-Synthese (72 °C)
![Page 7: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/7.jpg)
7
Schutzhaube
Heizblöcke
Steuerungseinheit
PCR-Gerät
![Page 8: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/8.jpg)
8
III. Mathematische Beschreibung der PCR IZyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4
1Denaturierung
2Annealing
3Extension
N = N0 * 2n
N = Zahl der amplifizierten Moleküle
N0 = Zahl der Startmoleküle
n = Zahl der Zyklen n
N
N0
N
N0
![Page 9: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/9.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 9
III. Mathematische Beschreibung der PCR II
Plateau-Phase
Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung
theoretisch:
20 Zyklen: 1,048,576
30 Zyklen: 1,073,741,824
n
N
N0
N
N0
![Page 10: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/10.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 10
III. Mathematische Beschreibung der PCR IIIEffizienz E der PCR:
Anteil der Matrizen (Templates), die in jedem Schritt umgesetzt wird ≠ 100%
E meist um die 85%
geringe Veränderungen E große Veränderungen N
Beispiel: E=0.85; n=30 => N=10.4*107N0
E=0.80; n=30 => N= 4.6*107N0
E = Amplifikationseffizienz
N = N0 * (1+E)n
![Page 11: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/11.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 11
IV. Mathematische Problemstellungen IPrimer Schmelztemperatur
Einfaches Modell
Primer kürzer als 14 Nukleotide:
TM=2*(A+T)+4*(G+C)
Primer länger als 14 Nukleotide:
TM=64.9+(G+C-16.4)/(A+T+C+G)
entscheidend ist der GC Gehalt (3 H-
Bindungen), beeinflusst TM maßgeblich
![Page 12: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/12.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 12
IV. Mathematische Problemstellungen IIKompliziertes Modell
R… molare Gaskonstante R=1.987(cal/°C*mol)
… dimensionslose molare Primerkonzentration
T0=-273.15°C
t… Temperaturkurrektor t=-21,6°C
S… Entropie des Primers in cal/(K*mol)
H… Enthalpie des Primers in kcal/mol
![Page 13: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/13.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 13
IV. Mathematische Problemstellungen IIIBerechnung Enthalpie, Entropie:
H(p)=i=1n-1H(pi,pi+1); S äquivalent
Beispiel:
p=GGAT
H(GGAT)=H(GG)
+H(GA)+H(AT)
(pi;pi+1) H(pi;pi+1) S(pi;pi+1)
AA oder TT 9.1 24.0
AT 8.6. 23.9
TA 6.0 16.9
CA oder TG 5.8 12.9
GT oder AC 6.5 17.3
CT oder AG 7.8 20.8
GA oder TC 5.6 13.5
CG 11.9 27.8
GC 11.1 26.7
GG o. CC 11.0 26.6
![Page 14: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/14.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 14
V. Quantitative PCR I
Frage: Wie groß ist N0?
Methode 1: Titrationsanalyse
Verwendung externen Standards mit bekanntem N0
Anfertigung Verdünnungsreihe von Standard und Probe
Amplifikation in n Zyklen Berechnung N0 Probe über Steigung
![Page 15: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/15.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 15
Auswertung:der Unterschied von N0 ist proportional zu den Steigungen der Geraden
man sucht Wert auf x-Achse (linearer Teil)
Abtragung der dazu gehörigen y-Werte
Differenz dieser Werte gleich der Differenz von N0 von Probe und Standard
so etwa 2- bis 10-fache Konzentrationsunterschiede
bestimmbar
V. Quantitative PCR II
Probe
Standard
Lo
g N
Log N0
![Page 16: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/16.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 16
einfaches Beispiel:N0S=100 (log N0S=2), n=20, E=0.85 => NS=100*(1+0.85)20
NS=2.21*107 => log NS=7.344
NP bei N0=100 => log NP=7.568
log N0S + 0.224 ergibt log N0P
log N0P=2.224
N0P=168
V. Quantitative PCR III
Probe
StandardLo
g N
Log N0 2
7.568
7.344
![Page 17: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/17.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 17
Methode 2: lineare Analyse N = N0 * (1+E)n
(nach: Y = a * X + b)
Log N = [Log (1+E)]*n + Log N0
n0
Log N 0
Lo
g N Log (1+E)
V. Quantitative PCR III
![Page 18: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/18.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 18
VI. Reverse Transcriptase oder RT-PCR
Ausgangsmaterial: m-RNA ds-cDNA
Enzym: Reverse Transcriptase Retroviren
Tth-Polymerase Reverse TranscriptaseMangan-Ionen
![Page 19: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/19.jpg)
19
3’5’ mRNA3’ 5’Primer 1
Primer 25’ 3’
5’3’einzelsträngigecDNA
doppelsträngige3’5’5’ cDNA3’
Reverse Transkription
Amplifikation
3’5’
5’3’
Primer 25’ 3’
Primer 13’ 5’
Synthese des komplementärencDNA Stranges
![Page 20: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/20.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 20
VII. Real Time PCR
Im Prinzip wie eine Standard PCR, jedoch mit Farbstoff der in die DNA interkaliert
In diesem Zustand Detektion möglich
früher: Ethidiumbromid und Detektion mit Videokamera
heute: Fluoreszierende Farbstoffe und digitale Aufnahme
Echtzeitmessung mit jedem Zyklus
![Page 21: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/21.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 21
Zyklenzahl
Flu
ore
sze
nz
![Page 22: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/22.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 22
VIII. Messung von Metallothionein-I mRNAAuswertung
Auftragen der Werte in ein Diagramm: x-Achse = log(Std.DNA)
y-Achse = log(Verhältnis) Geradengleichung: Schnittpunkt mit der x-Achse ist Äquivalenzpunkt (log1=0)
![Page 23: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/23.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 23
VIII. Gen-Expression durch RT-PCRCT-Wert
-Patientenabhängig
-Errechnet sich aus den Zyklen, die benötigt werden, um einen spezifischen Schwellenwert zu überschreiten ( Fluoreszenz)
1. Normierung des CT-Wertes des Target-Gens
2. Eichung des CT(Target)-Wertes zu Bezugsexpressionsgröße
2 -∆∆CT relative
Expression in Bezug auf Calibrator-Gen (100%)
![Page 24: Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020320/568154d9550346895dc2dae4/html5/thumbnails/24.jpg)
Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 24
Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit
Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure AufmerksamkeitVielen Dank für eure Aufmerksamkeit