iyon değişim kromatografisi

7/29/2019 iyon deiim kromatografisi

1/102

T.CUKUROVA NVERSTESFEN BLMLER ENSTTS

DOKTORA TEZ

Hasan KARADA

SPEROKST DSMUTAZ ENZMNN NSAN ERTROSTLERNDENSAFLATIRILMASI VE BAZI PESTSTLERN ENZM AKTVTESZERNE ETKSNN NCELENMES

KMYA ANABLM DALI

ADANA, 2007


2/102

T.CUKUROVA NVERSTESFEN BLMLER ENSTTS

SPEROKST DSMUTAZ ENZMNN NSANERTROSTLERNDEN SAFLATIRILMASI VE BAZI

PESTSTLERN ENZM AKTVTES ZERNE ETKSNNNCELENMES

Hasan KARADA

DOKTORA TEZ

KMYA ANABLM DALI

Bu tez 17/08/2007 Tarihinde Aadaki Jri yeleri TarafndanOybirlii/Oyokluu le Kabul Edilmitir.

mza............ mza.................... mza.Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGN Prof.Dr.SeyhanTKEL Prof.Dr. Llfer TAMERDANIMAN YE YE

mza.. mza..Prof.Dr. ermin GL Do.Dr.GzideYCEBLGYE YE

Bu tez Enstitmz Kimya Anabilim Dalnda hazrlanmtr.

Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUN

Enstit Mdr

Bu alma ukurova niversitesi Bilimsel Aratrma Projeleri BirimiTarafndan Desteklenmitir.Proje No: FEF 2003D17

Not: Bu tezde kullanlan zgn ve baka kaynaktan yaplan bildirilerin, izelge, ekil ve fotoraflarnkaynak gsterilmeden kullanm, 5846 sayl Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hkmlere tabidir.


3/102

I

ZDOKTORA TEZ

SPEROKST DSMUTAZ ENZMNN NSANERTROSTLERNDEN SAFLATIRILMASI VE BAZI

PESTSTLERN ENZM AKTVTES ZERNE ETKSNNNCELENMES

Hasan KARADAUKUROVA NVERSTESFEN BLMLER ENSTTS

KMYA ANABLM DALI

Danman :Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGNYl: 2007, Sayfa: 89Jri: Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGN

Prof.Dr.SeyhanTKELProf.Dr. Llfer TAMERProf.Dr. ermin GLDo.Dr.GzideYCEBLG

Speroksit Dismutaz (SOD), (E.C:1.15.1.1) speroksitin hidrojen peroksidedismutasyonunu katalizler. Bu almada, SOD, DEAE-Selloz kromatorafisi ve

bakr-iminodiasetik asit-agaroz kromatorafisi kullanlarak izole edilmitir. Enzim %

33,8 verimle 196,3 kat saflatrlmtr. Vmax ve Km srasyla 5000 U/mg prot. ve

3.10-3 mM ksantin olarak bulunmutur. Optimum scaklk, 15 C (288 K) olarak

belirlenmitir. Depolama kararll aratrlmtr.Aktivasyon enerjisi 16,856 kj/mol,

denatre olmaya balanan scaklk 19 C (292 K) olarak hesaplanmtr. Geri

dnm says (kcat) ve katalitik etkinlik (kcat/Km ) srasyla 1667 s-1 ve 555 667 s-1.

mM-1 Ksantin-1 olarak bulunmutur. SODnin molekler arl 20 000 olarak

saptanmtr. Cyprodinilin SODyi yarmal (kompetitif) olarak inhibe ettii,

Fludioxonilin ise SODyi yarmasz (non-kompetitif) olarak inhibe ettii

bulunmutur.

Anahtar Kelimeler: Speroksit Dismutaz, Saflatrma, Eritrosit, Cyprodinil,

Fludioxonil.


4/102

II

ABSTRACT

PhD THESIS

PURIFICATION OF SUPEROXIDE DISMUTASE FROM

HUMAN ERYTHROCYTES AND EFFECT OF SOME

PESTICIDE ON ENZYME ACTIVITY

Hasan KARADA

DEPARTMENT OF CHEMISTRY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF UKUROVA

Supervisor: Asst.Prof.Dr. Ramazan BLGNYear: 2007, Pages: 89Jury: Asst.Prof.Dr. Ramazan BLGN

Prof.Dr. SeyhanTKELProf.Dr. Llfer TAMERProf.Dr. ermin GLAssoc.Prof.Dr. GzideYCEBLG

Superoxide Dismutase (SOD), (E.C:1.15.1.1) catalyzes the dismutation of the

superoxide to hydrogen peroxide. In this study, SOD isolated by using DEAE-

cellulose chromatography and copper-iminodiacetic acid agarose chromatography.

Enzyme was purified 196,3 fold and 33,8 % efficiency. Vmax and Km were found as

5000 U/mg prot. and 3.10-3 mM Xanthine, respectively. Optimum temperature was

determined as 15 C (288 K). Storage stability was investigated. Activation energy

was calculated as 16,856 kj/mol and initiation of denaturation temperature was

calculated as 19 C (292 K). Turnover number (kcat) and catalytic efficiency

(kcat/Km ) were found as 1667 s-1 and 555 667 s-1.mM-1 Xanthine-1, respectively.

Molecular weight of SOD was determined as 20 000. Cyprodinil inhibited SOD

competitivly and Fludioxonil inhibited SOD non-competitivly.

Key Words: Superoxide Dismutase, Purification, Erythrocyte,Cyprodinil,

Fludioxonil.


5/102

III

TEEKKR

Doktora almam boyunca, engin bilgi ve deneyimleriyle bana yol gsteren,

danman hocam Yrd.Do.Dr. Ramazan BLGNe, sayn hocam Prof.Dr. Seyhan

TKELe, sayn hocam Do.Dr. Gzide YCEBLGe ve tez izleme komitesinde

bulunan sayn hocam Prof.Dr. Llfer TAMERe sonsuz teekkrlerimi sunarm.

Arkadalarm Ar.Gr. zlem ALPTEKN, Deniz YILDIRIM ve Dilek

ALAGZn manevi destekleri iin teekkr ederim.

Ayrca doktora almam boyunca bana destek olan eim Nuriyeye ve aileme

teekkr ederim.


6/102

IV

NDEKLER SAYFA

Z..I

ABSTARCT.II

TEEKKRIII

NDEKLER...IV

SMGELER VE KISALTMALAR..VIII

ZELGELER DZN...IX

EKLLER DZN.X

1. GR1

1.1. Protein Saflatrma Amac Ve Stratejisi1

1.1.1. Protein Saflatrmann Amac...1

1.1.2.n Hazrlklar....3

1.1.2.1.Kaynak Seimi...3

1.1.2.2.Protein Hakkndaki Bilgi Birikimi.4

1.1.3. Protein Saflatrma Stratejisi...4

1.1.3.1. Aktivitenin Korunmas.51.1.3.2. Stratejik Planlama6

1.2. Kromatorafi.8

1.2.1. yon-Deiim Kromatorafisi..8

1.2.1.1. Proteinlerin yon-Deiim Kromatorafisi le Saflatrlmas...11

1.2.1.1.(1). yon Deitiricinin Seimi12

1.2.1.1.(2). Tampon Seimi.12

1.2.1.1.(3). Kolon Seimi.13

1.2.1.1.(4). rnek Tatbiki Ve Elsyon.14

1.2.2. mmobilize Bakrlgi Kromatorafisi..14

1.3. Pestisitler..16

1.3.1. Pestisitlerin Snflandrlmas:...16

1.3.1.1. Etkiledikleri Canl Gruplarna Gre...16

1.3.2. Pestisitlerin Hayvansal Organizmaya Giri Yollar..17

1.3.2.1. Az Yoluyla Giri.17

1.3.2.2. Deri Yoluyla Giri..18


7/102

V

1.3.2.3. Solunum Yoluyla Giri..18

1.3.3. Pestisitlerin Etki Mekanizmalar...18

1.3.3.1. Fiziksel Varsaym..18

1.3.3.2. Toksoforik Varsaym.19

1.3.3.3. Yerine Geme19

1.3.3.4. Enzim Faaliyetini Engelleme.19

1.3.4. Aratrlan Pestisitler.20

1.4. Serbest Radikaller Ve Antioksidan Savunma Sistemleri22

1.4.1. Serbest Oksijen Radikalleri22

1.4.1.1. Speroksit Radikali (O2)22

1.4.1.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)...23

1.4.1.3. Hidroksil Radikali (OH )23

1.4.2. Antioksidan Savunma Sistemleri...23

1.4.2.1. Doal (Endojen) Antioksidanlar24

1.4.2.1.(1). Enzimler24

1.4.2.1.(2). Enzim Olmayanlar.24

1.4.2.2. Eksojen Antioksidanlar (lalar)...251.4.2.3. Gda Antioksidanlar.25

1.5. Speroksit Dismutaz ( Speroksit Oksidoredktaz, E.C:1.15.1.1, SOD)...25

1.5.1. Bakr-inko Speroksit Dismutaz25

1.5.1.1. karyotlarda ve Prokaryotlarda Cu-Zn SOD...26

1.5.1.2. Cu-Zn SODnin Yaps ve Katalitik Etkinii26

1.5.1.3. Cu-Zn SODnin Yaps.28

1.5.2. Mangan Speroksit Dismutaz...281.5.2.1. Mn-SOD Yerleimi...29

1.5.2.2. Mn-SOD Yaps30

1.5.3. Demir Speroksit Dismutaz..30

1.5.3.1. Fe-SODlerin Yerleimi31

1.6.Projenin Yeri Ve nemi...31

2. NCEK ALIMALAR..32

3. MATERYAL VE METOD42


8/102

VI

3.1. Materyal..42

3.1.1. Kimyasallar42

3.1.2. Kullanlan Cihazlar...43

3.2. Metod...44

3.2.1. Enzimin Saflatrlmas..44

3.2.1.1. Hemoliz, Diyaliz Ve Santrifjleme44

3.2.1.2. DEAE-Selloz Kromatorafisi..44

3.2.1.3. Bakr-minodiasetik Asit-Agaroz Kromatorafisi.45

3.2.2. Speroksit Dismutaz Tayini45

3.2.2.1. Prensip 45

3.2.2.2. Aktivite lm..46

3.2.3. Protein Tayini.47

3.2.4. Pestisit Etkisi..48

3.2.5. Optimum Scaklk..48

3.2.6. Depolama Kararll.48

3.2.7. Molekler Arlk tayini49

3.2.7.1. Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi

(SDS-PAGE)..49

3.2.8. Michaelis-Menten Katsays (Km) Ve Maksimum Hzn (Vmax)

Grafiksel Yntemle Belirlenmesi..52

3.2.9. Aktivasyon Enerjisinin Hesaplanmas...53

4. BULGULAR VE TARTIMA...55

4.1. Bulgular...55

4.1.1. Speroksit Dismutazn Saflatrlmasle lgili Bulgular.554.1.2. Speroksit Dismutazn Karakterizasyonu le lgili Bulgular...62

4.1.2.1. Optimum Scaklk..62

4.1.2.2. Aktivasyon Enerjisinin, Denatre Olmaya Balanan Scakln

Hesaplanmas.63

4.1.2.3. Geri Dnm Says Ve Katalitik Etkinliin Hesaplanmas64

4.1.2.4. Depolama Kararllnn Aratrlmas..65


9/102

VII

4.1.2.5. Michaelis-Menten Katsays (Km) Ve Maksimum Hzn

(Vmax) Grafiksel Yntemle Belirlenmesi.66

4.1.2.6. Speroksit Dismutazn Molekler Arlnn Tayini.68

4.1.3. Cyprodinil Ve Fludioxonilin Speroksit Dismutaz Aktivitesine

Etkisi..69

4.1.3.1. Cyprodinil le Salatrlm Speroksit Dismutazn

Etkileimi69

4.1.3.2. Cyprodinil le Eritrositlerin Etkileimi..70

4.1.3.3. Cyprodinilin nhibisyon Tr...71

4.1.3.4. Fludioxonil le Salatrlm Speroksit Dismutazn

Etkileimi...73

4.1.3.5. Fludioxonil le Eritrositlerin Etkileimi.74

4.1.3.6. Fludioxonilin nhibisyon Tr..75

4.2. Tartma..77

5. SONULAR VE NERLER82

5.1. Sonular..82

5.2. neriler...83

KAYNAKLAR...84

ZGEM89


10/102

VIII

SMGELER VE KISALTMALAR

DEAE : Dietilaminoetil

IDA : minodiasetik Asit

SOD : Speroksit Dismutaz

Cu-Zn SOD: Bakr-inko Speroksit Dismutaz

Mn-SOD : Mangan Speroksit Dismutaz

Fe-SOD :Demir Speroksit Dismutaz

XOD : Ksantin Oksidaz

N.B.T : Nitro Blue Tetrazolium

SDS-PAGE :Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi

TEMED : N,N,N,N

-Tetra Metil Etilen Diamin

APS : Amonyum perslfat

Km : Michaelis-Menten Sabiti

Vmax : Doygun substrat deriiminde enzimin ulaabilecei maksimum hz.

Ea : Aktivasyon Enerjisi

kcat :Geri Dnm Says

Ki : nhibisyon Sabiti

Prot : Protein


11/102

IX

ZELGELER DZN SAYFA

izelge 1.1. Protein saflatrma tekniklerinin zellikleri.7

izelge 1.2. Yaygn kullanlan iyon deitiriciler..10

izelge 1.3. Cyprodinilvefludioxonilin IUPAC ad ve yaps.21

izelge 1.4. Cyprodinilvefludioxonilin zellikleri..21

izelge 3.1. % jel konsantrasyonlarna kar eklenmesi gereken maddeler...50

izelge 4.1. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve

405 nmdeki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite deerleri.57

izelge 4.2. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm

ve 405 nmdeki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite

deerleri... 60

izelge 4.3. Saflatrma tablosu.62

izelge 4.4. Speroksit dismutazn farkl scaklklarda llen aktivite deerleri...62

izelge 4.5. Speroksit dismutazn 1/Tye kar, ln V deerleri..64

izelge 4.6. Speroksit dismutazn depolama kararll ile ilgili bulgular..65

izelge 4.7. Speroksit dismutaz iin farkl substrat deriimlerinde llen

aktivite deerleri....66

izelge 4.8. Standart proteinlerin g hzlarna kar log Molekl arlklar...68

izelge 4.9. eitli Cyprodinil deriimlerinin saflatrlm speroksit dismutaz

aktivitesi zerine olan etkisi...70

izelge 4.10. eitli Cyprodinil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden

sonraki SOD aktivite deerleri.71

izelge 4.11. Speroksit dismutaz iin farkl substrat ve Cyprodinil

deriimlerinde llen aktivite deerleri.72

izelge 4.12. eitli Fludioxonil deriimlerinin saflatrlm speroksit dismutaz

aktivitesi zerine olan etkisi.....73

izelge 4.13. eitli Fludioxonil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden

sonraki SOD aktivite deerleri.74

izelge 4.14. Speroksit dismutaz iin farkl substrat ve Fludioxonil

deriimlerinde llen aktivite deerleri.75


12/102

X

EKLLER DZN SAYFA

ekil 1.1. yon deitiricilera)Anyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlarb) Katyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar...9

ekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit elat kompleks destei, b) metal elat ilgi

desteine proteinlerin balanmas..........16

ekil 3.1. Standart protein grafii...48

ekil 3.2. Michaelis-Menten grafii...52

ekil 3.3. Lineweaver-Burk grafii53

ekil 3.4. Aktivasyon enerjisinin bulunmas iin Arrhenius grafii..54

ekil 4.1. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve 405 nmdeki

absorbans deerleri....55

ekil 4.2. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nmdeki

absorbans deerleri....56

ekil 4.3. DEAE-Selloz kolonundan alnan fraksiyonlarda spesifik aktivite

deerleri.56

ekil 4.4. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarn 280 nm ve

405 nmdeki absorbans deerleri...58

ekil 4.5. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarda aktivite ve

280 nmdeki absorbans deerleri...59

ekil 4.6. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alnan fraksiyonlarda spesifik

aktivite deerleri60

ekil 4.7. Speroksit dismutaz iin aktivite-scaklk grafii..63

ekil 4.8. Speroksit dismutaz iin Arrhenius grafii64

ekil 4.9. Speroksit dismutazn depolama kararll grafii..66

ekil 4.10. Speroksit dismutaz iin Michaelis-Menten grafii.67

ekil 4.11. Speroksit dismutaz iin Lineweaver-Burk grafii..67

ekil 4.12. Speroksit dismutaz enzimine ait SDS-PAGE elektroforez sonular.68

ekil 4.13. SDS-PAGE jel elektroforezinde standart olarak kullanlan sr albumini,

ovalbumin, -Chymotrypsin ve sitokrom cnin molekl arlklarnn

logaritmasna kar yrme hzlar..69


13/102

XI

ekil 4.14. Cyprodinil ile etkiletirilen saflatrlm speroksit dismutazda

aktivite grafii..70

ekil 4.15. eitli Cyprodinil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki

SOD aktivite grafii.....71

ekil 4.16. Cyprodinil ile etkiletirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafii..72

ekil 4.17. Fludioxonil ile etkiletirilen saflatrlm speroksit dismutazda

aktivite grafii...74

ekil 4.18. eitli Fludioxonil deriimleri ile eritrositlerin etkileiminden sonraki

SOD aktivite grafii.....75

ekil 4.19. Fludioxonil ile etkiletirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafii..76


14/102

1.GR Hasan KARADA

1

1. GR

1.1. Protein Saflatrma Amac Ve Stratejisi

lk kez Berzelius tarafndan kullanlan ve 1840 ylnda ders kitaplarna geen

protein ad yunanca bir numara, birinci srada olmak anlamna gelen proteuo

kelimesinden tretilmitir. Proteinler bu ad hakl olarak tamaktadr. Saysz hayat

fonksiyonu proteinlere baldr ve proteinsiz bir canl sz konusu olamaz. Her

hcrenin bileeni olan proteinlerin enzimatik kataliz, transport, depolama, mekanik

destek, koordine hareket, sinir impluslarnn transmisyonu, immn koruma, byme

ve farkllamann kontrol gibi fonksiyonlar vardr. Proteinlerin saflatrlmas hem

bu fonksiyonlar yapan molekln belirlenmesi ve olayn mekanizmasnn

aydnlatlmas hem de in vitro koullarda endstriyel veya analitik amala kullanlma

olanann aratrlmas asndan byk nem tar (Telefoncu,1996).

1.1.1. Protein Saflatrmann Amac

Protein saflatrmann amac saf protein elde etmek deil daha sonraki almalar

iin kullanlabilecek bir protein preparat hazrlamaktr. Bu almalar; proteinin

aktivitesinin aratrlmas ve bu aktiviteden biyoteknolojik retim, analitik veya

tedavi edici amala yararlanlmasna ynelik olabilecei gibi, protein yapsnn veya

yap fonksiyon ilikisinin aratrlmasn da hedefleyebilir. Amaca uygun bir protein

preparat hazrlayabilmek iin aadaki hususlarn netletirilmesi zorunludur.

Gereksinim duyulan saf protein miktar

Ne dzeyde aktivite kaybnn tolere edilebilecei

Ne dzeyde saflk istendii

Saflatrma ilemi iin ne kadar zaman ve para harcanabilecei, v.b.

Biyoteknolji devrimini yaadmz gnmzde kullanm amacna gre

gerekli protein miktar birka mikrogram (klonlama almalar) ile birka kilogram

(endstriyel ve farmastik uygulamalar iin) arasnda deiir. Protein retiminde


15/102

1.GR Hasan KARADA

2

zaman ve maliyet ok nemlidir. Gerekli protein miktar ve saflk dzeyi kullanm

amacna baldr. Bilimsel aratrmalar iin az miktarda protein yeterlidir fakat

preperat kesinlikle zararl yabanc aktivite iermemelidir. Endstriyel uygulamalar

iin byk lekte retim sz konusudur ve saflk ikinci derecede nem tar. Tedavi

edici uygulamalar iin hazrlanan protein preperatnn ise yksek saflkta olmas

gerekir.

Protein aktivitesinin belirlenmesi hedeflenmi ise kesinlikle aktif formda

(rnein; bir enzim, bir reglatr protein veya bir antikor gibi) elde edilmelidir.

Bunun iin ok az miktarda protein yeterlidir. Fakat ama proteinin aktivitesinden

yararlanmak ise daha fazla protein gerekecektir. nert proteinlerin bulunmas her iki

ama iinde engel oluturmadndan, yabanc aktiviteler tamamen uzaklatrlm

ise daha ileri dzeyde bir saflatrma gereksizdir. Saflatrmada uygulanacak her yeni

adm zaman ve aktivite kaybna sebep olaca gibi verimi drp maliyeti

arttracaktr.

Yap aratrma almalarnda ise olduka fazla miktarda ve yksek saflkta

proteine gereksinim vardr. Bu durumda maliyet ve zaman ikinci derecede nemlidir.

Fakat yap-fonksiyon ilikisi aratrlyorsa saflatrma ilemi sresince aktivite

kaybn minimize etmek iin ilem sresinin olabildiince ksaltlmas gerekir.

Beirli bir miktar k maddesinden elde edilecek saf protein miktar

saflatrma admlarnn toplam verimine baldr. Adm says verim ile ters fakat

saflk derecesi ile doru orantldr. En az saflatrma adm ile amaca uygun saflkta

protein preparat hazrlamak ok nemlidir. zellikle afinite kromatorafisi ve

afinite-ultrafiltrasyon teknikleri protein saflatrlmasnda adm saysn dramatik

biimde drmektedir.

Bir protein preparatnn saflk dzeyini genel anlamda toplam protein yzdesi

belirlemekle birlikte baka grup maddelerden kaynaklanan safszlklarda nemlidir.

Proteinin kullanm amacna baml olarak istenen saflk dzeyide deiir. Tedavi

edici amal kullanalacak protein preparatnn ok saf olmas istenir. Proses katk

maddeleri, nkleik asit kalntlar v.b. safszlklarn kesinlikle uzaklatrlmas

gerekir. Yksek dzeyde safla ulaabilmek iin yaplan saflatrma admlar bir

yandan protein verimini drrken dier tarftan maliyeti ok arttrr. Bilimsel


16/102

1.GR Hasan KARADA

3

aratrmalarda birka ilave saflatrma basama nemli olmayabilir ancak ticari

retim durumunda en ekonomik koullarda allmaldr. Saflatrlan protein bir

enzim ise ve yalnz enzimatik aktiviteden yararlanlacaksa toplam protein orannn %

80-90 arasnda olmas yeterlidir. Fakat protein olmayan safszlklar enzim

aktivitesini olumsuz etkilememeli, preparat enzim aktivitesini interfere eden yabanc

enzimleri zellikle proteolitik enzimleri iermemelidir. Yap aratrmalarnda

kullanlacak proteinlerin saflk dzeyi tedavi edici amala kullanlanlar kadar olmasa

bile en az % 95 saf protein iermelidir.

Saflatrma ilemleri sresince protein denatrasyonundan korunmas ve

biyolojik aktivitesini yitirmemesine zen gsterilmelidir. Bu ekilde hazrlanan

protein preparat her trl almada kullanlabilirken ama yalnz polipeptid zincir

dizisini (primer yap) aydnlatmak ise daha sert koullarda allmasnda saknca

yoktur. Protein saflatrlmasndaki admlar denatrasyon ve proteolizi minimuma

drecekekilde seilmelidir (Telefoncu,1996).

1.1.2.n Hazrlklar

1.1.2.1.Kaynak Seimi

Seilen kaynakta hedeflenen protein hem kararl hem de bol bulunmaldr.

Ayrca kaynan kolay salanabilir, bol ve ucuz olmasda nemlidir. Hayvansal

kaynaklar seilirken saflatrlacak protein miktarna uygun byklkte hayvan

seilmeli ve yabani hayvanlar yerine evcil hayvanlar tercih edilmelidir. Bir

zorunluluk yoksa, hayvansal kaynaklar yerine kltr ortamnda retilebilen bakteri,

maya, mantar veya memeli hcreleri kullanlmaldr. Bylece hcre oalmas

annda biyosentezleri ynlendirebilme olanana kavuulur ve ihtiyaca uygun

boyutta reaktr ile retim yaplabilir.

Gen teknolojisinin salad olanaklar sayesinde hcre metabolizmas youn

olarak hedeflenen proteinin biyosentezine ynlendirilebilmektedir. Seilen konuku

(host) hcrenin proteini ekstraseller blgeye salglamas saflatrma asndan

nemli stnlkler salar.


17/102

1.GR Hasan KARADA

4

Kukusuz hayvansal ve mikrobiyal kaynaklar yannda bitkisel kaynaklardan

da saf protein retiminde yararlanlabilir. Ancak mevsime, iklime bamllk ve

transport gibi sorunlar bitkisel kaynaklarn kullanmn snrlandrmaktadr.

1.1.2.2.Protein Hakkndaki Bilgi Birikimi

Proteinin molekler yaps, fiziksel ve kimyasal zellikleri ekstraseller veya

intraseller olmas ve hcre iinde bulunduu yerin bilinmesi saflatrma prosesin

belirlenmesinde ok yardmc olur. Belirli bir proteinin hcre iindeki lokalizasyonu

kaynaa baml deildir, kimyasal yaps ve molekl boyutu da genellikle benzerlik

gsterir.

Proteinin fonksiyonel aktivitesi hcre iindeki lokalizasyonu hakknda bilgi

verir. rnein; ekstraseller byme faktr reseptrleri plazma membrannda

bulunurken, transkripsiyonda grev alan enzimlerin ekirdekte lokalize olmalar

doaldr. Proteinin intraseller veya ekstraseller membrana bal olmas veya

organellerde bulunmas, znp znmemesi ekstraksiyon yntemi seiminde ve

kullanlacak tamponunun bileiminin belirlenmesinde etkilidir.

Saflatrlacak protein, glikoprotein veya lipoprotein ise zellikleri dier

safszlk proteinlerinden ayrcalk gsterir ve rnein glikoproteinler lektin afinite

kromatorafisi ile saflatrlabilirler.

1.1.3. Protein Saflatrma Stratejisi

Bir proteinin saflatrlmasnda uygun bir ilem dizisinin optimizasyonu ok

nemlidir. En etkili, en hzl ve en ekonomik ayrma ve saflatrma proseslerinin

mevcut bilgiler yardmyla belirlenmesi hedeflenir. Bu nedenle saflatrlacak

proteinin bulunduu kaynaklar, zellikleri ve stabilitesinin iyice tetkik edilmesi

gerekir. Uygulanacak ayrma ve saflatrma teknikleri proteinin biyolojik aktivitesini

olumsuz etkilememelidir.


18/102

1.GR Hasan KARADA

5

1.1.3.1. Aktivitenin Korunmas

zellikle intraseller proteinler saflatrma koullarndan ok etkilenirler. Hcre

ierisinde indirgen koullar egemen olup pH 6,5-7,5 arasndadr ve protein

konsantrasyonuda yksektir ( ~100 mg/ml). Hcre ve organellerin paralanmas

sonucu ayr kompartmanlarda bulunan ve birbirini etkiliyebilen eitli maddeler bir

araya gelecekler, proteoliz etkinleecek ve ortam pHs decektir. Ayrca

proteinlerin kolayca ykseltgenmeleri sz konusudur. Tm bu problemlerin

alabilmesi iin tampon ve tampona kat lacak maddelerin seimi zel bir nem tar.

Dk scaklkta (~ 4 C) ve hzl alma sonucu proteolizin etkinlii azalr.

Proteolitik enzimler daha ok lizozomlarda lokalize olduklarndan homojenizasyon

koullarnda lizozom membranlarn dayankl klmak iin tampon zeltiye maltoz

ve sakkaroz gibi disakkaridler ilave edilebilir. Ayrca tampona proteolitik enzim

inhibitrlerinin katlmas da ok etkili bir nlemdir. ou proteolitik enzimlerin

molekl ktleleri 20-30 kDa arasnda olduundan hedeflenen proteinin mol ktlesi

daha byk ise protein saflatrma prosesinin ilk admlarnda jel geirgenlik

kromatorafisi uygulanabilir. Fakat bu tekniin kapasite ve ayrma gcnn ok

dk olmas gibi sakncalar vardr.

Asidik veya bazik pH koullar, organik zgenler ve scaklk protein

denatrasyonuna neden olan ana parametrelerdir. Hcre ii pH koullarna (pH 6,5-

7,5) uygun tampon sistemler kullanlmas, saflatrmann ilk admlarnda 4 Cde

(proteolizi nlemek iin), daha sonraki admlarda ise oda scaklnda (20-25 C)

allmas ou proteinler iin denatrasyona neden olmaz. Organik zgenler ile

protein ktrme adm gerekli ise bu ilemin dk scaklkta yaplmas uygundur.

Enzim aktif merkezleri reaktif gruplar ierdiinden substrat dnda birok

yabanc madde ile etkileebilir ve enzim inaktif hale gelir. Hcre paralanmasndan

sonra intraseller enzimlerin karlat ykseltgen ortam zellikle HS-proteazlarn

hzl inaktivasyonuna sebep olur. Bunu nlemek iin tampona 2-merkaptoetanol veya

ditiyotreitol ilave edilir. 2-merkaptoetanol ancak 24 saat koruyucu etkiye sahiptir ve

kokusu rahatsz edicidir. Ditiyotreitol hem daha dk konsantrasyonda hem de uzun

sre etkilidir. Ykseltgenler yannda Me2+

iyonlar da HS-gruplarn balayarak


19/102

1.GR Hasan KARADA

6

inaktivasyona neden olurlar. Eer protein veya enzim kendisi metal iyonu iermiyor

ise EDTA gibi kompleksletiricilerin de tampona katlmasnda yarar vardr. Ayrca

tampona saflatrlacak enzimin substrat veya kofaktrnn katlmasda

inaktivasyona kar etkili bir nlemdir.

Protein saflatrma admlarnda proteinin cam reaksiyon kaplarnn yzeyinde

adsorpsiyonu byk bir sorundur. Bu sorunu aabilmek iin polipropilen kaplar

kullanlr. zellikle seyreltik protein zeltileri yzey adsorpsiyonu ile nemli

kayplar verdikleri gibi kuarterner yapl proteinlerin alt birimlerinin (subunit)

ayrmasda sz konusudur. Ortama sr serum albumini (< % 0,1) veya non-iyonik

deterjanlarn (< % 0,1) katlmas adsorpsiyon kayplarn en aza indirgerse de her iki

katk maddesi protein saflatrmada baz sorunlara neden olabilir.

Tampona eker alkolleri (gliserin, sorbitol, mannitol v.b) ve baz ekerlerin

(glukoz, sakkaroz) katlmas su aktivitesini dreceinden denatrasyon ile

fonksiyonel protein kaybn azaltr. Ayrca % 20den fazla gliserin kat lrsa 20

Cde donmadan protein zeltisinin saklanmas mmkndr.

Protein saflatrma ilemine uzun sreli ara verme (bir gece gibi) durumunda

zeltiye bakteriostatik ve proteaz inhibitrleri ilave edilmeli ve souk odada

saklanmaldr. Daha uzun sreli bekletmelerde zelti dondurulmaldr. Sv azot

veya kuru buz-metanol karm ile ok dondurma tercih edilir. Yksek

konsantrasyonlarda amonyum slfat proteinleri stabilize ettiinden bir gece veya

daha uzun depolama amonyum slfat ile ktrme admndan sonra yaplmaldr.

1.1.3.2. Stratejik Planlama

Saflatrmann stratejik hedefi ucuz ve etkili yntemler ile yksek saflk ve

verim ile protein kazanmaktr. Saflatrmada kullanlacak tekniklerin seimi ve

sralamas ok nemlidir. izelge 1.1de protein saflatrmada kullanlan temel

tekniklerin bir kyaslamas verilmitir.


20/102

1.GR Hasan KARADA

7

izelge 1.1. Protein saflatrma tekniklerinin zellikleri (Telefoncu,1996)

Teknik Dayandzellik

Kapasite Etkinlik Verim Maliyet

PH ktrmesi Yk Yksek okdk

Orta Dk

(NH4)2SO4 ktrmesi Hidrofobisite Yksek okdk

Yksek Dk

Ekstraksiyon Deiik Yksek okdk

Yksek Dk

Biyoafinite kromatorafisi Biyoafinite Yksek Yksek Deiebilir Yksekyon deiimkromatorafisi

Yk Orta Orta Orta Orta

Hidrofobik etkileimkromatorafisi

Hidrofobisite Orta Orta Orta Orta

Kromatofokuslama(odaklama) Yk/ pI Dk Yksek Orta Yksek

Boya afinite kromatorafisi Deiik Orta Yksek Orta OrtaLigand afinitekromatorafisi

Biyoaktivite Orta-dk

okyksek

Dk Yksek

Jel Geirgenlikkromatorafisi

Moleklboyutu

okdk

Dk Yksek Orta

Saflatrmann ilk admlarnda daha ok deritirmeye ynelik (yksek

kapasiteli) teknikler kullanlr. Bylece ortamdaki suyun byk ksm uzaklatrlm

olur. ktrme, ekstraksiyon ve absorpsiyon kromatorafi teknikleri bu amala

kullanlabilir.

Ayrca gc asndan ktrme ve ekstraksiyon teknikleri etkin deilken

kromatorafik teknikler zellikle afinite kromatorafisi ok etkindir ve 1000 kattan

fazla saflatrma salar. Afinite-ultrafiltrasyon kombinasyonu gibi yksek ayrma

gl tekniklerin kullanlmas saflatrma prosesindeki adm saysn ok drr.

Fakat afinite tekniklerinin ok pahal olduu, bu nedenle ktrme gibi ucuz

teknikler ile kontaminantlarn nemli oranda uzaklatrlmasndan sonra

uygulanmalar gerektii unutulmamaldr. Protein saflatrmada uygulanacak

teknikler genel olarak aadaki sray izler:

Homojenizasyon

ktrme

yon deiim kromatorafisi

Afinite kromatorafisi

Jel Geirgenlik kromatorafisi


21/102

1.GR Hasan KARADA

8

Saflatrmann verimi protein tayini ile, ka kat saflatrma gerekletirildii

ise birim protein ktlesi bana fonksiyonel aktivitenin llmesi ile bulunur. Protein

saflk testi ve ka yabanc protein ierdii jel elektroforezi ile belirlenir.

Safszlklarn molekl ktleleri SDS-PAGE ile tayin edilir ve safszlklar jel

geirgenlik kromatorafisi ile uzaklatrlr.

1.2. Kromatorafi

Kromatorafi kelimesi Yunanca chroma renk ve Graphein yazmak

kelimelerinden kaynaklanmtr. lk defa yirminci yzyln balarnda grnr renkli

bitki pigmentlerin ayrlmasnda kullanlm bir tekniktir.

Kromatorafi farkl bileiklerin deiken bir ekilde farkl fazlarda

dalmasna dayanr. Daima duraan faz (stasyonel faz) ve hareketli faz (mobil faz)

vardr. Hareketli faz duraan fazn zerinden geer ve ayrlmas istenen maddeyi de

beraberinde srkler. Ayrlacak madde bileenleri farkl derecede duraan fazla

etkileime girerler. Duraan fazla etkileimi fazla olan bileenler daha ar,

etkileimi az olan bileenler ise daha abuk hareket ettiklerinden bileenler

birbirinden ayrlr. Bileiklerin bileenlerine ayrlmasnda, duraan faz ile bileenler

arasndaki etkileimin tabiatna gre farkl kromatorafik yntemler gelitirilmitir.

Bu etkileim molekl byklne, polariteye, spesifik balanma zelliklerine veya

elektrostatik ekim gcne dayanabilir (Telefoncu,1996).

1.2.1. yon-Deiim Kromatorafisi

Elektrostatik ekime dayanan bu adsorpsiyon kromatorafisinde rnekte

bulunan bileenler ykl duraan faza olan afinitelerine gre ayrlrlar. yon

deitiriciler iki ksmdan oluur:

1. inde ve yzeyinde kimyasal olarak (kovalent balarla) balanm ykl gruplar

bulunan boyutlu, apraz balarla balanm znr olmayan dolgu maddesi

(matriks).


22/102

1.GR Hasan KARADA

9

2. Hareketli kar iyonlar. Kar iyonlar tersinir olarak ayn ykteki baka iyonlarca,

znr olmayan dolgu maddesinde herhangi bir deiiklie yol amadan

deitirilebilirler (Boyer, 1993).

yon deitirici dolgu maddesi ayet pozitif gruplarla kimyasal olarak

balanmsa, kar iyonlar negatif olup, bu tr iyon deitiriciler negatif iyonlar

deitirdiklerinden anyon deitiriciler adn alrlar. Benzer ekilde ayet dolgu

maddesi negatif gruplarla kimyasal olarak balanmsa, kar iyonlar pozitif olup, bu

tr iyon deitiriciler pozitif iyonlar deitirdiklerinden katyon deitiriciler adn

alrlar (ekil 1.1).

- + + - + - - +

+ + + + - - - +

- - - +a) b)

ekil 1.1. yon deitiricilera)Anyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar b)Katyon deitiriciler ve deitirilebilir kar iyonlar (Pharmacia FineChemicals AB,1980)

Dolgu maddesi alminyum silikatlar, sentetik reineler, polisakkaritler v.b.

olabilir. Dolgu maddesinin tabiat iyon deitiricilerin mekanik kararlln, ak

zelliini, bozulabilen biyolojik maddelere kar davrann ve ksmen de

kapasitesini belirler. lk kullanlan iyon deitiricileri sentetik reineler olup suyun

demineralizasyonunu ve su kalitesini dzeltmede ve atklardan iyonlarn

kazanlmasnda kullanlmtr. Bu tr iyon deitiriciler yksek derecede ykl

gruplarla kovalent olarak balanm hidrofobik polimer dolgu maddeleri olup

biyolojik maddelerin saflatrlmasnda uygun deildir zira yksek yk younluu ve

polimerlerin hidrofobik oluu biyolojik maddelerin denatre olmalarna sebep olur.

Biyolojik maddelerin ayrmnda ilk kullanlan iyon deitiriciler Peterson ve

Sober (1956), tarafndan gelitirilen selloz iyon deitiricilerdir. Hidrofilik tabiat

sebebiyle sellozun proteinleri denatre etme eilimi ok dktr. Pharmacia Fine

Chemicals firmas tarafndan gelitirilen modifiye dekstran olan Sephadex, apraz

bal agaroz olan Sepharose ve epiklorohidrin ile apraz balanarak

kuvvetlendirilmi selloz olan Sephacel iyon deitiricileri, kresel tanecikli


23/102

1.GR Hasan KARADA

10

yksek gzenekli ilk iyon deitiricilerdir. Bu gnlerde ok farkl destek maddesi

vardr ancak protein fraksiyonlanmas iin en yaygn tercih edilen destek maddesi

sellozdur (Johnstone ve Thorpe, 1982).

Fiberli sellozik iyon deitiricilerin peptid ve protein saflatrlmasnda

tercih edilme sebebi peptid ve proteinlerin bu dolgu maddesinde ok kararl

olmalardr (Boyer, 1993).

Yaygn olarak kullanlan iyon deitiricilerin, deitirdikleri iyon yklerine

gre trleri, destek maddeleri, destek maddesine kovalent olarak bal iyonik

gruplar, kar iyonlar, pH kullanm aralklar ve zayf veya kuvvetli iyon deitirici

trleriizelge 1.2de zetlenmitir.

izelge 1.2. Yaygn kullanlan iyon deitiriciler (Telefoncu,1996)

yonik Grup PH Kullanm

Aral

Mevcut Maddeleri

Anyon Deitiricileri

Zayf Anyon Deitiricisi

Dietilaminoetil (DEAE)

Fonksiyonel Grup:

-O-CH2CH2N+-(C2H5)2H Cl

-

Kar iyon: Cl-

2-9 Dekstran,

Agaroz,

Bilyeletirilmi selloz,

Lifli selloz,

Mikrogranler selloz

Kuvvetli Anyon Deitiricisi

Kuaterner aminoetil (QAE)

Fonksiyonel Grup:

-O-CH2CH2N+-(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 Cl

-

Kar iyon: Cl-

2-10 Dekstran,

Lifli selloz

Katyon Deitiricileri

Zayf Katyon DeitiricisiKarboksimetil (CM)

Fonksiyonel Grup:

-O-CH2COO Na+

Kar iyon: Na+

3-10 Dekstran,Agaroz,

Lifli selloz,

Mikrogranler selloz

Kuvvetli Katyon Deitiricisi

Slfopropil (SP)

Fonksiyonel Grup: -O-CH2CH2CH2SO3 Na+

Kar iyon: Na+

2-12 Dekstran,

Mikrogranler selloz


24/102

1.GR Hasan KARADA

11

yon deitiricilerin kar iyonlar absorplama kabiliyeti kantitatif olarak

kapasite olarak tanmlanr. yon deitiricisinin total kapasitesi, o iyon

deitiricisinin kuru gramnda bulunan ykl ve potansiyel olarak ykl gruplarn

miktardr. Genel olarak miligram kuru arlk bana iyonlaabilen gruplarn

miliekivalenleri olarak ifade edilir ve deneysel olarak titrasyonla tayin edilir. yon

deitiricisinin kapasitesi destek maddesinin gzeneinin fonksiyonudur.

malatlarn literatrnden protein iin mevcut kapasite mikrogranler, bilyelenmi

selloz ve agaroz iin ok benzerdir (0,11-0,15 g albumin / ml DEAE trevi iyon

deitiricisi). yon deitiricilerin yksek kapasitesi ok byk hacimlerin prosesine

ve sonra konsantre ekilde eldesine imkan verir.

yon deiim kromatorafisi ile ayrmada temelde iki etap vardr: lk etap

rnek tatbiki ve iyon deitirici zerinde adsorpsiyon, ikinci etap ise adsorbe edilen

rnek bileenlerinin kolondan ayrlm olarak ele edilmeleri (Boyer, 1993).

1.2.1.1. Proteinlerin yon-Deiim Kromatorafisi le Saflatrlmas

Proteinler iyon deitiricilere zt ykl gruplar arasndaki iyonik etkileimle

tersinir olarak balanrlar. Balanan proteinler ya tampon zeltisinin iyonik gc

kademeli olarak arttrlarak ya da tampon zeltisinin pH deitirilmek suretiyle

protein yzeyindeki etkileen gruplarn yk yok edilmek suretiyle kolondan ayr

ayr ele edilirler. Btn bu ilemler esnasnda iyonik deitiricinin yk sabit

kalacak bir pH aral seilmelidir yoksa btn proteinler kolondan ayrlmadan

birlikte ele olurlar.

Balanma gc hem proteinin izoelektrik noktasyla hem de toplam yk ile

balantldr. Dolaysyla ayn izoelektrik noktasna sahip iki protein denge

izoelektrik fokuslama ile ayrlmazken iyon-deiim kromatorafisiyle ayrlabilirler

(Johnstone ve Thorpe, 1982).


25/102

1.GR Hasan KARADA

12

1.2.1.1.(1). yon Deitiricinin Seimi

Amfoterik maddeler olan proteinlerin net ykleri deikendir. Dk

pHlarda pozitif, yksek pHlarda negatif ve izoelektrik noktada (pI) ise sfr

ykldr. Proteinlerde etkileime giren yk gruplar balca karboksil, amino veya

tersiyer amino gruplardr. Dolaysyla anyon deitiricileri proteinlerin protonsuz

karboksil gruplarn balarken protonlanm amino gruplarn iter. Genel kaide olarak

toplam aspartik asid ve glutamik asid art deiken proteinler anyonik deitiriciler

ile ayrlrken, lizin, arjinin ve histidin ierii farkl proteinler katyonik deitiricilerle

ayrlabilirler. Ancak, bu kaide kesin bir kaide deildir, zira balanmay etkileyen bir

ok faktr vardr. Bu sebeple proteinlerin ayrlmasna teebbs edilmeden protein

karmnn hem asidik hem de bazikartlarda poliakrilamid jellerle elektroforezinin

yaplmasnda fayda vardr. Elektroforetik ayrmlar, yaklak olarak anyon ve katyon

deiim kromatorafisinin analitik versiyonlar olarak hizmet ederler. rnein, eer

karmn iyi bir ayrm alkalin elektroforezle elde edilirse o zaman preparatif olarak

benzer pHta anyon deitirici ile ayrlabilir. Prensipte amfoterik molekller hem

anyon hem de katyon deitiricilerine balanabilirler ama byk biyomolekllerle

allrken kararllk pH aralnnda dikkate alnmas gerekir. Kararl pH aral,

biyomolekln denatre olmad pH araldr.

ou kez ayrlmaya allan proteinin izoelektrik noktas bilinmez ve bir

protein karmndaki proteinlerin birbirlerinden ayrlabilmesi iin ne tip bir iyon

deitirici kullanlaca ancak deneme yanlma yntemi ile gerekletirilir. Az bir

miktar rnek tampon zeltide zlr ve farkl iyon deitiricilerin bulunduu farkl

test tplerine eit olarak konulur. 10-15 dakika bekletildikten sonra santrifjlenerek

zeltinin 280 nmde absorbans okunur. Bal olarak en dk absorbans veren test

tpndeki iyon deitirici uygun deitiricidir (Pharmacia Fine Chemicals AB,1980).

1.2.1.1.(2). Tampon Seimi

Tampon zeltisinin pH iyon deitiricinin alma aralnda olmal ve

proteine zarar vermeyecek pH aralnda bir deerde olmaldr. Proteinin


26/102

1.GR Hasan KARADA

13

deitiriciye balanmas iin pH izoelektrik noktasnn en az yar, tercihen bir birim

uzanda (anyon deitiriciler iin stnde, katyon deitiriciler iin altnda)

olmaldr. zoelektrik noktasnn ok zerindeki veya ok altndaki pHlar gereinden

daha kuvvetli balanmay indklediinden sonuta denatrasyon ve dk geri

kazanma yol aar.

Proteinlerin baland pHtaki tampon balang tamponu olarak alnr, zira

proteinler balanmal ancak serbest kalacaklar pHa yakn pHta olmaldr ki, ok

yksek gte iyonik g kullanlmadan kolondan ele edilebilsinler.

Balang pH ayn zamanda zayf m kuvvetli mi iyon deitirici

kullanlmasnn gerektiini gsterir. Zayf iyon deitiriciler, anyon deitiricilerde

pH 6nn altnda katyon deitiricilerde pH 9un zerinde yklerini kaybetmee

balarlar. Kuvvetli iyon deitiriciler sadece ok dk iyonizasyonlu maddelerin

ayrmnda kullanlr.

1.2.1.1.(3). Kolon Seimi

Dier kolon kromatorafilerinde de olduu gibi kullanlan cam kolonun i

ap, kolon boyunca ayn olmal, k noktasnda l hacim mmkn olduunca

az olmaldr. k musluu deliinin i ap 1 mm civarnda olmaldr. En kullanl

kolonlarn boyu 90-100 cm olup ap rnein miktarnca belirlenir. rnein hacmi

total kolon hacminin % 5ini gememeli hatta iyi bir ayrm iin % 1-2 tercih

edilmelidir. Genelde 10-30 mg protein/100 ml reine iyi bir yklemedir. Daha fazla

protein verimi arttrrken ayrm drr. Dolaysyla rnn safl azalr. Az

ykleme ise, ayrm arttrrken verimi drr.

yon deiim kromatorafisinde genelde 20-30 cm kolon boyu uygundur.

Hatta daha ksa kolon boylar tercih edilir. Tatbik edilen rnek hacmi nemli

deildir, zira balanan proteinler konsantrasyondan fazla etkilenmezler.


27/102

1.GR Hasan KARADA

14

1.2.1.1.(4). rnek Tatbiki Ve Elsyon

rnek tatbik edilmeden balang tamponu ile dializ edilmelidir. Sonu

hacmin nemi yoktur. rnein uygulanmasndan sonra kolon hacminin iki kat

hacimdeki balang tamponu ile ykanmaldr ki balanmam proteinin tamam

kolondan ele edilebilsin. Balanan proteinler bundan sonra artan iyonik gteki

tamponla veya pH deitirilmi tamponla (anyon deitiricilerde pH drlerek,

katyon deitiricilerde pH ykseltilerek) veya hem pH deitirilerek hem de iyonik

g arttrlarak ele edilir. yonik gcn deitirilmesi genelde tercih edilir. nk

bu daha iyi kontrol edilebilir. Sonu iyonik gcn 1,0 olmas genellikle ou

proteinleri ele etmek iin yeterlidir. Ya tampon konsantrasyonu arttrlr ya da

tampon konsantrasyonu sabit tutulurken dier iyonlar rnein sodyum klorr iyonlar

arttrlr. Sodyum klorr iyonlarnn arttrlmas genelde daha iyi bir yntemdir.

nk tamponlama kapasitesi dolaysyla pH ayrm boyunca sabit kalr (Johnstone

ve Thorpe, 1982).

1.2.2. mmobilize Bakr lgi Kromatorafisi

mmobilize metal ilgi kromatorafisinde proteinlerin adsorpsiyonu

immobilize metal iyonu ile protein yzeyinde elektron verici gruplar aras ndaki

kordinasyon temelindedir. ekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit elat kompleks

desteini,b) ise metal elat ilgi desteine proteinlerin balanmasn gstermektedir.

ounlukla kullanlan gei metal iyonlar Cu (II), Zn (II) , Co (II) , Fe (III) dr. Bu

metaller elektron ifti kabul edicilerdir ve lewis asitleri olarak adlandrlrlar.

Elektron verici atomlar (N,S,O) elatlatrc bileikte mevcuttur. Bunlar

kromatorafik destee balanmtr. Ayn zamanda metal iyonlar ile koordinasyon

yapp metal elatlar olutururlar. Metal elatlar, iki dili, dili v.b. olabilir. Bu

doldurulmu koordinasyon balarnn saysna baldr. Geriye kalan metal

koordinasyon blgeleri normalde su moleklleri ile doldurulurlar ve proteinden gelen

uygun elektron verici gruplarla yer deitirirler. Amino ucuna ek olarak, baz amino

asitler, zellikle yan zincirlerindeki elektron verici atomlardan dolay balanmaya


28/102

1.GR Hasan KARADA

15

uygundurlar. Bir ok amino asit art rnein glutamik asit, aspartik asit, tirozin,

sistein, histidin, arginin, lisin ve metionin balanmada yer almasna ramen

immobilize metal ilgi kromatorafisinde protein alkonmas ncelikle histidin

artnn varlna baldr. elatlanm metal iyonlarna balanabilecek serbest

sisteinler indirgenmi halde nadiren bulunurlar. Bunun yannda triptofan, fenilalanin

ve tirozinin aromatik yan zincirleri histidin artklarnn yanna girebilecek yaknlkta

ise balanma imkanlar olur.

Proteinin immobilize metal ilgi kromatorafisi desteine adsorpsiyonu,

histidin artnda bulunan imidazol azotunun protonlanmam formda olduu ntral

veya hafife bazik pHda uygulanr. Genellikle elatlanm metal iyonuyla ba

yapmayan, bal olarak yksek iyonik gteki tamponlar (0,1-1,0 M NaCl ieren)

spesifik olmayan elektrostatik etkileimleri indirgemek iin kullanlrlar. Hedef

proteinin elsyonu protonlama, ligand deiimi veya metal iyonunun gl bir

elatr iyonu (EDTA) ile ekstraksiyonu ile baarlabilir. midazol ile ligand deiimi

yaklak ntral pHda uygundur. EDTA gibi gl elatlatrc ajanlarn

uygulanmas bal proteinleri ele eder, bununla beraber balanma zellii bozulur

ve kolonun metal iyonlar ile dier ayrm iin yklenmesi gerekir (Porekar ve

Menart, 2001).


29/102

1.GR Hasan KARADA

16

(b)

ekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit elat kompleks destei, b) metal elat ilgidesteine proteinlerin balanmas (Porekar ve Menart, 2001)

1.3. Pestisitler

Pestisit : Kltr bitkilerine zarar veren hastalk etmenleri, zararllar ve yabanc otlar

gibi organizmalar ldren canl kkenli veya kimyasal maddelere pestisit ad verilir.

Pestisit kelime olarak yabanc kaynakl olup, pest = zararl, cide = ldrc olmak

zere zararl ldrc anlamnda bir bileik kelimedir (ncer, 2000).

1.3.1. Pestisitlerin Snflandrlmas:

Pestisitler deiik zelliklerine gre snflandrlrlar.

1.3.1.1.Etkiledikleri Canl Gruplarna Gre

Bu snflandrmada etkiledii canl n planda tutulur. Buna gre pestisitler;


30/102

1.GR Hasan KARADA

17

a) nsektisidler (Bcekleri ldren)

b) Akarisitler (Akarlar ldren)

c) Nematisit (Nematodlar ldren)

d) Mollussisit (Yumuakalar ldren)

e) Rodentisit (Kemirgenleri ldren)

f) Avisit (Kular ldren)

g) Afisit (Yaprakbitlerini ldren)

h) Fungisit (Funguslar ldren)

i) Bakterisit (Bakterileri ldren)

j) Herbisit (Otlar ldren)

k) Algisit (Algleri ldren)

olmak zere snflandrlr.

1.3.2. Pestisitlerin Hayvansal Organizmaya Giri Yollar

Pestisitler hayvansal organizmalara deiik yollarla girerler. Pestisitler bu

girileri srasnda baz hcre ve dokularn etkilenmesine, hatta lmne neden

olurlar. Ayn zamanda baz doku ve organlar tarafndan pestisitin bir ksm tutularak

etkisinin azalmas sonucunu getirir.

Pestisitler hayvansal organizmaya yolla girerler.

1.3.2.1.Az yoluyla

1.3.2.2.Deri yoluyla

1.3.2.3. Solunum yoluyla

1.3.2.1. Az Yoluyla Giri

Besin ile birlikte alnan pestisit azda amilaz ve lipaz v.b. enzimlerle

karlar. Bu enzimler etkili maddenin bir ksmn etkileyerek baz metabolitlere

dntrr. Meydana gelen rnler etkili maddeden daha az veya daha ok zehirli

rnler olabilir. Etkili madde daha sonra crop, yani kursaa gelir. Kursakta da baz


31/102

1.GR Hasan KARADA

18

metabolitlere ayrlabilir. Daha sonra mideye gelen etkili madde epitel hcreleri

tarafndan alnarak sinir sistemine ular veya vcut svsna yani kana geer.

1.3.2.2. Deri Yoluyla Giri

Hayvansal organizma derisi ile temas eden pestisitin bir ksm derinin d

yzndeki kl, ty, pul gibi yaplar yardmyla tutulur. Geri kalan etkili madde deri

tabakalarndan geerek sinir sistemine ular.

1.3.2.3. Solunum Yoluyla Giri

Gaz etkili pestisitler atmosfer havas ile birlikte solunum yoluyla girerek

difzyon yoluyla hemolimf yani kana geer ve kan vastasyla organlara ular.

Pestisitlerin organizmaya en hzl girii solunum yoluyla gerekleir. Ancak,

zellikle bcekler, stigmalarn kapatmak suretiyle gaz etkili pestisitin vcut iine

girmesini engellemeye alr.

1.3.3. Pestisitlerin Etki Mekanizmalar

Pestisitlerin hayvansal organizma ve dolaysyla bceklerdeki etki

mekanizmalar ile ilgili 4 varsaym vardr. Bunlar aadaki gibi gruplandrlabilir.

1.3.3.1. Fiziksel Varsaym

1.3.3.2. Toksoforik Varsaym

1.3.3.3. Yerine Geme

1.3.3.4. Enzim Faaliyetini Engelleme

1.3.3.1. Fiziksel Varsaym

1956 ylnda Kens isimli aratrc tarafndan ortaya atlm bir varsaymdr.

Bir organa ulaan etkili madde iyonlar lipoprotein balantlarna yerleerek onlarn

yaplarnn, rnein geirgenliklerinin bozulmasna neden olurlar.


32/102

1.GR Hasan KARADA

19

1.3.3.2. Toksoforik Varsaym

Etkili madde herhangi bir yolla organizmaya girdiinde etkili maddenin

moleklleri organizmada mevcut bir kimyasal madde ile birleerek baz fizyolojik

olaylarn engellenmesine veya tmyle ortadan kalkmasna neden olabilir.

1.3.3.3. Yerine Geme

Etkili maddenin herhangi bir bann organizmada mevcut bir antimetabolit

ile yerdeitirmesi sonucu zehirlenme ortaya kar. rnein selenyum topraa

verildiinde bitki tarafndan alnr ve bitki iin zehirli deildir. Ancak bu bitki ile

beslenen bcek vcuduna giren selenyum bcek vcudunda kkrdn yerine geerek

ani zehirlenmeye neden olur. Klorlandrlm hidrokarbonlardan Lindanede bu tr

etki mekanizmas bulunduu bilinmektedir.

1.3.3.4. Enzim Faaliyetini Engelleme

Deneysel olarak ortaya konmu ve en fazla zerinde durulan bir etki

mekanizmasdr. Esas, enzimin bloke edilerek faaliyetinin engellenmesine dayanr.

Herhangi bir organizmada bir fizyolojik olayda normal reaksiyon aadaki gibi

gerekleir.

E + S ESP + E

Burada E, enzim; S, enzim ile reaksiyona giren madde; ES, ara rn;

P,rndr.

Yukardaki reaksiyonda enzim ile engelleyici bir madde, rnein bir pestisit

reaksiyona girdiinde aadaki reaksiyon ortaya kar.

E + I EI


33/102

1.GR Hasan KARADA

20

Burada E, enzim; I, engelleyici madde rnein pestisit; EI, engellenmi

enzimdir. Bu reaksiyondan da grlebilecei gibi sonuta bir rn meydana gelemez.

nk etkili madde enzimin faaliyetini engellemitir. Sonuta da zehirlenme olay

ortaya kar. Genel olarak sinir sistemi etki mekanizmas byle gerekleir.

Sinir sisteminde bir uyartnn iletiimi kolin ve asetik asitin birlemesi sonucu

meydana gelen asetilkolin ile salanr. Uyart iletiimi bittiinde kolinesteraz enzimi

reaksiyona girerek asetilkolini kolin ve asetik asite paralayarak sinir sistemindeki

uyart iletiimini durdurur. ok ksa zaman dilimi iinde gerekleen bu

biyokimyasal reaksiyon normal bir reaksiyon olarak sreklidir.

Hayvansal organizmaya, rnein bir bcek vcuduna sinir sistemi etkili bir

pestisit girdiinde, pestisit kolinesteraz enziminin faaliyetini yani ilevini

engelleyerek uyart sonucu meydana gelen asetilkolin, kolin ve asetik asite

paralanamaz. Bunun sonucu sinir sistemindeki uyart srer ve sonuta zehirlenme

olay gereklemi olur. Zehirlenmi organizmalarda srekli titremeler ite bunun

sonucu, yani iletiimin srekli oluundan kaynaklanr. Organik fosforlu,

klorlandrlm hidrokarbonlar ve karbamatl pestisitlerde etki mekanizmas bu tr

enzim faaliyetinin engellenmesi eklindedir.

1.3.4.Aratrlan Pestisitler

Cyprodinil ve fludioxonil fungisitlerini ieren Switch 62.5 WG bada ve

sebzede (domateste) kuruni kf (Botrytis cinerea) hastalnn mcadelesinde

kullanlacak sistemik ve kontak zelliklerine sahip yepyeni bir tarm ilacdr. Bu

tarm ilac % 37,5 cyprodinilve % 25,0 fludioxonil iermektedir. lacn bileimine

giren iki etkili maddeden biri olan cyprodinil sistemik etkili olup methionin

biyosentezini engelleyerek fungusun hayat devresini, bitki dokularna giriini ve

misellerin geliimini nler. Cyprodinilyapraklar ve meyveden hzla bnyeye alnr.

Bitkide yukarya doru ve yapran bir yznden dier yzne geer. lacn

bnyesinde bulunan dier etkili madde fludioxonilkontak etkili olup bitki bnyesine


34/102

1.GR Hasan KARADA

21

tanmas snrldr. Cyprodinilvefludioxoniletkili pestisitin zelliklerini izelge 1.3.

ve izelge 1.4. te grebiliriz (Ylmaz, 2002).

izelge 1.3. Cyprodinilvefludioxonilin IUPAC ad ve yaps (Ylmaz, 2002)

Ad IUPAC Ad Kapal

Forml

Molekl

Arl

ekli

Fludioxonil 4-(2,2-difluoro-1,3-

benzodioxol-4-yl)

pyrrole-3-

carbonitrille

C12H6F2N2O2 248,19

NH

O

O

FF

C

N

Cyprodinil N-(4-cyclopropyl-6-

methyl-pyrimidin-2-

yl)-aniline

C14H15N3 225,3

izelge 1.4. Cyprodinilvefludioxonilin zellikleri (Ylmaz, 2002)Ad Organik

zcde

znrlk

(25 C)

Erime

Noktas

(C)

Kimyasal

Snf

Pestisit

Snf

LD50

Deeri

(mg/kg)

Maksimum

Kalnt

Miktar

(MRL,

mg/kg)

Fludioxonil suda 1,53 mg/L

etanol 44 g/L

metanol %2(w/v)

aseton % 12(w/v)

N-metil pirolidon

% 60 (w/v)

199,4 fenilpirol fungisit 5000 den

fazla

2

Cyprodinil suda 16 mg/L

aseton 610 g/L

etanol 160 g/L

n-oktanol 160 g/L

toluene 460 g/L

hekzan 30 g/L

75,9 pirimidin-

amin

fungisit 2000 den

fazla

0,5

N

N

N


35/102

1.GR Hasan KARADA

22

1.4.Serbest Radikaller Ve Antioksidan Savunma Sistemleri

Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmam elektron ihtiva eden

atom veya molekllerdir. Ultraviyole nlar, evresel kirlilikler, sigara duman, stres,

pestisitler, toksinler gibi fiziksel ve kimyasal ajanlarla dokularda hasar oluur.

Normalde, hcrelerde en byk serbest radikal kayna elektron transport zincirinde

elektron szntsdr (Lunec, 1990).

1.4.1. Serbest Oksijen Radikalleri

Biyolojik sistemlerdeki en nemli serbest radikaller, oksijenden oluan

radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasnda anahtar rol oynayan maddeler

oksijenin kendisi, speroksit (O2), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali

(OH) dir (Halliwell ve Gutteridge, 1984).

Oksijenin elektronlar yle ekilde dalmlardr ki bu elektronlardan ikisi

elememitir. Bu yzden oksijen bazen diradikal olarakta deerlendirilir. Oksijenin

bu zellii onun dier serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini salar.

Radikal olmayan maddelerle ise daha yava reaksiyona girer (Lunec, 1990).

1.4.1.1. Speroksit Radikali (O2)

Hemen hemen tm aerobik hcrelerde oksijenin bir elektron alarak

indirgenmesi sonucu, serbest speroksit radikal anyonu meydana gelir.

O2+e- O2

Speroksit radikali, ksenobiyotikler gibi ajanlarla, ksantin oksidazn rol

ald enzimatik tepkimelerle, baz oksidaz tepkimelerinde, fagositoz srasnda,

elektron transport sistemi srasnda oluur.

Speroksit radikali, SOD ile katalizlenen enzimatik dismutasyona girerek

azalr (Halliwel ve ark, 1992).


36/102

1.GR Hasan KARADA

23

1.4.1.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)

Molekler oksijenin, evresindeki molekllerden iki elektron almas veya

speroksitin bir elektron almas sonucu peroksit oluur. Peroksit molekl iki

hidrojen atomuyla birleerek hidrojen peroksiti (H2O2) meydana getirir. H2O2

membranlardan geebilen, uzun mrl bir oksidandr. Ancak biyolojik sistemlerde

hidrojen peroksitin asl retimi, speroksitin dismutasyonu ile olur (Halliwel ve ark,

1992).

2O2 + 2H + H2O2 + O2

1.4.1.3. Hidroksil Radikali (OH )

Hidroksil radikali, hidrojen peroksitin gei metallerinin varlnda

indirgenmesiyle (Fenton reaksiyonu) meydana gelir.

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH

Son derece reaktif bir oksidan molekldr. Yarlanma mr ok ksadr.

Olutuu yerde byk hasarlara neden olur. Tioller ve ya asitleri gibi eitli

molekllerden bir proton kopararak yeni radikallerin olumasna yol aar (Halliwel

ve ark, 1992).

1.4.2. Antioksidan Savunma Sistemleri

Reaktif oksijen trlerinin oluumunu ve bunlarn meydana getirdii hasar

nlemek iin vcutta birok savunma mekanizmalar gelimitir. Bunlar antioksidan

savunma sistemleri veya ksaca antioksidanlar olarak bilinirler. Antioksidanlar,

peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen trlerini

toplayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler. Antioksidanlar, doal (endojen

kaynakl) ve eksojen kaynakl antioksidanlar olmak zere balca iki ana gruba


37/102

1.GR Hasan KARADA

24

ayrlabildii gibi serbest radikalin meydana geliini nleyenler ve mevcut olanlar

etkisiz hale getirenler eklinde de ikiye ayrlabilirler. Ayrca enzim ve enzim

olmayanlar eklinde de snflandrlrlar. Hcrelerin hem sv hem de membran

ksmlarnda bulunabilirler (Akku, 1995).

1.4.2.1. Doal (Endojen) Antioksidanlar

1.4.2.1.(1). Enzimler

Mitokondriyal Sitokrom Oksidaz Sistemi

Speroksit Dismutaz

Katalaz

Glutatyon Peroksidaz

Glutatyon-S-transferaz

Hidroperoksidaz

1.4.2.1.(2). Enzim Olmayanlar

a) Lipid fazda bulunanlar

- tokoferol (E vitamini)

- karoten

b) Sv fazda (hcre sitozolnde veya kan plazmasnda) bulunanlar

Askorbik asit, Melatonin, rat, Sistein, Serulplazmin, Transferin,

Laktoferrin, Miyoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Metionin, Albumin, Bilirubin,

Glutatyon.


38/102

1.GR Hasan KARADA

25

1.4.2.2. Eksojen Antioksidanlar (lalar)

-Ksantin Oksidaz nhibitrleri: Tungsten, Alloprinol, Oksiprinol, Folik asit, Pterin

aldehid.

-Soya Fasulyesi nhibitrleri: Ksantin dehidrojenazn proteolitik etki sonucu ksantin

oksidaza dnmn inhibe ederler.

-NADPH Oksidaz nhibitrleri: Adenozin, Lokal Anestezikler, Kalsiyum Kanal

Blokerleri, Non-Steroid Antiinflamatuar lalar, Cetiedil, Difenilin odunyum,

Rekombinant Speroksit Dismutaz, Trolox-C: E Vitamini Analoudur.

-Endojen Antioksidan Aktiviteyi Arttran Maddeler: Glutatyon Peroksidaz

aktivitesini arttran Ebselen, Asetilsistein.

- Dier Nonenzimatik Serbest Radikal Toplayclar: Mannitol, Albumin, DMSO.

-Demir Redoks Dngsnn nhibitrleri: Desferroksamin, Serulplazmin

-Ntrofil Adezyon nhibitrleri

-Sitokinler: TNF ve nterlkin-I

-Barbitratlar

- Demirelatrleri

1.4.2.3. Gda Antioksidanlar

Btillenmi Hidroksitoluen (BHT), Btillenmi Hidroksianisol (BHA),

Sodyum Benzoat, Ethoxyquin, Propylgalate, Fe-Speroksit Dismutaz (Akku, 1995).

1.5. Speroksit Dismutaz ( Speroksit Oksidoredktaz, E.C:1.15.1.1, SOD)

1.5.1. Bakr-inko Speroksit Dismutaz

1938de Mann ve Keilin, sr kanndan izole ettikleri bakr ieren mavi yeil

proteini, haemocupreini tanmladlar.1953de benzer bir protein at karacierinden

izole edilmi ve hepatocuprein olarak adlandrlmtr. Beyinden cerebrocuprein gibi

bu tip dier protein sonradan izole edilmitir. 1970de eritrosit proteinin bakr gibi


39/102

1.GR Hasan KARADA

26

inkoda ierdii bulunmutur. Bu proteinlerde hibir enzimatik reaksiyon

grlmemi olup bazen metal depolayclar olarak nerildiler. Buna karn, 1969da

Mc Cord ve Fridovich, eritrosit proteinin speroksit radikalini katalitike

uzaklatrabildiini belirttiler. Bu eritrosit proteini bir speroksit dismuataz enzimi

(SOD) olarak fonksiyon gstermektedir.Youn aratrmalara ramen, SODnin

katalizledii baka substrat bulunamamtr. Demek ki SOD katalitike

speroksitlerin uzaklatrlmasna spesifik grnmektedir (Bertini ve ark, 1998).

Bakr inko ieren speroksit dismutazlar olaan d bir ekilde kararldr.

Eritrositlerden Cu-Zn SODnin saflatrlmasnda, hcreler paralanr. Hemoglobin

kloroform ve etanol muamelesi ile ardndan santrifjleme ile ayrlr. Enzim organik

faza girer, burada souk aseton eklenmesi ile ktrlr. Ardndan iyon deiim

kromatografisi ile ileri derecede saflatrlr. Birok enzim byle ileme dayanamaz.

Cu-Zn SOD, sya, proteazlarn saldrsna, guadinyum klorr, sodyum dodesil slfat

ve renin denetrasyonuna kar olduka dayankldr (Fridovich, 1995).

1.5.1.1. karyotlarda ve Prokaryotlarda Cu-Zn SOD

Yaplan almalar Cu-Zn SODlerin hemen hemen tm karyotik hcrelerde

var olduunu gstermitir. Hayvan hcrelerinde Cu-Zn SODlerin ou sitozolda

yerlemitir, fakat bazlar lizozmlarda, ekirdekte ve i ve d mitokondrial

membrann arasnda bulunur. Peroksizomlarnda ayn zamanda biraz Cu-Zn SOD

ierdii kaydedilmitir (Slot ve ark, 1986). Bakteri veya siyanobakteriler gibi

prokaryot hcrelerde Cu-Zn SODlerin daha az yaygn olduu dnlebilir. Fakat

bu gr dzeltilmelidir. nk Cu-Zn SODnin prokaryotlardaki varl rneklerle

kantlanmaktadr.

1.5.1.2. Cu-Zn SODnin Yaps ve Katalitik Etkinii

imdiye kadar Cu-Zn SODler karyotlardan izole edilmi olup, 32 000 bal

molekler ktleye sahiptir. ki protein alt nitesi ierir. Her bir alt nite aktif

blgesinde bir bakr ve bir inko iyonu ierir (Fridovich, 1995). Bir farkl tip Cu-Zn


40/102

1.GR Hasan KARADA

27

SOD, ekstraseller SOD (EC-SOD) tanmlanmtr. ntraseller Cu-Zn SODnin

aksine EC-SOD yksek bal molekler ktleye (yaklak 135 000) sahiptir.

Tetramerik glikoprotein ierir ve her alt nitesi bir bakr ve bir inko ierir.

Bakteriyel Cu-Zn SODler karyot enzimler gibidirler. Genellikle dimerdirler ve alt

niteleri bana bir Cu ierirler. Buna karn E.Coli enziminin bir monomere sahip

olduu belirtilmitir (Battistoni ve ark, 1996).

Tm Cu-Zn SODler ayn reaksiyonu katalizlerler; speroksitin ( )

dismutasyonunu olduka hzlandrrlar.

(temel hal)

Katalizlenmemi speroksitin dismutasyon hz sabiti byk ounlukla

zeltinin pHna bal iken, ki bu fizyolojik pHda yaklak 5.105 M-1.s-1 dir, sr

eritrosit Cu-Zn SOD tarafndan katalizlenen reaksiyon hemen hemen pH 5,3-9,5

aralnda pHdan bamszdr ve speroksit reaksiyonu iin hz sabiti yaklak

1,6.109 M-1.s-1 dir.

Cu-Zn SODdeki bakr iyonu dismutasyon reaksiyonunda indirgenmeye ve

ykseltgenmeye uramaktadr.Yani,

Enzim-Cu2+ + O2 Enzim-Cu+ + O2

Enzim-Cu+ + O2 + 2H+ Enzim-Cu2+ + H2O2

Net reaksiyon:

Zn2+ katalitik dngde fonksiyon gstermez fakat enzimi kararl hale getirir.

Bu sonu, aktif blgede metaller karldnda ve tek yada birlikte tekrar yerine

konduundaki denemelerden karlmtr. Hatta, metalden yoksun Cu-Zn SOD

enzimine (apoenzim) bakr iyonlarnn eklenmesi ile SODnin tekrar aktivite

kazanmas, bakrn eser miktarlarn lmede kullanlmtr. Genelde, dier gei

metallerinin iyonlar, rnein Mn2+ fonksiyonel enzimi vermek zere bakr ile

yerdeitiremez, fakat kobalt, civa veya kadmiyum iyonlar, enzim kararlln

O2 +O2 +2H+ H2O2+O2

O2 +O2 +2H+ H2O2+O2

O2


41/102

1.GR Hasan KARADA

28

arttrmak iin Zn2+ ile yerdeitirebilir (Fridovich, 1995). ayet Co2+, Cu2+ ile

yerdeitirirse speroksit dismutasyonundan bahsedilebilir (ONeill ve ark, 1982).

Fakat yalnzca 4,8.106 M-1.s-1 hz sabiti ile enzim alr.

1.5.1.3. Cu-Zn SODnin Yaps

eitli bitki ve hayvanlardaki Cu-Zn SODlerin tm amino asit dizilii (baz

durumlarda boyutlu yaps) belirlenmi ve genel olarak hepsinin benzer olduu

ortaya kmtr (Fridovich, 1995). lkin sr eritrosit Cu-Zn SODnin detayl yaps

belirlenmitir. Her bir alt nite sekiz antiparalel krmal yapdan olumutur. Bakr

iyonu 4 histidin artnn (amino asit diziliindeki 44,46,61 ve 118 numaral amino

asitler) imidazol halkalarndaki azotlarla etkileim ile aktif blgede tutulur. inko

iyonu ise bakra His 61, His 69, His 78 ve Asp 81in COO- (karboksi) grubu ile

kprl konuma getirilmitir. Her iki metal ile etkileime giren His 61 dismutasyon

iin gerekli protonun salanmasnda rol oynad dnlmektedir. nsan Cu-Zn

SODsi benzer yap gsterip, 30x40x70 A civarnda elips eklinde dimerik bir

enzimdir. Her bir alt nite bir inko ve bir bakr iyonuna ek olarak 153 amino asit

art ierir.

1.5.2. Mangan Speroksit Dismutaz

E.Coliden ilkin izole edilen SOD, Cu-Zn SODden tamamyla farklyd

(Fridovich, 1995). Mavi yeilden ziyade pembeydi, siyanr veya dietilditiyokarbamat

tarafndan inhibe edilmiyordu, 32 000 den ziyade 40 000 bal molekler arla

sahipti, kloroform art etanol muamelesi ile bozuluyordu ve aktif blgesinde mangan

ieriyordu. Temel halde enzim, mangan +3 basamandadr. Bu farkllklara karn,

Mn-SODler, Cu-Zn SODlerle temelde ayn reaksiyonu katalizlerler. Basitletirilmi

reaksiyon mekanizmas aadaki ekilde yazlabilir;


42/102

1.GR Hasan KARADA

29

Mn3+-O2 Mn2+ + O2Mn3+ +O2

Mn2+ + O2Mn2+-O2 + 2H

+ Mn3+ + H2O2

pH 7,0 de speroksit dismutasyonu Cu-Zn SOD ve Mn-SOD iin benzerdir.

Fakat Cu-Zn SODnin aksine Mn-SODnin hz alkali pH da der. rnein E.Coli

Mn-SODsi iin hz sabiti pH 7,8de 1,8.109 M-1.s-1 iken pH 10,2de 0,33.109

M-1.s-1dir. Mn-SOD, Cu-Zn SODye gre deterjan gibi kimyasallarla denatrasyona

veya syla denatrasyona daha fazla duyarldr (Halliwell ve Gutteridge, 1999).

1.5.2.1. Mn-SOD Yerleimi

Mn-SOD bakteriler, bitkiler ve hayvanlarda yaygn olarak bulunur. ou

hayvan dokularnda ve mayada, tamamylada olmasada byk ounlukla Mn-SOD,

mitokondride bulunur (Fridovich, 1995). Mn-SOD ve Cu-Zn SODnin bal

aktivitesi dokuya ve tre baldr. Mitokondrisiz memeli eritrositi Mn-SOD iermez.

Fare karacierindeki Mn-SOD, toplam SOD aktivitesinin yaklak % 10u kadardr.

Normal byme ortamnda Dactylium dendroides mantarnn toplam SOD

aktivitesinin % 80ini Cu-Zn SOD, % 20sini Mn-SOD oluturur. Bununla beraber,

bakr iyonu kayna snrlanrsa, toplam seller SOD aktivitesini sabit hale getirmek

iin fazlaca Mn-SOD sentezlenir (Shatzman ve Kosman, 1979). Bu fazla Mn-SOD

sitozolda grlr. Benzer bir ekilde Cu-Zn SOD aktivitesinde artma, Mn-SOD

aktivitesinde azalma Mn ile snrlandrlm diyet ile beslenen tavuk karacierinde

gzlenmitir (De Rosa ve ark, 1980).

Baz kabuklularda Mn-SOD mitokondrinin dndada bulunur. Mavi yenge

Callinectes sapidus, mitokondri ve sitozolde Mn-SOD ierir fakat Cu-Zn SOD

iermez.


43/102

1.GR Hasan KARADA

30

1.5.2.2. Mn-SOD Yaps

Yksek organizmalardakiMn-SODler genelde 4 protein alt nitesi ve nite

bana 0,5 veya 1 Mn iyonu ierirler. Buna karn tamam olmasada bakteri

enzimlerinin ou iki alt niteye sahiptir. Mn-SODnin aktif blgesinden mangann

uzaklatrlmas ile katalitik aktivite yok olur. Mangan genelde demiride ieren gei

metalleri ile yerdeitiremez.

Hayvanlar, bitkiler veya bakterilerdeki Mn-SODlerin amino asit dizilileri

birbirine benzerdir ve Cu-Zn SODnin diziliine benzemez (Halliwell ve Gutteridge,

1999).

1.5.3. Demir Speroksit Dismutaz

E.Coli bakterisinden 4 SOD enzimi saflatrlabilir; Cu-Zn SOD, Mn-SOD,

demir ieren enzim Fe-SOD ve ayn dimerik moleklde demir enziminin ve mangan

enziminin alt nitelerini ieren hibrid enzim (Fridovich, 1995). Fe-SOD ve Mn-

SODnin her ikiside hcre matriksinde bulunmutur.

Demir ieren SODler genelde iki protein alt nitesi ierirler. Buna karn

bazlarnn 4 alt nite ierdii belirtilmitir. Dimerik enzimler genelde enzim

molekl bana 1 yada 2 demir iyonu ierirler. Fe-SODlerdeki demir temel halde

Fe3+ halindedir ve katalitik dng srasnda Fe3+ ve Fe2+ basamaklar arasnda gidip

gelir. Yani,

Fe3+-enzim + O2 Fe2+-enzim + O2

Fe2+-enzim + O2 + 2H+ Fe3+-enzim + H2O2

Net reaksiyon:

Mn-SOD gibi Fe-SODlerde pH 7,0 ile karlatrldklarnda yksek pH da

katalitik aktivitesi derler ve siyanr ile inhibe edilmezler. Speroksit ile

reaksiyonunun hz sabiti Fe-SODlerde dier tip SODlerden hafife daha dktr.

O2 +O2 +2H+ H2O2+O2


44/102

1.GR Hasan KARADA

31

Fe-SODlerin amino asit dizilileri, Mn-SODlere benzerdir ve Cu-Zn SOD

diziliinden farkldr. Bu E.Colide hibrid SODnin nasl var olduunu aklar.

1.5.3.1. Fe-SODlerin Yerleimi

Baz bakteriler rnein E.Coli, Fe-SOD ve Mn-SODnin her ikisini ierirken,

bazlar yalnzca bir enzim ierirler (Fridovich, 1995). rnein Bacillus cereus

yalnzca Fe-SOD ierirken, Streptococcus sanguis yalnzca Mn-SOD ierir.

Photobacterium leiognathi Cu-Zn SOD yannda Fe-SOD ierirken, ortak yaamayan,

serbest yaayan Photobacterium sepia Fe-SOD ierir fakat Cu-Zn SOD iermez.

Hibir hayvan dokusu Fe-SOD iermez, fakat baz yksek bitki dokular

ierir. Hardal yapraklarndaki mitokondride, membran boluklar arasnda Cu-Zn

SOD ve matrikste Mn-SOD ierir. Fakat Fe-SOD kloroplastlarda yerlemitir

(Halliwell ve Gutteridge, 1999).

1.6.Projenin Yeri Ve nemi

Serbest radikaller; hcrelerde elektron transfer reaksiyonlaryla meydana

gelebildii gibi, radyasyon, alkol ve uyuturucular, hava kirlilii yapan fotokimyasal

maddeler, pestisitler, sigara duman, anestezikler v.b. nedenlerle oluabilmektedirler.

Doal endojen enzim olan speroksit dismutaz enzimi, hcrelerdeki speroksit

radikallerinin H2O2e dntrlmesinden sorumludur. Bu almada insan

eritrositlerinden Cu-Zn SOD enzimi saflatrlm, saflatrlm enzim direkt olarak

Cyprodinil ve Fludioxonil pestisitleri ile etkiletirilmitir. Enzim aktivitesi

incelenmitir. Ayrca enzimin kinetik parametreleride belirlenmitir.


45/102

2. NCEK ALIMALAR Hasan KARADA

32

2. NCEK ALIMALAR

Bartkowiak ve ark. (1979), domuz karacier ve eritrositlerinden SODn

saflatrma koullarn tespit etmilerdir. ki dokudan alnan enzimlerin elektroforetik

hareketliliini, pI deerini, amino asit bileimlerini, spektrofotometrik grafiklerini

incelemilerdir. Enzimin ayrma artlarn aratrmlar ve her iki dokudan elde

edilen SODlerin alt nitelerinin molekl arlnn yaklak 16 000 dalton

olduunu bulmulardr. Enzimin aktivitesi zerine snn ve pHn etkisini test

etmilerdir. ki enzimin bal olarak termokararllk gsterdiini belirtmilerdir.

Inouye ve ark. (1985), sr eritrositlerinden Cu-Zn SODnin (E.C.1.15.1.1)

saflatrlmas iin etkili bir metod gelitirmilerdir. Aseton ile ktrlm

homojenat 20 mM tris HCl tamponunda (pH=7,5) zmler ve yksek

performansl iyon deitirici, TSK-GEL DEAE-5PW kolonuna uygulamlardr.

TSK-GEL DEAE-5PWyi kullanarak kk miktarlardaki yabanc proteinleri

uzaklatrmlar ve byk aplarda saf protein hazrlamlardr. Enzimi, NaCln 0

dan 0,3 Ma deien konsantrasyonuyla ele etmilerdir. Cu-Zn SODnin, SDS-

PAGEde ve iyon deitirici yksek performansl sv kromatorafisinde tek bant

gsterdiini ve 3800 nite/mg protein spesifik aktivitesine sahip olduunu

belirtmilerdir.

Asano ve ark. (1986), bal olarak basit ve tekrar edilebilir bir ilemi, insan

eritrositlerinden katalazn (E.C.1.11.1.6) ve bakr-inko speroksit dismutazn

(E.C.1.15.1.1) bakrelat ilgi kromatorafisi ile izolasyonu iin gelitirmilerdir. Bu

metodu kullanarak iki enzimi kolaylkla ve katalaz % 23,4 verimle 565 kez; Cu,Zn-

SODyi %35 verimle 2190 kez saflatrmlardr. Poliakrilamid jel elektroforezi ile

yrttklerinde bu enzimlerin homojen olduklarn grmlerdir. SODnin molekler

arln 17 000 1000, katalazn molekler arln 240 000 bulmulardr.

Weselake ve ark. (1986), Cu-Zn SODyi insan krmz hcrelerinden DEAE-

Sefaroz ve bakr elat afinite kromatorafisi kullanarak izole etmilerdir. Enzimin

3400den 3800 nite/mg proteine deien spesifik aktivitesine ulamlardr.

SODyi krmz hcre hemolizatndan % 58 verimle, 2000 kez saflatrmlardr.


46/102


33

SODnin alt nitesinin molekl arln SDS-PAGE ile 18 000-19 000 arasnda

bulmulardr.

Stepanik ve Ewing (1990), glutatyon peroksidaz, katalaz ve speroksit

dismutaz insan eritrositlerinden DEAE-selloz kullanarak saflatrmlardr.

Glutatyon peroksidaz, speroksit dismutaz ve katalazdan tiyol-dislfid deitirici

kromatorafi ile ayrtrmlar, molekler eleme ve boya-ligand ilgi kromatorafisi

ile % 90 homojenlie saflatrmlardr. Katalaz ve speroksit dismutaz birbirinden

jel eleme kromatorafisi ile ayrp saflatrmlardr. Katalaz amonyum slfat

ktrmesi ile yaklak % 90 orannda saflatrmlardr. Speroksit dismutaz ise

ayn homojenlie hidrofobik etkileim kromatorafisi ile saflatrmlardr. 820 ml

ykanm eritrositlerden 45 mg SOD ve 232 mg katalaz elde etmilerdir.

Kumagai ve ark. (1994), bakr inko speroksit dismutaz (Cu-Zn SOD)

sr eritrositlerinden pH kontroll amonyum slfat methanol ekstraksiyonu ile izole

etmilerdir. % 90 amonyum slfat doygunluunda paralanm krmz hcre

sspansiyonun pHn 5,0a ayarlamlardr. Eit miktardaki methanol eklenmesi ile

enzim spesifik aktivitesi 2000 nite/mg protein den daha byk deere ulamtr.

DEAE-Selloz kolon kromatografisi kullanlarak yaplan ileri saflatrmada, olduka

saflam Cu-Zn SOD, Sodyum Dodesil Slfat Poliakrilamid Jel Elektroforezinde

(SDS-PAGE) bir tek band gstermitir. Bu ilemi kullanarak 1 litre sr kanndan

4728 nite/mg protein spesifik aktivitesine sahip 14 mg saf Cu-Zn SOD elde

etmilerdir.

Zhenfei ve ark. (1996), Cu-Zn SODyi bakla tohumlarndan

saflatrmlardr. Enzimi 2852 nite/mg protein spesifik aktivite elde etmiler ve

enzimin KCN ve H2O2 tarafndan gl bir ekilde inhibe edildiini bulmulardr.

Enzimin pH=5-9da 70 Cye kadar kararl olduunu, molekl arlnn 31 kDa ve

alt nitesinin 14 kDa olduunu belirtmilerdir.

Suwalsky ve ark. (1997), heptaklorun, su yaam iin zehirli olan bir

organoklorlu pestisit olduunu belirtmilerdir. Bu pestisitin bebekler iin anlaml

kaynann anne st olduunu belirtmilerdir. Heptaklorun lipofilik karakterinden

dolay, lipidce zengin hcre zarlarnn pestisidin etkileimi iin olas hedefler

olduunu belirtmilerdir. Pestisidin krmz hcrelerle etkileimini aratrmak iin,


47/102


34

heptakloru insan eritrositleri ve krmz hcre zarlarnn molekler modelleriyle

etkiletirmilerdir. Bu modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC)in ve dimiristil

fosfatidil etanolamin (DMPE)in oklu tabakalarndan olutuunu belirtmilerdir.

Bunlarn srasyla eritrosit zarlarnn d ve i tabakasnda yerlemi fosfolipid

eitleri olduklarn belirtmilerdir. Elektron mikroskobu ile yaptklar taramada, 10

mM heptaklorun eritrositlerde ekil deiiklii yaptn belirtmilerdir. te yandan

X-nlar krnm ile DMPC ve DMPE zerine yaptklar deneylerde, heptaklor ile

DMPC tabaka yapsnn DMPE tabaka yapsndan daha ok etkilendiini

gzlemlemilerdir. Floresans spektroskopisi ile DMPC zerine yaptklar lmler,

X-nlar krnm sonularn kuvvetlendirmitir. DMPCnin hidrokarbon zincirinin

ve polar ba blgelerinin heptaklor tarafndan bozulduunu belirtmilerdir.

Suwalsky ve ark. (1998), Lindanenin d parazitlenme ve bitlenmeye kar

veterinerlik ve insan ilalarnda genie kullanlan organoklorlu pestisit olduunu

belirtmilerdir. Lindanenin lipofilik karakterinden dolay, lipidce zengin hcre

zarlarnn pestisidin etkileimi iin olas hedefler olduunu belirtmilerdir.

Lindanenin krmz hcrelerle etkileimini aratrmak iin, lindaneyi insan

eritrositleri ve krmz hcre zarlarnn molekler modelleriyle etkiletirmilerdir. Bu

modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC)in ve dimiristil fosfatidil etanolamin

(DMPE)in tabakalarndan olutuunu belirtmilerdir. Bunlarn srasyla eritrosit

zarlarnn d ve i tabakasnda yerlemi fosfolipid eitleri olduklarn

belirtmilerdir. Floresans spektroskopisi ile yaptklar deneylerde lindanenin DMPC

ile etkiletiini gstermilerdir. Bu sonular X-n krnm ile dorulamlardr.

Bununla beraber DMPE tabakasnda daha byk bozulmalar gzlemlemilerdir.

Elektron mikroskobu ile, lindane ile etkiletirilen insan eritrositlerinin diskeklinin

bozulduunu gstermilerdir. ift tabaka hipotezine gre, bu sonular ile, eritrosit

zarnn i tabakasna lindanenin girdiini gstermilerdir. Buradan pestisitin toksik

etkisinin, pestisitin hcre zarnn lipid ksm ile etkileim kapasitesi ile ilgili olduu

sonucunu karmlardr.

Tarhan ve Tuzmen (2000), speroksit dismutaz koyun eritrositlerinden

izole etmilerdir. SOD aktivitesini, optimize edilmi deney koullar altnda 6-

hidroksidopamin (6-OHDA)in otooksitlenme hzndaki deiimi ile incelemilerdir.


48/102


35

Enzimin Cu ve Zn ierdiini, kloroform-etanol karmna duyarl olmadn,

siyanr ve hidrojen peroksit ile inhibe edildiini bulmulardr. Koyun eritrosit Cu-Zn

SODsi iin optimum pH 9,4; optimum scakl 30C olarak belirtmilerdir.

Enzimin 2,5 saat inkbasyonla ntral pHda 37 Cye kadar termal kararllk

gsterdiini belirtmilerdir.

melekolu ve ark. (2000), el ili ve evresi tarm alanlarnda alan

(16,52 6,92 yl) ve pestisitlerin kronik etkisine maruz kalan tarm iilerinden

(n=40) kan rneklerini almlar ve bu rneklerden elde edilen eritrositlerde

antioksidan savunma enzimlerinden speroksit dismutaz (SOD) ve katalaz(CAT)

aktivitelerini spektrofotometrik olarak lmlerdir. Ayn lmleri pestisitlere

dorudan maruz kalmayan kiilerdede yapmlardr (n=30). Tarm iilerinde

eritrosit SOD dzeyini kontrol grubuna oranla daha yksek bulurken (p


49/102


36

terminal amino asit srasn 25 amino asit iin belirlemi ve bu sray dier Cu-Zn

SODlerle karlatrmlardr. Kl balndan elde edilen SODde N-terminal

alanin artklarnn asetillenmediini belirtmilerdir. 60 Cnin zerinde enzimin

termo kararlnn sr Cu-Zn SODsinden daha dk olduunu belirtmilerdir.

ztrk ve Tarhan (2001), tavuk karacierinden SODyi saflatrm ve

ksmen karakterize etmilerdir. nce karacieri homojenize edip, hemoglobini

karmlardr. Takiben protein keleini, (NH4)2SO4, metanol, (NH4)2SO4-metanol

ve polietilen glikol ile etkiletirmilerdir. Polietilen glikolu, PD-10 kolonu

kullanarak kromatorafi ile uzaklatrmlardr. Enzim aktivitesi olan fraksiyonlar

ultrafiltreden geirip, DEAE-iyon kromatorafisi ve Sefhadeks G-75 jel filtrasyon

kromatorafisi ile % 7,3lk verimle 286 kez saflatrmlardr. 4818,2 U/mg spesifik

aktivitesine ulamlardr. Enzimin her biri 16.000 500 molekler arlna sahip,

Cu ve Zn ieren iki alt niteye sahip olduunu belirtmilerdir. SODnin, DTT ve -

merkaptoetanol ile inhibe edilmediini CN- ve H2O2 ile inhibe edildiini

belirtmilerdir. Ayrca SODnin 2 mM iyodoasetamid ile % 40 aktivite kaybettiini

gzlemlemilerdir.

Aydemir ve Tarhan (2001), SODyi tavuk eritrositlerinden saflatrm ve

ksmen karakterize etmilerdir. Eritrosit membranlarn Triton X-100n varlnda

dondurup-zme metodu ile paralamlardr. Etanol ktrmesinden sonra, SOD

ieren zeltiyi DEAE-Selloz ve ardndan Sephadex G-100 jel kolonlarna

uygulamlardr. Tavuk eritrosit SODsini % 26 verimle 508 kez saflatrmlardr.

8 480 U/mg spesifik aktivitesine ulamlardr. Molekler arl jel filtrasyon ile

30,6 0,4 kDa olarak bulmulardr. Enzimin yksek termal kararlla sahip

olduunu belirtmilerdir.

Hidayat ve ark. (2003), emlsiyon tekniini kullanarak almina

paracklarn agaroz ile kaplayarak yksek younluklu destek hazrlamlardr.

minodiasetik asit ve Cibacron Mavi 3 GAy destek zerine immobilize etmilerdir.

Bu destei inko ile yklyerek maya alkol dehidrojenaznn saflatrlmas iin

kullanl bir kromatorafi destei elde etmilerdir. Enzimin yksek geri kazanmn

ve yksek saflatrma faktrn elde etmek iin elsyon stratejisini aratrmlardr.

0,5 M NaCl ieren 4 mM EDTA kullanarak bir basamakta elsyon ile % 66 enzim


50/102


37

geri kazanm ve 4,7 saflatrma faktr elde etmilerdir. NaCl ieren imidazol

kullanarak 2 basamakta elsyon ile daha yksek saflatrma faktr elde etmilerdir.

1 M NaCl ieren 5 mM imidazol kullanarak ilk basamakta elsyon ile enzimi

iermeyen dier proteinlerin ounu serbest brakmlardr. kinci basamakta 1,5 M

NaCl ieren 150 mM imidazol kullanarak yaplan elsyonda % 40,7 enzim geri

kazanm ile 6,5 saflatrma faktr elde etmilerdir.

Altuntas ve ark. (2003), organofosfat tarafndan retilen reaktif oksijen

trlerinin (ROS) eitli pestisitlerin toksitesine yol atn belirtmilerdir. Bu

almada, in vitro koullarda, organofosfat insektisit fosalonun lipid

peroksidasyonu (LPO) ve antioksidan savunma sistemine nasl etki ettii

aratrlmtr. Bu amala fosalonun eitli dozlarn LPO, speroksit dismutaz

(SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-PX) ve katalaz (CAT) aktivitesi zerine etkisini

eritrositlerde almlardr. Her fosalon dozunu, daha nceden hazrlanm eritrosit

rnekleriyle + 4 Cde 0, 60, 180 dakika inkbe etmilerdir. nkbasyondan sonra,

malondialdehid (MDA) dzeyini, SOD, GSH-PX, CAT aktivitesini belirlemilerdir.

Fosalonun MDA oluumunda art ve SOD, GSH-PX, CAT aktivitesinde azalma

meydana getirdiini belirtmilerdir.

Bukowska (2003), insan eritrositlerine, 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D)

ve 2,4-diklorofenoln (2,4-DCP) farkl konsantrasyonlarnn etkisini in vitro

koullarda incelemilerdir. Speroksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-

PX) aktivitesini ve indirgenmi glutatyonun (GSH) dzeyini belirlemilerdir.

Eritrosit SOD aktivitesinin artan 2,4-D ve 2,4-DCP dozu ile azaldn buna karn

GSH-PX aktivitesinin arttn belirtmilerdir. 500 ppm 2,4-Dnin eritrositlerdeki

indirgenmi glutatyonun dzeyini % 18 azalttn ve 250 ppm 2,4-DCPnin ise

indirgenmi glutatyonun dzeyini % 32 azalttn belirtmilerdir.

Lie ve ark. (2004), amonyum slfat ile ktrp, DEAE-Sefaroz iyon

deitirici ve Sephacryl S-200 jel filtrasyon kromatorafisi ile italyan ii arsndan

SODyi 53,05 U/mg protein spesifik aktivitesi ile 104 kez saflatrmlardr. Elde

edilen enzim SDS-PAGEde tek band gstermitir. Scakln SOD aktivitesi zerine

etkisini incelemi ve enzimin olduka kararl olduunu bulmulardr. Cu. Zn, Fe ve

Mn ieriini almlar ve enzimin Cu, Zn ierdiini bulmulardr. Dairesel


51/102


38

dikroizm spektrumunu aratrmlar ve proteinin % 26,1 -heliks, % 53,8 -tabaka ve

% 22,0 rastgele halka ierdiini bulmulardr. SODnin izoelektrik odaklanmas ile

enzimin zincir ii dislfid ba ierdiini gstermilerdir. Amino asit bileimini

aratrmlar ve enzimin 402 amino asit ierdiini bulmulardr. Enzimin greceli

olarak yksek miktarda aspartik asit, glisin, lsin, alanin, glutamik asit ve valin

ierdiini bulmulardr. renin enzimi inhibe ettiini, ultraviyole absorpsiyonunda

deime yaptn ve floresans emisyonunda azalma meydana getirdiini

bulmulardr. DTTnin enzim aktivitesinde deime, ultraviyole absorpsiyonunda

artma, floresans emisyonunda azalma meydana getirdiini bulmulardr.

Sivaprakasam ve ark. (2004), Speroksit dismutaz amonyum slfat

fraksiyonlamas, jel szme ve iyon deiim kromatorafisi kullanarak guavann ham

yeil meyvelerinden % 47 geri kazanm ile saflatrmlardr. Saflatrlm enzimin

40 kDa molekler arlna sahip olduunu ve 20 kDaluk iki eit alt niteye sahip

olduunu belirtmilerdir. Enzimi pH=7,8de maksimum aktivite gstermesi iin 45

dakika a maruz brakmlardr. Tipik Michaelis-Menten kinetii

gzlemlemilerdir. Nitrobenzen tetrazolium ve riboflavin substratlar iin Km

deerlerini srasyla 15 ve 2,3 mM bulmulardr. Enzimin 40Cye kadar kararl

olduunu ve % 76 inhibisyona kadar nitroblue tetrazoliumun inhibisyonunda

dorusal art gzlemlemilerdir. Mg2+nin enzim aktivitesini % 48 arttrdn,

Mn+2nn aktiviteyi % 55 inhibe ettiini, Cu2+, Co2+ ve Ca2+ iyonlarnn aktivite

zerinde hibir etkiye sahip olmadn belirtmilerdir. KCN, H2O2 ve NaN3in

enzimi srasyla % 36, % 71 ve % 33 inhibe ettiini bulmulardr. Bununla birlikte

SDS, kloroform:etanol (1:1) karmnn, -merkaptoetanoln aktivite zerinde

herhangi bir etki gstermediini belirtmilerdir.

Seatovic ve ark. (2004), Speroksit dismutaz Srbistann termal kaplca

sularnda bulunan Thermotrix sp.dan saflatrmlardr. SODyi hcre ekstrakndan

amonyum slfat ktrmesi, Sefhadeks G 75 Jel Eleme Kromatorafisi ve QAE-

Sefhadeks iyon deiim kromatorafisi ile saflatrmlardr. Saflatrlm enzimin

spesifik aktivitesini 9191 U/mg protein bulmulardr. Saflatrlm enzimi analiz

etmiler ve ksmen karakterize etmilerdir. Enzimin molekl arln, jel

kromatorafisi ile 37 kDa bulmulardr. SDS-PAGE ile enzimin iki eit alt niteden


52/102


39

olutuunu belirtmilerdir. zoelektrik noktasn, izoelektrik odaklama ile 5,3 olarak

bulmulardr. Enzim aktivitesinin optimum pHn 8-10 dzeyinde bulmulardr.

SOD aktivitesi iin optimum scakl 60 C olarak bulmulardr. 40, 50, 60 Cde bir

saat inkbasyonla SOD aktivitesinin artn belirtmilerdir. Fakat 80 Cde SODnin

denatre olduunu belirtmilerdir. 25 Cde 24 saat inkbasyonla SOD aktivitesinde

hafife azalma olduunu belirtmilerdir.

Ren ve ark. (2004), immobilize bakr (II) ilgi kromatorafisini, proteinlerin

paralanmasndan oluan histidin ieren peptidlerin seimi ile rnek karmn

sadeletirmek iin organizma ierisindeki btn proteinleri izole etmek iin

kullanmlardr. Bu almada, histidin ieren peptidleri tek basamakta tutuklanp

salverilmesinde iminodiasetik asiti (IDA) duraan faz olarak kullanan 4 farkl

destein spesifikliini aratrmlardr. Yksek Tutuklaycelatlatrc HP (agaroz),

TSK elat-5PW ve Gzenekli 20 MCnin ticari olarak mevcut olduunu

belirtmilerdir. IDAy ayn zamanda CIM diskleri (gliysidilmetakrilat-etilen

dimetakrilat) zerine immobilize etmilerdir. Bu destekleri deerlendirmek iin

transferin ve -galaktozidazn paralanm rneklerini kullanmlardr. TSKelat-

5PWnin histidin ieren peptidleri balayan en gl destek olduunu Gzenekli

destein ise yksek spesifik olmayan balanmalara sahip olduunu belirtmilerdir.

Agaroz temelli kolonun ise bal olarak yksek spesifiklie ve seicilie sahip

olduunu belirtmilerdir.

Zunsheng ve ark. (2005), Cordyceps Militaristen Cu-Zn SOD retmilerdir.

Cu-Zn SODnin kltr szntsnde var olduunu ve protein oran olarak

hcreleraras Cu-Zn SOD aktivitesinin, kltrn byme devresinde yksek

olduunu belirtmilerdir. Cu2+, Zn2+, Mn2+ ve Fe2+nin enzim biyosentezi zerine

etkisini aratrmlardr. Cu-Zn SODyi Cordyceps Militaristen izole etmiler ve

ksmen karakterize etmilerdir. Saflatrmay (NH4)2SO4 ktrmesi, DEAE-Sefaroz

hzl akan anyon deiim kromatorafisi, CM-650 katyon deiim kromatorafisi ve

sefhadeks G-100 jel szme kromatorafisi olmak zere 4 basamakta

gerekletirmilerdir. Saflatrlm enzimin 35070 400 Da molekler arlna

sahip olduunu ve her biri bir Cu, Zn elementine sahip iki eit alt niteden

olutuunu belirtmilerdir. Saflatrlm enzimin izoelektrik noktasn 7,0 olarak


53/102


40

bulmulardr. Saflatrlm enzimin N-terminal amino asit dizisini 12 amino asit iin

belirlemiler ve bu diziyi dier Cu-Zn SODlerinkiyle karlatrmlardr. Optimum

pHI 8,2-8,8 olarak bulmulardr. Saflatrlm enzimin pH 5,8-9,8de kararl

kaldn ve pH 7,8de 25 Cden 50 Cye kadar 1,5 saat inkbasyonla yine kararl

kaldn belirtmilerdir. Saflatrlm enzimin H2O2 ve KCNe duyarl olduunu

bulmulardr. Saflatrlm enzim zerine 2,5 mM NaN3, PMSF, Triton x-100, -

merkaptoetanol ve DTTnin 5 saat inkbasyonu ile herhangi bir inhibisyon

etkisininin olmadn bildirmilerdir.

Vyas ve Kumar (2005), kn yetien ay filizlerinden mangan ieren

speroksit dismutaz saflatrmlardr. Enzimi amonyum slfat ktrmesi, DEAE-

selloz kolon kromatorafisi ve HPLC sistemi ile silika temelli molekler dlama

kromatorafisi ile saflatrmlardr. 51 kez saflatrma yapmlar ve 56,66 U/mg

protein spesifik aktiviteye ulamlardr. Denatre PAGE ile tek band elde

etmilerdir. Enzimin 169 kDa molekler arlna sahip olduunu belirtmilerdir.

Buna karn SDS-PAGE ile monomer arln 43 kDa bulmulardr. Bylece

enzimin homotetramer olduunu nermilerdir. Saflatrlm enzim iin optimum

pHI 8,0 olarak bulmulardr. Optimum scakl ise 0 C olarak bulmulardr.

Enzimin geni bir scaklk aralnda aktivite gsterdiini belirtmilerdir.

Mavi ve ark. (2006), baz ilalarn, insan eritrosit ve lkosit hcrelerindeki

speroksit dismutaz enzim aktivitesi zerine inhibisyon ve aktivasyon etkilerini

incelemilerdir. lkin, Cu-Zn SOD enzim

iyon değişim kromatografisi

Documents

Transcript of iyon değişim kromatografisi