Isolation of Three Flavonoids fromWithania Somnifera Leaves (Solanaceae)

and their Antimicrobial Activities

Bashir, H. S. Mohammed, A. M.

Magsoud, A. S.Shaoub, A. M.4

Presented byERRISKA RAHMA PUTRI (3325102418)

170 cm (5 to 6 ft).Taksonomi

Kingdom Plantae

Subkingdom Tracheobionta

Division Magnoliophyta

Class Magnoliopsida

Subclass Asteridae

Order Solanales

Family Solanaceae

Subfamily Asteroideae

Genus Withania

Species W. somnifera

Withania Somnifera (Solanaceae)

http://www.iloveindia.com/indian-herbs/ashwagandha.html

30-15

0 cm

Plant Chemicals(+)- withanine, somniferine, somnine, somniferinine, withananine, anhydrine, methanol, hexane, diethyl ether, alkaloid (0.13-0.31%), choline, tropanol, pseudotopanol, cuscokygrene, 3-tigioyloxytropana, isopelletierine, withaferin-A, starch, glycosides, dulcitol, withancil, aspartic acid, glycine, tyrosine, alanine, glutamic acid, cysteine.

Ashwagandha• Withania somnifera, umumnya

dikenal sebagai ashwagandha, Ginseng India, dan ceri musim dingin.

• obat herbal di Ayurvedic dan ramuan dalam dunia medis selama lebih dari 3000 tahun.

• Manfaat ashwagandha antara lain sebagai obat bronkitis, asma, maag, anti - inflamasi, mengatasi gangguan kognitif dan neurologis, dan insomnia.

• Berdasarkan manfaat Aswaganha tersebut diduga mengandung flavonoid.

• Flavonoid ini memiliki aktivitas biologis yang luar biasa, termasuk efek penghambatan pada enzim, efek modulasi pada beberapa jenis sel, perlindungan terhadap alergi, antivirus, anti-malaria, antioksidan, antiinflamasi, dan sifat anti-karsinogenik.

MATERIALS AND METHODS

• Daun Withania somnifera (Solanaceae) yang dikumpulkan pada Maret 2010 dari Erkowait (Timur dari Sudan)

• Reagensia pro analitis• Mikroorganisme yang digunakan :

Bacillus subtilis, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.Diperoleh dari Departemen Botani, Universitas Cairo, Cairo City, Mesir. Organisme yang disimpan dalam agar posisimiring dalam botol McCartney dan disimpan di lemari es.

Bahan

Alat• Alat Gelas Kaca• Spektrofotometer UV• Lampu UV

• FTIR• NMR

Ekstraksi Konstituen Daun Withania SomniferaDaun Kering Withania Somnifera 1 kg

Diblender

Diekstraksi dengan kloroform (penghilangan klorofil, resin, dan bahan lilin).

Ekstrak Withania Somnifera

Dimaserasi dengan metanol 85%, 24 jam, suhu kamar, sesekali diaduk.

Disaring dengan vakum

Bubur Withania Somnifera

Proses ekstraksi daun kering Withania Somnifera diulangi 1 x dengan metanol 85% dan pengulangan ekstraksi dilakukan 2 x dengan metanol 50%.

Dicampurkan

Pelarut diuapkan di rotary evaporator, T : 40°C, tekanan rendah

Ekstrak 1(Metanol 85%)

Ekstrak 2(Metanol 85%)

Ekstrak 3(Metanol 50%)

Ekstrak 4(Metanol 50%)

Ekstrak kering Withania Somnifera (53 g)

Persiapan Uji Standar Organisme

Testing For Antibacterial Activity2 mL standard bacteria stock suspension

Mixed with 200 mL of sterile molten nutrient agar, at 45° C.

Cut and distributed 20 mL into sterile Petri dishes.

Filled with 0.1 ml extract (pure component).

Allowed to diffuse at room temperature for two hours.

Incubated in the up right position at 37 C for 18 hours.

Measured the diameter inhibition zones and averaged.

Bacteria in nutrient agar

1 mL kaldu organisme uji

Dioleskan pada permukaan agar.

Diinkubasi pada 37° C selama 24 jam.

Dicuci saline steril normal

Suspensi disimpan dalam lemari es, T : 4°C sampai digunakan.

Bakteri pada agar (108-109 koloni)

Preliminary Phytochemical screening of the Withania somnifera

• Flavonoids3 mL ekstrak daun Withania somnifera

Diberi beberapa tetes larutan AlCl3

+ if Larutan Berwarna Kekuning

3 mL ekstrak daun Withania somnifera

Diberi beberapa tetes larutan KOH

+ if Larutan Berwarna Kuning Tua

Shinoda Test

Sedikit ekstrak daun Withania Somnifera

Dimasukkan potongan kecil pita Magnesium

Ditambahkan beberapa tetes HCl pekat

If Larutan Berwarna Merah Tua + Flavon Glikosida

1

2

Preliminary Phytochemical screening of the Withania somnifera

• Steroid dan Terpenoid40 mL ekstrak daun Withania somnifera

Diuapkan pada water bath

Ekstrak kering (Residu)

Ditambahkan petroleum eter

Diekstraksi dengan 20 mL kloroform

5 mL ekstrak kloroform

Ditambahkan 0,5 mL acetic anhydride

Ditambahkan 2 tetes asam sulfat pekat

Ekstrak kering (Residu)Diekstraksi dengan 20 mL kloroform

+ SteroidIf Larutan Hijau

+ TerpenoidIf no pink-violet colour

Preliminary Phytochemical screening of the Withania somnifera

• Alkaloid30 mL ekstrak daun Withania somnifera

Diuapkan pada water bath

Ditambahkan 5 mL HCl 2 N dan dipanaskan 10 menit

Didinginkan, saring dan ambil filtrat.

2 mL filtratDitambahkan beberapa tetes Reagen Mayer

(Potassium mercuric iodide solution).

+ Alkaloid if terdapat endapan

Preliminary Phytochemical screening of the Withania somnifera

• Tannin25 mL ekstrak daun Withania somnifera

Diuapkan pada water bath

Ekstrak Kering (Residu)Diekstraksi dengan n-heksana

Disaring dan simpan filtrat

Filtrat n-heksana

+ Tannin jika filtrat menjadi berwarna biru

Dicampurkan dengan larutan garam panas (NaCl 0,9%)

Didinginkan, saring, dan ditambahkan 10 mL FeCl3

Preliminary Phytochemical screening of the Withania somnifera

• Isolation of flavonoidsEkstrak kering daun Withania somnifera

Dimasukkan dalam kolom poliamida 6S (80x3 cm)

Dielusi dengan air dan pencampuran air-metanol

7 Fraksi

Fraksi utama digabungkan dan dibagi 3 fraksi

Fraksi A (5g) Fraksi B (3g)

W1

(29 mg)

W2

(36 mg)W3

(27 mg)

W4

(21 mg)

Dikromatografi dengan sepadex LH 20 dan kertas saring

RESULTS AND DISCUSSION

1. Weight and percentage yield of some compounds extracted from W. somnifera leaves.

components weight Percentage yield

Compound W1 (mg) 29 0.58

Compound W2 (mg) 36 0.72

Compound W3 (mg) 27 0.77

2. The Rf values and colour reactions of pure compounds

3. The IR spectroscopic analysis of pure compounds extracts of Withania somnifera leaves gave the following characteristic absorption peaks

4. The Pure compounds dissolved in methanol, were subjected to UV spectrophotometric.

Terdapatnya NaOMe, AlCl3, AlCl3 / HCl, dan pencampuran reagen NaOAc / H3BO3 yang terpisah ditambahkan ke dalam larutan metanol yang diselidiki material dan pengukuran UV (tabel 4) untuk menentukan posisi gugus hidroksil.

5. The antibacterial activity of crude and pure compounds extracted from Withania somnifera

• Ekstrak kasar Withania somnifera menunjukkan penghambatan terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus dan penghambatan lemah terhadap Neisseria gonorrhoeae dan Bacillus subtilis.

• Komponen W1 cukup menghambat lima organisme tersebut tetapi lebih kecil dari ekstrak kasar.

• Senyawa W2 menunjukkan penghambatan lemah terhadap semua organisme.

• Senyawa W3 memiliki nilai penghambatan yang paling tinggi terhadap semua organisme, namun pada Pseudomonas aeruginosa aktivitasnya rendah.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) gambar (1) menunjukkan δ (ppm): δ 3.0 - 3.5 (m, 3H) ditetapkan untuk fungsi metoksil; δ 4,2-5 (m, 6H) terhitung proton gula, δ 6,04 (s, 1H) dan δ 6,25 (d, 1H), masing-masing merupakan C6-dan C8-H. Resonansi pada δ 6.84 dan 7.98 ppm merupakan informasi adanya senyawa aromatik H dari cincin B.

Senyawa W2 menyerap pada λ max (MeOH) 267, 350 nm, spektrum NaOMe ditunjukkan pergeseran batokromik dari +49 nm (tabel 4) menunjukkan adanya 4’-OH dan tidak adanya 3-OH. Hasil pergeseran UV dan 1H-NMR menjelaskan struktur senyawa W2 (gambar: 2).

Data spektrum UV senyawa W3 dalam MeOH ditandai sebuah flavon dengan tiga gugus hidroksil. Penambahan NaOMe memberikan pergeseran batokromik dari 30 nm (tabel 4) menunjukkan 4’- OH. Juga 7-OH dan katekol gugus dalam cincin B adalah ditandai dengan reagen pergeseran NaOAc dan NaOAc / H3BO3 masing-masing. 1H-NMR spektrum W3 (Gambar: 3) menunjukkan: δ 3,2-3,9 (m) ditetapkan untuk proton gula. Selain itu, hanya ada satu sinyal proton anomerik gula gugus yang melekat pada kerangka flavonoid (doublet pada δ 5,4) membuktikan adanya rhamnosyl gugus (dengan gugus metil pada 1,1 ppm). Resonansi pada δ 6.15 dan 6,7 (d, 2H) ditugaskan untuk sinyal juga C6-dan C8-H pada δ 6.92 (s, 1H), 7.03 (s, 1H) dan 7,41 (d, 1H) yang khas untuk flavon cincin B dengan 3’ - dan 4’ -OH fungsi. Resonansi pada δ 8 ppm adalah karakteristik dari C5- H.

BIOSINTESIS

http://www.enzyme-database.org/reaction/phenol/querc3gly.html

KESIMPULANDari ekstrak metanol Withania somnifera tiga flavonoid diisolasi dan dimurnikan menggunakan teknik kromatografi yang berbeda. Senyawa ini (W1, W2 dan W3) telah diidentifikasi melalui alat spektroskopi IR, UV, 1H NMR, dan MS spektroskopi. Ekstrak kasar dan murni senyawa menunjukkan aktivitas penghambatan yang baik terhadap patogen manusia : Bacillus subtilis, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus.