Isolation and characterization of organism producing thermo- stable lipase 報告學生 : 莫曉嬌...
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Isolation and characterization of organism producing thermo-
stable lipase
報告學生 : 莫曉嬌 宋志潔 報告日期 :2003/12/29
前言 Lipase ( 脂肪分解酵素 ) 可用作分解脂肪
環境中有許多微生物可產生 lipases ,催化 triglycerol 分解成 glycerol 與 fatty acid
微生物所產生的 lipase 多為胞外酵素
Lipase 多為適中溫酵素
Lipase 有許多用途: 1. 食品工業:起士
2. 清潔劑工業3. 油脂工業:甘油4. 廢水處裡5. 醫療:吸收不良病患
Thermostable lipase : 1. 嗜高溫微生物 2. 一般溫度生長之微生物
材料 培養基 1.Tributyrin agar plate (per L) : Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Tributyrin 15.0g 2. 不同受質培養基: Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Olive oil Corn oil Pig oil Tween20 10.0g/L﹑ ﹑ ﹑ Rhodamin B 10.0ml/L
3. 生化測試培養基: NA+NaCl Nitrate broth SIM MR-VP ﹑ ﹑ ﹑ broth Phenol red+sugar broth MSA ﹑ ﹑ ﹑ Citrate Urea broth﹑
樣本: 木柵動物園之堆肥
0.85% NaCl 無菌生理實驗水
實驗流程培養和分離
1g 樣本 +9mL 0.85% NaCl↓
取 0.1ml之 101 10﹑ 2 10﹑ 3 10﹑ 4 10﹑ 5稀釋度塗抹平板,在 Tributyrin agar plate
↓50℃培養 1-3 天
↓觀察有無生長與透明環產生
↓
選擇有透明環之菌落,在 Tributyrin agar plate上作純培養, 50℃培養 1-3 天
↓
在 Tributyrin agar plate 上作繼代培養,50℃與 60 ℃培養 1-3 天
↓培養於 Tributyrin plate Olive oil plate﹑ ﹑
Corn oil plate Tween20 plate ﹑ ﹑Pig oil plate , 50℃與 55 ℃培養 1-3 天
↓
觀察有無生長與透明環產生↓
培養於 Tributyrin plate﹑含有 Rhodamin B的 Olive oil plate Corn oil plate ﹑ ﹑
Tween20 plate Pig oil plate﹑ ,50℃與 55 ℃培養 1-3 天
↓觀察有無生長與透明環及螢光產生
↓鑑定
鑑定Gram stain : G(+) rods(圖二)
Spore stain(圖四, 圖五)
Glucose fermentation
1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A
(Bacillus sp.)
Catalase Catalase
+ -
+ -
+
-
Sporosacina sp.
Clostridium sp.
Desulfotomaculum sp.
+ -
Motile
+ -
Lactobacillus sp.
Erysipelothrix sp.
2D
(Brochothrix)
Listeria sp.
Kurthia sp.
1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A(Bacillus sp.)
60 ℃生長+ -
1C, 1E
(B. stearothermophilus)10%NaCl 生長
+ -
1D
(B. pantothenticus)
1B, 1F, 2A
(B. megaterium)
鑑定 ( 續 )Gram stain: G(+) cocci
Catalase+ -
Oxidase Streptococcus sp.+ -
Micrococcus sp.
Motile+ -
2E
(Planococcus sp.)
Staphylococcus sp.
Stomatococcus sp.
結果
培養基種類 加入Rhodamin B 1B 1C 1D 1E 1F 2A 2D 2ETributyrin plate - G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+Olive oil plate - G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/+Corn oil plate - G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/+Tween20 plate - G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+Olive oil plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*Corn oil plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*Tween20 plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*Pig oil plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*
註:
菌株編號
1. G/+:有生長且有透明環 G/-:有生長但沒有透明環2. G/+*:有生長且有螢光 G/-*:有生長但沒有螢光
表一、 不同測試菌株生長於不同受質培養基之結果
鑑定測試項目 1B 1C 1D 1E 1F 2A 2D
Endospore production + + + + + + -Spore shape E E E E E ESpore position C C C C CL CLCatalase + + + + + + +Oxidase - - - - - - -Nitrate reduction + + + + + + +VP - - - - - - -Urease - - - - + - -Citrate + + + - - - +
Fermentation:glucose + + + + + + +mannitol + + + + + + +xylose - - - - - - -fructose (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)lactose - - - - - - -
arabinose - - (+) (+) (+) - -Growth on:
2%NaCl + + + + + + +
5%NaCl + + + + + + +7%NaCl + + + + + + +
10%NaCl - - (+) - - - -Growth on :
50℃ + + + + + + +
55℃ + + + + + + +
60℃ - + - + - - -註:
2. +:正反應 -:負反應 (+):弱正反應
表二 、 革蘭氏陽性桿菌(1B, 1C, 1D, 1E,1F, 2A, 2D)之孢子染色 與生化鑑定測試結果
菌株編號
1. E: C: CL:橢圓形 位於中央 位於中央偏側邊
鑑定測試項目 結果 鑑定測試項目 結果Catalase + Fermentation:Oxidase - glucose +
Nitrate reduction + mannitol -
Motile + xylose -
Indole - fructose (+)
VP - lactose -
Urease - arabinose (+)MSA* - Growth on:Citrate - 2%NaCl +
Growth on : 5%NaCl (+)
50℃ + 7%NaCl -
55℃ + 10%NaCl -
60℃ - 15%NaCl -
註:
2. MSA反應: -表示沒有生長
菌株編號-2E
1. +:正反應 -:負反應 (+):弱正反應
表三、 革蘭氏陽性球菌(2E)之生化測試結果
討論 鑑定的結果之正確性,原因是 :
1. 有很多生化測試是 d 或 ND
2. 所作的生化測試並不完全 3. 測得的結果很類似 4. 部分菌株特性 Bergey’s manual 中没列
改善上述缺點的方法 :
1. 操作技術純熟 2. 用 Biolog 分析
參考文獻Rohit Sharma, and Yusuf Chisti. 2001. Production, purification, characterization, and applications of lipase. Biotechnol Advances.19:627-662.
Yougxiang Wang. 1995. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus Strain A30-1 (ATCC 53841). J Fermen Bioeng. 79:433-438.
謝汎擎 . 2001 . 耐熱脂肪分解酵素分離與特性測定 .
Bergey’s manual. Vol. 2.