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Per conoscere le le proprietà di specie di Per conoscere le le proprietà di specie di microrganismi che convivono nel medesimo microrganismi che convivono nel medesimo
ambiente dovremo riuscire a:ambiente dovremo riuscire a:
1. Letteralmente separarli fisicamente gli uni dagli altri;
2. Farli crescere separati in laboratorio in condizioni artificiali.
Operazioni fondamentali dell’indagine microbiologica
ISOLAMENTO E COLTIVAZIONEISOLAMENTO E COLTIVAZIONE
1. Letteralmente separarli fisicamente gli uni dagli altri;
2. Farli crescere separati in laboratorio
Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) con cui convive.con cui convive.
Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) suColtivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) suun substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine unaun substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine unapopolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.
Coltura pura o axenicaColtura o popolazione cellulare derivante dalla moltiplicazione di una
singola cellula microbica
Presupposto fondamentale per lo studio e l’identificazione dei m.o., isolati dai vari materiali sottoposti all’esame microbiologico, è quello di disporre di una coltura pura
Per coltura pura si intende l’insieme delle cellule che si
ottengono dalla riproduzione diuna sola cellula iniziale
TECNICHE DI SEMINA E ISOLAMENTO
•diluire il campione iniziale per separare le cellule presenti (isolamento)
•trasferire una singola colonia in un terreno sterile in modo da ottenere una popolazione di cellule identiche (coltura pura)
TECNICHE DI ISOLAMENTO
Per ottenere una coltura pura è quindi necessario:
TECNICHE DI ISOLAMENTO
�ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO
�ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA
�ISOLAMENTO PER COLTURA MONOCITOGENETICA
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO
• E’ necessario un terreno agarizzato su piastra Petri
•Si depone sul terreno una piccola quantità del campione da analizzare (popolazione mista)
•Con l’ansa si striscia il campione su tutta la piastra
•Il sistema può variare in relazione al percorso da far seguire all’ansa sulla superficie dell’agar
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO
Le cellule vengono rilasciate in maniera disuguale:• le « strisciate » iniziali rilasceranno molte cellule che daranno
origine, dopo incubazione, ad una patina
•Il progressivo esaurimento del carico dell’ansa determinerà alla fine la semina di poche cellule separate tra loro.
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA
•È necessario preparare una serie di provette contenenti acqua sterile, soluzione salina o terreno liquido
•Il campione viene inoculato in modo tale che ciascuna provetta riceva una certa quantità della sospensione cellulare della provetta precedente
•In questo modo ciascuna provetta rappresenta una determinata diluizione del campione iniziale
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 mlCampioneiniziale
Diluizione 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione viene depositata su terreno agarizzato già solidificato
Con una bacchetta di vetro si spande il campione su tutta la piastra
A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno separate le une dalle altre
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA
SEMINA E ISOLAMENTO PER
INCLUSIONE
Piastramento per inclusione: un volume noto di coltura viene pipettato su una piastra Petri sterile, viene poi aggiunto il terreno agarizzato ancora fuso ma non troppo caldo (45-48 °C). Il terreno viene mescolato alla coltura. Viene utilizzato per losviluppo di mo anaerobi
ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO
A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno separate le une dalle altre
Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione
viene depositata su terreno agarizzato già solidificato
Con una bacchetta di vetro si spande il campione
su tutta la piastra
Isolamento per coltura monocitogenetica
Questo tipo di isolamento permette di poter catturare una
cellula dalla piastra di coltura mediante l’utilizzo di un ago
capillare. In questo modo si ha l’assoluta certezza di aver
isolato una singola cellula
micromanipolatoreCapillare con il quale vengono posizionate le cellule sulla piastra (ingrandimento)
Posizionamento delle cellule su terreno completo. Le cellule sono posizionatea quattro a quattro. I numerie le lettere indicanoLa posizione di ogni cellula
a b c d1234
ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)
Forma Rilievo
piatto
sopraelevato
convesso
umbonato
sottile, allungatoeffusopuntiforme
circolare
filamentosa
rizoide
irregolare
d < 1 mm
irregolare, a filo intrecciato
irregolare, ramificata
ID dei microrganismiAspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)
Superficie Margine
intero
ondulato
eroso
filamentoso
arricciato
liscia
radiata
rugosa
concentrica
rilevata ondulata
anelli concentrici
raggrinzita