BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang.Imunohistokimia merupakan proses untuk mendeteksi antigen (protein, karbohidrat, dsb) pada sel dari jaringan dengan prinsip reaksi antibody yang berikatan terhadap antigen pada jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan =antibody dan histo menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik dari proses seluler seperti proses proliferasi sel, apoptosis sel. Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. Untuk memvisualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibody dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, dimana cara yang paling sering digunakan ialah dengan konjugasi antibody dengan enzim seperti peroksidase. Selain itu juga bias digunakan fluorophore seperi fluorescin atau rhodamin. Untuk mempelajari morfologi sel, sel dalamjaringan difiksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan divisualisasikan dengan mikroskop elektron atau mikroskop cahaya.Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untukmengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Imunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan.Teknik imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. Teknik ini diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati dibawah mikroskop. Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. Tempat pengikatan antara antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanya dilekatkan pada antibodi dan bisa divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk mengidentifikasi marker. Marker dapat berupa senyawa berwarna : Luminescence, zat berfluoresensi : fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin, logam berat : colloidal, microsphere, gold, silver, label radioaktif, dan enzim : Horse Radish Peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase. Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat diamati dengan mikroskop bright field (mikroskop bidang terang). Akan tetapi seiring berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna) dibawah mikroskop fluorescense.

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Bagaimana langkah-langkah untuk pengujian Imunohistokimia?

1.2.2 Bagaimana Metode dasar identifikasi antigen dalam jaringan dengan imunohistokimia?1.2.3 Apa saja Metode dalam Imunohistokimia?

1.2.4 Bagaimana Prosedur Dasar dalam Imunohistokimia?

1.2.5 Bagaimana Prosedur Imunohistokimia dalam Pewarnaan Tunggal (IHK-Single Staining)?1.2.6 Bagaimana Prosedur Imunohistokimia Pewarnaan Ganda (IHK-Double Staining)?1.3 Tujuan1.3.1 Mengetahui langkah-langkah dalam Imunohistokimia1.3.2 Mengetahui Metode dasar identifikasi antigen dalam jaringan dengan Imunohistokimia.1.3.3 Mengetahui Metode dalam Imunohistokimia1.3.4 Mengetahui Prosedur Dasar dalam Imunohistokimia1.3.5 Mengetahui Prosedur Imunohistokimia dalam Pewarnaan Tunggal (IHK-Single Staining).1.3.6 Mengetahui Prosedur Imunohistokimia Pewarnaan Ganda (IHK-Double Staining)BAB IIPEMBAHASAN2.1 Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimiaAdapun langkah-langkah untuk melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu preparasi sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat. Sampel labeling terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi adalah suatu imunoglobulin yang dihasilkan oleh sistem imun dalam merespon kehadiran suatu antigen tertentu. Antibodi dibentuk berdasarkan antigen yang menginduksinya. Beberapa antibodi yang telah teridentifikasi adalah IgA, IgD, IgE, IgG, dan IgM. Antigen adalah suatu zat atau substansi yang dapat merangsang sistem imun dan dapat bereaksi secara spesifik dengan antibodi membentuk kompleks terkonjugasi. Ikatan antibodi-antigen divisualisasikan menggunakan senyawa label/marker.

2.1.1 Metode dasar identifikasi antigen dalam jaringan dengan imunohistokimiaMetode dasar identifikasi antingen pada jaringan menggunaka 2 metode yaitu metode langsung (direct method) dan tidak langsung (indirect method). Metode langsung (direct method) merupakan metode pengecatan satu langkah karena hanya melibatkan satu jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) atau rodhamin. Di sisi lain, metode tidak langsung (indirect method) menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel) dan antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer bertugas mengenali antigen yang diidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi kedua merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan penambahan substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan senyawa tertentu. Disamping kedua metode di atas, analisis imunohistokimia juga dapat dilakukan melalui metode Peroxidase-anti-Peroxidase dan metode Avidin-Biotin-Complex (ABC).Metode Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP) adalah analisis imunohistokimia menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi yang membentuk seperti roti sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadap antigen (enzim) untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses kimia terkonjugasi Fitur unik dari prosedur ini adalah larutan enzim-antibodi dan kompleks imun PAP. Enzim Horseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik spesies tertentu dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim. Antiserum ini dipanen dan ditempatkan dalam larutan pada enzim sehingga membentuk kompleks imun yang larut. Sedangkan metode Avidin-Biotin-Complex (ABC) adalah metode analisis imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan beberapa biotin dalam molekul avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target.

IHC merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan memiliki keuntungan yang luar biasa untuk dapat menunjukkan secara tepat di dalam jaringan mana protein tertentu yang diperiksa. IHC juga merupakan cara yang efektif untuk memeriksa jaringan. Teknik ini telah digunakan dalam ilmu saraf, yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein dalam struktur otak tertentu. Kekurangan dari teknik ini adalah kurang spesifik terhadap protein tertentu tidak seperti teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul protein dan sangat spesifik terhadap protein tertentu. Teknik ini banyak digunakan dalam diagnostik patologi bedah terhadap kanker, tumor, dan sebagainya. Adapun marker untuk diagnosa IHC adalah sebagai berikut:

Carcinoembryonic antigen (CEA): digunakan untuk identifikasi adenocarcinoma.

Cytokeratins: digunakan untuk identifikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi dalam beberapa sarkoma.

CD15 and CD30 : digunakan untuk identifikasi Hodgkin's disease Alpha fetoprotein: untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler

CD117 (KIT): untuk gastrointestinal stromal tumors (GIST)

CD10 (CALLA): untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia Prostate specific antigen (PSA): untuk prostate cancer estrogens dan progesterone staining untuk identifikasi tumor

Identifikasi sel B limfa menggunakan CD20 Identifikasi sel T limfa menggunakan CD 32.3 Metode dalam Imunohistokimia

1. Metode Langsung (direct method)Metode ini menggunakan sebuah antibodi berlabel yang akan langsung berikatan dengan antigen yang sesuai. Dalam tahapannnya antigen dilokalisasi satu tahap dengan antibodi yang dikonjugasi dengan marker. Metode ini memiliki kelebihan yaitu sederhana dan hasilnya cepat didapatkan. Sedangkan kekurangannnya adalah morfologi latar tidak tampak, pada tiap antigen yang berbeda diperlukan antibodi terkonjunggasi yang berbeda-beda. Metode ini lebih jarang digunakan dalam aplikasinya. Penggunaan metode ini direkomendasikan dalam identifikas immunoglobulin, komplemen, komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit. Serta melokalisasi antigen Viral, bakterial, protozoal, dalam smear atau cairan tubuh.

Metode imunohistokimia direct menggunakan antibody primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung.

2. Metode tidak Langsung (indirect method)Metode ini menggunakan antibodi primer yang tidak berlabel yang akan berikatan dengan antigen, selanjutnya antibodi sekunder yang berlabel akan berikatan dengan antibodi primer. Label antibodi sekunder dapat berupa enzin, fluoresen, atau biotin. Tahapannya ada dua langkah, pertama inkubasi dengan antibodi primer, kemudian antibodi sekunder.kelebihan adalah Versatility, dan lebih sensitive dari pada metode langsung. Sedangkan kekurangan adalah latar tidak tampak, dan harus dengan frozen section metode ini direkomendasikan pada antibodi pada dalam serum (dipakai sebagai antibodi primer: penyakit autoimun, infeksi bakteri dan parasit).

Metode imunohistokimia indirect menggunakan antibody primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan juga antibody sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari antibody primer.2.4 Prosedur DasarProsedur histoteknik umumnya menggunakan fiksasi formalin dalam pembuatan preparat. Formalin dapat melakukan ikatan silang (cross-lingking) dengan protein target pada jaringan, sehingga antigen ( protein target) menjadi tertutup (masking) sehingga tidak bisa dikenali oleh antibodi yang digunakan. Untuk itulah diperlukan tahap antigen Retrival yang bertujuan membuka (unmasking) pada protein target. Terdapat beberapa macam prosedur antigen retrival tergantung dari jenis protein targen yang dituju.Tahap selanjutnya yang menetukan tingkat keberhasilan prosedur Imunohistokimia, yaitu melakukan bloking enzim-enzim endogen terutama bila menggunakan enzim peroksidase untuk melabel antibodi sekunder. Enzim peroksidase adalah enzim yang umumnya terdapat pada berbagai jenis jaringan dan sel terutama sel darah merah (pseudoperoksidase) dan sel darah putih (peroksidase endogen). Bila enzim peroksidase ini tidaak diblok terlebih dahulu, maka substrat kromogen yang diberikan dapat bereaksi dengan peroksidase pada jaringan dan sel, bahkan dapat bereaksi dengan peroksidase yang digunakan untuk melabel. Dengan demikian, hal tersebut akan menghasilkan interpretasi yang tidak benar. Bloking enzim endogen peroksidase dilakukan dengam memberikan hidrogen peroksidase sebagai substrat peroksidase pada slide. Substrat ini akan mengakibatkan peroksidase yang ada didalam sel, sehingga yang bereaksi dengan substrat kromogen hanya peroksidase yang ada pada antibodi. Bila enzim alkalin fosfatase dipakai untuk melabel antibodi, maka prosedur bloking enzim endogen tidak diperlukan. Biotin endogen sering dijumpai pada hati dan ginjal. Untuk mengatasinya, sebaiknya digunakan sistem deteksi yang tidak mengandung avidin-biotin atau melakukan preinkubasi dengan avidin.

Tahap berikutnya yang juga penting yaitu bloking untuk mencegah terjadinya pewarnaan latar yang nonspesifik dimana hasil positif yang diperoleh bukan karena reaksi ikatan antigen-antibodi. Hal ini sering terjadi karena adanya ikatan ionik nonspesifik antara antibodi dengan muatan dari jaringan ikat pada spesimen seperti halanya dengan kolagen. Ikatan nonspesifik tersebut dapat dikurangi dengan menggunakan serum non-imun dari spesies yang sama dengan antibodi sekunder.2.5 Prosedur Imunohistokimia Pewarnaan Tunggal (IHK-Single Staining)Langkah-langkah yang harus dilakukan dalam pewarnaan tunggal adalah sebagai berikut :

1. Melakukan deparafinasi preparat dengan xilol I dan II, masing-masing selama 5 menit.

2. Kemudian, lakukan dehidrasi dengan etanol absolut sebanyak dua kali, dan dengan etanol 90% dan 70% masing-masing selama 5 menit.

3. Preparat yang telah dilakukan dehidrasi dengan etanol selanjutnya, preparat direndam dalam larutan phosphate buffer seline( PBS) sebanyak 3 kali,masing-masing selama 5 menit, setelah itu direndam dalam 10 mM buffer sitrat pH 6 dan dipanaskan dalam macrowave bersuhu tinggi selama kurang lebih 9 menit.

4. Preparat dikeluarkan dari macrowave dan didiamkan sesaat pada suhu ruangan.5. Preparat kemudian direndam dengan menggunakan PBS sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit.

6. Sisa-sisa PBS kemudian dikeringkan yang terdapat pada preparat, kemudian preparat diletakkan dalam wadah yang telah dilapisi tissue yang disemprot dengan air agar menjadi lembab.

7. Siapkan larutan blotto (susu skim 2% dalam aquades), diteteskan keatas preparat jaringan dan didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang.

8. Preparat kemudian dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, masing-masing selama 10 menit.

9. Keringkan kembali sisa-sisa PBS yang masih menempel dan siapkan antibodi primer yang dilarutkan dalam larutan blotto dengan perbandingan 1:1000.

10. Preparat kemudian ditetesi dengan larutan antibodi primer tersebut dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruangan.

11. Kemudian preparat dicuci kembali dengan PBS sebanyak 3 kal, masing-masing selama 10 menit.12. Keringkan kembali sisa-sisa PBS yang masih menempel pada preparat dan disiapkan antibodi sekunder yang dilarutkan didalam larutan blotto dengan perbandingan 1:1500.

13. Preparat kemudian ditetesi dengan larutan antibodi sekunder tersebut dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang.14. Pereparat kemudian dicuci menggunakan PBS sebanyak 3 kali, masing-masing selama 10 menit.

15. Keringkan kembali PBS yang masih menempel dan selanjutnya preparat hasil pewarnaan IHK siap untuk diamati.2.6 Prosedur Imunohistokimia Pewarnaan Ganda (IHK-Double Staining)Prosedur yang dilakukan pada pewarnaan ganda adalah sebagai berikut :1. Slide preparat direndam dalam xylol I dan xylol II, masing-masing selama 5 menit, kemudian direndam kedalam etanol absolut selama 5 menit sebanyak 2 kali dan dilanjutkan dengan etanol 90% dan 70% masing-masing selama 5 menit.

2. Selanjutnya, direndam didalam PBS I,II,III, masing-masing selama 5 menit.

3. Kemudian, preparat dimasukkan kedalam 10 mM buffer sitrat (pH 6) dan dipanaskan didalam microwave bersuhu tinggi selama 10 menit preparat dan wadah selanjutnya dikeluarka dari dalam microwave.

4. Selanjutnya, preparat dikeluarkan dari larutan buffer sitrat dan ditunggu hingga dingin.5. Preparat dicucu menggunakan PBS I,II,III, masing-masing selama 5 menit, lalu bloking menggunakan 2% susu skim selama 1 jam.

6. Kemudian, cuci kembali dengan PBS I,II,III, masing-masing selama 5 menit.

7. Selanjutnya, tetesi dengan menggunakan first primary antibody (1:1000) dalam 2% susu skim pada suhu ruang selama 1 jam.

8. Preparat kemudian dicuci kembali dengan PBS I,II,III, masing-masing selama 10 menit kemudian ditetesi dengan first secondary antibody (1:1500) dalam 2% susu skim selama 1 jam dalam suhu ruang tanpa cahaya.

9. Preprat dicuci lagi menggunakan PBS I,II,III, masing-masing selama 10 menit dan bloking kembali menggunakan 2% susu skim semalaman.

10. Setelah itu, preparat dicuci lagi dengan PBS I,II,III, masing-masing selama 5 menit.

11. Kemudian tetesi dengan second primary antibody (1:1000) dalam 2% susu skim disuhu ruang selama 1 jam.

12. Setelah itu, preparat dicuci lagi dengan PBS I,II,III, masing-masing selama 10 menit.

13. Preparat lalu ditetesi dengan second secondary antibody (1:1500) selama 1 jam dalam suhu ruangan tanpa cahaya, kemudian dicuci kembali mengunakan PBS I,II,III masing-masing selama 10 menit. 14. Preparat siap untuk dibaca warnanya.BAB III

KESIMPULAN

3.1 KesimpulanImunohistokimia merupakan suatu teknik penentuan keberadaan (lokasi) antigen (protein target) dalam suatu jaringan ataupun sel menggunakan reksi antigen dan antibodi. Teknikini diawali dengan penggunaan metode histoteknik yaitu dengan cara pembuatan irisan jaringan untuk diamati. Reaksi yang terjadi pada ikatan antara antigen dan antibodi merupakan ikatan yang kasat mata (tidak dapat dilihat dengan mata) oleh karena itu diperlukan alat bantu untuk melihat apakah pada pengujian Imunohistokima akan terbentuk warna yang akan membedakan ikatan yang terjadi pada antigen-antibodi yang telah dilabel. Adapun untuk melabel pada uji Imunohistokimia ini menggunakan enzim kemudian akan direaksikan dengan substrat kromogen (yaitu substrat yang akan menghasilkan produk akhir yang berwarna dan tidak dapat larut) kemudia diamati menggunakan mikroskop.

1