European J. Biochem. 7 (1969) 286-293

Iodation des protkines par voie enzymatique 3. Complexe intermediaire enzyme-prothine et mecanisme de la reaction

J. NUNEZ et J. POMMIER

Laboratoire de Biochimie Gknkrale e t Comparke du College de France, Paris

(Requ le 1 ao1?t/23 septembre 1968)

In the preceding publication we have shown that horse radish peroxidase forms an enzyme- halogen complex with iodide ; first the halogen is oxidised by the enzyme forming the complex ; secondly the oxidised halogen is transferred directly from the complex to acceptor proteins. Therefore we have assumed that an interaction may occur between the enzyme-halogen complex and the tyrosine residues of the protein acceptor.

In the present work we will show that an enzyme-protein complex can be formed; when horse radish peroxidase is incubated in the presence of both thyroglobulin and an H,O, generating system, thyroglobulin isolated after the reaction is linked to peroxidase molecules. This complex is not formed when the H,O, generating system is omitted. This result suggests that the tyrosine groups of thyroglobulin are oxidised by the peroxidase. Free tyrosine is indeed oxidised by the enzyme through a free-radical mechanism ; the fact that 50 O i 0 of the radioactivity, present in the 3,5 positions is freed as tritiated water indicates that [3,5-3H,]tyrosine forms a dimer during peroxidase oxidation. If free tyrosine is oxidised by such a mechanism we might assume that the residues of the same amino acid linked to a protein may be used as a substrate by the peroxidase. Such an assumption is supported by the fact that proteins are competitive inhibitors of the gaiacol peroxidative oxidation. If the tyrosine residues of the protein are oxidised as free radicals we might assume that the oxidised form of iodine linked to the enzyme is 1’. Therefore the mechanism of enzymatic iodination of proteins should proceed by an addition of free radicals.

We can conclude from kinetic studies that the presence of an increasing amount of protein, up to a certain limit, inhibits the iodination reaction. Iodide inhibits only when it is present in excess, where I, is formed. From these results we might propose the following mechanism for the iodination reaction: the enzyme contains two sites almost identical; each of them should be able to form the complex with one of the two substrates, sequentially; when iodide is linked first, the velocity of the reaction attains maximum; when the protein is linked prior to the first site, iodide linkage to the second site is slowed and the velocity of the reaction reduced.

L’utilisation de la peroxydase de raifort comme modkle [ i ] de la reaction d’iodation thyroidienne nous a permis de mettre en evidence un complexe inter- mediaire enzyme-haloghe [2]. L’halogkne est ren- fermB dans le complexe sous forme oxydBe et peut atre chdB directement B l’accepteur proteique sans &re libhrB dans le milieu d’incubation. Ce transfert direct nous a permis de supposer l’existence d’une interaction entre les rBsidus de tyrosine de l’accepteur protbique et le complexe. Dans ce travail nous avons, en effet, mis en evidence un complexe intermediaire form6 entre l’enzyme et la proteine et montre que les rksidus de tyrosine de cette dernibre sont substrats de la reaction. La &action serait de type radicalaire, l’halogkne etant oxydb en I‘ le rbsidu de tyrosine de la protbine en Tyr’. L’iodation de la proteine inter-

Abbreviation non usuelle. Monoiodotyrosine, MIT. Enzymes. Peroxydase de raifort (EC 1.11.1.7); glucose

oxydase (EC 1.1.3.4).

viendrait alors par addition des deux radicaux libres formits. L’enzyme possbderait deux sites partielle- ment Bquivalents susceptibles de fixer respective- ment chacun des deux substrats selon un mecanisme de type sequentiel.

MATERIEL ET MBTHODES

Produits Les produits utilises sont : la peroxydase de raifort

Rz 3 (Boehringer), le glucose anhydre (Prolabo), la glucose oxydase Grad A (Boehringer), la thyroglo- buline purifiee de mouton, la ribonuclbase Grad A (Boehringer), le lysozyme Grad A (Calbiochem), les o-tyrosine et m-tyrosine (Sigma Chemical Company) ; le Gaiacol R P (Prolabo) ; la [3,5-3H]tyrosine est syn- thetishe au laboratoire 131 ; les deux isotopes de l’iode 1251 et 1311 sont fournis par le Commissariat b 1’Energie Atomiyue,

J. NUNEZ et J. POMMIER 287 Vol.7, No.2, 1969

Cine‘tiques d’iodation Elles sont ritalisees B 37”, pour un volume final

de 1 ml, dans le tampon phosphate (pH 6,O) 0,05 M en presence de 10 pg de peroxydase de raifort, du systbme generateur d’H,O, (I0 pg de glucose oxydase et 35,5 pg de glucose) et de quantites variables d’iodure et de proteines. Apres une preincubation de deux minutes, l’addition de la glucose oxydase permet B la reaction de debuter. Une aliquote du milieu reactionnel est prelevee B chaque temps et soumise B l’analyse chromatographique (solvant butanol-acide acetique-eau; 8:2 :2; v/v/v); l’iodure en excBs est separe des proteines halogknees qui restent B l’origine du chromatogramme, on deter- mine ainsi le pourcentage d’iode incorpori: sous forme organique dans l’accepteur proteique ; connaissant l’activitk specifique de l’iodure marque on peut calculer bgalement par cette methode le nombre d’atomes d’iode fixes par mole d’accepteur protbique.

Oxydation d u gaiacol par la peroxydase Mesure de l’activite‘ peroxydasique. L’activitB per-

oxydasique des diverses fractions obtenues par ultra- centrifugation en gradient de saccharose ou par filtration sur Sephadex est mesuree en prenant le gaiacol comme substrat. A chaque fraction sont ajout6s 0,2 ml de gaiacol (0,25 mg), 0,7 ml de tampon phosphate 0,05 M (pH 6), et 50 p1 de solution d’H,O, (50 mN). On determine pour chaque fraction l’augmentation initiale d’absorbance B 470 mp par minute B temperature ordinaire. La lecture est realisee au spectrophotomktre Zeiss dans des cuves de 1 ml.

Mesure de l’inhibition par les prote‘ines de l’activite‘ peroxydasique. L’oxydation du gai’acol par la per- oxydase est suivie par la mesure de l’augmentation de densite optique B 470 mp B temperature ordinaire dans des cuves de 1 ml au spectrophotombtre Zeiss. Les vitesses initiales de la reaction d’oxydation du gaiacol sont determinees pour une quantite constante de peroxydase (0,6 pg) avec des concentrations de substrat variant de 0, l B 0,s mg/ml en absence et en presence de lysozyme.

Oxydation de la tyrosine par la peroxydase Elle est realisee par incubation B 37” dans le

tampon phosphate 0,05 M (pH 6,8), (volume total 1 ml) de 50 pg de peroxydase de raifort, 50 pg de [3,5-3H]tyrosine et du systkme generateur d’H,O,. L’incubation est poursuivie jusqu’8 ce que toute la tyrosine soit consommite (2 heures). Une analyse en chromatographie sur papier (solvant butanol-acide acetique-eau ; 8 : 2 : 2 ; v/v/v) permet de verifier qu’il en est bien ainsi. Le milieu reactionnel total est soumis B une distillation. On determine parallblement : (a) l’activite specifique de l’eau distillee marquee par 3H obtenue; (b) l’activith specifique du milieu reac-

tionnel total. On peut ainsi calculer simplement le pourcentage de 3H libere sous forme d’eau tritiee au cours de l’oxydation de [3H]tyrosine.

Me‘thodes de purification et d’analyse Les methodes de purification et d’analyse utiliskes,

percolation sup Sephadex G-25 ou G-200, chromato- graphie sur papier et ultracentrifugation en gradient de saccharose ont 6th decrites precedemment [2].

Me‘thodes de comptage Pour les differents isotopes de l’iode, la methode

a &ti: decrite [2]. Les comptages de tritium sont effec- tues avec un compteur B scintillation liquide (Tricarb 4.000 Packard). Pour les mesures d’activitb speci- fique absolue de l’eau tritihe, les Bchantillons sont dissous dans l’alcool. Les corrections sont effectuees par la mbthode du titmoin incorpore.

R~~SULTATS

Mise en e‘vidence d’un complexe interrne‘diaire peroxydase-prote‘ine

De la thyroglobuline marquee par lZ5I est incubbe avec de la peroxydase de raifort et en presence (essai I ) ou non (essai 2) d’un systeme genkrateur d’H,O,. Le melange reactionnel est analysi: sur colonne de Sephadex G-200 qui separe trks efficace- ment la thyroglobuline (P. M. = 650.000) de la peroxydase (P. M. = 40.000). On mesure dans l’ef- fluat: (a) la radioactivite due B lZ5I qui permet de reperer la thyroglobuline; on constate dans les essais 1 et 2 que la totalit6 de cette proteine est normalement exclue de la colonne ; (b) l’activite peroxydasique (vis b vis du gaiacol). On constate dans l’essai 2 (effectu6 en absence de systbme gene- rateur d’H,O,) que le pic de thyroglobuline ne contient pas d’activith peroxydasique. Dans l’essai 1, par contre (effectui: en presence du systkme generateur d’H,O,) une activite peroxydasique nette peut &re mesuree (Fig. I A). Le pic de thyroglobuline exclu de la colonne et contenant de l’activiti: enzymatique est alors analyse par ultracentrifugation en gradient de saccharose (Fig. 1 B) ; on verifie une nouvelle fois que I’activitB peroxydasique accompagne le pic de pro- thine. De la radioactivite associee B l’enzyme shdi- mente egalement au fond du tube de centrifugation.

Le fait que la peroxydase ne soit associite B la thyroglobuline que lorsque le milieu d’incubation contient un systbme generateur d’H,O, suggbre que certains residus de la prothine ont 6th oxydes par l’enzyme et ont contract6 avec le site actif de celle-ci une liaison assez solide pour resister aux etapes de purification que nous avons dhcrites. Nous pouvons donc ecrire 1’6quation [I].

E + Protitine 2 E-Protkine oxydite. (1)

288 European J. Biochem. Iodation des proteines par voie enzymatique. 3

A 1 I I I I I I

I I I I

?

\ I \ I I I I I I I

I c

FRACTIONS

I b

32

E \ T a

01

FRACTIONS

- 0.1

C . .- E T a

- 0.05

Fig. 1. Mise en Lvvidence d’un complexe perox~(~ase-~rotk ine . (A) Analyse par chromatographie stir colonne de Sephadex G-200 d’un melange de thyroglobuline (3 mg) marquee par lZ5I et de 250 pg de peroxydase incubi? pendant trois minutes L 37” en presence du systhme gi?n&rateur d’H,O, pnis refroidi L 0”. Pour chaque fraction, on mesure la radioactivite due L lZ5I et Yactiviti? peroxydasique (vis vis du gaiacol). (B) Analyse par ultracentrifugation en gradient de saccharose du pic de thyroglobuline isole par chromatographie sur colonne de Sephadex dans les conditions de la Fig. 1 A. La centrifugation est poursuivie pendant 15h L 35.000 tours/min en gradient de saccharose (100-25Og/l) dans le rotor SW39 de la centrifugeuse

Spinco L2. 0 , radioactivit6 de lZ5I; 0, augmentation de l’absorbance B 470 mp

Les residus oxydes de la prothine sont probablement ceux de tyrosine, puisque cet acide amink phbnolique, substrat oxydogenique, doit 6tre oxydi? en radical libre. Cette kventualitk i~ BtB vhrifikes par l’expitrience suivante.

Oxydation de la [3,5-3H2]tyrosine par la peroxydase de raifovt

Gross et Sizer [4] ont montre que la p-tyrosine libre est oxydke par la peroxydase de raifort pour donner des polymkres selon la reaction (2). Pour verifier cette conclusion nous avons effectue l’ex- perience suivante : de la [3,5-3H,]tyrosine est incubite en presence de peroxydase de raifort et du systkme generateur d’H,O,. Lorsque toute la tyrosine est consomm6e, le milieu reactionnel est soumis B une distillation; en effet si le produit de la reaction est un polymkre du type decrit par Gross et Sizer, de l’eau tritiee doit 6tre libkrbe. On vkrifie qu’il en est bien ainsi et que 50 O/,, de la radioactivite initialement prksente dans [3,5-3H2]tyrosine est recueillie dans le distillat sous forme d’eau tritiee. Ce resultat confirme

OH OH OH

CH / \

NH, COOH Dim‘ere

que la tyrosine serait oxydeo selon un mecanisme radicalaire en Tyr’, conclusion conforme au caractkre oxydogenique du substrat [5] pour laquelle nous n’apportons cependant pas de preuve directe; deux radicaux libres forment le dimere Tyr:Tyr par ad- dition radicalaire. Par analogie nous pouvons sup- poser que le residu Tyr d’une protkine oxydee par la peroxydase de raifort est egalement transform6 en radical libre. Pour des raisons stkriques il ne se forme pas de dimkre avec une protkine; cette Bventualitit est facile &carter puisque le poids moleculaire de la prothine oxydee devrait doubler, ce qui n’est pas le cas.

Si le residu de tyrosine d’une p r o t h e est oxydh, il devrait rentrer en comp6tition avec un autre sub- strat de l’enzyme, le gaiacol par exemple.

Inhibition, cornpititive, par diverses protdines, de l’oxydation peroxydasique du gaiacol

L’oxydation peroxydasique du gaiacol est inhibee compktitivement, par diverses proteines. Ce resultat est illustrit dans le cas du lysozyme par la Fig.2 qui est &tablie en coordonnees inverses selon la reprksen- tation de Lineweaver et Burk. I1 confirme que les rksidus de tyrosine de la protkine sont substrat de l’enzyme.

Nous pouvons donc itcrire, B la suite de ces diverses experiences, 1’6quation [3].

E + Tyr-Protkine E-Tyr‘-Proteine . (3)

Vol.7, No.2, 1969 J. NUNEZ et J. POMMIER 289

Niveau d’oxydation de l’iodure et micanisme radicalaire de la &action enzymatique d’habgdnation

Dans l’article precedent [2] nous avons montre que l’enzyme forme avec l’halogbne oxyde un com- plexe intermediaire. Une des experiences permettant de le montrer avait B t B conduite de la manibre suivante : la peroxydase marquee par 1311, qui contient, une partie de cet halogkne marque sous forme labile et transferable, est additionne B froid de thyroglo- buline et d’iodure marque par lZ5I; on vkrifiait que le premier isotope 1311 est transfitre sur la prothine alors que le second n’est pas incorpore et ne subit aucune transformation. Ce resultat nous a permis de

I I * 05 1 125

C GA1‘ACOLl-’ (ml/mg)

Fig. 2. Inhibition par le lysozyme de l’oxydation d u gaiacol catalyse‘e par la peroxydase (reprksentation de Lineweaver- Burk). L’oxydation du gaiacol est mesurke Q 470 mp dans des cuves de I m l au spectrophotomhtre Zeiss. Les essais sont rkalises pour des concentrations en gaiacol variant de 0,l B 0,8 mg/ml en I’absence et en prksence de lysozyme

(40 mg/ml). 0, gaiacol seul; 0. gaiacol + lysozyme

conclure B un transfert direct de l’halogkne oxyde de l’enzyme B la prothine. Le second isotope lZ5I- n’est pas oxydi: dans ces conditions. Faut-il en conclure qu’au cours du transfert aucune reaction d’oxydation n’intervient ‘1‘ Pour le verifier nous avons realisit l’experience suivante : 2 pg d’IK marque par lZ5I sont ajoutks B la peroxydase halogenee (0,2 ml) marquee par 1311, en absence de thyroglobuline. Une extraction B l’heptane du milieu rhactionnel montre que, dans ces conditions, une partie de l’halogkne est retrouvee sous forme de I,. Cet element est marque B la fois par 1311 et lZ5I. L’iodure marque par lz5I a done 6th oxyd6. Ce resultat nous permet de discuter deux Bventualites : (a) l’halogbne transferable serait lie A l’enzyme sous forme I+. Le transfert aurait lieu sans qu’aucune oxydation de la protkine intervienne. L’oxydation du second isotope se ferait selon la reaction [4].

I+ + I- +I,. (4)

Si tel Btait le cas, on ne comprendrait pas pourquoi, en presence de l’accepteur proteique, une telle r6ac- tion ne pourrait avoir lieu; (b) l’halogbne trans- ferable serait present, dans le complexe intermediaire qu’il forme avec l’enzyme, sous forme 1’. I1 faut alors supposer, pour que l’iodation de la thyroglobuline puisse avoir lieu, gue le complexe enzyme-haloghe possbde la capacitb d’oxyder un deuxibme substrat. Ce dernier peut %re soit I-, soit les restes de tyrosine de la p r o t h e . Ces deux substrats seraient en com- petition. Quand ils sont ajoutes simultanement c’est la protbine qui est oxydee. Les cinetiques d’iodation de diverses proteines etablies pour diverses concen- trations en chacun des deux substrats suggbrent qu’il doit en &re ainsi.

Iodation du lysozyme et de la rinonuclLaase

Une quantite constante de peroxydase (I0 pg) est incubite en presence du systkme gknhrateur d‘H,O, et de concentrations variables d’iodure et de lyso- zyme. La Fig.3 reprkente une serie de cinetiques (pg d’iodure incorpori: dans le lysozyme en fonction du temps d’incubation) obtenues. L’examen de cette figure montre: (a) que le lysozyme est inhibiteur lorsqu’il est en excbs par rapport B l’iodure; l’in- hibition est levee lorsque l’on augmente la concen- tration d’halogbne relativement B celle de la proteine. L’inhibition n’est done pas due B une competition entre les deux substrats vis L vis de l’eau oxygenee necessaire B la reaction qui n’est donc pas le facteur limitant. La competition doit plut6t &re attribuee au fait que la protitine est substrat et qu’elle se fixe sur l’enzyme. (b) l’inhibition par le lysozyme augmente en fonction de la concentration en proteine mais atteint un maximum: ce resultat sera interpretit plus loin. Un temps de latence est observe quand la reaction est inhibee par excbs de protkine. Bjorksten [6] signale un phhnombne analogue lorsque le sub- strat de la peroxydase est l’iodure seul; cet effet est, independant de la concentration en H,O, en iodure et en Hf. L’existence de ce temps de latence difficile, B interpreter dans 1’8tat actuel de l’experimentation, ne permet pas d’effectuer une analyse quantitative des donnees cinhtiques. Cependant pour souligner les deux conclusions qualitatives precedentes il est pos- sible de considhrer, arbitrairement, que le nombre de pg d‘haloghe incorpores entre 1 et 3min correspond B la vitesse initiale ce qui nous permet de dessiner les Fig.4 et 5.

L’examen de la Fig.5 montre que l’iodure est Bgalement inhibiteur de l’halogenation du substrat protkique mais seulement lorsqu’il est en grand excbs. Par contre on peut montrer que l’iodure en excbs n’est pas inhibiteur de sa propre oxydation; pour des concentrations auxquelles l’iodation de la protkine est inhibee il se forme I, que l’on peut

290 Iodation des protbines par voie enzymatique. 3 European J. Biocheiii.

5119 IK I 1Owg IK t

0.1

INCUBATION (min)

/

m /* 1

INCUBATION ( m i n )

1 3 5 10 1 3 5 10 INCUBATION (min) INCUBATION (min)

0 0 5 1 2 5 10 LIKI (pg/ml)

t

10 -

5 -

I

002 05 1 2 CIKI-' (ml/pg)

Fig.3. Cine'tiques d'iodation d u lysozyme obtenues pour diffe'rentes concentrations e n iodure et e n prote'ine. Les rBsultats sont re- prBsentBs dans chaque cas pour une concentration en iodure con- stante. Les essais sont rhalisbs dans l e tampon phosphate 0,05M (pH 6), B 37" (volume final 1 ml). Les quantitks de peroxydase (10 pg) e t de glucose oxydase (10 pg) sont identiques pour tous les essais. *, 0,2 mg lyso- zyme ; 0 , 2 mg lysozyme ; 0 , 6 mg lysozyme; A, 12 mg lysozyme;

m, 20 mg lysozyme

Fig.4. Vitesse initiale de la riac- t ion d'iodation e n fonction de la concentration e n iodure. (A) Les essais sont ceux reprBsent6s par la Fig.3. Les vitesses initiales sont calculbes sur chaque cinh- tique comme le nombre de pg dhalogbne incorpori? par min dans I'intervalle de temps com- pris entre 1 et 3 min aprbs le debut de I'incubation. A, 0,2 mg lysozyme; 0 , 2 mg lysozyme; 0, 12mg lysozyme. (B) ReprB- sentation des m h e s rBsultats en coordonkes inverses. 0 , 2 mg lysozyme; 0, 6 mg lysozyme;

A, 12 mg lysozyme

Vo1.7, No.2, l O G 0 J. NUNEZ et J. POMMIER 291

mettre en evidence par mesure B 355 mp de l’ab- sorption due B I,- form6 selon la reaction [5].

I, + I- * 1,-

I, et, I,- ne sont done probablement pas des especes d’halogbne reactives dans l’iodation enzymatique de la prothine, puisque cette derniere est inhibee des que Yon peut les mettre en evidence.

L’inhibition de l’iodation du lysozyme par exces d’iodure peut Btre interpretke de la manikre suivante: l’enzyme posskde un site capable de ceder

A

’“1

En utilisant de la ribonuclkase comme substrat proteique accepteur d’iode oxydi: on obtient des rhsultats du mBme type (Fig.6). On remarque ici encore que l’inhibition par excks de proteine atteint un maximum; de mBme la reaction n’est inhibee par exces d’iodure, avec formation de I,, que pour des concentrations de cet element trks Blevhes. Cette proteine contient [7] trois residus de tyrosine qui pr6- sentent un comportement normal (sur 6 au total) alors que le lysozyme en renferme deux [8]; l’inhibition par l’iodure n’est visible dans le cas de la ribonuclease

I I I * * 2 10 50 100 2 10 50

CIODUREI (pg /ml ) CiODUREl (pg/rnl)

Fig. 5 Fig. 6 Fig.5. Vitesse initiale de la rkaction d’iodation e n fonction de la concentration e n iodure (2, 10, 50 et 100pglml) pour une

faible concentration e n prote‘ine (0,Z mg). La vitesse initiale est calculee comme dam le cas de la. Fig.4 Fig.6. Vitesse initiale de la re’action d’iodation de la ribonucliase e n fonction de la concentration e n iodure. Les cinktiques d’iodation de la ribonuclkase sont obtenues pour diverses concentrations en iodure et en proteine. Les essais rbalisbs dans les m6mes conditions que pour le lysozyme (tampon phosphate pH 6, 0,05 M, 37”, volume final 1 ml, peroxydase 10 pg, glucose oxydase 10 pg). La vitesse initiale de la reaction d’iodation calculee pour chaque cinetique comme le nombre de pg dha loghe incorpore par min dans l’intervalle de temps compris entre 1 et 3 min, est representee en fonction de la concen-

tration en iodure. 0, 0,l mg ribonuclease; 0 , 0,5 mg ribonuel6ase; A, 2 mg ribonuclkase

deux electrons B deux molecules d’iodure selon la reaction [ 5 ] :

H A F, + I - - = EI, + 1-2 E -I, - 1 , z E + 1,. (6)

Le site de la peroxydase serait double et done capable de fixer deux molkcules de substrat oxydogthique. Lorsque l’iodure est en grand excks, deux molecules de cet element sont fix6es; il se forme I, et la reaction est inhibee [equation (S)]. Lorsque une proportion convenable entre iodure et proteine est respectee une molhcule de chacun des deux substrats est fixee et la vitesse de la reaction est maximum. Enfin, lorsque laprotkine est en excks, sa fixation bl’enzyme entraine une inhibition; pour des raisons steriques il est diffi- cile d’imaginer que deux molecules de proteine puissent Btre fixkes B une m6me molecule d’enzyme. L’inhibition par excbs de prothine doit done &re interpretbe selon d’aut,res hypotheses que nous examinerons plus loin.

que pour des concentrations en cet element t r h &levees. La difference observee selon que l’accepteur proteique est la ribonuclhase ou le lysozyme peut Btre due soit 5, ce que la premiere proteine contient, par m61e, un nombre plus &lev& de residus de tyro- sine, soit parce que leur rbactivite est plus grande, soit enfin simultanement B ces deux raisons. S’il en est ainsi ce resultat est coherent avec l’existence d’une competition entre les deux substrats diffitrents, l’iodure et la prothine.

DISCUSSION

Les resultats obtenus permettent de proposer un mecanisme pour la reaction enzymatique d’iodation. La prothine n’est pas un simple accepteur d’haloghe oxydi! ; les restes de tyrosine sont tres vraisemblable- ment oxydhs en radical libre Tyr’. Les arguments suivants peuvent Btre avances en faveur de cette conclusion: la prothine forme avec l’enzyme un

292 Iodation des protbines par voie enzymatique. 3 European J. Biocheiii.

50 - --. 8 5 40 t f 30- z

20 -

10 .

- -

complexe uniquement en presence d’un systkme gBnBrateur d’HzO, ; elle est inhibiteur compBtitif de l’oxydation du gaiacol ; la tyrosine libre, substrat oxydogenique, est oxydB en radical libre pour donner un dimkre. Diverses recherches [9] ont d’ailleurs montrB que 1’activitB biologique de plusieurs enzymes est abolie aprks incubation en prBsence de peroxy- dase; que l’absorption des protBines B 2 8 0 m ~ est modifiBe par ce meme traitement; enfin que des Bquivalents d’oxydation sont consommes dans ces conditions [7].

Nos experiences suggkrent en outre que l’halogkne est 1% transitoirement b l’enzyme sous forme de radical 1‘. L’halogBnation des protbines par voie enzymatique pourrait done se faire par addition radicalaire :

R-Tyr‘ + I’ + R-MIT. (7)

Nous sommes donc conduits B admettre que l’iodure et les rBsidus de tyrosine sont substrats. L’enzyme, active par H,O, possbde deux Bquivalents d’oxy- dation; il est done capable de fixer deux molBcules de substrat oxydogenique c’est B dire donateur d’un atome d’hydrogbne. Nous avons vu en effet que lorsque l’iodure est en grand excks on obtient une inhibition qui s’accompagne de la formation de I,. Celle-ci peut s’expliquer si l’enzyme contient deux sites Bquivalents, chacun d’entre eux Btant capable de fixer un atome d’iode oxydB I’ [Bquation (S)]. Le mecanisme d’oxydation et de dimbrisation de la tyrosine libre peut &re expliquk de la m6me fagon:

(8)

Les reactions (5) et (6) supposent l’existence d’un double site. Les raisons pour lesquelles il convient d’Bcarter l’existence d’un seul site [equation (9)] sont les suivantes: nous savons que la peroxydase forme avec une

E + 2 Tyr + E < Tyr’ +Tyr : Tyr + E. Tyr’

I

2E + I + Tyr +E-I’ + E-Tyr’ +MIT + 2E (9)

molecule d’H20, un composb d’addition contenant deux Bquivalents d’oxydation, qui peuvent ensuite &re cBdBs. Or lorsque les deux complexes E-I‘ et E -Tyr’ sont form&, un seul Bquivalent d’oxydation est consomm6. Les complexes devraient done 6tre capables d’oxyder une deuxibme molbcule de substrat oxydoghique. En outre, nous l’avons vu [2], l’halogkne oxydB fix6 b l’enzyme est directement transf6rB B la protkine, sans &re libere dans le milieu. Un tel rksultat permet de supposer l’existence d’une inter- action entre le complexe Enzyme-I’ et la prothine. D’autre part la probabilith pour que I., situB sur l’enzyme, rBagisse avec le rBsidu de tyrosine, Bgale- ment complex6 avec une molBcule de peroxydase, devrait 6tre trks faible ou nulle pour des raisons d’encombrement. En outre si l’enzyme n’a qu’un seul

site, l’iodure et la protbine seront en competition et la vitesse dBpendra non seulement de la concentration absolue des substrats mais aussi de leur concentration relative. En presence d’un grand excks d’un des deux substrats la reaction devrait &re complBtement in- hibBe. Or si nous examinons les cinktiques d’iodation du lysozyme (Fig.3) on peut constater qu’il existe une limite B l’inhibition par la protbine. Cette limite est trBs nette si l’on reprbsente le pourcentage d’in- hibition en fonction de la Concentration de protBine pour chaque concentration d’iodure (Fig. 7) .

2 6 12 20 CPROTElNEl ( r n g h l )

Fig. 7. Pourcentage d’inhibition de la rkaction d’iodation du lysozyme reprdsente‘e en fonction de la concentration e n pro- te‘ine pour diffkrentes concentrations e n iodure. Les vitesses obtenues pour la concentration de protkine bgale & 2 mg/ml et respectivement pour les quantitks diodure de 0,6-1 et 2 pg sont prises arbitrairement comme les vitesses optimales de la reaction d‘iodation. L’inhibition est calculke pour chaque concentration en iodure comme 1e rapport entre les vitesses initiales obtenues pour 6, 12 et 20 mg de lysozyme et la vitesse optimale (2 mg de lysozyme). 0 , 0,6 pg IK;

0 , 1 pg IK; A, 2 pg IK

Nous sommes conduits B supposer l’existence de deux sites sur lesquels se fixent respectivement l’iodure et la prothine. Un tel mecanisme suppose que les deux sites sont Bquivalents stBrBospBcifique- ment et qu’ils sont proches l’un de l’autre. Examinons maintenant si les deux sites sont vraiment Bqui- valents. Ce problkme peut &re rBsolu lorsque l’iodure est en excks sans 6tre inhibiteur (Fig.6). La compBti- tion entre l’iodure et la proteine devrait se conclure dans ce cas en faveur de l’haloghe pour le premier site mais Bgalement pour le second. Une telle Bven- tualitB devrait conduire B une inhibition et B la for- mation de I,, ce qui n’est pas le cas. I1 faut done penser que les deux sites ne sont pas vraiment bquivalents et que la compBtition pour le second est en faveur de la protbine. La reaction peut ainsi Bvoluer normalement.

D’autre part on constate aussi une inhibition lorsque la prothine est en excbs. Dans ce cas la pro- thine doit &re fixbe la premiere avec l’un des deux

Vo1.7, No.2, 1969 J. NUNEZ et J. POMMIER 293

sites de l’enzyme. On peut facilement concevoir que, contrairement b ce qui se passe pour l’iodure, deux m6les de prothine ne peuvent pas se fixer b une m6me molitcule d’enzyme selon la reaction (10) pour des

Tyr - Proteine < Tyr - Protitine (10) E + 2 Protitines + E

raisons d’encombrement . Rappelons cependant l’exis- tence d’une limite superieure (Fig.3 et 7) B l’inhibi- tion par la protbine. Pour expliquer cette limite nous pouvons supposer que lorsque la protitine est en exces elle se fixerait la premiere sur un des deux sites de l’enzyme ce qui aurait pour consequence de diminuer l’affinite et l’accessibilitb du second site pour l’iodure. L’ordre de fixation de chacun des deux substrats jouerait ainsi un r81e dans la vitesse initiale d’iodation. Le mitcanisme de la rbaction serait alors de type sequentiel.

Dans la premikre variante l’iodure accede le pre- mier B l’enzyme [itquation ( l l ) ] ; dans la seconde la proteine est fixite la premiere ce qui

E + I- +E /’’ I’ + Tyr - Proteine +

provoque une inhibition partielle de la fixation de l’iodure [itquation (12)]

Tyr‘ - Proteine E + Prothine --f E /’ + I- +

La nature du double site demeure inconnue. Cependant des rbsultats obtenus par Brill et Weinryb [lo] permettent de penser que le site de fixation du substrat de la peroxydase de raifort est un residu de mitthionine proche du heme qui pourrait fixer un substrat rbdogbnique AH, et l’oxyderait en deux ittapes. En d’autres termes le complexe enzyme-H,O,

cbderait au substrat ses deux itquivalents d’oxydation par l’intermitdiaire de ce r6sidu. Dans le cadre du mecanisme de la reaction d’iodation que nous avons proposb, les deux equivalents d’oxydation seraient citdits respectivement b deux molecules identiques de substrat oxydogenique (2 I- avec formation de I, ou 2 Tyr avec dimerisation en Tyr:Tyr) ou diffitrents (I- et Tyr-Proteine avec formation de protitine halogenee). Des Btudes portant sur l’inhibition de l’enzyme, B pH acide, par l’iodacetamide, dans des conditions oh la methionine est seule ritactive, in- diquent que cet acide amin6 pourrait bien constituer le double site responsable de la fixation et de l’oxy- dation de l’iodure et de la proteine. Ces ritsultats feront l’objet d’une publication ulterieure.

Ce travail a bbnbficib d’une subvention du Centre Natio- nal de la Recherche Scientifique (Equipe de Recherche NO 18) et d’une aide de la Dblbgation Gknbrale a la Recherche Scientifique et Technique (Comitb de Biologie MolBculaire Contrat No 66.00.268). Nous remercions Mme S. de PrailaunB de sa collaboration.

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