Introduction aux puces à ADN Vincent BARRA ISIMA / LIMOS UMR CNRS 6158 Campus des Cézeaux 63177...
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Introduction aux puces à ADN
Vincent BARRA
ISIMA / LIMOS UMR CNRS 6158
Campus des Cézeaux 63177 AUBIERE
www.isima.fr/vbarra
2
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications – détermination des familles de gènes co-régulés, – recherche de systèmes de régulation, …
Domaines – Pharmacologie– médecine – environnement…
Mesure du niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes simultanément
Puces à ADN
BiologieNanotechnologie
Chimie Traitement d’images
Bioinformatique
Introduction (1/3)
Introduction
3
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Puces perles
*****
GeneChip Affymetrix
Puces ADNc
Membrane NylonSAGE
DifférentesTechnologies
CGHAgilent: Puces à jet d’encre
Introduction (2/3)
Introduction
4
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Puces ADNc
Principe : technique d'hybridation.
Introduction (2/3)
Introduction
5
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionIntroduction
Eléments de biologie
Les puces à ADN
Analyse des données issues des puces à ADN
De la cellule à l’ADN De l’ADN au génomeDu génome au transcriptome
Introduction (3/3)
Principe Préparation du matériel biologiqueAcquisition d’une image de puce à ADN
Traitement d’imagesAnalyse des données
Quelques applications
Etudes comparatives de transcriptomesAgriculture
6
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Eléments de biologie moléculaire
Biologie
7
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
De la cellule à l’ADN
Biologie
8
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Dogme central de la biologie moléculaire
ADN ARN ProtéineTranscription
Traduction
Rép
licat
ion
Transcription inverse
Biologie
9
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Elements de biologie moléculaire
Biologie
Transcription
Traduction
Synthèse de protéines
ADNARNm ARNt
Acides aminés
ARNm
codon
Membrane nucléaire
Anticodon
ARN
polymérase
Nucléotides ARN
ARNr
Ribosome
Chaîne polypeptide
10
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Ribonucléotides libres
Transcription
Biologie
11
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Copie du gène en ARN = ARNm
L'ARNm se détache et la molécule d'ADN se referme
Transcription
Biologie
12
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
La synthèse de la protéine (assemblage des acides aminés) se fait au niveau des ribosomes
Biologie
Traduction
Pour synthétiser la protéine, il faut :
• ARNm = information (la recette)
• Ribosome = machine à assembler les acides aminés
• Acides aminés = pièces de construction
• ARNt (ARN de transfert) = molécules qui transportent les acides aminés du cytoplasme au ribosome où ils sont assemblés en protéine.
13
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Traduction
Biologie
14
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
•La maturation des protéines a lieu dans le Reticulum endoplasmique et l ’appareil de Golgi
• Modifications chimiques de la protéine (glycosylation, mérystylation, phosphorylation….)
• La maturation est indispensable à la fonctionnalité des protéines
Biologie
Hélice
Hélice
Feuillet Feuillet
Traduction
15
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
La protéine assemblée se replie pour former une structure tridimensionnelle précise
Biologie
Traduction
16
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Insuline
Hémoglobine
Biologie
Traduction
17
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Acétylcholinestérase
Hélices alpha
Feuillets bêta
Biologie
Traduction
18
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
19
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
20
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
21
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
22
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
Anticorps IGE
23
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
24
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
1. Structure
2. Régulation du métabolisme
3. Mouvement
4.Transport de molécules
5. Immunité
6. Transport membranaire
7. Métabolisme (les enzymes)
Biologie
Traduction
Principales fonctions des protéines
25
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Dogme central de la biologie moléculaire
ADN ARN ProtéineTranscription
Traduction
Rép
licat
ion
Transcription inverse
Les puces à ADN permettent de mesurer globalement le niveau d’expression de l’ARNm
Protéine
Transcription
Traduction
Ribosome
ADN
ARNmARNr ARNt
Biologie
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Intérêts et applications
Biologie
• Etude de la dynamique du transcriptome
• Recherche et action de médicaments
• Recherche de mutations
• Oncologie
• Environnement et agriculture
• …
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Les puces à ADN
Puces
28
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionPuces
Etapes d’une expérience utilisant des puces à ADN
29
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionPuces
Etude de cas
• On cherche à déterminer les gènes d’un organisme activés ou réprimés en conditions particulières
• On suppose disposes de deux types de cellules pour cet organisme :
des cellules de contrôle
des cellules représentative du phénomène étudié (pathologie, cycle cellulaire, stress hydrique, stress anaérobique,…)
• Exemple : croissance d’une levure en conditions aérobie/anaérobie
• Utilisation courante des puces à ADN
30
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionPuces
Préparation des cibles (1/2)
On laisse croître les cellules dans les deux conditions
Ajustement des transcriptomes pour survivre
Centrifugation
On purifie
On isole les ARNm
Tampon d'extraction
On dilue
On facilite l’extraction
31
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionPuces
Préparation des cibles (2/2)
On ôte l’ARNm et on le place dans des nouveaux tubes
Mélange
La soupe est prête !
Conversion ARNm/ADNc
Marquage R/V
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Préparation des sondes
On dépose des milliers de séquence d’ADNc (sondes) sur un support de verre de petite taille.
– Les sondes doivent être spécifiques d’un gène– Chaque dépôt est la transcription inverse d’un ARNm
que l’on souhaite mesurer
Puces
Les sondes sont déposées par un robotspotteur
70 mm20 mm
33
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Hybridation
Puces
Hybridation
34
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Acquisition de l’image de puce (1/3)
• Acquisition à l’aide d’un scanner deux couleurs : détection différentielle de la fluorescence des cibles aérobies/anaérobies présentes sur le support• Amplification du signal par des tubes photomultiplicateurs• Construction d’une image en fausses couleurs
Puces
35
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Acquisition de l’image de puce (2/3)
Exemple
Excitation laser vert
Excitation laser rouge
Puces
36
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Acquisition de l’image de puce (2/3)
Exemple
Gène aérobique Gène anaérobique
Gène exprimé dans les deux conditions
Puces
37
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Acquisition de l’image de puce (3/3)
Puces
38
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionPuces
Schéma récapitulatif
Puce à ADN
excitation
laser 1laser 2
émission
Tableau N*P
Analyse et normalisation d’images
Hybridation
Sondes
39
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Analyse des données
Analyse
40
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Analyse des données
Adressage
Segmentation
Quantification
Extraction de
connaissances
Impact considérable sur l’interprétation biologique des données
Analyse
41
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Queues de comètes
Débordement des puitsMauvais rapport S/BSuperpositon
–Segmentation signal/fond et débruitage
–Extraction et normalisation de l’information
–Recherche des centres de spots
Problèmes :
Traitement d’images
Analyse
42
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionAnalyse
Traitement d’images
Localisation des spots
Méthodes algorithmiques Méthodes géométriques
43
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionAnalyse
Traitement d’images
Extraction des gènes d’intérêt
Quels sont les gènes dont la variation d’intensité est significative ?
Analyse de données/extraction de connaissances
Quantification
Intensités en rouge et vert
Intensités en rouge et vert corrigées du bruit de fond
…
44
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionAnalyse
Analyse de données
Objectifs
A partir de la liste des gènes ayant une variation significatives par rapport à l’expérience :
• Trouver les gènes ayant une variation recherchée
• Regrouper les gènes ayant des variations similaires
• Trouver les gènes expliquant les variations d’autres gènes
45
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Classification hiérarchique :– Calcul d’une matrice de similarité entre gènes
– Regroupement des deux gènes les plus proches
– Remplacement des deux gènes par un gène moyen
– Processus itératif
Construction d’un arbre phylogénique représentant
une hiérarchie de groupes de gènes
Une des premières méthodes utilisées
Analyse de données
Analyse
46
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Analyse de données
Exemple : Extrait du génome de la
levure du boulanger
Saccharomyces cerevisiae
Clustering hiérarchique
Analyse
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Algorithme des nuées dynamiques
Analyse de données
Initialisation Classification Mise à jour des centres
Analyse
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Réseaux de neurones
8 groupes 8 groupes stables stables
Analyse de données
Analyse
49
Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionAnalyse
Représentation des données
Problèmes– Visualiser les résultats de l’analyse du transcriptome à l’échelle du génome
entier– Intégrer les résultats pour répondre aux interrogations.
Deux types de méthodes– Organisation de la liste des gènes visualisation des résultats– Représentations quantitatives vue globale de l’effet des expériences
50
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Tableau résumant les expressions de chaque gène
Représentation en fausses couleurs Induction du gène par une échelle (noir/rouge) Répression du gène par une échelle (noir/vert)
Peu lisible
Pas d’inclusion des intensités
+ intensité moyenne des gènes + éléments cis régulateurs dans les promoteurs
Représentation des données
Analyse
51
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Localisation chromosomique des gènesLocalisation chromosomique des gènes
Analyse
Représentation des données
GraphiqueGraphique mettant en valeur l’effet observé à l’échelle du génomemettant en valeur l’effet observé à l’échelle du génome
52
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Utilisation de méthodes issues du data mining : exemple de la mise en évidence de relations entre objets
Calcul de similaritésCalcul de similaritésRéseau de pointsRéseau de points
Carte stableCarte stable
Exemple d’applicationExemple d’application
Carte aléatoireCarte aléatoire
Analyse
Représentation des données
53
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Incorporation d’autres informations– Fonctionnelles (banques de données)– Expertes (biologistes..)
Comparaison des résultats obtenus avec ce qui est déjà connu
Analyse
Représentation des données
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Quelques applications
Applications
55
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN
Applications
56
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes
Applications
Le transcriptome = population des ARNm exprimés par un organisme à un instant donné. résulte d’un équilibre entre la synthèse et la dégradation des ARNm varie en fonction des conditions intra- et extra-cellulaires. offre une représentation dynamique de l’état de la cellule et des processus biologiques en cours.
L’analyse du transcriptome permet d’établir le « profil d’expression » de chaque gène considéré, c’est-à-dire la variation de son niveau d’expression selon un ou plusieurs paramètres (temps, type cellulaire, etc.).
57
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes
Applications
De nombreuses études ont été réalisées dans différents organismes afin d’identifier les gènes co-régulés dans certaines réponses cellulaires spécifiques.
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, études de la variation transcriptionnelle des gènes :
• au cours du cycle cellulaire mitotique• au cours de la méiose et de la sporulation• en réponse à la transition de la fermentation anaérobie à la respiration• en réponse aux lésions de l’ADN provoquées par des irradiations ou des agents génotoxiques• etc.
58
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes
Applications
• La comparaison de divers transcriptomes de mutants, de types cellulaires ou de tissus donnés permet également de prédire la fonction de gènes non caractérisés et d’élucider des réseaux de régulation de voies biochimiques complexes.
• l’analyse du transcriptome permettant de caractériser l’état de la cellule, l’utilisation de puces à ADN dans un objectif de diagnostic est en développement.
distinguer des types de cancers non différentiables par d’autres méthodes recherche et la validation de substances thérapeutiques en permettant l’identification de nouveaux gènes cibles et la caractérisation de la réponse cellulaire à un traitement.
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes
Applications
• Analyse de mutations : cribler des gènes caractérisés par leur polymorphisme. La diversité génétique d’une population peut être explorée et la relation entre le génotype et le phénotype, de gènes et de groupes de gènes peuvent ainsi être mis à jour.
• Analyse des mutations des gènes codant pour deux enzymes du virus du SIDA (Gen-Chip HIV, Affymetrix) • détection des mutations génétiques liées à certains cancers du colon et du sein (Leti, Grenoble)• détection des mutations de l’exon 11 du gène BRCA1, responsable du cancer héréditaire du sein et de l’ovaire (Hacia et al, Affymetrix)• …
60
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN – agriculture
Genoplante
Programme fédérateur de génomique végétale qui associe en France la recherche publique (INRA, CIRAD, IRD, CNRS) et les principales sociétés privées impliquées dans l'amélioration et la protection des cultures ( Biogemma, Bayer Cropscience, Bioplante).
ObjectifsDécouvrir des gènes utiles : amélioration des plantes raisonnée et découverte de nouvelles molécules agro-chimiques plus respectueuses de l'environnement.Etude des espèces "modèles : étude d'Arabidopsis et du riz permettra pour avancer dans la connaissance des autres plantes cultivées.
ExempleDétermination des processus biologiques et moléculaires améliorant la tolérance au froid
du blé
Applications
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Applications des puces à ADN – agriculture
Applications
Leader, Journal of Cereal Science, 41, pp 149.163, 2005
Etude des gènes activés après bourgeonnement
62
Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Conclusion
Il est maintenant possible d’analyser l’expression de milliers de gènes en parallèle et à haut débit. Révolution technologique Changement d’échelle de la recherche biologique
Domaine plurisiciplinaire
Applications multiples
Conclusion
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Conclusion
Conclusion
Quel avenir pour les biopuces ?
Les possibilités des puces à ADN sont inversement proportionnelles à leurs tailles.
• ARN artificiels capables de remplacer des anticorps monoclonaux
• Accès aux immuno-analyses simultanées du même prélèvement pour le diagnostic moléculaire des maladies infectieuses la recherche sur les résistances aux antibiotiques.
• Mise au point imminente de puces de polymorphismes dont les applications seront des plus nombreuses:
Etude de la diversité génétique dans le cadre de la génétique des populations Etablissement de cartes génétiques affinées Recherche accélérée sur les maladies à origine génétique (dépistage, facteurs de risque...)
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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion
Conclusion
Conclusion
Et bientôt…la transformation des puces en laboratoires (CEA)
Dépôt de l’échantillon
Puce à ADN
• Détection, en moins d'une heure, les agents infectieux présents dans un échantillon de sang ou de salive • Détection de l'éventuelle présence d'une trentaine de micro-organismes en même temps
Traitement de l’échantillon